CN115433260A - 一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01及其制备方法与应用 - Google Patents

一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga‑DOTA‑PG01及其制备方法与应用，涉及生物医学领域；放射性多肽制备时，先通过生物偶联技术将环状多肽PG01 N端的氨基与偶联剂DOTA‑NHS进行缩合反应，得到多肽偶联物，多肽偶联物中的螯合剂DOTA与68Ga螯合，构建靶向ALK融合蛋白的放射性多肽；本发明首次合成了靶向ALK融合蛋白的多肽，通过68Ga标记构建了靶向ALK融合蛋白的放射性多肽，能作为示踪剂用于ALK阳性肿瘤的活体显像，提出ALK融合基因阳性患者筛查及病理信息获取新方法。

Description

一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01及其制备方法与应用。
背景技术
我国癌症发病率、死亡率全球第一。基于基因的靶向治疗是目前肿瘤治疗最精准的方法，而开展靶向治疗的前提是筛选出特定基因阳性的人群。
间变性淋巴瘤激酶(ALK)是胰岛素受体家族的一种受体酪氨酸激酶，正常情况下只表达于神经***，它与多种肿瘤的发生有着密切的联系。ALK蛋白的N端位于细胞膜外，C端位于胞内；胞外是受体区，胞内是激酶区。胞内的激酶区是ALK发挥激酶功能的主要结构域，可激活多个细胞内信号通路，包括JAK-STAT、PI3K-AKT、mTOR及MAPK等信号通路，从而参与调节细胞生长、转化及抗细胞凋亡。在多种肿瘤中ALK的胞内激酶区发生重组、突变或扩增，引起下游信号通路的激活，导致癌细胞的增殖、生长和侵袭。
融合突变是ALK最常见的基因异位，在多种肿瘤中均发现ALK融合突变，如NSCLC患者中有3-7%发现ALK-EML4融合蛋白；在其他肿瘤如神经母细胞瘤、乳腺浸润性导管癌等肿瘤中，ALK融合已被证实为肿瘤发生的驱动基因。ALK融合基因已经成为多种肿瘤的特异性靶点。
目前检测ALK融合基因表达主要通过活检或组织学检测，但均存在一定局限性，如：有创性、不可能每个组织都能取得到样本、不能反应病变全貌等；因此，开发特异性靶向ALK融合蛋白的新型核素药物，发展无创、快速、精准检测基因的影像学方法，用于ALK阳性患者“伴随诊断”、获得活体分子病理信息，实现ALK阳性肿瘤的“精准制导”，具有重大的临床价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG
01及其制备方法与应用，公开一种靶向ALK融合蛋白的核素探针，实现基于核素探针的无创快速核医学影像检测ALK融合蛋白，解决当前主要通过活检或组织学检测ALK融合蛋白基因表达方法存在的局限性。
为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01。通过生物偶联技术将环状多肽PG01 N端的氨基与偶联剂DOTA-NHS进行缩合反应，得到多肽偶联物DOTA-PG01；所述多肽偶联物DOTA-PG01中的螯合剂DOTA与68Ga螯合，构建靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01；
所述放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的结构式如下所示：
Figure 262997DEST_PATH_IMAGE001
；
所述靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的氨基酸序列为：
Thr-cyclo(Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys)-Phe，
其中，环状结构由Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys通过两个半胱氨酸之间形成二硫键成环。
进一步的，所述DOTA-PG01的结构式如下所示：
Figure 358299DEST_PATH_IMAGE002
。
本发明另一技术方案在于公开上述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）采用固相合成法，合成DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列；
（2）将步骤（1）制备得到的多肽序列进行环化及纯化，得到多肽偶联物DOTA-PG01；其中，环状结构通过两个半胱氨酸的巯基缩合形成二硫键；
（3）对多肽偶联物DOTA-PG01进行68Ga标记，得到靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01。
进一步的，所述步骤（1）的执行过程为：
以Rink amide-MBHA resin树脂为起始树脂、Fmoc-Phe为原料，采用DIPEA/HBTU/HOBT缩合体系固相法合成DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cy
s-Phe多肽树脂，再用TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液从该多肽树脂上裂解DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列；
上述过程的具体流程包括：
用哌啶DMF溶液脱去Rink amide-MBHA resin树脂上的氨基保护基，洗涤所述树脂，用含有DIPEA /乙酸酐的DCM溶液封闭所述树脂上未反应的位点；
除去溶剂、再洗涤所述树脂后，连接Fmoc-Phe，获得Fmoc-Phe-MBHA树脂序列；
脱去Fmoc-Phe-MBHA树脂序列上的Fmoc保护基团，按照从羧基端到氨基端的顺序对氨基酸序列Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe依次重复脱保护并在DIPEA/HBTU/HOBT缩合体系中进行缩合反应，直至多肽序列全部偶联到Fmoc-Phe-MBHA树脂序列上，获得Fmoc-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂；
然后脱去Fmoc-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂上的Fmoc保护基团，连接偶联剂DOTA-NHS，获得DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂；
最后采用TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液从树脂上裂解多肽，得到DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列。
进一步的，所述缩合反应中各反应物的物质的量比例为Fmoc-Phe：DIPEA：HOBT：HBTU：Rink amide-MBHA resin = 3.5：7：4：4：1。
进一步的，所述TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液中各组分的体积比为TFA：TIS：PhOH：Thioanisole：H2O=30：2：2：1：1，所述DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂和裂解液的质量比为1：（10~15）。
进一步的，所述DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列制备中反应物Rink amide-MBHA resin树脂、DOTA-NHS和DIPEA的物质的量之比为（2~2.5）：（8~10）：1。
进一步的，所述步骤（3）的具体流程如下：
将多肽偶联物DOTA-PG01溶解于NaOAc缓冲液中，向该DOTA-PG01溶液中加入[68Ga]GaCl3溶液，在45~60℃反应15~20 min，得到靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01；
其中，所述NaOAc缓冲液的浓度为0.1M，pH为4.0~4.6；所述DOTA-PG01溶液的浓度为20~25uM，所述[68Ga]GaCl3溶液为0.01N HCl淋洗出来的溶液。
进一步的，所述DOTA-PG01溶液和[68Ga]GaCl3溶液的体积比为（0.6~1.5）：1。
本发明还提出上述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01作为示踪剂在肿瘤显像中的应用。
由以上技术方案可知，本发明的技术方案获得了如下有益效果：
本发明首次合成了靶向ALK融合蛋白的多肽DOTA-PG01，并进行了68Ga标记，构建了靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01；本发明采用MTT方法测定了DOTA-PG01的细胞毒性，证实了DOTA-PG01对肿瘤细胞无明显的抑制作用，说明DOTA-PG01无细胞毒性；此外，通过小动物PET/CT考察了放射性多肽68Ga-DOTA-PG01作为示踪剂的肿瘤成像效果，发现68Ga-DOTA-PG01可以用于ALK阳性肿瘤的活体显像。
本发明公开的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01作为检测靶向ALK融合蛋白的新型探针，开创了ALK融合基因阳性患者筛查及病理信息获取新方法，弥补了传统检测方法的缺点与不足，避免误诊误治情况的发生；同时可以监测靶向治疗过程中ALK融合蛋白的表达变化，跟踪靶向治疗效果、便于及时调整治疗方案，提高肿瘤患者的精准治疗效率。
应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
附图不表示按照真实参照物比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：
图1是多肽偶联物DOTA-PG01的ESI-MS质谱图；
图2是多肽偶联物DOTA-PG01的纯度检测图；
图3是放射性多肽68Ga -DOTA-PG01放射化学纯度检测图；
图4是放射性多肽68Ga -DOTA-PG01的体外稳定性检测图；
图5是多肽偶联物DOTA-PG01对A549/EML4-ALK细胞毒性实验（MTT实验）结果图；
图6(a)是A549/EML4-ALK细胞对放射性多肽68Ga -DOTA-PG01的结合曲线图；
图6(b)是A549/EML4-ALK细胞对放射性多肽68Ga -DOTA-PG01的解离曲线图；
图7是多肽偶联物DOTA-PG01与ALK融合蛋白的竞争性结合曲线图；
图8是放射性多肽68Ga -DOTA-PG01与ALK融合蛋白的饱和结合曲线图；
图9是放射性多肽68Ga -DOTA-PG01的体内稳定性分析图；
图10是放射性多肽68Ga -DOTA-PG01的体内生物分布图；
图11是实验组（上）与抑制组（下）的荷瘤小鼠PET/CT显像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。同样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一个”“一”或者“该”等类似词语也不表示数量限制，而是表示存在至少一个。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”或者“包含”后面列举的特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件，并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、 操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。“上”“下”“左”“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。
基于ALK融合已被证实为肿瘤发生的驱动基因，并成为多种肿瘤的特异性靶点的研究现状，而目前检测ALK融合基因表达的主要方式是采用具有一定局限性的活检或组织学检测的现象；本发明旨在于开发一种针对特异性靶向ALK融合蛋白的新型核素药物，即一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01及其制备方法与应用，用作示踪剂实现无创、快速、精准检测ALK融合基因，跟踪靶向治疗效果以便及时调整治疗方法，提高精准治疗效率。
下面结合具体实施例及附图，对本发明公开的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01及其制备方法与应用作进一步具体介绍。实施例方案中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品，常温为20~30℃。
实施例1：制备靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01
（1）以Rink amide-MBHA resin树脂为起始树脂、Fmoc-Phe为原料，采用DIPEA/HBTU/HOBT缩合体系固相法合成DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cy
s-Phe多肽树脂，再用TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液从树脂上裂解DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列；
具体的，先用哌啶DMF溶液脱去Rink amide-MBHA resin树脂上的氨基保护基，洗涤所述树脂，用含有DIPEA /乙酸酐的DCM溶液封闭所述树脂上未反应的位点；除去溶剂、再洗涤所述树脂后，连接Fmoc-Phe，获得Fmoc-Phe-MBHA树脂序列；脱去Fmoc-Phe-MBHA树脂序列上的Fmoc保护基团，按照从羧基端到氨基端的顺序对氨基酸序列Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe依次重复脱保护并在DIPEA/HBTU/HOBT缩合体系中进行缩合反应，直至多肽序列全部偶联到Fmoc-Phe-MBHA树脂序列上，获得Fmoc-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂；然后脱去Fmoc-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂上的Fmoc保护基团，连接偶联剂DOTA-NHS，获得DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-T
yr-Cys-Phe多肽树脂；最后采用TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液从树脂上裂解多肽，得到DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列。
其中，哌啶DMF溶液浓度为20%-25%，可选23%；封闭液按体积比计，DIPEA：乙酸酐=1：（2~2.5），可选1:2.2；缩合反应时反应物按物质的量比计，Fmoc-Phe：DIPEA：HOBT：HBTU：Rink amide-MBHA resin = 3.5：7：4：4：1；裂解液按体积比计，TFA：TIS：PhOH：Thioanisole：H2O=30：2：2：1：1；DOTA偶联时反应物按物质的量比计，树脂：DOTA-NHS：DIPEA= （2~2.5）：（8~10）：1，例如选择2:8:1；多肽裂解时裂解液用量按质量比计，DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂：裂解液=1：（10~15），例如1:15；
（2）步骤（1）制备得到的多肽序列DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe中 的Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys通过两个半胱氨酸的巯基缩合形成二硫键实现环化，环化 条件为：二甲亚砜在常温下反应24h，利用相高效液相色谱仪进一步纯化，得到多肽偶联物 DOTA-PG01；其中，DOTA-PG01的结构式为：
Figure 341298DEST_PATH_IMAGE003
。
（3）将多肽偶联物DOTA-PG01溶解于NaOAc缓冲液中，向DOTA-PG01溶液中加入[68Ga]GaCl3溶液，在45~60℃反应15~20 min，得到靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01；其中，放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的结构式为：
Figure 205349DEST_PATH_IMAGE004
。
其中，NaOAc缓冲液的浓度为0.1 M，pH为4.0~4.6，例如调试pH=4.5；DOTA-PG01溶解于NaOAc缓冲液后，浓度为20~25 uM，实施例中浓度为25 uM；[68Ga]GaCl3溶液为0.01NHCl淋洗出来的溶液；68Ga标记时，DOTA-PG01溶液和[68Ga]GaCl3溶液的体积比为（0.6~1.5）：1，可选0.8:1。
对本实施例步骤（2）制备的多肽偶联物DOTA-PG01进行了ESI-MS质谱表征，结果如图1所示，实验结果表明多肽偶联物DOTA-PG01的分子量与理论值一致，其纯度高于98%。
对本实施例步骤（2）制备的多肽偶联物DOTA-PG01采用高效液相色谱进行了纯度分析，结果如图2所示。
其中，HPLC流动相（A=0.1%TFA/水，B=0.1%TFA/乙腈），Sepax GP-C18 120 Å（250× 4.6 mm, 5 µm），具体见表1。
表1为高效液相色谱分析多肽偶联物DOTA-PG01的检测条件
Figure 206672DEST_PATH_IMAGE005
由图2可知，制得的多肽偶联物DOTA-PG01的纯度大于98%。
对本实施例步骤（3）制备的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01用带有放射性检测器的分析型HPLC进行放化纯度检测，结果如图3所示。其中，HPLC流动相（A=0.1%TFA/水，B=0.1%TFA/乙腈），Zorbax 5 μ C18 100 Å （250 × 4.6 mm，5 µm），具体见表2。
表2为高效液相色谱分析放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的检测条件
Figure 232397DEST_PATH_IMAGE006
由图3可知，放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的放射化学纯度大于99%。
实施例2：靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的体外放射化学性质研究
体外稳定性：将15uL的实施例1制备的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01加入到185uL、pH= 7.4的PBS缓冲液或人血清中，37℃孵育10、30、60、120、240 min。孵育结束后，PBS样品直接取出注入Radio-HPLC进行检测；血液样品加入无水乙醇并离心、过滤，然后用Radio-HPLC进行检测。
如图4所示，实验结果表明体外的68Ga-DOTA-PG01放射化学纯度无明显变化，均大于95%，说明放射性多肽68Ga-DOTA-PG01 2h内具有很好的体外稳定性。
亲水亲脂性：5uL（约0.1MBq）的实施例1制备的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01用pH =7.4的HEPES缓冲液稀释至500 uL，然后继续加入500 uL正辛醇并剧烈振荡；从水相和有机相各取出400 uL液体测量其放射性计数；脂水分配系数通过公式[Log(有机相的放射性计数/水相的放射性计数)]计算出，结果如表3所示。
表3放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的脂水分配系数
Figure 951960DEST_PATH_IMAGE008
实验结果表明放射性多肽68Ga-DOTA-PG01具有较好的亲水性。
实施例3：多肽偶联物DOTA-PG01细胞生长抑制及细胞摄取研究
细胞培养：在5% CO2，37℃细胞培养箱中，含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中培养非小细胞肺癌细胞（A549/EML4-ALK）。
MTT实验：分别将10uL浓度为0.04、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0uM的实施例1制备的多肽偶联物DOTA-PG01加入到含有90uL培养液的非小细胞肺癌A549/EML4-ALK细胞中（最终浓度为：0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5uM），在不同时间段（6、24、 48和72 h）观察多肽偶联物DOTA-PG01对细胞生长的影响。
如图5所示，实验结果表明多肽偶联物DOTA-PG01对非小细胞肺癌A549/EML4-ALK细胞的生长无明显抑制或促进作用，说明多肽偶联物DOTA-PG01无细胞毒性。
细胞摄取实验：将2×105个A549/EML4-ALK细胞在MatTek玻璃底培养皿培养24h 后，用PBS洗涤，然后在37℃与实施例1制备的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01（1nM）孵育15、30、 60、120 min；ALK融合蛋白的结合特异性通过加入克唑替尼（100nM）预孵育细胞30min进行 阻断，然后在37℃下加入放射性多肽68Ga-DOTA-PG01（1nM）进一步孵育细胞15、30、60、120 min；孵育结束后，用冷PBS洗涤细胞3次，通过伽玛计数器检测细胞内放射性计数，从而拟合 出细胞摄取曲线；其中，克唑替尼是FDA批准的靶向ALK融合蛋白的小分子化合物，其结构式 如下所示：
Figure 88543DEST_PATH_IMAGE009
。
如图6(a)和6(b)所示，实验结果表明90min内细胞对放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的摄取达到最高，随后趋于平稳；放射性多肽68Ga-DOTA-PG01与ALK融合蛋白的结合常数结合常数（K on）为0.043nM-1min-1、解离常数（K off）为0.067min-1，根据K d= K off/K on计算得到K d为1.56nM。
实施例4：靶向ALK融合蛋白的多肽偶联物DOTA-PG01与受体的结合力研究
竞争实验：在培养非小细胞肺癌A549/EML4-ALK的细胞孔内，加入125I标记的克唑替尼及浓度为10-13～10-4 M的实施例1步骤制备的多肽偶联物DOTA-PG01（多肽偶联物DOTA-PG01最终浓度为：10-14～10-5 M）进行竞争性结合。孵育2 h后，测定细胞表面和细胞内的放射性计数，通过Graphpad Prism软件拟合出竞争结合曲线，得出多肽偶联物DOTA-PG01与ALK融合蛋白的竞争结合常数；其中，125I-克唑替尼的制备方法如下：取Indogen管，加入100uL 0.05M PB，4ug 克唑替尼，150uCi 125I，混匀反应20min（每5min摇匀一次）后加入150uL 0.05M PB终止反应，然后使用C18小柱、水/乙腈（6/4）淋洗液淋洗出125I-克唑替尼，将125I-克唑替尼淋洗液中的乙腈除去，得到125I-克唑替尼溶液用于竞争性实验研究。可选的，实施时也可直接购买成品的125I-克唑替尼。
饱和实验：向非小细胞肺癌细胞中加入浓度为2、4、8、16、32、64、128、256nM的实施例1制备的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01（放射性多肽68Ga-DOTA-PG01最终浓度为：0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 nM），37 ℃孵育2 h，测定细胞表面和细胞内的放射性计数，得到放射性多肽68Ga-DOTA-PG01与ALK融合蛋白的结合容量（特异性结合+非特异性结合）。非特异性结合通过共孵育放射性多肽68Ga-DOTA-PG01和克唑替尼（100nM）得到，进而通过Graphpad Prism软件拟合出饱和结合曲线，得到放射性多肽68Ga-DOTA-PG01与受体最大特异性结合容量（B max）和结合力（K d），结果如表4、图7（竞争实验曲线）和图8（饱和实验曲线）所示。
表4放射性多肽68Ga-DOTA-PG01与受体的结合力数据
Figure 226264DEST_PATH_IMAGE011
竞争实验结果表明多肽偶联物DOTA-PG01与ALK融合蛋白有着较强的受体结合力，K i值达到2.8±0.3nM；饱和实验结果表明放射性多肽68Ga-DOTA-PG01与ALK融合蛋白的受体结合力K d值达到nM级别，放射性多肽68Ga-DOTA-PG01与A549/EML4-ALK细胞的受体最大结合容量Bmax约为309.2± 17.5fmol/mg蛋白。
实施例5：靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的体内稳定性研究
取9只健康雄性裸鼠评价实施例1制备的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01在体内的代谢稳定性。每只裸鼠经尾静脉注射约7.4 MBq实施例1制备的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01，注射5、30、60min后，分别取3只裸鼠收集尿液和血液样本，处理后注入Radio-HPLC，观察放射性多肽68Ga-DOTA-PG01不同样本中的放射性化学纯度，结果如图9所示。
实验结果表明放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的体内稳定性较强，60min后68Ga-DOTA-PG01在血液中的稳定性高于90%；此外，60min后尿液中发现68Ga-DOTA-PG01的放射性占比仍大于80%，说明68Ga-DOTA-PG01在体内较稳定。
实施例6：靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的体内生物学分布研究
裸鼠皮下瘤模型的建立：体外培养非小细胞肺癌A549/EML4-ALK细胞，用无血清培养液洗涤和离心，进行活细胞计数后用戊巴比妥钠溶液注射小鼠腹腔（50 mg/kg）麻醉裸鼠，将100 uL含4×106个非小细胞肺癌细胞的无血清悬液注入裸鼠前肢左侧腋下，注射后5天开始观测裸鼠的状况，得到荷瘤鼠模型。
取荷瘤鼠10只，分为两组，尾静脉注射约7.4 MBq放射性多肽68Ga-DOTA-PG01作为示踪剂；注射示踪剂后0.5h和1h分别处死5只小鼠，取血液、肿瘤及其它主要脏器和组织，称重并测定放射性计数，经放射性衰变校正后计算标准吸收值（SUV）和每克组织的百分注射剂量率（%ID/g），结果如表5和图10所示。
表5小鼠各组织在注射示踪剂后的放射性计数
Figure DEST_PATH_IMAGE012
实验结果显示在注射放射性多肽68Ga-DOTA-PG01 0.5h和1h后，其在肾脏的放射性沉积最高，肝脏次之，表明放射性多肽68Ga-DOTA-PG01主要通过肾脏和肝胆途径代谢。
实施例7：放射性多肽68Ga-DOTA-PG01在荷瘤鼠中的PET/CT显像应用
取实施例6所述荷瘤小鼠6只，分为两组，一组为实验组，一组为阻断组，每组3只小鼠。实验组直接尾静脉注射约37MBq 的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01，阻断组注射克唑替尼1h后尾静脉注射约37MBq的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01。注射放射性多肽68Ga-DOTA-PG01后1h麻醉荷瘤小鼠行PET/CT显像，三维模式采集20 min静态图像。采用OSEM3D/MAP法重建，获得衰减校正后的PET/CT融合图像。观察实验组肿瘤成像情况，并对照抑制组结果验证放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的靶向特异性，结果如图11所示。
实验结果显示实验组肿瘤部位有明显的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01放射性摄取，抑制组肿瘤的放射性沉积显著降低；表明放射性多肽68Ga-DOTA-PG01特异性靶向ALK融合蛋白，可以用于ALK融合蛋白高表达肿瘤的显像、疗效监测等。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (10)

1.一种靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01，其特征在于，通过生物偶联技术将环状多肽PG01 N端的氨基与偶联剂DOTA-NHS进行缩合反应，得到多肽偶联物DOTA-PG01；所述多肽偶联物DOTA-PG01中的螯合剂DOTA与68Ga螯合，构建靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01；
所述放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的结构式如下所示：
Figure 585262DEST_PATH_IMAGE001
；
所述靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的氨基酸序列为：
Thr-cyclo(Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys)-Phe，
其中，环状结构由Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys通过两个半胱氨酸之间形成二硫键成环。
2.根据权利要求1所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG
01，其特征在于，所述DOTA-PG01的结构式如下所示：
Figure 627037DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求1-2任一项所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用固相合成法，合成DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列；
（2）将步骤（1）制备得到的多肽序列进行环化及纯化，得到多肽偶联物DOTA-PG01；其中，环状结构通过两个半胱氨酸的巯基缩合形成二硫键；
（3）对多肽偶联物DOTA-PG01进行68Ga标记，得到靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01。
4.根据权利要求3所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG
01的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的执行过程为：
以Rink amide-MBHA resin树脂为起始树脂、Fmoc-Phe为原料，采用DIPEA/HBTU/HOBT缩合体系固相法合成DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cy
s-Phe多肽树脂，再用TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液从该多肽树脂上裂解DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列；
上述过程的具体流程包括：
用哌啶DMF溶液脱去Rink amide-MBHA resin树脂上的氨基保护基，洗涤所述树脂，用含有DIPEA /乙酸酐的DCM溶液封闭所述树脂上未反应的位点；
除去溶剂、再洗涤所述树脂后，连接Fmoc-Phe，获得Fmoc-Phe-MBHA树脂序列；
脱去Fmoc-Phe-MBHA树脂序列上的Fmoc保护基团，按照从羧基端到氨基端的顺序对氨基酸序列Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe依次重复脱保护并在DIPEA/HBTU/HOBT缩合体系中进行缩合反应，直至多肽序列全部偶联到Fmoc-Phe-MBHA树脂序列上，获得Fmoc-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂；
然后脱去Fmoc-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂上的Fmoc保护基团，连接偶联剂DOTA-NHS，获得DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂；
最后采用TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液从树脂上裂解多肽，得到DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列。
5.根据权利要求4所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG
01的制备方法，其特征在于，所述缩合反应中各反应物的物质的量比例为Fmoc-Phe：DIPEA：HOBT：HBTU：Rink amide-MBHA resin = 3.5：7：4：4：1。
6.根据权利要求4所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG
01的制备方法，其特征在于，所述TFA/TIS/PhOH/Thioanisole/H2O裂解液中各组分的体积比为TFA：TIS：PhOH：Thioanisole：H2O=30：2：2：1：1，所述DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽树脂和裂解液的质量比为1：（10~15）。
7.根据权利要求4所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG
01的制备方法，其特征在于，所述DOTA-Thr-Cys-D-Trp-Thr-Lys-Tyr-Cys-Phe多肽序列制备中反应物Rink amide-MBHA resin树脂、DOTA-NHS和DIPEA的物质的量之比为（2~2.5）：（8~10）：1。
8.根据权利要求3所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体流程如下：
将多肽偶联物DOTA-PG01溶解于NaOAc缓冲液中，向该DOTA-PG01溶液中加入[68Ga]GaCl3溶液，在45~60℃反应15~20 min，得到靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01；
其中，所述NaOAc缓冲液的浓度为0.1M，pH为4.0~4.6；所述DOTA-PG01溶液的浓度为20~25uM，所述[68Ga]GaCl3溶液为0.01N HCl淋洗出来的溶液。
9.根据权利要求8所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01的制备方法，其特征在于，所述DOTA-PG01溶液和[68Ga]GaCl3溶液的体积比为（0.6~1.5）：1。
10.根据权利要求1或2所述的靶向ALK融合蛋白的放射性多肽68Ga-DOTA-PG01作为示踪剂在肿瘤显像中的应用。
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