CN115433219B

CN115433219B - 一种具有光动力学性质的极性荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115433219B
Application number: CN202211166940.9A
Authority: CN
Inventors: 张玲; 吕雳; 陈默函; 薛运生; 李铮; 王淑婉; 徐晨蕾; 匡磊
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-09-23
Also published as: CN115433219A

Abstract

本发明涉及一种具有光动力学性质的极性荧光探针及其制备方法和应用，其极性荧光探针的结构式如下，不仅可以实现肿瘤细胞及活体水平的肿瘤组织的荧光成像，能够利用极性引起的荧光信号差异来区分健康细胞与肿瘤细胞，实现了在活体水平肿瘤组织的特异性成像；也可产生单线态氧，具有光动力治疗性质，可以有效地抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞凋亡，在裸鼠移植瘤模型发挥了较好的抗肿瘤活性。

Description

一种具有光动力学性质的极性荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有光动力学性质的极性荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

细胞极性是细胞微环境中一项重要参数，表现为细胞中极性蛋白复合物与其它极性生物分子的有序排列。细胞极性的稳定是细胞生命活动的重要保障，如细胞的***、分化、增殖等。研究表明，癌症在发生发展的过程伴随细胞极性降低，例如，表达极性分子的基因Par6突变导致上皮细胞极性的破坏；参与细胞极性调节的LKB1激酶缺失，会破坏乳腺上皮细胞极性，加剧肿瘤转移和侵袭；非典型细胞外因子/平面细胞极性(Wnt/PCP)通路信号蛋白VANGL2在基底乳腺癌组织中过表达等。这些研究揭示了，细胞极性降低是肿瘤细胞的重要特征与标志。荧光成像引导的精确光动力治疗 (photodynamic therapy，PDT)策略，可以通过肿瘤细胞的特异性荧光响应信号引导光源精确照射肿瘤区域，从而对肿瘤进行精确治疗。目前，已开发了多种基于肿瘤微环境(弱酸、过表达的酶、GSH 等)的荧光成像与PDT结合的荧光探针，但具有PDT功能的极性荧光探针尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种具有光动力学性质的极性荧光探针HBT-CUR，不仅可以实现肿瘤细胞及活体水平的肿瘤组织的荧光成像，能够利用极性引起的荧光信号差异来区分健康细胞与肿瘤细胞，实现了在活体水平肿瘤组织的特异性成像；也可产生单线态氧，具有光动力治疗性质，可以有效地抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞凋亡，在裸鼠移植瘤模型发挥了较好的抗肿瘤活性。

本发明的另一个目的是提供上述极性荧光探针的制备方法。

本发明的又一发明目的是提供上述极性荧光探针具有荧光成像诊断、发挥光动力治疗效果的医药用途，特别是体内外肿瘤细胞和组织的荧光成像诊断和/或治疗。

本发明的技术方案如下：

一种具有光动力学性质的极性荧光探针(HBT-CUR)，其探针的结构式如下所示：

本发明提供的极性荧光探针(HBT-CUR)构思，主要包括以下几点：(1)优良的荧光团骨架的构建：以2-(2′-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)为ESIPT荧光团骨架及电子供体基团(Donor)，以较强的缺电子基团二氟硼酸酯结构作为电子受体基团(Acceptor)，构建具有D-π-A共轭结构分子；(2)极性敏感基团：引入二氟硼酸酯结构作为极性敏感基团；(3)探针光敏性质的设计：分子结构中具有较强的分子内电荷转移(ICT)效应，强的ICT作用会提高其激发态电子转移的效率，从而增强单线态氧的产率。

在本发明中，具有光动力学性质的极性荧光探针的制备方法，它包括如下步骤：

进一步地，具有光动力学性质的极性荧光探针的制备方法，它包括以下更详细的步骤：

(1)在氢氧化钠存在的条件下，化合物a与2-氨基苯硫酚进行化学反应制备中间体HBT-1；

(2)在三氟乙酸存在的条件下，中间体HBT-1与六亚甲基四胺进行化学反应制备中间体HBT-2；

(3)在氮气保护下，化合物b与三氟化硼***进行化学反应制备中间体C-1；

(4)在哌啶存在的条件下，中间体HBT-2与中间体C-1进行化学反应制备极性荧光探针HBT-CUR。

对于本发明而言，在步骤(1)中，化合物a与2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:1～3，可以但不局限于 1:1、1:1.3、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8或1:3，为了获得更好的效果，化合物a与2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:2。

在步骤(1)中，化合物a与氢氧化钠的摩尔比为1:5～10，可以但不局限于1:5、1:5.5、1:6、1:16.5、 1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9或1:10，为了获得更好的效果，化合物a与氢氧化钠的摩尔比为1:8。

在步骤(1)中，反应温度为80～100℃，可以但不局限于80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，为了获得更好的效果，反应温度为90℃。

进一步地，反应时间为1～3h，优选为1h。

在步骤(2)中，中间体HBT-1与六亚甲基四胺的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、 1:0.95、1:1、1:1.05、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体HBT-1与六亚甲基四胺的摩尔比为1:1。

在步骤(2)中，中间体HBT-1与三氟乙酸的质量体积比为40～50:1mg/ml，可以但不局限于40:1mg/ml、43:1mg/ml、45:1mg/ml、45.3:1mg/ml、45.4:1mg/ml、45.6:1mg/ml、48:1mg/ml或50:1mg/ml，为了获得更好的效果，中间体HBT-1与三氟乙酸的质量体积比为45.4:1mg/ml。

在步骤(3)中，化合物b与三氟化硼***的摩尔比为1:1～3，可以但不局限于1:1、1:1.3、1:1.5、 1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8或1:3，为了获得更好的效果，化合物b与三氟化硼***的摩尔比为1:2。

在步骤(4)中，中间体HBT-2与中间体C-1的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、 1:0.95、1:1、1:1.05、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体HBT-2与中间体C-1的摩尔比为1:1。

在步骤(4)中，中间体HBT-2与哌啶的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、 1:1、1:1.05、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体HBT-2与哌啶的摩尔比为1:1。

本发明提供的荧光探针作为光敏剂可用于检测细胞极性中，不仅可以实现肿瘤细胞及活体水平的肿瘤组织的荧光成像，能够利用极性引起的荧光信号差异来区分健康细胞与肿瘤细胞，实现了在活体水平肿瘤组织的特异性成像。

本发明提供的荧光探针作为光敏剂可用于肿瘤的光动力肿瘤治疗中，具有光动力治疗性质，产生单线态氧，可以有效地抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞凋亡，在裸鼠移植瘤模型发挥了较好的抗肿瘤活性。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供的具有光动力学性质的极性荧光探针(HBT-CUR)，不仅可以实现肿瘤细胞及活体水平的肿瘤组织的荧光成像，能够利用极性引起的荧光信号差异来区分健康细胞与肿瘤细胞，实现了在活体水平肿瘤组织的特异性成像；也可产生单线态氧，具有光动力治疗性质，可以有效地抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞凋亡，在裸鼠移植瘤模型发挥了较好的抗肿瘤活性。

极性荧光探针(HBT-CUR)荧光量子产率及最大发射波长在不同极性溶剂中发生明显变化(在甲苯溶液中Φ_f＝0.189，λ_em＝600nm；在DMSO溶液中Φ_f＝0.035，λ_em＝666nm)，能高选择性、高灵敏地检测极性变化，并且具有良好的抗光漂白性、结构稳定性与可见光稳定性；同时探针还具有优异的光敏性能，单线态氧产率Φ_Δ可以达到0.70。

探针HBT-CUR能在肿瘤细胞(4T1、MCF-7、HepG2、MDA-MB-231、786-o)低细胞极性环境中产生较强的荧光信号，而在健康细胞(HK-2、MCF-10A)中仅有微弱的荧光信号，利用极性的差异来区分肿瘤细胞与健康细胞。

探针还可以通过PDT方式，产生活性氧(ROS)促使肿瘤细胞凋亡。探针能特异性成像活体水平的肿瘤组织，且荧光信号稳定，适合长时间成像(6h)；在活体水平肿瘤组织的光动力治疗显示，给予探针结合光照治疗后，MCF-7裸鼠移植瘤模型的肿瘤体积明显减小，表明探针具有良好的抗肿瘤活性。

附图说明

图1是探针HBT-CUR的设计原理示意图；其中，图1中的英文对应的中文如下：donor代表供体；acceptor代表受体；low polarity代表低极性；fluorescence iamging代表荧光成像； normal代表正常细胞；cancer cell代表肿瘤细胞；tomor代表肿瘤；light代表光照射；PDT代表光动力学治疗；ICT代表分子内电荷转移；Borate ester代表二氟硼酸酯；HBT代表2-(2′-羟基苯基) 苯并噻唑；

图2是化合物HBT-1的¹H NMR；

图3是化合物HBT-1的¹H NMR；

图4是化合物C-1的¹H NMR；

图5是探针HBT-CUR的¹HNMR图谱；

图6是探针HBT-CUR的¹³CNMR图谱；

图7是探针HBT-CUR的¹⁹FNMR图谱；

图8是探针HBT-CUR的高分辨质谱：[M-H]^-calculated for C₁₉H₁₄BF₂NO₃,384.0677；found, 384.0671.

图9是探针HBT-CUR的吸收光谱与发射光谱；其中，图9中(A)为探针在甲苯(Toluene)、乙醇 (Ethanol)、1,4-二氧六环(Dioxane)、乙腈(Acetonitrile)、甲醇(Methanol)、二氯甲烷(Dichloromethane)、丙酮(Acetone)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(Ethylacetate)、PBS(10mM)中的紫外吸收光谱，在横坐标380nm处，曲线由低到高依次代表PBS(10mM)、乙醇(Ethanol)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(Methanol)、1,4-二氧六环(Dioxane)、乙腈(Acetonitrile)、乙酸乙酯(Ethylacetate)、丙酮(Acetone)、二氯甲烷(Dichloromethane)和甲苯(Toluene)；图9中(B)为探针(10μM)在上述溶剂中的荧光发射光谱，在横坐标630nm处，曲线由低到高依次代表PBS(10mM)、甲醇(Methanol)、乙醇(Ethanol)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈(Acetonitrile)、1,4-二氧六环(Dioxane)、二氯甲烷(Dichloromethane)、甲苯(Toluene)、乙酸乙酯(Ethylacetate)和丙酮(Acetone)；

图10是探针HBT-CUR的检测性能；其中，图10中(A)为HBT-CUR(10μM)在PBS(0％-60％) 溶剂中的吸收光谱，在横坐标380nm处，曲线由低到高依次代表50％PBS、60％PBS、40％PBS、30％PBS、 20％PBS和50％PBS；图10中(B)为HBT-CUR(10μM)在PBS(0％-60％)溶剂中的荧光光谱图，在横坐标600nm处，曲线由低到高依次代表60％PBS、50％PBS、40％PBS、30％PBS、20％PBS和50％PBS；图10中(C)为探针(10μM)在PBS含量0％-60％的溶剂体系中365nm激发下的荧光图；图10中(D) 为荧光强度(10％-60％PBS体系)与极性参数Δf的相关关系R²＝0.991(Ex＝405nm，slit：5nm)；

图11是探针HBT-CUR的稳定性；其中，图11中(A)为HBT-CUR(10μM)在50％PBS与不含PBS 的Dioxane溶液中激发光源连续照射10min的抗光漂白性能(Ex＝405nm，slit：5nm)；图11中(B)为 HBT-CUR(10μM)在50％PBS与不含PBS的Dioxane溶液中37℃条件下放置32h的稳定性；图11中(C) 为HBT-CUR(10μM)在50％PBS与不含PBS的Dioxane溶液中LED灯(100mW/cm²)照射30min的光稳定性(Ex＝405nm，slit：5nm)；

图12是探针HBT-CUR对极性的选择性；其中，图12中(A)为探针HBT-CUR(10μM)在甘油含量由10％增加到50％的PBS溶液中的荧光光谱，代表甘油浓度为由10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％和50％的曲线，相互之间的差异不大，基本重合；图12中(B)为探针HBT-CUR(10μM) 在甘油含量由10％增加到50％的PBS溶液中最大荧光强度值的变化；

图13是探针HBT-CUR对极性的选择性；其中，图13中(A)为探针HBT-CUR(10μM)在pH从4.0 增加到9.0的PBS溶液中的荧光光谱，代表pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 和9.0的曲线，相互之间的差异不大，基本重合；图13中(B)为探针HBT-CUR(10μM)在pH从4.0增加到9.0的PBS溶液中最大荧光强度值的变化；

图14是探针HBT-CUR对极性的选择性；其中，图14中(A)为探针(10μM)与活性氧(O₂ ^·-；H₂O₂； HClO；¹O₂；t-BuOOH；·OH)(100μM)、活性氮(NO₂ ^-；NO₃ ^-；ONOO^-；NO)(100μM)37℃条件下孵育1min后的荧光光谱，所有列举的代表活性氧和活性氮的曲线基本重合；图14中(B)为每组溶液的最大荧光强度值，1.O₂ ^·-(100μM)；2.H₂O₂(100μM)；3.HClO(100μM)；4.¹O₂(100μM)； 5.t-BuOOH(100μM)；6.·OH(100μM)；7.NO₂ ^-(100μM)；8.NO₃ ^-(100μM)；9.ONOO^-(100μM)；10.NO(100μM)；11.Dioxane；

图15是探针HBT-CUR对极性的选择性；其中，图15中(A)为探针(10μM)与活性硫(Na₂S； NaHS；Na₂SO₃；NaHSO₃；CH₃SSSCH₃；CysSSCys；GSSG；S₈；GSH)37℃条件下孵育1min后的荧光光谱，所有列举的代表活性硫的曲线基本重合；图15中(B)为每组溶液的最大荧光强度值，1.Na₂S (100μM)；2.NaHS(100μM)；3.Na₂SO₃(500μM)；4.NaHSO₃(500μM)；5.CH₃SSSCH₃(100μM)；6.CysSSCys(1mM)；7.GSSG(1mM)；8.S₈(500μM)；9.GSH(10mM)；10.Dioxane；

图16是探针HBT-CUR对极性的选择性；其中，图16中(A)为探针(10μM)在金属离子(Sn²⁺； Cd²⁺；Mn²⁺；Co²⁺；Cu²⁺；Hg²⁺；Zn²⁺；Fe²⁺；Ca²⁺；Fe²⁺；Al³⁺；Ni²⁺；Mg²⁺；Li⁺；Na⁺；K⁺；Ag⁺)37℃条件下孵育1min后的荧光光谱，所有列举的代表不同金属离子的曲线基本重合；图16中(B)为每组溶液的最大荧光强度值，1.Sn²⁺(1mM)；2.Cd²⁺(1mM)；3.Mn²⁺(1mM)；4.Co²⁺(1mM)；5.Cu² ⁺ (1mM)；6.Hg²⁺(1mM)；7.Zn²⁺(1mM)；8.Fe²⁺(1mM)；9.Ca²⁺(1mM)；10.Fe³⁺(1mM)；11.Al³⁺(1mM)；12.Ni²⁺(1mM)；13.Mg²⁺(1mM)；14.Li⁺(1mM)；15.Na⁺(1mM)；16.K⁺(1mM)；17.Ag⁺ (1mM)；18.Dioxane；

图17是探针HBT-CUR对极性的选择性；其中，图17中(A)为探针(10μM)在氨基酸(Gly；D-Ala； Val；Ile；L-Cys；L-Thr；Asp；L-Glu；L-Arg；L-Lys；L-His；Hcy；)37℃条件下孵育1min后的荧光光谱，所有列举的代表不同氨基酸的曲线基本重合；图17中(B)为每组溶液的最大荧光强度值，1.Gly (1mM)；2.D-Ala(1mM)；3.Val(1mM)；4.Ile(1mM)；5.L-Cys(1mM)；6.L-Thr(1mM)；7.Asp (1mM)；8.L-Glu(1mM)；9.L-Arg(1mM)；10.L-Lys(1mM)；11.L-His(1mM)；12.Hcy(1mM)； 13.Dioxane；

图18是DCFH-DA体外检测探针HBT-CUR产生活性氧；其中，图18中(A)为探针(10μM)与 DCFH-DA(40μM)的PBS溶液，在光源(LED，100mW/cm²)照射下，525nm处的荧光信号变化；(Ex＝488nm，silt：5)；其中，上方的曲线代表HBT-CUR+DCF-DA，下方的曲线代表 HBT-CUR+DCF-DA+Light；图18中(B)为溶液在365nm激发光下呈现明显的绿色荧光；

图19是DPBF检测探针HBT-CUR乙醇溶液中单线态氧产率；其中，图19中(A)为探针(10μM) 在LED光源(100mW/cm²)下照射1min，吸收光谱的变化，代表时间为60s、50s、40s、30s、20s、10s 和0s的曲线，相互之间的差异不大，基本重合；图19中(B)为DPBF(100μM)在光源下照射1min，吸收光谱的变化，代表时间为60s、50s、40s、30s、20s、10s和0s的曲线，相互之间的差异不大，基本重合；图19中(C)为探针(10μM)与DPBF(100μM)在光源下照射1min，吸收光谱的变化，在横坐标400nm处，曲线由低到高依次代表60s、50s、40s、30s、20s、10s和0s；图19中(D)为Rose bengal (10μM)与DPBF(100μM)在光源下照射1min，吸收光谱的变化，在横坐标400nm处，曲线由低到高依次代表60s、50s、40s、30s、20s、10s和0s；图19中(E)为探针(10μM)与DPBF(100μM)的乙醇溶液体系在410nm处的吸光度随时间变化的线性关系(R²＝0.991)；图19中(F)为Rose bengal(10 μM)与DPBF(100μM)的乙醇体系在410nm处的吸光度随时间变化的线性关系(R²＝0.999)；

图20是MTT法测HBT-CUR的细胞毒性；其中，图20中(A)为4T1，786-o，HepG 2，MCF-7， MDA-MB-231，HK-2，MCF-10A细胞与不同浓度的探针HBT-CUR(0，2.5，5，10，20μM)孵育24h细胞存活率，在图中5组柱形图中，每一组柱形图中从左到右依次代表4T1，786-o，HepG 2，MCF-7， MDA-MB-231，HK-2，MCF-10A细胞；图20中(B)为4T1，786-o，HepG2，MCF-7，MDA-MB-231， HK-2，MCF-10A细胞与探针HBT-CUR(5μM)孵育不同时间(0，6，12，24，48h)的细胞存活率，在图中5组柱形图中，每一组柱形图中从左到右依次代表4T1，786-o，HepG 2，MCF-7，MDA-MB-231， HK-2，MCF-10A细胞；

图21是探针HBT-CUR的生物相容性荧光成像：探针(5μM)与MCF-7细胞孵育不同时间(0，5， 10，15，20min)，随后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色5min，共聚焦成像；探针呈红色荧光，DAPI呈蓝色荧光；(Channel1：λ_ex＝405nm，λ_em＝405-500nm；Channel2：λ_ex＝405nm，λ_em＝600-700 nm；Scale bar：40μm)；

图22是探针HBT-CUR的亚细胞器共定位荧光成像：探针(5μM)与MCF-7细胞孵育20min后荧光成像；然后分别用Lyso-Tracker Green DND-26(66.7nM)、ER-Tracker Green(1μM)、Golgi-Tracker Green(NBD C6-ceramide,3μM)和Mito-Tracker Green FM(200nM)染色；第4列图为染料与探针的强度相关关系图；第5列为固定横截面的荧光强度分析，在第5例第一行中，在横坐标数值为0.5 处，上方的曲线代表Lyso Green，下方的曲线代表HBT-CUR，第5例第二行中，在横坐标数值为1 处，上方的曲线代表ER-Tracker，下方的曲线代表HBT-CUR；第5例第三行中，在横坐标数值为0.5 处，上方的曲线代表GiTracker，下方的曲线代表HBT-CUR；第5例第四行中，在横坐标数值为1.4 处，上方的曲线代表Mito Green，下方的曲线代表HBT-CUR；(Red channel:λ_ex＝405nm,λ_em＝650-750 nm；green channel:λ_ex＝488nm,λ_em＝490-550nm Scale bar：40μm)；

图23是探针HBT-CUR对不同细胞株的极性检测；探针(5μM)分别与不同细胞株在37℃条件下孵育20min后，激光共聚焦成像，其中，图23中(A)为4T1；图23中(B)为MCF-7；图23中(C)为HepG2；图23中(D)为MDA-MB-231；图23中(E)为786-o；图23中(F)为HK-2；图23中(G)为MCF-10A；图23中(H)为上述图23中(A)-(G)共7组细胞中的相对荧光强度，数据以Mean±SD表示(n＝3)，实验将细胞分组(786-o vs HK-2；MCF-7、MDA-MB-231及4T1 vs MCF-10A)采用t检验进行组间统计学差异分析，***表示p<0.001；(λ_ex＝405nm，λ_em＝600-700nm，Scalebar：40μm)；

图24是流式细胞术测定探针(5μM)在肿瘤细胞(4T1，MCF-7，HepG2，MDA-MB-231，786-o) 与正常细胞(HK-2，MCF-10A)中的平均荧光强度；图24中(A)为细胞平均荧光强度；图24中(B) 为上述7组细胞中的相对荧光强度(n＝3)，实验数据Mean±SD表示，实验将细胞分组(786-o VS HK-2； 4T1、MCF-7与MDA-MB-231VS MCF-10A)采用t检验进行组间统计学差异分析，***表示p<0.001；

图25是钙黄绿素(Calcein AM)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡染色(PDT促进细胞凋亡的时间)；探针(5μM)与细胞孵育20min后，在LED(100mW/cm²)照射25min，每隔5min进行一次荧光成像；(Calcein AM：λ_ex＝488nm，λ_em＝500-550nm；PI：λ_ex＝561nm，λ_em＝590-640nm，Scalebar：100μm)；

图26是钙黄绿素(Calcein AM)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡染色荧光成像；Control：MCF-7细胞； Light：MCF-7细胞LED光源照射；HBT-CUR：探针(5μM)与细胞孵育20min，避光处理； HBT-CUR+Light：探针(5μM)与细胞孵育20min后，LED光源照射；(Calcein AM：λ_ex＝488nm，λ_em＝500-550nm；PI：λ_ex＝561nm，λ_em＝590-640nm，Scale bar：100μm)；

图27是DCFH检测细胞中产生的活性氧；HBT-CUR+Light：探针(5μM)与MCF-7细胞孵育20min 后，采用LED(100mW/cm²)光照25min；Control：MCF-7细胞不做任何处理；HBT-CUR：探针(5μM) 与MCF-7细胞孵育20min，且避光处理；Light：MCF-7细胞LED(100mW/cm²)光照；上述各自细胞不同处理后，加入DCFH(10μM)进行共聚焦荧光成像；(λ_ex＝488nm，λ_em＝490-550nm，Scale bar： 40μm)；

图28是探针HBT-CUR在活体水平肿瘤组织的极性检测；其中，图28中(A)荷瘤小鼠瘤内注射100 μL探针(终浓度1mM,生理盐水：DMSO＝9:1v/v)，(0min，1min，5min，10min，20min，40min， 60min，80min，120min，6h，12h，24h，48h)的荧光成像；图28中(B)荷瘤小鼠瘤内注射100μL 溶剂(生理盐水：DMSO＝9:1v/v)，(0min，1min，5min，10min，20min，40min，60min，80min， 120min，6h，12h，24h，48h)的荧光成像；图28中(C)荷瘤小鼠瘤内注射探针后，120min内的荧光强度值，数据Mean±SD表示(n＝6)；图28中(D)荷瘤小鼠瘤内注射探针后，(6h，12h，24h， 48h)时间点的荧光强度值，数据Mean±SD表示(n＝6)；

图29是探针HBT-CUR的活体水平荧光成像；对照：以右侧腋下正常组织与左侧腋下肿瘤组织中注射100μL的空白溶剂(生理盐水：DMSO＝9:1溶液，v/v)；其中，图29中(A)为小鼠右侧正常组织成像；其中，图29中(B)为小鼠左侧肿瘤组织成像；HBT-CUR：右侧腋下正常组织与左侧腋下肿瘤组织中注射100μL的探针(1mM，生理盐水：DMSO＝9:1，v/v)；图29中(C)为小鼠右侧正常组织成像；图29中(D)为小鼠左侧肿瘤组织成像；图29中(E)为对瘤内注射探针的荷瘤小鼠肿瘤组织的荧光信号强度与同只正常组织中荧光信号强度(n＝6)，***表示p<0.001；

图30是活体水平不同光源治疗方案的研究，每组小鼠均采用瘤内注射100μL的探针(1mM，生理盐水：DMSO＝9:1，v/v)，Control不给与外源光照射，其它各组分别给予300mW/cm²功率光源、500 mW/cm²功率光源、1W/cm²功率LED灯照射，每日照射30min；其中，图30中(A)为荷瘤小鼠14天内的体重变化；其中，图30中(B)为荷瘤小鼠14天内的肿瘤体积变化；其中，图30中(C)为14天后将小鼠处死，剖离肿瘤组织对比图；

图31是探针在活体水平上的肿瘤治疗，HBT-CUR+Light：荷瘤小鼠采用瘤内注射100μL的探针(1 mM，生理盐水：DMSO＝9:1，v/v)，每两天注射一次，每日用LED(300mW/cm²)光源照射30min 处理；Light：给予每日30min的光照，注射100μL空白溶剂；HBT-CUR：注射100μL的探针(1mM) (每两天一次)，避光处理；Control：荷瘤小鼠自然生长。各组进行为期14天的治疗过程；其中，图31 中(A)为荷瘤小鼠14天内的体重变化；图31中(B)为荷瘤小鼠14天内的肿瘤体积变化；图31中(C) 为14天后处死小鼠，解剖出的肿瘤质量，并对组间采用t检验进行显著性差异分析，***代表p<0.001；图31中(D)为治疗14天后，荷瘤小鼠右侧腋下肿瘤组织拍照；a.Control；b.Light；c.HBT-CUR； d.HBT-CUR+Light；图31中(E)为14天后处死小鼠，解剖出的肿瘤相机拍照；图31中(F)为14天后处死小鼠，解剖出的肿瘤组织的H&E染色；a.Control；b.Light；c.HBT-CUR；d.HBT-CUR(Scale bar： 50μm)；

图32是Control、Light、HBT-CUR、HBT-CUR+Light不同处理组的荷瘤小鼠治疗14天后，心脏组织、肝组织、脾脏组织、肺组织、肾脏组织的H&E染色(Scale bar：50μm)。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的极性荧光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

一、实施方法

1、溶液配制

探针溶液的配制：将HBT-CUR(3.85mg，0.01mmol)溶解于1.0mL的二甲基亚砜溶液中，配成10.0mM的探针溶液。

谷胱甘肽(GSH)储备液的配置：将GSH(30.70mg，0.10mmol)溶于去离子水(10.0mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和10.0mM的溶液备用。

L-半胱氨酸(L-Cys)储备液的配置：将Cys(12.10mg，0.10mmol)溶于去离子水(10.0mL) 中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和10.0μM的溶液备用。

同型半胱氨酸(Hcy)储备液的配置：将Hcy(13.50mg，0.10mmol)溶于去离子水(10.0mL) 中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和10.0μM的溶液备用。

其他物质(Gly,D-Ala,Val,Ile,L-Thr,Asp,L-Glu,L-Arg,L-Lys,L-His等)储备液配置方法同上。

ONOO^-；O₂ ^·-；H₂O₂；HClO；¹O₂；t-BuOOH；·OH；Na₂S；NaHS；CH₃SSSCH₃；CysSSCys；GSSG；S₈；Na₂SO₃；NaHSO₃；NO₂ ^-；NO₃ ^-；NO；Sn²⁺；Cd²⁺；Mn²⁺；Co²⁺；Cu²⁺；Hg²⁺；Zn²⁺；Fe²⁺； Ca²⁺；Fe³⁺；Al³⁺；Ni²⁺；Mg²⁺；Li⁺；Na⁺；K⁺；Ag⁺都以双蒸水做溶剂。·OH通过FeII(EDTA)与 H₂O₂之间的Fenton反应获得。NO从3-(氨基丙基)-1-3-羟基-3-异丙基-2-氧代-1-三氮烯(NOC-5,50 μmol/ml)产生。

以上所有配制溶液均现配现用。

2、细胞

种属品系：MCF-7(人乳腺癌细胞株)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞株)、HepG 2(肝癌细胞株)、 4T1(小鼠乳腺癌细胞株)、786-o(人肾透明细胞癌细胞株)、HK-2(人肾皮质近曲小管上皮细胞)、 MCF-10A(乳腺上皮细胞)。来源：中国科学院细胞库、上海富衡科技有限公司。

3、实验动物

种属品系：健康雌性Balb/C裸鼠，体重20-25g。来源：常州卡文斯实验动物有限公司。

二、实验方法

2.1探针HBT-CUR合成

以三氟甲基苯酚(化合物a)为原料与2-氨基苯硫酚反应合成化合物HBT-1，然后经Duff反应合成HBT-2。以乙酰丙酮(化合物b)为原料合成C-1。C-1与HBT-2在哌啶条件下，经Knoevenagel缩合生成极性荧光探针HBT-CUR。探针HBT-CUR的设计原理如图1所示。

2.1.1化合物HBT-1的合成

将2-(三氟甲基)苯酚(162.1mg，1.0mmol)，2-氨基苯硫酚(260.9mg，2.0mmol)和1mol/L NaOH(8.0mL)的混合物在氮气保护下加热至90℃，反应1h。冷却至室温后，将混合物用1mol/L HCl (8.0mL)调节pH至7，产生黄色沉淀。过滤，用水(3×10.0mL)洗涤滤饼，然后将滤饼在甲醇(8.0 mL)中重结晶(65℃回流，冷却结晶)，得到白色固体状(R_f＝0.6，PE/EA＝20:1,v/v)产物132.0g，产率60.2％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(d,J＝8.0Hz,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.0 Hz,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.37-7.43(m,2H),7.11(d,J＝8.0Hz,1H),6.96(t,J＝8.0Hz,1H).如图 2所示。LC-MS Found[M-H]^-:226.2.

2.1.2HBT-2的合成

将HBT-1(454.0mg，2.0mmol)溶于10.0mL三氟乙酸中，加入六亚甲基四胺(280.0mg，2.0mmol)，回流反应5h。然后将反应混合物冷却至室温并用1mol/L NaOH调节pH＝7，有黄色沉淀生成。用饱和盐水洗涤滤饼，烘干，产物为黄色固体。TLC监测(R_f＝0.5，PE/EA＝20:1，v/v)。产物210.0mg，产率40.3％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ10.53(s,1H),8.05-8.13(m,2H),7.93(t,J＝8.0Hz,2H),7.56(t, J＝8.0Hz,1H),7.46(t,J＝8.0Hz,1H),7.10(t,J＝8.0Hz,1H).LC-MS Found[M-H]^-:254.0.如图3所示。

2.1.3C-1的合成

氮气保护下，将化合物b(100.1mg,1.0mmol)与三氟化硼***(284.1mg，2.0mmol)混合后室温反应12h，产物析出透明针尖状结晶，抽滤，水洗3次晾干。TLC(R_f＝0.6，PE/EA＝5:1，v/v)产物 133.2mg，产率90.4％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ5.97(s,1H),2.03(s,6H).LC-MS Found[M+Na]⁺: 171.0.如图4所示。

2.1.4极性荧光探针HBT-CUR合成

将HBT-2(255.1mg，1.0mmol)与C-1(141.1mg，1.0mmol)溶于20.0mL无水乙醇，加入哌啶(544.6mg，1.0mmol)，回流反应6h，产物析出橙黄色沉淀，抽滤，无水乙醇冲洗三次。TLC监测(R_f＝0.6，PE:EA＝1:1，v/v)。产物115.0mg，产率29.1％。¹HNMR(400MHz,DMSO-D₆)δ8.32(d,J ＝16.0Hz,1H),8.24(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(d,J＝8.0Hz,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.0Hz, 1H),7.62(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),7.54(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),7.34(d,J＝16.0Hz,1H),7.18(t,J＝8.0Hz, 1H),6.56(s,1H),2.41(s,3H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-D₆)δ＝193.4,180.6,168.7,157.6,151.2,142.0, 133.8,133.0,132.9,127.8,126.8,123.1,123.0,122.6,122.2,121.0,118.1,102.5,24.7ppm.¹⁹FNMR(376 MHz,CDCl₃)δ-136.10ppm.相关谱图见图5-8。

2.2探针HBT-CUR的吸收光谱与发射光谱的测定

2.2.1探针在不同溶剂中的紫外吸收光谱的测定

紫外光谱采用UV-2401PC紫外可见分光光度计测定。将探针加入石英比色皿中，加入10种不同的溶剂将其稀释成10μM，进行紫外吸收光谱的测定。

2.2.2探针在不同溶剂中的荧光光谱的测定

将探针HBT-CUR溶于10种不同的溶剂中，配置成10μM的待测样品溶液，进行荧光光谱的测定。每组数据至少平行测定三次。结果以mean±SD表示。荧光分光光度计测试条件：对于探针HBT-CUR，激发波长为405nm，激发狭缝宽度5nm，发射狭缝宽度5nm，扫描速度1200nm/min，发射光谱范围在405-800nm。光电倍增管的电压设为600V。

2.3探针HBT-CUR在不同溶剂中的荧光量子产率的测定

实验选用相对法测定探针在不同溶剂中的荧光量子产率^[104-105]，参比物质选用硫酸奎宁，计算公式：

Φ_x＝Φ_s(A_sF_x/A_xF_s)(n_x/n_s)²

Φ：荧光量子产率

A：激发波长处的吸光度

F：校正后的荧光光谱曲线下积分面积

n：溶剂折射率

2.4探针HBT-CUR的检测性能

将探针HBT-CUR母液分别用含PBS(0-60％)的Dioxane-PBS溶剂体系稀释成10μM，分别进行紫外吸收光谱与荧光发射光谱的测定，并绘制最大发射波长处荧光强度与溶剂极性参数Δf的相关关系图。不同溶剂极性参数Δf采用Lippert Mataga公式计算：

表1二元混合溶剂的极性参数表

ε_mix＝f_aε_a+f_bε_b (1)

ε：溶剂的介电常数

f:占总溶剂体系的百分比

n:溶剂的折射率

2.5探针HBT-CUR的稳定性检测

2.5.1探针的稳定性

将探针母液分别用Dioxane与50％Dioxane-PBS溶剂稀释成10μM，两组样品同时在37℃分别保存2,4,8,16,32h测定其荧光光谱。

2.5.2探针的抗光漂白性

将探针母液分别用含水量为50％与不含水的Dioxane溶剂稀释成10μM，两组样品在相同条件下连续扫描10min，测定每一分钟时间点的荧光光谱。

2.5.3探针的可见光稳定性

将探针母液分别用Dioxane与50％Dioxane-PBS溶剂稀释成10μM，两组样品同时在100mW/cm²的白光光源下照射30min，每隔5min测定一次荧光光谱。

2.6探针HBT-CUR的活性氧检测

将DCFH-DA活化，即称取DCFH-DA溶于DMSO配制成1mM的母液。取母液0.5mL加入到2mL 0.01M的氢氧化钠水溶液中，溶液混匀后于室温静置30min使其充分水解活化，然后水解产物中加入10mL磷酸钠缓冲溶液(10mM)调pH为7.4，负20℃避光储存。

将探针HBT-CUR(10mM)取1μL加入到2mL的已活化的DCFH溶液中，用LED(100mW/cm²) 光源照射1min后，用荧光分光光度计测定其发射光谱。激发波长为488nm，激发狭缝宽度5nm，发射狭缝宽度5nm。

2.7探针HBT-CUR的单线态氧产率的测定

以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为¹O₂捕集剂，玫瑰红为标准参照物(Φ_Δ＝0.75)，在室温下测定了探针HBT-CUR的单线态氧量子产率(Φ_Δ)。HBT-CUR溶解在含有20μM DPBF的1.0mL甲醇中。每个制备好的溶液用100mW/cm²的LED灯照射1min，时间间隔为10s，测定其紫外吸收光谱，当测试溶液中HBT-CUR与玫瑰红具有相同的OD值时，根据下面公式计算出单线态氧量子产率：

Φ_Δ:单线态氧产率

K:DPBF在410nm处的吸光度降解速率

2.8探针HBT-CUR细胞毒性测试

采用MTT法测定探针HBT-CUR的细胞毒性。将MCF-7，HepG 2，MDA-MB-231，4T1，786-o， HK-2，MCF-10A细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板，放入5％CO₂培养箱进行培养，培养至细胞进入对数生长期，除去培养液，将细胞分别与不同浓度的HBT-CUR孵育48h。以不加入 HBT-CUR的细胞作为对照。24h，每个孔中加入20μL MTT染料(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物，5mg/mL，溶于PBS缓冲液中)，继续在37℃条件下孵育4小时。随后除去剩余的 MTT溶液，每孔中加入150μL的DMSO以溶解甲瓒结晶。摇床震荡10min后，用酶标仪测量570nm 的吸光度。每个样品重复三次，整个实验重复三次。

2.9细胞培养、细胞的荧光成像

将MCF-7(DMEM高糖培养基)，HepG 2(DMEM高糖培养基)，MDA-MB-231(DMEM高糖培养基)，4T1(DMEM/F12高糖培养基)，786-o(1640高糖培养基)，HK-2(低糖培养基)，MCF-10A(专用特殊培养基)细胞接种于含10％的胎牛血清的细胞培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。生长至对数期，用胰酶消化，接种于共聚焦专用皿中。

2.9.1细胞摄取成像

除去细胞培养液，加入PBS清洗2次。将探针HBT-CUR(终浓度5μM)加入共聚焦皿中与细胞孵育20min，除去培养基，PBS清洗2次。加入600μL的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，PBS 清洗2次。加入500μL的DAPI染液，染色10min后，除去DAPI染液，PBS清洗2次，加入1.0mL 的新鲜的不完全培养基，进行共聚焦荧光成像。

通道1(蓝色荧光通道)的激发波长为405nm，发射波长范围为420-470nm；通道2(红色荧光通道)的激发波长为405nm，发射波长范围为600-700nm。采用徕卡软件(Lecia)进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。

2.9.2细胞共定位成像

除去细胞培养液，加入PBS清洗2次。将配制好的ER-Tracker Green/Lyso-TrackerGreen/Mito-Tracker Green/Golgi-Tracker Green工作液分别与细胞在37℃、5％CO₂中孵育15-30min，除去工作液，PBS清洗2次。将含探针HBT-CUR(终浓度5μM)的不完全培养基加1.0mL于共聚焦皿中与细胞孵育20min，除去培养基，PBS清洗2次。加入1.0mL的新鲜的不完全培养基，进行共聚焦荧光成像。

通道1(绿色荧光通道)的激发波长为488nm，发射波长范围为500-550nm；通道2(红色荧光通道)的激发波长为405nm，发射波长范围为600-700nm。采用徕卡软件(Lecia)进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。

2.9.3细胞共聚焦成像

除去细胞培养液，加入PBS清洗2次。将探针HBT-CUR(终浓度5μM)加入共聚焦皿中与细胞孵育20min，除去培养基，PBS清洗2次。加入1.0mL的新鲜的不完全培养基。进行共聚焦荧光成像。

通道1(红色荧光通道)的激发波长为405nm，发射波长范围为600-700nm。采用徕卡软件(Lecia) 进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。

2.9.4细胞水平荧光强度定量检测

将细胞以100,000个/孔接种于六孔板中，37℃、5％CO₂培养至细胞贴壁。将探针HBT-CUR(终浓度5μM)加入孔板中与细胞孵育20min，除去培养基，PBS清洗2次。加入1.0mL胰酶消化，用 PBS重悬后，移液枪吸500μL置于流式管进行检测。

通道(PerCP)的激发波长为488nm，发射波长为675nm。采用FlowJo10.6.2进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。

2.9.5细胞凋亡染色

将细胞以100,000个/孔接种于六孔板中，37℃、5％CO₂培养至细胞贴壁。将探针HBT-CUR(终浓度5μM)与配制好的钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein Am/PI)工作液(1.0mL)加入孔板中，再与细胞孵育20min后，用100mW/cm²的LED灯照射25min，用荧光显微镜进行成像。

通道1(绿色通道)的激发波长为405nm，发射波长为455nm。通道2(红色通道)的激发波长为488nm，发射波长为590nm。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。

2.9.6细胞中ROS检测荧光成像

除去细胞培养液，加入PBS清洗2次。将探针HBT-CUR(终浓度5μM)与配制好的DCFH-DA 工作液1.0mL加入共聚焦皿中与细胞孵育20min后，用100mW/cm²的LED灯照射25min。

通道1(绿色荧光通道)的激发波长为488nm，发射接收波长为500-550nm。采用徕卡软件(Lecia) 进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。

2.10动物饲养

健康雌性Balb/C裸鼠，体重20-25g，由常州卡文斯实验动物公司提供。所用动物协议由徐州医科大学动物保护和使用委员会批准，进行的动物实验符合中国法律在使用实验动物的规定。实验前应该提前一周使动物熟悉环境，置于自然昼夜节律光照条件下分笼群养，温度为22±2℃，湿度为50± 10％。

2.11裸鼠移植瘤模型的建立

将MCF-7细胞培养至生长对数期，消化，生理盐水重悬，细胞计数在3×10⁷个/mL，细胞活率大于90％。取100μL(3×10⁶个)细胞悬浮液接种于裸鼠左上肢腋下皮下。

2.12裸鼠移植瘤模型的荧光成像

2.12.1成像时间的影响

选取同一批次6只状态良好，肿瘤体积超过200mm³的裸鼠。将裸鼠用异氟烷气体麻醉后，瘤内注射100μL探针HBT-CUR(1mM)，分别在(1min、5min、10min、20min、40min、60min、80min、 120min、6h、12h、24h)采用Night OWLⅡLB983小动物活体成像仪进行成像。成像条件：激发波长475nm，发射波长600nm。采用Indigo软件进行图像和数据的分析。

2.12.2活体水平肿瘤特异性成像

选取同一批次12只状态良好，肿瘤体积超过200mm³的裸鼠。随机分为2组，每组6只，分别为Control组、探针组，将裸鼠用异氟烷气体麻醉后，探针组在荷瘤小鼠左腋下瘤内与右腋下组织内在同一时间内注射100μL探针HBT-CUR(1mM)，Control组在荷瘤小鼠左腋下瘤内与右腋下组织内在同一时间内注射等量的空白溶剂(生理盐水：DMSO＝9:1)，20min后采用Night OWLⅡLB983小动物活体成像仪进行成像。成像条件：激发波长475nm，发射波长600nm。采用Indigo软件进行图像和数据的分析。

2.13活体水平的光动力治疗实验

2.13.1治疗方案的建立

选择状态良好的裸鼠，肿瘤体积超过100mm³的裸鼠，随机分为四组，每组六只。分为Control 组、Light+HBT-CUR组(300mW/cm²，500mW/cm²，1mW/cm²)，控制相同的饲养条件与生长环境。 (1)Control组：移植瘤小鼠模型不做任何处理，正常条件饲养；(2)Light+HBT-CUR组：每隔24h 瘤内注射100μL的HBT-CUR溶液(终浓度为1mM,生理盐水：二甲基亚砜＝9:1v/v)，每日给予(300 mW/cm²，500mW/cm²，1mW/cm²)不同功率的30min光照，与对照组相同条件饲养。实验开始后，每日测量小鼠的体重，与肿瘤体积，治疗14天。

2.13.2活体水平的肿瘤治疗

选择状态良好的裸鼠，肿瘤体积超过200mm³的裸鼠，随机分为四组，每组六只。分为Control 组、Light+生理盐水组、HBT-CUR探针组、Light+HBT-CUR组，控制饲养条件与生长环境相同。(1) Control组：移植瘤小鼠模型不做任何处理，正常条件饲养；(2)Light+生理盐水组：每隔24h瘤内注射100μL的生理盐水，每日给予30min的300mW/cm²光源照射，与对照组相同条件饲养；(3) HBT-CUR探针组：每隔24h瘤内注射100μL的HBT-CUR溶液(终浓度为1mM,生理盐水：二甲基亚砜＝9:1v/v)，与对照组相同条件饲养；(4)Light+HBT-CUR组：每隔24h瘤内注射100μL的 HBT-CUR溶液(终浓度为1mM,生理盐水：二甲基亚砜＝9:1v/v)，每日给予30min的300mW/cm²的光照，与对照组相同条件饲养。实验开始后，每日测量小鼠的体重，与肿瘤体积，至治疗完成。每日拍照，记录小鼠的状态变化。实验结束后，取离体肿瘤进行拍照。对小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤做H&E病理学染色。

2.14数据处理

每组数据至少平行测定3次，结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS16.0软件进行统计分析。采用t检验进行组间统计学差异分析，p<0.05表示差异有统计学意义。

三、效果验证

1、探针HBT-CUR对极性检测性能的研究

1.1探针HBT-CUR的吸收光谱与发射光谱

探针HBT-CUR(10μM)在甲苯(Toluene)、乙醇(Ethanol)、1,4-二氧六环(Dioxane)、乙腈 (Acetonitrile)、甲醇(Methanol)、二氯甲烷(Dichloromethane)、丙酮(Acetone)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(Ethylacetate)、PBS共10种溶剂的吸收光谱与发射光谱进行检测。如图9A所示，探针 HBT-CUR主要吸收峰在400nm，而在DMSO与乙腈中分别出现了600nm、590nm的新吸收峰，这一双峰现象，可能是因为溶剂分子与探针间的相互作用，导致探针在基态时酮式比例的提高。随后，继续对10种溶剂中探针HBT-CUR的荧光光谱进行检测，如图9B所示，探针在溶剂极性较小的甲苯溶液中最大发射波长蓝移至600nm，而在极性较大的DMSO溶剂中波长红移至666nm，说明探针的荧光性能受溶剂极性影响。

1.2探针HBT-CUR的荧光量子产率

为了表征探针HBT-CUR分子的荧光性能，选取硫酸奎宁作为参比，采用相对法测定其荧光量子产率，测定结果如表2所示，可以看出探针HBT-CUR(10μM)在溶剂极性较小的甲苯溶液中荧光量子产率Φ_f可达0.189，而在极性较大的PBS溶液中荧光量子产率Φ_f只有0.001，进一步说明探针受溶剂的极性影响显著。

表2探针HBT-CUR(10μM)的荧光量子产率

F:荧光强度；A:吸光度；n:折射率；ε:介电常数；Φ_f:荧光量子产率

1.3探针HBT-CUR的检测性能

为了进一步探究探针HBT-CUR能否特异性识别极性，选用Dioxane-PBS体系为溶剂探究其光谱性质的变化(图10)。随着PBS的比例从0％增加到60％，390nm处的紫外吸收峰逐渐下降，460nm处的吸收峰逐渐升高。同时，随着PBS比例的升高，620nm处的荧光强度逐渐降低，波长红移。随后对荧光强度与极性参数Δf进行相关关系的函数拟合，结果显示荧光强度与极性具有良好的相关性R²＝0.991。上述实验结果充分说明，探针可以灵敏地检测极性。

1.4探针HBT-CUR的稳定性

探针的稳定性是探针性能的一项重要指标，采用Dioxane-PBS体系为溶剂检测探针HBT-CUR(10 μM)的抗光漂白性以及稳定性。图11A显示在激发光连续激发10min内，探针的荧光强度几乎没有变化，证明探针具有较强的抗光漂白能力。如图11B所示，探针溶液在37℃条件下放置32h，荧光强度没有明显变化。图11C显示探针在LED灯(100mW/cm²)照射30min，荧光强度没有明显的变化。上述结果说明探针具有较好的稳定性和抗光漂白性能。

1.5探针HBT-CUR的选择性

在体外考察其它物种对探针检测极性的影响是十分必要的。因此，首先探究黏度对探针检测极性的干扰，如图12所示，探针(10μM)在不同黏度(glycerol 10％-50％)环境下荧光光谱没有明显的变化，未见荧光响应。其次，探究了pH是否对探针检测极性产生影响，如图13所示，探针(10μM) 在不同pH(4.0-9.0)条件下荧光光谱没有明显的变化，未见荧光响应。接着，探究了活性氧与活性氮对探针检测性能的干扰，如图14所示，探针(10μM)与活性氧(ROS，包括O₂ ^·-；H₂O₂；HClO；¹O₂； t-BuOOH；·OH)、活性氮(RNS，包括NO₂ ^-；NO₃ ^-；ONOO^-；NO)物种37℃条件下孵育后并未影响其荧光光谱，也未改变最大荧光强度值，只在溶剂体换成Dioxane后呈现荧光开启。然后，探究了活性硫对探针检测性能的干扰，如图15所示，探针(10μM)与活性硫(RSS，包括Na₂S；NaHS； Na₂SO₃；NaHSO₃；CH₃SSSCH₃；CysSSCys；GSSG；S₈；GSH)孵育后，没有引起荧光信号变化。随后，探究了金属离子是否会激活探针荧光信号，如图16所示，探针(10μM)与金属离子(Sn²⁺；Cd²⁺； Mn²⁺；Co²⁺；Cu²⁺；Hg²⁺；Zn²⁺；Fe²⁺；Ca²⁺；Fe²⁺；Al³⁺；Ni² ⁺；Mg²⁺；Li⁺；Na⁺；K⁺；Ag⁺)几乎没有荧光响应。最后，探究了氨基酸是否会激活探针荧光信号，如图17所示，探针(10μM)与氨基酸 (Gly；D-Ala；Val；Ile；L-Cys；L-Thr；Asp；L-Glu；L-Arg；L-Lys；L-His；Hcy)探针荧光光谱无明显变化。上述结果说明，不同pH、不同黏度、活性氧、活性氮、活性硫、金属离子、氨基酸都不会引起探针产生荧光信号，探针只有在极性较低的溶剂体系(Dioxane)中产生荧光信号，表明探针具有良好的选择性，不受环境和其它物质的干扰。

1.6探针HBT-CUR的光敏性质

通过对探针产生的活性氧(ROS)及单线态氧产率进行测定，进而考察其光敏性质。首先，通过 2,7-二氯二氢荧光素(DCFH-DA)对探针产生的活性氧进行检测(图18)。探针(10μM)在没有光源照射的条件下，未见荧光响应信号。而在光源照射条件下，体系在525nm处产生了显著的荧光信号，在365nm紫外灯照射下，溶液发出明亮绿色荧光。上述结果表明探针HBT-CUR可以通过光照产生活性氧。

接着，选用玫瑰红(Rose bengal，Φ_Δ＝0.75)作为参比，通过二苯基异苯并呋喃(DPBF)(100μM) 对探针(10μM)在乙醇中的单线态氧产率进行检测(图19)。如图19A与图19B所示，探针(10μM) 与DPBF(100μM)在乙醇溶液中，光源照射1min，紫外吸收光谱几乎无变化，说明该方法适合用于探针单线态氧产率的检测。图19C显示探针与DPBF在乙醇溶液中，光源照射1min，体系在410nm处的吸光度逐渐下降；图19E显示410nm处的吸光度与光照时间呈线性关系(R²＝0.991)；采用用相同方法检测玫瑰红(10μM)的乙醇溶液在410nm处吸光度变化与时间的相关关系(图19D与图19F)，通过公式：Φ_Δ,sample＝Φ_Δ,standard(K_sample/K_standard)，(Φ_Δ:单线态氧产率；K:DPBF在410nm处的吸光度降解速率)计算得出探针HBT-CUR在乙醇中的单线态氧产率(Φ_Δ＝0.52)。按照上述方法测定并计算探针在不同溶剂中的单线态氧产率。结果如表3所示，探针在Dioxane中具有较高的单线态氧产率(Φ_Δ＝0.70)。上述结果表明HBT-CUR是性能良好的Ⅱ型光敏剂。

表3不同溶剂中单线态氧产率(Φ_Δ)

Reference:Rose bengal

2、探针HBT-CUR细胞水平荧光成像

2.1细胞毒性测试

在进行细胞实验之前，首先进行探针HBT-CUR的细胞毒性测试。选取小鼠乳腺癌细胞(4T1)，人肾透明细胞癌细胞(786-o)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、三阴性人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)及人乳腺上皮细胞(MCF-10A)共7种细胞株，以MTT法检测探针HBT-CUR的细胞毒性(图20)。将不同浓度的探针HBT-CUR(0,2.5,5,10, 20μM)与上述这10种细胞株共同孵育。结果发现，当探针浓度小于5μM时，细胞的存活率在90％以上。随后将HBT-CUR(5μM)与这10株细胞共同孵育0，6，12，24，48h后细胞存活率仍在80％左右。上述结果说明，探针HBT-CUR(5μM)毒性较低，可用于细胞水平成像。

2.2探针HBT-CUR的生物相容性

探针的细胞相容性是探针能否用于细胞成像的重要指标。本文用探针(5μM)与MCF-7细胞孵育不同时间(0，5，10，15，20min)，随后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色5min，再进行共聚焦成像。结果如图21所示，探针与细胞孵育5min左右，可以进入细胞呈现出红色荧光， DAPI主要聚集于细胞核呈现蓝色荧光。表明探针可以进入细胞内具有良好生物相容性。

2.3探针在细胞中的分布

细胞为了更有序地发挥其功能，细胞中的不同区域具有不同的细胞极性。研究表明，肿瘤形成过程中，溶酶体发生结构改变，数量和大小增加，并表现出溶酶体活性减弱，这可能导致溶酶体极性的变化。为了研究探针HBT-CUR在肿瘤细胞中分布，选用溶酶体绿色染料(Lyso-Tracker Green)，内质网绿色探针(ER-Tracker Green)，高尔基体绿色探针(Golgi-Tracker Green)，线粒体绿色探针 (Mito-Tracker Green)四种细胞器靶向染料分别与探针HBT-CUR(5μM)进行亚细胞器共定位成像。结果如图22所示，探针与溶酶体共定位成像效果较好，皮尔逊相关系数为0.96；与内质网、高尔基体及线粒体共定位皮尔逊相关系数分别为0.78、0.76、0.65。细胞成像图横截面荧光强度分析表明，溶酶体荧光强度和峰型重合较好。上述结果表明HBT-CUR具有良好的溶酶体定位的能力。

2.4肿瘤细胞特异性成像

为了证明探针HBT-CUR能特异性地识别肿瘤细胞，用探针HBT-CUR(5μM)对小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人肾透明细胞癌细胞(786-o)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、三阴性人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)、人乳腺上皮细胞(MCF-10A) 共7株细胞株进行荧光成像。如图23A-E所示，4T1、786-o、MCF-7、HepG 2、MDA-MB-231，上述肿瘤细胞株内可见明亮的红色荧光，这些红色荧光是由于肿瘤的低极性引起的。如图23F-G所示， HK-2、MCF-10A则几乎无细胞内荧光信号。如图23H，对细胞分组(786-oVS HK-2；MCF-7与 MDA-MB-231VS MCF-10A)采用t检验进行组间统计学差异分析，结果显示，肿瘤细胞株与正常细胞株中的荧光强度具有显著性差异。综上所述，探针通过检测细胞中极性的差异，从而区分肿瘤细胞和正常细胞，从而特异性成像肿瘤细胞。

2.5探针HBT-CUR细胞水平成像的定量检测

为了进一步证明探针具有特异性成像肿瘤细胞的能力，对探针(5μM)与7种细胞株分别孵育20 min后，通过流式细胞实验对细胞内的平均荧光强度进行定量分析(图24)。由图24A可见，肿瘤细胞的平均荧光强度明显高于正常细胞。图24B分别比较了MCF-7、MDA-MB-231，4T1与MCF-10A； 786-o与HK-2两种不同器官或组织的正常细胞与肿瘤细胞的平均荧光强度，并进行统计学分析，结果显示肿瘤细胞与正常细胞的平均荧光强度有显著性差异。结果进一步表明，探针可以特异性区分肿瘤细胞。

2.6细胞凋亡染色

为了研究探针HBT-CUR能否有效地诱导肿瘤细胞凋亡，通过Calcein AM/PI对细胞进行染色， Calcein AM可将活细胞染成绿色，PI可以将凋亡细胞染成红色。结果如图25，与探针孵育后的细胞在外部光源照射下0到25min内，绿色荧光信号逐渐减少，红色荧光信号逐渐增加，表明在探针与光源共存的条件下，细胞出现快速凋亡现象。为了进一步证明细胞凋亡是光源照射与探针的共同作用结果，将细胞分组为Control、Light、HBT-CUR、HBT-CUR+Light，荧光成像结果如图26所示，Control、Light、 HBT-CUR只有极少的红色荧光信号，HBT-CUR+Light出现大面积的红色荧光信号。上述结果说明，探针HBT-CUR与外部光源共同存在的条件下，会引起细胞快速凋亡。

2.7细胞中的活性氧检测

PDT过程主要通过光照促使光敏剂产生大量活性氧，使细胞过度氧化应激从而发生凋亡。为了探究探针导致细胞凋亡的原因，通过将探针(5μM)与MCF-7细胞孵育20min后，用LED(100mW/cm²) 光源照射25min，加入DCFH(10μM)，DCFH与活性氧反应会发出520nm的绿色荧光信号。以空白处理、加探针且避光处理、不加探针光源照射处理作为对照。结果如图27所示，孵育探针并施加光源照射的MCF-7细胞呈现明亮的绿色荧光信号，对照的MCF-7细胞均只有微弱的绿色荧光响应信号，结果表明探针在外部光源照射下产生了活性氧。上述结果说明，探针通过PDT方式产生ROS诱导肿瘤细胞凋亡。

3、探针HBT-CUR活体水平成像

于细胞实验结果，在活体水平上对探针HBT-CUR在肿瘤组织中的成像能力进行研究。首先考察了探针HBT-CUR在肿瘤组织中的保留时间，将肿瘤体积大于200mm³的荷瘤小鼠随机分为两组，实验组荷瘤小鼠瘤内注射100μL探针(1mM，二甲基亚砜：生理盐水＝1:9，v/v)，对照组荷瘤小鼠瘤内注射20μL空白溶剂(二甲基亚砜：生理盐水＝1:9，v/v)，注射后0min，1min，5min，10min，20min， 40min，60min，80min，120min，6h，12h，24h，48h进行活体水平成像。如图28所示，瘤内的荧光强度在10min达到荧光强度峰值(10倍)，并且在6h内仍能检测到较强的荧光信号(6倍)，6h 后荧光信号逐渐降低，48h后荧光信号只有不到2倍。表明探针可以实现肿瘤组织成像，在肿瘤组织中较短时间(10min)内即可产生较强的荧光信号，并可以进行较长时间成像，具体见图29。

4、探针HBT-CUR活体水平肿瘤组织的光动力学治疗

活体水平成像结果表明，探针可用于肿瘤组织的可视化成像。探讨探针在裸鼠移植瘤模型中对肿瘤组织的治疗作用。首先，要摸索合适的光源治疗方案。将肿瘤体积大于100mm³的小鼠随机分组，每组6只编号:300mW/cm²功率光源；500mW/cm²功率光源；1W/cm²功率光源；Control。每组小鼠均采用瘤内注射100μL的探针(1mM，二甲基亚砜：生理盐水＝1:9，v/v)，每两天注射探针一次，对照不给予光照，其它各组分别给予300mW/cm²功率光源、500mW/cm²功率光源、1W/cm²功率光源的照射，每日光照30min(每间隔5min照射一次)，治疗14天，记录14天内小鼠的体重与肿瘤体积的变化(图30)。图30A显示治疗过程小鼠体重几乎没有变化。图30B显示，14天内Control肿瘤体积急剧增加，而不同功率光源***体积均减小，表明探针可以有效的抑制肿瘤生长。如图30C所示，小鼠治疗14天后取出肿瘤组织拍照，与Control组相比治疗组肿瘤体积明显减小，光源功率从300 mW/cm²增加到1W/cm²时肿瘤的抑制作用只有轻微的增强，这表明300mW/cm²的光功率足以有效的激发探针产生单线态氧。上述实验结果表明，探针HBT-CUR通过PDT方式可有效地抑制肿瘤组织的生长，具有良好的抗肿瘤作用。

进一步确证探针抑制肿瘤生长是通过PDT的方式。首先，将肿瘤体积大于200mm³的荷瘤小鼠随机分为四组每组6只，编号为：Control、Light、HBT-CUR、HBT-CUR+Light。HBT-CUR+Light，采用瘤内注射100μL的探针(1mM，二甲基亚砜：生理盐水＝1:9，v/v)，每两天给药一次，每日给予 300mW/cm²的LED光源照射30min(每隔5min照射一次，共照射30min)；Control不做任何处理，荷瘤小鼠自然生长；Light荷瘤小鼠给予瘤内注射100μL的空白溶剂(二甲基亚砜：生理盐水＝1:9， v/v)，每两天注射一次，每日给予300mW/cm²的LED光源照射30min(每隔5min照射一次，共照射30min)；HBT-CUR荷瘤小鼠瘤内100μL的探针(1mM，二甲基亚砜：生理盐水＝1:9，v/v)，每两天给药一次，并做避光处理。进行为期14天的治疗。记录14天内每组小鼠的体重(图31A)与肿瘤体积的变化(图31B)。结果显示，小鼠体重在14天内几乎无明显变化，相比对照组，HBT-CUR+Light 组肿瘤体积明显减小，表明探针在外部光源照射下对肿瘤有明显的抑制作用，且具有良好的生物相容性。14天后，对裸鼠的左侧腋下肿瘤组织用相机拍照比较(图31D)，结果显示，HBT-CUR+Light组荷瘤小鼠(1.36D-a)左侧腋下的肿瘤体积明显小于其它组的肿瘤体积。随后处死小鼠，解剖分离荷瘤小鼠的内脏器官(心、肝、脾、肺、肾)及肿瘤组织，对离体肿瘤组织称重(图31C)并用相机拍照 (图31E)，结果显示，HBT-CUR瘤内注射探针的荷瘤小鼠离体肿瘤组织体积与重量明显低于其它组。并将离体的肿瘤组织(图31F)与器官(图32)进行H&E病理学染色。结果显示，Control、Light 与HBT-CUR组的小鼠肿瘤细胞密集，细胞核深染且呈明显异型性，肿瘤内血管比较丰富，未见坏死灶；HBT-CUR+Light组大部分肿瘤细胞已经完全坏死，细胞核也消失，周边区域散在部分细胞核，呈明显固缩状态，核膜辨识不清，着色层次欠分明。荷瘤小鼠离体器官心脏组织、肝组织、脾脏组织、肺组织、肾脏组织几乎都是正常的，没有明显的病理变化。综上，探针可以在外部光源的照射下，通过PDT的方式抑制肿瘤生长。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims

1.一种具有光动力学性质的极性荧光探针，其探针的结构式如下所示：

。

2.权利要求1所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）在氢氧化钠存在的条件下，化合物a与2-氨基苯硫酚进行化学反应制备中间体HBT-1；

（2）在三氟乙酸存在的条件下，中间体HBT-1与六亚甲基四胺进行化学反应制备中间体HBT-2；

（3）在氮气保护下，化合物b与三氟化硼***进行化学反应制备中间体C-1；

（4）在哌啶存在的条件下，中间体HBT-2与中间体C-1进行化学反应制备极性荧光探针HBT-CUR，具体合成路线如下：

。

3.根据权利要求2所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，化合物a与2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:1~3；化合物a与氢氧化钠的摩尔比为1:5~10。

4.根据权利要求3所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，化合物a与2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:2；化合物a与氢氧化钠的摩尔比为1:8。

5.根据权利要求2所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，反应温度为80~100℃；反应时间为1~3h。

6.根据权利要求5所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，反应温度为90℃；反应时间为1 h。

7.根据权利要求2所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，中间体HBT-1与六亚甲基四胺的摩尔比为1:0.8~1.5；中间体HBT-1与三氟乙酸的质量体积比为40~50:1mg/ml。

8.根据权利要求7所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，中间体HBT-1与六亚甲基四胺的摩尔比为1:1；中间体HBT-1与三氟乙酸的质量体积比为45.4:1mg/ml。

9.根据权利要求2所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，化合物b与三氟化硼***的摩尔比为1:1~3；在步骤（4）中，中间体HBT-2与中间体C-1的摩尔比为1:0.8~1.5；中间体HBT-2与哌啶的摩尔比为1:0.8~1.5。

10.根据权利要求9所述的极性荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，化合物b与三氟化硼***的摩尔比为1:2；在步骤（4）中，中间体HBT-2与中间体C-1的摩尔比为1:1；中间体HBT-2与哌啶的摩尔比为1:1。

11.权利要求1所述的极性荧光探针在制备检测细胞极性的药物中的应用。

12.权利要求1所述的极性荧光探针在制备作为光动力肿瘤治疗药物中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的极性荧光探针通过PDT方式产生单线态氧杀伤肿瘤细胞。