CN115427446A - Wnt超级激动剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多特异性多价抗原结合分子，其能够通过结合并激活至少一种或两种WNT受体和WNT增强剂而用作WNT激动剂、WNT增强剂和WNT超级激动剂分子。

Description

WNT超级激动剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月24日递交的美国临时申请第62/980,870号和2020年11月16日递交的美国临时申请第63/114,368号的优先权，其中每项通过引用整体并入本文中。
关于序列表的申明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称是SRZN_018_02WO_ST25.txt。该文本文件大小为1,179KB，创建于2021年2月24日，并正在通过EFS-Web以电子方式提交。
发明领域
本发明提供了既具有WNT激动剂活性又具有WNT增强剂活性或仅具有WNT激动剂或WNT增强剂活性的抗原结合形式。
发明背景
WNT(“Wingless相关整合位点”或“Wingless和Int-1”或“Wingless-Int”)配体及其信号在控制许多重要器官和组织(包括骨骼、肝脏、皮肤、胃、肠、肾、中枢神经***、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗和许多其他组织)的发育、体内平衡和再生中起关键作用(例如，由Clevers、Loh和Nusse(2014)Science；346:54综述的)。WNT信号传导通路的调节具有治疗退行性疾病和组织损伤的潜力。
七次跨膜受体Frizzled(FZD)对几乎所有WNT信号传导都至关重要，并且N-末端FZD富含半胱氨酸结构域(CRD)用作WNT结合结构域。除了FZD，WNT/β-连环蛋白通路还需要低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/6)以作为共受体。LRP5和LRP6是功能冗余的单通道跨膜受体。LRP6的生物化学研究表明，不同的WNT可能与LRP5/6蛋白的不同胞外结构域结合。LRP6的细胞外结构域包含四个重复序列的β-螺旋桨和表皮生长因子样(βP-E)结构域。细胞外LRP6区的晶体结构表明βP-E重复代表两个离散的、紧凑的、刚性结构，每个结构包含两个βP-E对。WNT9b结合LRP6的细胞外结构域的前两个βP-E重复序列，而WNT3a结合最后两个βP-E结构域。
非WNT激动剂或增强剂分别包括Norrin和R-脊椎蛋白(R-Spondin，RSPO)。Norrin是一种Fz4特异性配体，其与另一种WNT受体LRP5的结合和激活一起形成WNT替代分子或模拟分子。
四个RSPO基因代表可以增强WNT通路信号传导的保守分泌蛋白家族。LGR4/5/6(富含亮氨酸重复的GPCR 4、5和6)是RSPO的受体。
RSPO的作用似乎是稳定WNT受体、FZD和LRP5/6，以促进或增强WNT信号传导。RSPO1-4是放大WNT信号的配体家族。每个RSPO都通过受体复合物起作用，所述受体复合物的一端含有锌和环指3(ZNRF3)或环指蛋白43(RNF43)，并且另一端含有富含亮氨酸重复的G-蛋白偶联受体4-6(例如，由Knight和Hankenson 2014,Matrix Biology；37:157-161综述的)。RSPO也可能通过另外的作用机制发挥作用(Lebensohn和Rohatgi 2018,eLife,7:e33126)。ZNRF3和RNF43是两种膜结合的E3连接酶，其特异性靶向WNT受体(FZD1-10和LRP5或LRP6)以进行降解。RSPO与ZNRF3/RNF43和LGR4-6的结合使得清除或隔离三元复合物，从而从WNT受体中去除E3连接酶并稳定WNT受体，使得增强WNT信号。每个RSPO包含两个Furin结构域(1和2)，Furin结构域1与ZNRF3/RNF43结合，且Furin结构域2与LGR4-6结合。含有Furin结构域1和2的RSPO片段足以放大WNT信号传导。
抗体是一种成熟且快速增长的药物类别，目前在美国和/或欧洲销售用于成像或治疗的至少45种基于抗体的产品，全球总销售额为～1000亿美元。抗体疗法的这一重大临床和商业成功激发了人们对开发包括双特异性抗体在内的下一代抗体药物的极大兴趣。正如其名称所暗示的，双特异性抗体或多特异性抗体(统称为“MsAb”)与至少两种不同的抗原或同一抗原上的至少两种不同的表位结合，这在50多年前首次证明。如临床开发中>30种BsAb所证明的，针对多特异性工程化单特异性抗体开辟了许多新的潜在治疗应用。
双特异性或多特异性抗体是一类工程化的抗体和抗体样蛋白，与“常规”单特异性抗体相比，它们在单个构建体中结合了两种或更多种不同的特异性抗原结合元件。由于双特异性抗体通常并不是天然存在的，因此它们是使用诸如细胞融合或重组DNA技术的技术以化学或生物学方式构建的。用单个分子结合两个或更多个不同表位的能力提供了许多潜在优势。一种方法是使用一个臂的特异性作为单个分子、细胞标志物或生物体(如细菌和病毒)的靶向位点，而另一臂作为效应位点以用于募集效应细胞或将分子有效载荷(如药物、细胞因子或毒素)递送至靶标。可选地，双特异性抗体可被用于双重靶向，允许以比单特异性抗体高得多的特异性检测或结合靶细胞类型。
免疫球蛋白的模块化结构已被开发用于产生越来越多(>60种)的可替代MsAb形式(参见例如，Spiess等人(2015)Mol.Immunol.67:95-106)。MsAb在此分为五个不同的结构组：(i)双特异性IgG(BsIgG)(ii)附接有其它抗原结合部分的IgG，(iii)MsAb片段，(iv)多特异性融合蛋白，和(v)MsAb缀合物。这些不同的MsAb形式中的每一种在每种抗原的结合效价、抗原结合位点的几何形状、药代动力学半衰期以及在一些情况下的效应功能方面都具有不同的特性。
对于代表绝大多数正在开发的MsAb分子的拮抗性MsAb抗体，抗原结合模块的几何形状不太重要。然而，对于激动性MsAb，这些分子需要忠实地模拟天然配体的活性，结合几何结构可能是至关重要的(参见例如，Shi等人(2018)J.Biol.Chem.293:5909-5919)。WNT替代分子也是如此，需要它们来结合和激活两种空间上分离的WNT受体FZD和LRP。
可以与异源寡聚WNT/LRP受体复合物结合的WNT替代分子先前已被描述(参见例如，WO2019/126398、US 2020-0308287 A1、USSN17/257,817和WO2020/010308)，如使用RSPO的WNT增强剂(参见例如，WO2018/140821、US 2020-0048324 A1、WO2018/132572、US 2020-0024338A1、17/257,820和WO2020/014271)。然而，以前没有公开过WNT替代分子和增强剂的组合，例如促进特定组织中的异源寡聚化以及由RSPO促进的WNT增强的WNT替代分子或其模拟物。因此，需要开发模拟天然配体(例如FZD和LRP受体)与引发激动性生物活性的异源寡聚复合物结合的不同抗原结合形式，以及增强WNT活性，例如使用RSPO模拟物。本发明通过提供与不同受体(共受体)结合并充当天然配体的模拟物或拮抗剂的多特异性抗体(MsAb)形式的灵活结构来满足这一需要。
附图简述
图1A-M显示了串联scFv-IgG、Fv-IgG、Fab-IgG和Fv-Fab形式的WNT替代分子的不同构型的结构-功能分析：(A)显示了使用抗LRP和抗FZD抗体片段产生的不同结构的示意图；(B)显示了这些WNT替代分子或WNT3A对WNT响应性HEK293 STF报告细胞系的相对活性；(C)显示了RSPO增强这些WNT替代物活性的能力；并且(D-M)显示了含有不同FZD结合剂的Fv-IgG结构在RSPO存在下刺激WNT通路的能力。
图2A-E显示了以不同构型与突变RPSO(RSPO2-RA)融合的抗FZD结合剂的结构-功能分析：显示了示意图(A)、WNT信号传导活性(B)和对与RSPOR2A融合的Fv-IgG的受体水平的影响(C)，在103处，从上到下的线对应于：抗GFP、未处理的、抗GFP-RSPO2A、F12578-RSPO2RA和无染色)；(D)显示了与RSPO2RA融合的另外的FZD结合剂的活性；并且(E)显示了单价融合蛋白的活性。“F”表示抗FZD结合剂，并且“aGFP”表示作为阴性对照的抗GFP抗体。
图3A-M显示了含有FZD、LRP和E3连接酶结合部分的三特异性六价分子的活性：(A)显示了融合至RSPO2-RA的WNT替代物(抗FZD、抗LRP双特异性抗体)的示意图；(B-K)显示了用不同特异性的RSPO2RA和FZD结合剂构建的分子都表现出WNT替代物和RSPO模拟活性(E、F、G、K分别来自用FZD4、FZD9、FZD10和FZD4转染的HEK293细胞)；(J)显示了WNT模拟分子上RSPO2RA另外的连接位点；(K)显示了具有(J)中所示形式的分子的活性(在左图的log-8处，从上到下的线对应于：L6-F4-2+20nM Rspo、L6-F4-2-RSPO2RA-CH、L6-F4-2-RSPO2RA-NL、L6-F4-2-RSPO2RA-CL和L6-F4-2；在右图的log-8处，从上到下的线对应于：L6-F4-RSPO2RA-CL、L6-F4+20nM RSPO2、L6-F4-RSPO2RA-CH、L6-F4-RSPO2RA-NL和L6-F4)；并且(L)和(M)显示了另外的RSPO2RA融合物的活性，所述融合物含有FZD结合剂，具有和不具有LRP结合剂，并融合在IgG上的其他位置处。
图4A-C显示了含有FZD、LRP和E3连接酶结合部分的另外的三特异性分子的活性：(A)显示了融合至RSPO2RA(下面四个结构)的WNT替代物(各种scFv-IgG构型的抗FZD、抗LRP双特异性抗体，上面两个结构)的示意图；并且(B-C)显示了(A)中分子在RSPO存在或不存在情况下的活性。在(B)中，在log-8处，从上至下的符号对应于：L6-F12578(Fv-IgG)+RSPO2、HC1-L6-F12578-RSPO2RA-KH+HC2-L6-F12578-HF、HC1-L6-F12578-RSPO2RA-KH+HC2-F12578-HF-RSPO2RA、HC1-L6-F12578-RSPO2RA-KH+HC2-F12578-HF、L6-F12578(Fv-IgG)和HC1-L6-F12578-KH+HC2-F12578-HF)。
图5A-H显示了WNT超级激动剂刺激几种小鼠和人类类器官的扩增：(A、C、E、G)7或14天后类器官生长的代表性明场图像。比例尺，400μm。(B、D、F、H)使用
Figure BDA0003813636360000051
对细胞活力进行定量。每个数据点代表一个独立的实验。A)使用0.1nM替代分子7天后小鼠小肠类器官的生长，和B)细胞活力的量化。C)使用1nM替代分子7天后人类小肠类器官的生长，和D)细胞活力的量化。E)使用1nM替代分子14天后小鼠肝细胞类器官的生长，和F)细胞活力的量化。G)使用1nM替代分子7天后人类小管(tubuloids)的生长，和H)细胞活力的量化。
图6A-H显示了WNT模拟分子的体内效应。为了测试具有不同FZD特异性的WNT模拟物的体内效应，在第0、3、7和10天，在C57Bl/6J小鼠中以3mg/kg腹膜内施用一组WNT模拟物。(A-C)通过DEXA分析在第7天和第13天各治疗组全身(A)、股骨(B)和腰椎(C)的骨矿物质密度(BMD)的相对变化(％)。(D)随时间的体重变化。(E)在第7天和第13天体脂肪含量的相对变化(％)。(F-H)在第14天取出时唾液腺(F)、肝脏(G)和小肠(H)的器官重量。统计分析：单因素方差分析，采用事后Holm-Sidak检验(GraphPad Prism)。与抗GFP组进行所有比较。数据显示为平均值±标准差(SD)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图7显示了示例性WNT替代分子的形式。对于所示的Fab-IgG结构(和其他结构)，FZD结合结构域和LRP5/6结合结构域的Fab区被指示为来源于亲本抗体的重链或轻链，但还考虑了Fab的所有其他组合，例如在Fab-IgG构建体的重链或轻链中的HC-HC或LC-LC Fab，或者在构建体的一个或两个臂中转换两个Fab的顺序。
图8显示了示例性WNT超级激动剂分子的形式。
发明概述
本发明提供了WNT超级激动剂分子，其包含多个抗原结合结构域，其中所述结合结构域与至少一种第一WNT受体和至少一种第二WNT受体以及WNT增强剂结合。在某些实施方案中，替代分子是通过在组织靶向部分存在的情况下促进至少两种不同受体的异源寡聚化来模拟天然配体的激动剂。在某些实施方案中，所述结合结构域被工程化以模拟天然WNT配体。在其他实施方案中，所述结合结构域直接融合在一起。在其他实施方案中，所述超级激动剂的结合结构域与肽连接子融合在一起。在一些实施方案中，所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸。在其他实施方案中，所述肽连接子的长度为约5个氨基酸至约15个氨基酸。在另一实施方案中，所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一实施方案中，所述结合结构域中的至少一种选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在其他实施方案中，所述结合结构域中的至少一种与Fc片段融合。在其他实施方案中，所述结构是Fv-IgG。
在特定的实施方案中，本公开提供了WNT超级激动剂分子，其包含：a)Frizzled(FZD)结合结构域；b)LRP5/6结合结构域；和c)E3连接酶结合结构域，其中所述超级激动剂分子激活细胞中经典的WNT信号传导通路。在某些实施方案中：所述FZD结合结构域结合一种或多种FZD受体；所述LRP5/6结合结构域结合LRP5和/或LRP6中的一种或多种；并且所述E3连接酶结合结构域结合ZNRF3和/或RNF43。在某些实施方案中，WNT超级激动剂包含一种或多种多肽，其中至少一种多肽包含融合至LRP5/6结合结构域的FZD结合结构域，并且其中至少一种多肽包含融合至FZD结合结构域或LRP5/6结合结构域的E3连接酶结合结构域。在具体实施方案中，融合结合结构域直接融合在一起和/或经由肽连接子融合。在一些实施方案中，肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长。在一些实施方案中，所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在WNT超级激动剂分子的具体实施方案中，所述结合结构域中的至少一种选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在WNT超级激动剂分子的具体实施方案中，所述结合结构域中的至少一种与Fc片段融合，任选地其中所述Fc片段来自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体同种型或α、δ、ε、γ或μ抗体重链。在某些实施方案中，所述WNT超级激动剂分子具有或包含表3或表4中所示的结构，例如，Fv-IgG结构。在某些实施方案中，所述WNT超级激动剂分子的WNT增强剂结构域包含选自以下的E3连接酶结合结构域：突变的R-脊椎蛋白(RSPO)蛋白及抗体或其功能片段。在一些实施方案中，与野生型RSPO相比，所述突变的RSPO蛋白具有与富含亮氨酸重复的G-蛋白受体4-6(LGR4-6)的减少的结合。在一些实施方案中，所述E3连接酶结合结构域结合锌和环指3(ZNRF3)和/或环指蛋白43(RNF43)。在特定实施方案中，所述E3连接酶结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在不同的实施方案中，所述E3连接酶结合结构域直接或经由连接子与Fv-IgG的Fc片段的C-末端融合，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。在不同的实施方案中，所述E3连接酶结合结构域直接或经由连接子与以下的C-末端融合：a)FZD结合结构域的轻链或其片段；b)FZD结合结构域的重链或其片段；c)LRP5/6结合结构域的轻链或其片段；或d)LRP5/6结合结构域的重链或其片段，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。在不同的实施方案中，结合E3泛素连接酶的结合结构域直接或经由连接子与以下的N-末端融合：a)FZD结合结构域的轻链或其片段；b)FZD结合结构域的重链或其片段；c)LRP5/6结合结构域的轻链或其片段；或d)LRP5/6结合结构域的重链或其片段，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。在一些实施方案中，所述WNT超级激动剂包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％的序列同一性的多肽的组合。
在相关的实施方案中，本公开提供了包含结合至少一种WNT受体的至少一个结合结构域的WNT增强剂分子(例如，RSPO模拟物)；以及WNT增强剂。在某些实施方案中，R-脊椎蛋白(RSPO)模拟物包含结合WNT受体的第一结合组合物和结合E3泛素连接酶的第二结合组合物。在一些实施方案中，所述第一结合组合物结合FZD受体或LRP受体，任选地LRP5和/或LRP6。在一些实施方案中，所述第一结合组合物选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在某些实施方案中，所述第二结合组合物是RSPO蛋白(任选地突变的RSPO蛋白)，或结合E3泛素连接酶的抗体或其片段。在某些实施方案中，所述结合组合物直接融合在一起或经由肽连接子融合。在一些实施方案中，所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在WNT增强剂分子的某些实施方案中，所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，WNT增强剂包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％的序列同一性的多肽的组合。
在另一实施方案中，本公开提供了WNT替代分子，其包含结合FZD受体的至少一个结合结构域和结合LRP受体的至少一个结合结构域。在某些实施方案中，WNT替代物包含：a)Frizzled(FZD)结合结构域；和b)LRP5/6结合结构域，其中所述超级激动剂分子激活细胞中经典的WNT信号传导通路。在某些实施方案中：a)FZD结合结构域结合一种或多种FZD受体；并且b)LRP5/6结合结构域结合LRP5和/或LRP6。在一些实施方案中，所述FZD结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在一些实施方案中，所述LRP5/6结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在一些实施方案中，所述结合结构域直接融合在一起或经由肽连接子融合。在具体实施方案中，所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在具体实施方案中，所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，所述WNT替代分子包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％的序列同一性的多肽的组合。
在本文所公开的包含WNT增强剂结构域或E3连接酶结合结构域的任何分子的各种实施方案中，所述WNT增强剂选自：野生型RSPO蛋白、突变的RSPO蛋白和结合E3泛素连接酶的结合结构域。在其他实施方案中，与野生型RSPO相比，所述突变的RSPO蛋白具有与富含亮氨酸重复的G-蛋白受体4-6(LGR4-6)的减少的结合。在另一实施方案中，所述结合E3泛素连接酶的结合结构域结合锌和环指3(ZNRF3)和/或环指蛋白43(RNF43)。在另一实施方案中，所述结合E3泛素连接酶的结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在某些实施方案中，所述结合E3泛素连接酶的结合结构域与Fv-IgG的Fc片段的C-末端融合。在其他实施方案中，所述结合E3泛素连接酶的结合结构域与以下的C-末端融合：a)结合FZD受体的结合结构域的轻链；b)结合FZD受体的结合结构域的重链；c)结合LRP受体的结合结构域的轻链；或b)结合LRP受体的结合结构域的重链。在另一实施方案中，所述结合E3泛素连接酶的结合结构域与以下的N-末端融合：a)结合FZD受体的结合结构域的轻链；b)结合FZD受体的结合结构域的重链；c)结合LRP受体的结合结构域的轻链；或d)结合LRP受体的结合结构域的重链。在某些实施方案中，所述超级激动剂包含表3或表4中所示的结构。
在本文所公开的任何分子的各种实施方案中，一种或多种多肽包含另外的序列(例如标签)，其可以例如被用于促进多肽的纯化。此类标签分子的实例包括但不限于His标签、Myc标签和Flag标签。
在一实施方案中，本发明提供了治疗患有与减少的WNT信号传导相关的疾病或病症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的WNT超级激动剂分子、WNT增强剂分子、WNT替代分子，或包含这些分子中的一种或多种的药物组合物。在某些实施方案中，所述疾病或病症选自：口腔粘膜炎、短肠综合征、炎性肠病(IBD)、其他胃肠道病症；代谢综合征的治疗、血脂异常、糖尿病的治疗、胰腺炎的治疗、其中外分泌或内分泌胰腺组织受损伤的病况；其中期望增强的表皮再生的病况，例如，表皮创伤愈合、糖尿病足溃疡的治疗、涉及牙、指甲或真皮发育不全等的综合征、其中血管生成是有益的病况；心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭；免疫缺陷、移植物抗宿主病、急性肾损伤、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、急性肝衰竭、具有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪变性的非酒精性肝病或脂肪性肝炎，听力丧失的治疗，包括听觉毛细胞的内部和外部损失、前庭功能减退、黄斑变性、玻璃体视网膜病变的治疗、糖尿病性视网膜病变、视网膜变性的其他疾病、Fuchs营养不良、其他角膜疾病、中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和影响血脑屏障的其他病况；脊椎损伤、骨相关疾病、其他脊椎疾病和脱发症。
在一实施方案中，本发明提供了生成、培养或维持器官组织、细胞或类器官培养物的方法，其包括使器官组织、细胞或类器官培养物与所述WNT超级激动剂分子、所述WNT增强剂分子或所述WNT替代分子、或包含所述WNT超级激动剂分子、所述WNT增强剂分子或所述WNT替代分子的药物组合物接触。在另一实施方案中，获得的器官组织来自供体，并与所述WNT超级激动剂分子、所述WNT增强剂分子或所述WNT替代分子接触，任选地通过用包含所述WNT超级激动剂分子、所述WNT增强剂分子或所述WNT替代分子的组合物离体灌注器官组织使获得的器官组织与所述WNT超级激动剂分子、所述WNT增强剂分子或所述WNT替代分子接触。在另一实施方案中，通过在体内使供体器官组织与包含所述WNT超级激动剂或所述WNT增强剂分子的组合物接触来维持器官组织的活力。在另一实施方案中，通过使类器官培养物与所述WNT超级激动剂分子、所述WNT增强剂分子或所述WNT替代分子接触来维持类器官培养物，任选地通过在包含所述WNT超级激动剂或所述WNT增强剂的培养基中培养所述类器官培养物来维持类器官培养物。
在其他相关实施方案中，本公开提供了在对象中诱导骨形成或增加骨密度的方法，其包括向所述对象施用有效量的WNT超级激动剂分子、WNT增强剂分子或WNT替代分子，或包含这些分子中的一种或多种的药物组合物。在一些实施方案中，使用结合FZD5、FZD8和FZD9的WNT超级激动剂分子进行所述方法。在一使用结合FZD5、FZD8和FZD9的WNT替代分子进行所述方法。
在其他相关实施方案中，本公开提供了再生对象的唾液腺或诱导对象的唾液腺生长的方法，其包括向所述对象施用有效量的WNT超级激动剂分子、WNT增强剂分子或WNT替代分子，或包含这些分子中的一种或多种的药物组合物。在一些实施方案中，进行所述方法以治疗所述对象的唾液过少。在一些实施方案中，使用结合FZD1、FZD2和FZD7的WNT超级激动剂分子进行所述方法。在一些实施方案中，使用结合FZD1、FZD2和FZD7的WNT替代分子进行所述方法。
在一些实施方案中，本发明提供了RSPO模拟物，其包含结合一种WNT受体的第一结合组合物和结合E3泛素连接酶的第二结合组合物。在一些实施方案中，所述第一结合组合物结合FZD受体或LRP受体。在其他实施方案中，所述第一结合组合物选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。在其他实施方案中，所述第二结合组合物是RSPO蛋白或结合E3泛素连接酶的抗体或其片段。
发明详述
如本文所用的，包括所附权利要求，诸如“一个/种(a/an)”和“所述(the)”的单数形式的词语包括它们对应的复数引用，除非上下文另有明确规定。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体将被理解为暗示包含所陈述的元素或整数或元素或整数的组，但不排除任何其他元素或整数或元素或整数的组。
除非另有明确说明，否则本说明书中的每项实施方案作必要的修正将适用于所有其他实施方案。
本文中所引用的所有参考文献均通过引用并入本文中，其程度与每项单独的出版物、专利申请或专利被具体且单独地指示通过引用并入本文的程度相同。
I.定义
分子的“活性”可以描述或是指该分子与配体或受体的结合、催化活性、刺激基因表达的能力、抗原活性、调节其他分子的活性等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞间相互作用(例如粘附)的活性，或维持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以意指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]、或[免疫活性]/[mg蛋白质]等。
如本文所用的，术语“施用”或“引入”或“提供”是指将组合物递送至对象的一个细胞、多个细胞、组织和/或器官，或递送至对象。此类施用或引入可以在体内、体外或离体进行。
如本领域公知的，抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过至少一个表位识别位点特异性结合靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)，位于免疫球蛋白分子的可变区。如本文所用的，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、VHH、其合成变体、天然存在的变体、包含抗体或其抗原结合片段的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体和包含所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。“双链抗体”、通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人(1993).,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)也是本文所考虑的特定形式的抗体。包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Minibodies)也包括在本文中(参见例如，S.Hu等人(1996),Cancer Res.,56:3055-3061；Ward,E.S.等人(1989)Nature 341:544-546；Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；和Y.Reiter等人(1996)Nature Biotech.14:1239-1245)。
如本文所用的，术语“抗原结合片段”是指包含与目标抗原，特别是与一种或多种FZD受体或LRP5或LRP6受体结合的免疫球蛋白重链和/或轻链或VHH的至少一个CDR的多肽片段。在这点上，本文所述抗体的抗原结合片段可包含来自结合一种或多种FZD受体或LRP5和/或LRP6的抗体的本文中所述VH和VL序列的1、2、3、4、5或所有6个CDR。在具体实施方案中，抗原结合片段可包含所有三个VH CDR或所有三个VL CDR。类似地，其抗原结合片段可包含VHH结合片段的所有三个CDR。FZD特异性抗体的抗原结合片段能够与FZD受体结合。LRP5/6特异性抗体的抗原结合片段能够结合LRP5和/或LRP6受体。如本文所用的，该术语不仅包括分离的片段，还包括包含本文所公开的抗体的抗原结合片段的多肽，诸如例如，包含本文所公开的抗体的抗原结合片段的融合蛋白，诸如例如，包含结合一种或多种FZD受体的VHH和结合LRP5和/或LRP6的VHH的融合蛋白。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(如抗体)结合并且另外能够用于动物以产生能够结合至该抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。在某些实施方案中，当结合剂(例如，WNT替代分子或其结合区)优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，其被称为特异性结合抗原。在某些实施方案中，当平衡解离常数为≤10-7或≤10-8M时，WNT替代分子或其结合区(例如抗体或其抗原结合片段)被称为特异性结合抗原。在一些实施方案中，平衡解离常数可以是≤10-9M或≤10-10M。
如本文所用的，术语“CDR”是指重链或轻链可变(V)区的三个高变区中的至少一个。从重链或轻链的N-末端开始，这些区结构域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包含单个CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。许多抗原-抗体复合物的晶体学分析表明，CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括分别***在重链和轻链框架区(FR)之间的重链和轻链CDR，所述重链和轻链框架区为CDR提供支持并相对于彼此限定CDR的空间关系。
如本文所用的，术语“FR”是指围绕重链或轻链V区的CDR的四个侧接氨基酸序列。一些FR残基可能接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接与CDR相邻的FR残基。在FR中，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有的V区序列都包含大约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当V区折叠成结合位点时，CDR显示为突出的环基序，其形成抗原结合表面。人们普遍认为，存在影响CDR环的折叠形状成某些“经典”结构的FR的保守结构区结构域——无论精确的CDR氨基酸序列如何。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链相互作用的非共价结构域间接触。可以通过参考Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四版.USDepartment of Health and Human Services.1987，及其更新，现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得，来确定免疫球蛋白CDR和可变结构域的结构和位置。
“单克隆抗体”是指同源抗体群，其中单克隆抗体由参与表位选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个表位。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、VHH、其变体、包含单克隆抗体的抗原结合片段的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，所述免疫球蛋白分子包含所需特异性的抗原结合片段(表位识别位点)和结合表位的能力，包括本文所公开的WNT替代分子。不打算限制抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上文在“抗体”定义下所描述的片段等。
术语“共受体”是指第一细胞表面受体，其结合与另一受体结合的信号传导分子或配体，以促进配体识别并启动生物学过程，如WNT通路信号传导。
术语“激动剂活性”是指激动剂模拟天然存在的蛋白质的作用或活性的能力。
如本文所用的，“肽连接子”或“连接子部分”是指有时重复的氨基酸残基(通常是甘氨酸和丝氨酸)序列，其用于连接下文所述的各种抗原结合结构域。连接子序列的长度决定了MsAb中抗原结合结构域的柔性，特别是在诸如FZD受体、LRP5和/或LRP6，和/或ZNRF3/RNF43的共受体上的表位结合方面。
如本文所用的，术语“增强”是指受配体或配体激动剂调节的受体信号传导水平与不存在激动剂(例如WNT替代分子)时的水平相比，可测量的增加。在具体实施方案中，与在不存在激动剂的情况下，例如在相同细胞类型中的受体信号传导水平相比，受体信号传导水平的增加为至少10％、至少20％、至少50％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子比包含相同FZD结合结构域和LRP5/6结合结构域但缺乏E3连接酶结合结构域的相应WNT替代分子更大程度地增加受体信号传导的水平，例如，增加至少10％、至少20％、至少50％或至少两倍。
与抗体或其抗原结合片段“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)的抗原或表位是本领域熟知的术语，并且确定此类特异性或优先结合的方法在本领域中也是众所周知的。分子(例如WNT替代分子或WNT超级激动剂分子)，如果相比其与可替代细胞或物质，其与特定细胞或物质反应或结合更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称其为表现出“特异性结合”或“优先结合”。分子或其结合区(例如WNT替代分子或其结合区)，如果相比其与其他物质结合，其以更大的亲和性、亲合力、更容易地结合，和/或持续时间更长，则其“特异性结合”或“优先结合”靶抗原(例如FZD受体)。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的替代分子或其结合区可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他性结合。通常，但不一定，提及结合意味着优先结合。
术语“可操作地连接”意指应用该术语的组件处于允许它们在合适条件下执行其固有功能的关系。例如，与蛋白质编码序列“可操作地连接”的转录控制序列与其连接，从而在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
如本文所用的，术语“控制序列”是指可以影响与其连接或可操作地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可能取决于宿主生物体。在具体实施方案中，原核生物的转录控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其他具体实施方案中，真核生物的转录控制序列可以包括包含转录因子识别位点、转录增强子序列、转录终止序列和多腺苷酸化序列中的一个或多个的启动子。在某些实施方案中，“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。
如本文所指的术语“多核苷酸”意指单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰(如溴尿苷)、核糖修饰(如***糖苷和2',3'-二脱氧核糖)和核苷酸间键修饰(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒酸磷酸酯、二硒酸磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯)。术语“多核苷酸”具体包括单链和双链形式的DNA。
术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代的糖基的核苷酸等。术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒酸磷酸酯、二硒酸磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。参见例如，LaPlanche等人(1986)Nucl.Acids Res.14:9081；Stec等人(1984)J.Am.Chem.Soc.106:6077；Stein等人(1988)Nucl.Acids Res.16:3209；Zon等人(1991)Anti-Cancer Drug Design,6:539；Zon等人(1991)Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,第87-108页(F.Eckstein编辑),Oxford University Press,OxfordEngland；Stec等人美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman(1990)Chem.Rev.90:543，其公开内容在此通过引用并入本文中，用于任何目的。寡核苷酸可包括可检测标记以能够检测寡核苷酸或其杂交物。
术语“载体”用于指代用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适用于转化宿主细胞并含有指导和/或控制***的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。如果存在内含子，表达包括但不限于诸如转录、翻译和RNA剪接的过程。
术语“宿主细胞”用于指已经引入或能够引入编码本文所述多肽中的一种或多种的核酸序列，并且进一步表达或能够表达选定的目的基因(如编码任何本文所述多肽的基因)的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论后代在形态或遗传构成上是否与原始亲本相同，只要存在所选基因即可。因此，还考虑了一种方法，其包括将此类核酸引入宿主细胞。引入可以采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入之后可以引起或允许来自核酸的表达，例如通过在基因表达条件下培养宿主细胞。在一实施方案中，核酸被整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，可以通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
“转导”还指通过逆转录病毒获得和转移真核细胞序列。术语“转染”用于指细胞吸收外来或外源DNA，并且当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域中是众所周知的并且在本文中被公开。参见，例如，Graham等人1973,Virology 52:456；Sambrook等人2001,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratories；Davis等人1986,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Elsevier；和Chu等人1981,Gene13:197。此类技术可用于将一种或多种外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。
如本文所用的，术语“转化”是指细胞遗传特征的改变，并且当细胞已被修饰以包含新DNA时，该细胞已被转化。例如，细胞被转化其中从其天然状态经过基因修饰。在转染或转导之后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加型元件瞬时保持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当DNA随着细胞***而复制时，细胞被认为已经被稳定转化。
术语“天然存在的”或“天然的”当与诸如核酸分子、多肽、宿主细胞等生物材料结合使用时，是指在自然界中发现并且不被人操纵的材料。类似地，如本文所用的的“非天然存在的”或“非天然的”是指在自然界中未发现或已被人在结构上修饰或合成的材料。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”以及“糖蛋白”可互换使用，并且意指不受任何特定长度限制的氨基酸聚合物。该术语不排除诸如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化以及信号序列的添加或缺失的修饰。术语“多肽”或“蛋白质”意指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可包含通过肽键非共价和/或共价连接在一起的多条链，其具有天然蛋白质的序列，即由天然存在的且特异性地非重组细胞，或遗传工程化或重组细胞产生的蛋白质，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖与本文所公开的FZD受体或LRP5或LRP6受体结合的WNT替代分子、其FZD结合区、其LRP5/6结合区、抗体及其抗原结合片段，或具有这些多肽中的任何一种的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。因此，“多肽”或“蛋白质”可以包含一条(称为“单体”)或多条(称为“多聚体”)氨基酸链。
本文所提及的术语“分离的蛋白质”“或“分离的抗体”意指主题蛋白质、替代分子或抗体：(1)不含通常在自然界中发现的至少一些其他蛋白质；(2)基本上不含来自相同来源(例如来自同一物种)的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达；(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂类、碳水化合物或与它在自然界中相关的其他物质分离；(5)与“分离的蛋白质”在自然界中与之相关的蛋白质部分不相关(通过共价或非共价相互作用)；(6)与自然界中不相关的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存在。此类分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA编码，或者可以是合成来源的，或者以上的任何组合。在某些实施方案中，分离的蛋白质可以包含天然存在的和/或人工多肽序列。在某些实施方案中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中发现的会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其他)的蛋白质或多肽或其他污染物。
“WNT超级激动剂”是具有增强的WNT激动剂活性的分子。如本文所用的，WNT超级激动剂具有WNT信号传导和WNT信号增强活性。在一些实施方案中，WNT超级激动剂分子将结合至少一种FZD受体和至少一种LRP受体，以及结合和激活至少一种E3泛素连接酶受体，从而稳定FZD受体和/或LRP受体。
II.总述
本发明提供了通过结合并调节共受体信号传导，例如与一种或多种FZD受体和一种或多种LRP5或LRP6受体，以及一种或多种ZNRF3/RNF43 E3泛素连接酶分子结合，进而调节下游WNT信号传导通路而用作WNT超级激动剂、WNT替代蛋白和WNT增强(RSPO模拟物)分子的抗原结合分子的组合，及其制备和用途。在具体实施方案中，替代分子激活或增加与一种或两种共受体相关的信号传导通路。
在具体实施方案中，本文所公开的WNT超级激动剂分子包含：(i)特异性结合一种或多种第一共受体的一种或多种抗体或其抗原结合片段，其包括具有特定共受体特异性和/或功能特性的抗体或其抗原结合片段；(ii)特异性结合一种或多种第二共受体的一种或多种抗体或其抗原结片段；和(iii)特异性结合一种或多种E3连接酶(例如，ZNRF3和/或RNF43)的一种或多种多肽(例如，突变的R-脊椎蛋白)。某些实施方案包括有利于增加下游信号传导和相关生物效应的WNT超级激动剂分子的第一和第二共受体结合区的特定结构形式或排列。
在具体实施方案中，本文所公开的WNT替代分子包含：(i)特异性结合一种或多种第一共受体的一种或多种抗体或其抗原结合片段，其包括具有特定共受体特异性和/或功能特性的抗体或其抗原结合片段；和(ii)特异性结合一种或多种第二共受体的一种或多种抗体或其抗原结合片段。某些实施方案包括有利于增加下游信号传导和相关生物学效应的WNT替代分子的第一和第二共受体结合区的特定结构形式或排列。
在具体实施方案中，本文所公开的WNT增强剂分子(也被称为RSPO模拟物)包含：(i)特异性结合一种或多种第一共受体(FZD或LRP5/6中的一种或多种)的一种或多种抗体或其抗原结合片段，其包括具有特定共受体特异性和/或功能特性的抗体或其抗原结合片段；(ii)特异性结合一种或多种E3连接酶(例如，ZNRF3和/或RNF43)的一种或多种多肽(例如，突变的R-脊椎蛋白)。某些实施方案包括有利于增加下游信号传导和相关生物效应的WNT超级激动剂分子的第一和第二共受体结合区的特定结构形式或排列。在具体实施方案中，WNT增强剂分子不与FZD受体和LRP5/6两者结合。
本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，除非明确指出相反，为了说明的目的，下文描述了其中的许多方法。此类技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel等人Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001)；Maniatis等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I&II卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编辑,1985)；Transcription andTranslation(B.Hames&S.Higgins编辑,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编辑,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)及其他相似的参考文献。
与一种或多种FZD受体结合的示例性抗体或其抗原结合片段或互补决定区(CDR)的序列在WO2019126399中列出。说明性LRP5和/或LRP6抗体或其抗原结合片段或互补决定区(CDR)的序列在WO2019126401中列出。结合一种或多种FZD受体和LRP5和/或LRP6的抗原结合分子的序列在分别于2017年12月19日、2018年3月9日和2018年6月4日递交的标题为“WNT信号传导通路激动剂(WNT Signaling Pathway Agonists)”的美国临时申请第62/607,875号、第62/641,217号和第62/680,522号中列出。
可以通过本领域熟知的方法制备抗体及其抗体片段。例如，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，其包括包含两个抗原结合位点的F(ab')2片段。根据本发明的某些实施方案使用的Fv片段可以通过IgM，并且在极少数情况下通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解切割产生。然而，Fv片段更常使用本领域已知的重组技术衍生。Fv片段包括非共价VH:VL异二聚体，其包括保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点。(参见例如，Inbar等人(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA69:2659-2662；Hochman等人(1976)Biochem 15:2706-2710；和Ehrlich等人(1980)Biochem 19:4091-4096)。
在某些实施方案中，包括单链Fv或scFV抗体。例如，可以使用标准分子生物学技术，遵循本申请关于选择具有所期望特异性的抗体的教导，制备κ抗体(Ill等人(1997),Prot.Eng.10:949-57；微型抗体(Martin等人(1994)EMBO J 13:5305-9；双链抗体(Holliger等人(1993)PNAS 90:6444-8；或janusins(Traunecker等人(1991)EMBO J 10:3655-59；和Traunecker等人(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:51-52.)。在其他实施方案中，可以制备包含本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包含来自不同抗体的CDR和框架区，而可以产生通过一个结合结构域特异性结合一种或多种FZD受体并通过第二结合结构域特异性结合第二分子的双特异性抗体。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生或者可以物理缀合在一起。
单链Fv(scFv)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其由基因融合表达，包括通过编码肽连接子连接的VH和VL编码基因。Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879-5883。已经描述了许多方法来辨别化学结构，以用于将来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻链和重链多肽链转化为scFv分子，该分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本相似的三维结构。参见，例如，Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号。以及Ladner等人的美国专利第4,946,778号。
在某些实施方案中，如本文所述的抗体是双链抗体形式。双链抗体是多肽的多聚体，每个多肽包含含有免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和含有免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，这两个结构域被连接(例如通过肽连接子)但不能彼此缔合以形成抗原结合位点：抗原结合位点通过多聚体中一个多肽的第一个结构域与该多聚体中另一个多肽的第二个结构域的缔合而形成(WO94/13804)。抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.等人(1989)Nature 341:544-546)。
在要使用双特异性抗体的情况下，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以以多种方式制造(Holliger,P.和Winter G.(1993)Curr.Op.Biotechnol.4:446-449)，例如用化学方法或从杂交杂交瘤制备，或者可以是上述任何双特异性抗体片段。可以在没有Fc区的情况下，仅使用可变结构域构建双链抗体和scFv，这可能会降低抗独特型反应的影响。
与双特异性完整抗体相反，双特异性双链抗体也可能特别有用，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。使用噬菌体展示(WO94/13804)从文库中可以容易地选择具有适当结合特异性的双链抗体(和许多其他多肽，如抗体片段)。如果双链抗体的一个臂要保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以建立一个文库，其中另一臂发生变化，并选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过杵进臼(knobs-into-holes)工程化制备(J.B.B.Ridgeway等人(1996)Protein Eng.,9:616-621)。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可以以
Figure BDA0003813636360000221
的形式提供。
Figure BDA0003813636360000222
是去除了铰链区的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht,The Netherlands；也参见，例如，US20090226421)。这种专有抗体技术创造了一种稳定、更小的抗体形式，与目前的小抗体形式相比，预期的治疗窗口更长。IgG4抗体被认为是惰性的，并因此不会与免疫***相互作用。完整人IgG4抗体可以通过消除抗体的铰链区来修饰，以获得相对于相应的完整IgG4(GenMab,Utrecht)具有不同稳定性特性的半分子片段。将IgG4分子减半仅在
Figure BDA0003813636360000231
上留下可以与同源抗原(例如疾病靶标)结合的一个区，并因此
Figure BDA0003813636360000232
仅与靶细胞上的一个位点单价结合。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以采取称为VHH的单个可变结构域片段的形式。VHH技术最初是在发现和鉴定骆驼科(例如骆驼和美洲驼)拥有仅由重链组成且因此缺乏轻链的完整功能抗体之后开发的。这些仅重链的抗体包含一个VHH结构域和两个恒定结构域(CH2、CH3)。克隆和分离的VHH结构域具有完整的抗原结合能力并且非常稳定。这些VHH结构域由单个基因编码，并在几乎所有原核和真核宿主(例如大肠杆菌(E.coli)(参见例如美国专利第6,765,087号)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)和酵母(例如酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属(参见例如美国专利第6,838,254号))中有效产生。生产过程是可扩展的，并且已经生产了数千克量的VHH。VHH可被配制成具有长保质期的即用型溶液。
Figure BDA0003813636360000233
方法(参见，例如，WO 06/079372)是一种用于基于B细胞的自动高通量选择，生成针对所需靶标的VHH的专有方法。VHH抗体通常具有约15kDa的小尺寸。
在某些实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来源于来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的其余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅包含移植到可变结构域中适当框架区的CDR。表位结合位点可以是野生型或被一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了人类个体中作为免疫原的恒定区，但对外来可变区的免疫应答的可能性仍然存在(LoBuglio,A.F.等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA86:4220-4224；Queen等人(1988)Proc Natl AcadSci USA 86:10029-10033；和Riechmann等人(1988)Nature 332:323-327)。本文所公开的抗FZD抗体人源化的示例性方法包括在美国专利第7,462,697号中所描述的方法。
另一种方法不仅聚焦于提供人类来源的恒定区，而且聚焦于修饰可变区以使它们尽可能接近人类形式。已知重链和轻链的可变区都包含三个互补决定区(CDR)，它们应答于所讨论的表位而变化并决定结合能力，侧接有四个框架区(FR)，它们在给定的物种中相对保守，并假定为CDR提供了支架。当针对特定表位制备非人类抗体时，可以通过将来源于非人类抗体的CDR移植到待修饰的人类抗体中存在的FR上来“重塑”或“人源化”可变区。以下参考文献已经报道了将该方法应用于各种抗体：Sato,K.等人(1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann,L.等人(1988)同上；Verhoeyen,M.等人(1988)Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等人(1991)Protein Engg 4:773-3783；Maeda,H.等人(1991)HumanAntibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:4181-4185；Tempest,P.R.等人(1991)Bio/Technol.9:266-271；Co,M.S.等人(1991)ProcNatl Acad Sci USA 88:2869-2873；Carter,P.等人(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289；和Co,M.S.等人(1992)J Immunol148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留了所有CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其他实施方案中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一、二、三、四、五、六个)，其也被称为“来源于”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体由可操作地连接或以其他方式融合至不同抗体的异源Fc部分的抗体的抗原结合片段组成。在某些实施方案中，异源Fc结构域是人源的。在其他实施方案中，异源Fc结构域可以来自与亲本抗体不同的Ig类别，包括IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)和IgM。在其他实施方案中，异源Fc结构域可以由来自不同Ig类别中的一种或多种的CH2和CH3结构域组成。如上文关于人源化抗体所述的，嵌合抗体的抗原结合片段可仅包含本文所述抗体的CDR中的一个或多个(例如，本文所述抗体的1、2、3、4、5或6个CDR)，或可以包含整个可变结构域(VL、VH或两者)。
III.受体替代配体(WNT替代分子)的结构
在某些方面，本公开提供了结合一种或多种第一受体(例如，FZD)和一种或多种第二受体(例如，LRP5和/或LRP6；也被称为LRP5/6)的替代分子。例如，WNT替代分子可以结合一种或多种人类FZD受体和一种或两种人类LRP5和/或人类LRP6。
在某些实施方案中，替代分子能够调节与和替代分子接触的细胞中其结合的至少一种共受体相关的信号传导事件。在某些实施方案中，替代分子增加受体信号传导。作为实例，WNT替代分子特异性调节人类WNT/β-连环蛋白信号传导通路的生物活性。
本发明的替代分子在结合一种或多种第一受体和一种或多种第二受体方面具有生物活性，并且作为实例，在WNT信号传导的激活中，WNT替代分子是WNT激动剂。术语“激动剂活性”是指激动剂模拟天然存在的蛋白质与第一和第二受体结合的效果或活性的能力。本文所公开的替代分子和其他受体激动剂模拟天然配体活性的能力可以通过许多测定来证实。作为实例，WNT替代分子(其中一些在本文中被公开)激活、增强或增加经典WNT/β-连环蛋白信号传导通路。
在具体实施方案中，本文所公开的替代分子的结构是双特异性的，即它们特异性结合两个或更多个不同表位，例如第一受体的一个或多个表位和第二受体的一个或多个表位。
在具体实施方案中，本文所公开的WNT替代分子是多价的，例如，它们包含各自特异性结合相同表位的两个或更多个区域，例如，结合一种或多种第一共受体内表位的两个或更多个区域和/或结合第二共受体内表位的两个或更多个区域。在具体实施方案中，它们包含与第一共受体内的表位结合的两个或更多个区域和与第二共受体内的表位结合的两个或更多个区域。在某些实施方案中，替代分子包含以下或约以下结合一种或多种第一共受体的区域数与结合第二共受体的区域数的比率：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、2:3、2:5、2:7、7:2、5:2、3:2、3:4、3:5、3:7、3:8、8:3、7:3、5:3、4:3、4:5、4:7、4:9、9:4、7:4、5:4、6:7、7:6、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。在某些实施方案中，替代分子是双特异性和多价的。
本文所公开的WNT替代分子的结构可以具有多种不同结构形式或构型中的任一种。替代分子可以包含多肽和/或非多肽结合部分(例如小分子)。在具体实施方案中，替代分子包含多肽区域和非多肽结合部分。在某些实施方案中，替代分子可以包含单个多肽，或者它们可以包含两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个多肽。在某些实施方案中，替代分子的一个或多个多肽是抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，替代蛋白包含两种抗体或其抗原结合片段，一种结合一种或多种第一共受体，且一种结合一种或多种第二共受体。在某些实施方案中，替代蛋白包含一个、两个、三个或四个多肽，例如，彼此连接或结合或彼此融合。图7中提供了本公开所设想的WNT替代蛋白结构的非限制性实例。
当替代分子包含单个多肽时，它们可以是包含一种或多种第一共受体结合结构域和一种或多种第二共受体结合结构域的融合蛋白。结合结构域可以直接融合或者它们可以经由连接子连接，例如，多肽连接子，包括但不限于本文所公开的那些中的任何一种。
当替代分子包含两个或更多个多肽时，多肽可以经由共价键(诸如例如二硫键)和/或非共价相互作用连接。例如，人免疫球蛋白IgG的重链在其CH3结构域水平上直接相互作用，而在其CH2结构域水平上，它们经由在DE转角中与天冬酰胺(Asn)N84.4连接的碳水化合物相互作用。在具体实施方案中，替代分子包含来源于抗体或其抗原结合片段的一个或多个区域，例如抗体重链或抗体轻链或其片段。在某些实施方案中，替代蛋白多肽包含经由一个或多个二硫键结合在一起的两个抗体重链区(例如，铰链区)。在某些实施方案中，替代蛋白多肽包含经由一个或多个二硫键结合在一起的抗体轻链区(例如，CL区)和抗体重链区(例如，CH1区)。
可以对替代蛋白多肽进行工程化以促进两个多肽之间的结合。例如，可以将杵进臼(Knob-into-holes)氨基酸修饰引入两个不同的多肽中以促进它们的结合。杵进臼氨基酸(AA)变化是抗体工程化中开发的一种合理设计策略，用于重链的异二聚化，用于产生双特异性IgG抗体。使AA变化工程化是为了在来自第一抗体的重链CH3上产生一个杵，并在第二抗体重链的CH3上产生一个臼。杵可以由属于AA的“非常大”的IMGT体积类别的酪氨酸(Y)表示，而臼可以由属于“小”的IMGT体积类别的苏氨酸(T)表示。将修饰引入多肽中以促进其结合的其他方法在本领域中是已知的并且是可用的。例如，可以引入特定氨基酸并将其用于交联，如半胱氨酸以形成分子间二硫键。
替代分子可以具有多种不同的结构形式，其包括但不限于在WO2019126398和WO2020010308中所描述的那些。
在一实施方案中，替代分子包含融合至VHH或其抗原结合片段的scFv或其抗原结合片段。在某些实施方案中，scFv特异性结合一种或多种第一受体，并且VHH特异性结合一种或多种第二受体。在某些实施方案中，scFv特异性结合LRP5和/或LRP6，并且VHH特异性结合一种或多种FZD受体。在具体实施方案中，scFv或其抗原结合片段直接融合至VHH或其抗原结合片段，而在其他实施方案中，两个结合区经由连接子部分融合。在具体实施方案中，VHH融合或连接至scFV的N-末端，而在其他实施方案中，VHH融合至scFv的C-末端。
在不同的实施方案中，包括但不限于WO2019126398、WO2020010308、表3、表4和图1-8中所示的那些，替代分子包含一种或多种Fab或其抗原结合片段以及一种或多种VHH或其抗原结合片段(或者可选地，一种或多种scFv或其抗原结合片段)。在某些实施方案中，Fab特异性结合一种或多种FZD受体，而VHH(或scFv)特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施方案中，Fab特异性结合LRP5和/或LRP6，并且VHH(或scFv)特异性结合一种或多种FZD受体。在某些实施方案中，VHH(或scFv)融合至Fab的N-末端，而在一些实施方案中，VHH(或scFv)融合至Fab的C-末端。在具体实施方案中，Fab以完整IgG形式存在，并且VHH(或scFv)融合至IgG轻链的N-末端和/或C-末端。在具体实施方案中，Fab以完整IgG形式存在，并且VHH(或scFv)融合至IgG重链的N-末端和/或C-末端。在具体实施方案中，两个或更多个VHH(或scFv)在这些位置的任何组合处融合至IgG。
Fab可以转化为包括Fab和Fc片段的完整IgG形式，例如，使用基因工程化产生包含融合至Fc区的Fab的融合多肽，即Fab以完整IgG形式存在。完整IgG形式的Fc区可以来源于多种不同Fc中的任一种，其包括但不限于野生型或修饰的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他同种型，例如野生型或修饰的人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgG4Pro(包括防止IgG4半分子形成的核心铰链区中的突变)、人IgA、人IgE、人IgM或被称为IgG1 LALAPG的修饰的IgG1。L235A、P329G(LALA-PG)变体已显示能够消除鼠IgG2a和人IgG1中的补体结合和固定以及Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。这些LALA-PG取代允许更准确地翻译在小鼠和灵长类动物之间利用“无效应”抗体框架支架产生的结果。在本文所公开的任何IgG的特定实施方案中，IgG包含以下氨基酸取代中的一个或多个：N297G、N297A、N297E、L234A、L235A或P236G。
提供了对一种或多种第一受体和一种或多种第二受体(例如，FZD和LRP)两者均是二价的共受体的二价和双特异性替代分子的非限制性实例，作为描述于WO2019126398和WO2020010308中的前四种结构，其中VHH或scFv以白色或灰色表示，并且Fab或IgG以黑色表示。如图所示的，VHH(或scFv)可以融合至两条轻链的N-末端、两条重链的N-末端、两条轻链的C-末端或两条重链的C-末端。进一步考虑，例如，VHH(或scFv)可以融合至重链和/或轻链的N-末端和C-末端、融合至轻链和重链的N-末端、融合至重链和轻链的C-末端、融合至重链的N-末端和轻链的C-末端、或融合至重链的C-末端和轻链的N-末端。在其他相关实施方案中，两个或更多个VHH(或scFv)可以融合在一起，任选地经由连接子部分，并在这些位置中的一个或多个处融合至Fab或IgG。在相关的实施方案中，替代分子具有杂IgG形式，而Fab作为半抗体存在，并且一个或多个VHH(或scFv)融合至以下中的一种或多种：Fc的N-末端、Fab的N-末端、Fc的C-末端或Fab的C-末端。这种形式的双特异性但单价的每种受体形式在图6中被描绘。在某些实施方案中，Fab或其抗原结合片段(或IgG)直接融合至VHH(或scFv)或其抗原结合片段，而在其他实施方案中，结合区经由连接子部分融合。在具体实施方案中，Fab在本文中被描述或包含本文中所描述的任何CDR组。
在不同的实施方案中，包括但不限于WO2019126398、WO2020010308、表3、表4和图1-8中所示的那些，抗原结合分子包含结合一种或多种第一受体(例如，FZD受体)的一个或多个Fab或其抗原结合片段，以及结合至少一种或多种第二受体(例如，LRP5和/或LRP6)的一个或多个Fab或其抗原结合片段。在具体实施方案中，其包含结合一种或多种第一共受体的两个Fab或其抗原结合片段，和/或结合一种或多种第二共受体的两个Fab或其抗原结合片段。在其他实施方案中，一个或多个Fab以完整IgG形式存在，并且在某些实施方案中，两个Fab以完整IgG形式存在。在某些实施方案中，完整IgG形式的Fab特异性结合一种或多种第一受体(例如，一种或多种FZD受体)，并且另一Fab特异性结合至少一种第二受体(例如，LRP5和/或LRP6)。例如，Fab特异性结合一种或多种FZD受体，并且完整IgG形式的Fab特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施方案中，Fab特异性结合LRP5和/或LRP6，并且完整IgG形式的Fab特异性结合一种或多种FZD受体。在某些实施方案中，Fab融合至IgG的N-末端，例如，融合至重链或轻链N-末端，任选地经由连接子融合至IgG的N-末端。在某些实施方案中，Fab融合至IgG重链的N-末端，而非融合至轻链。在具体实施方案中，两个重链可以直接或经由连接子融合在一起。图1A显示了对两种受体的此类双特异性和二价的实例。在其他相关实施方案中，两个或更多个VHH可以融合在一起，任选地经由连接子部分融合在一起，并且在这些位置中的一个或多个处融合至Fab或IgG。在相关的实施方案中，WNT替代分子具有杂IgG形式，而Fab中的一个作为半抗体存在，且另一个Fab融合至以下中的一种或多种：Fc的N-末端、Fab的N-末端、或Fc的C-末端。在图6中描绘了这种形式的每种受体形式的双特异性但单价。在某些实施方案中，Fab或其抗原结合片段直接融合至另一个Fab或IgG或其抗原结合片段，而在其他实施方案中，结合区经由连接子部分融合。在具体实施方案中，两种Fab中的一种或两种在本文中被描述或包含本文中所描述的任何CDR组。
在某些实施方案中，抗原结合分子具有如PCT申请公开第WO2017/136820号中所述的形式，例如Fab串联IgG(FIT-IG)形式。Shiyong Gong,Fang Ren,Danqing Wu,Xuan Wu&Chengbin Wu(2017)。FIT-IG还包括在例如，Gong等人(2017)mAbs 9:118-1128中公开的形式。在某些实施方案中，通过将两种亲本单克隆抗体的DNA序列重新排列成两种或三种构建体并在哺乳动物细胞中共表达它们，FIT-IG将两种抗体的功能组合到一个分子中。FIT-IG形式和构建体的实例在PCT申请公开第WO2017/136820号的图1A和图1B以及图2A和图2B中提供。在某些实施方案中，FIT-IG不需要Fc突变；没有scFv元件；并且没有连接子或肽连接器。每个臂中的Fab结构域“串联”工作，形成具有四个活性和独立的抗原结合位点的四价双特异性抗体，这些位点保留其亲本抗体的生物学功能。在具体实施方案中，WNT替代蛋白包含Fab和IgG。在某些实施方案中，Fab结合物LC与IgG的HC融合，例如，通过其间不同长度的连接子融合。在各种实施方案中，Fab结合物HC可以与IgG的LC融合或不融合。这种形式的一种变体被称为Fab串联IgG(或FIT-Ig)。
在某些实施方案中，WNT替代分子具有在PCT申请公开第WO2009/080251号(Klein等人)中所描述的形式，例如CrossMab形式。在Schaefer等人(2011)Proc.Natl.Acad.SciUSA 108:11187-11192中也描述了CrossMabs形式。CrossMab形式允许正确组装来源于现有抗体的两条重链和两条轻链，以形成双特异性、二价IgG抗体。该技术基于双特异性IgG抗体的一个Fab臂内的抗体结构域的交叉，以实现正确的链缔合。可以交换Fab的各个部分，例如可以交换整个Fab、可变重链和轻链或CH1-CL链。
在本发明的其他实施方案中，如图1A和表2中所示的，组合FiT-Ig和CrossMab技术以产生多特异性、多价抗原结合分子Cross-FiT。还设想了跨越Fab的CL结构域和Ig结构域之间，而不是CH1和Ig结构域之间的连接子。另外的抗原结合片段(例如Fab、VHH/sdAb、和/或scFv)可以在不同位点(例如重链或轻链和/或Fc结构域的C-末端处)附接到Cross-FiT结构，以创建多特异性抗体。
在具体实施方案中，替代分子包含两个或更多个VHH/sdAb(或scFv)，包括结合一种或多种第一受体的至少一个VHH/sdAb(或scFv)和结合至少一种第二受体的至少一个VHH/sdAb(或scFv)。在某些实施方案中，结合区之一是VHH/sdAb，并且另一个是scFv。包含两个或更多个VHH/sdAb(或scFv)的替代分子可以为多种构型的形式，包括但不限于在WO2019126398和WO2020010308中所描述的那些。在某些双特异性、二价形式中，两个或更多个VHH/sdAb(或scFv)串联融合或融合至Fc的两个不同末端，任选地经由一个或多个连接子串联融合或融合至Fc的两个不同末端。在存在连接子的情况下，连接子及其长度在VHH/sdAb(或scFv)与另一VHH/sdAb(或scFv)之间或在VHH与Fc之间可以相同或不同。例如，在某些实施方案中，VHH/sdAb在重链或轻链的N-末端和/或IgG重链的C-末端处融合。在具体实施方案中，两个或更多个VHH/sdAb在这些位置的任何组合处与IgG融合。在不同的实施方案中，两个VHH/sdAb都可以融合至Fc的N-末端、融合至Fc的C-末端，或者一个或多个VHH/sdAb可以融合至以下中的一种或两种：Fc的N-末端或C-末端。在相关实施方案中，替代分子具有异型IgG形式，而一个VHH/sdAb作为半抗体存在，并且另一个融合至Fc的N-末端或Fc的C-末端。在某些实施方案中，VHH/sdAb直接融合至另一个VHH/sdAb，而在其他实施方案中，结合区经由连接子部分融合。在具体实施方案中，VHH/sdAb在本文中被描述或包含本文中描述的任何CDR组。在不同的实施方案中，这些形式中的任何一种可以包含一种或多种scFv来代替一种或多种VHH/sdAb。
在某些实施方案中，替代分子为双链抗体的形式。针对两种共受体的结合剂也可以以双链抗体(或DART)构型连接在一起。双链抗体也可以是单链构型。如果双链抗体与Fc融合，这将产生二价双特异性形式。如果不与Fc融合，这将是一种单价双特异性形式。在某些实施方案中，双链抗体是由通过小肽连接子连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成的非共价二聚体scFv片段。另一种形式的双链抗体是单链(Fv)2，其中两个scFv片段彼此共价连接。
如所讨论的，在不同的实施方案中，替代分子包含本文所公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段。因此，在具体实施方案中，替代物包含两种多肽，其中每种多肽包含结合至少一种第一共受体的Nab或scFv，以及结合至少一种第二共受体的Nab或scFv，任选地其中一个结合结构域是scFv，且另一个是Nab。在某些实施方案中，替代物包含三种多肽，其中第一多肽包含抗体重链并且第二多肽包含抗体轻链，其中抗体重链和轻链结合任一受体，并且其中第三多肽包含融合至重链Fc区或抗体轻链的VHH/sdAb，其中VHH/sdAb结合任一共受体。在其他实施方案中，替代物包含四种多肽，其包括两条重链多肽和两条轻链多肽，其中两条重链和两条轻链结合一种或多种第一受体，并且还包含融合至一条或多条重链和/或轻链的一个或多个VHH/sdAb或scFv，其中VHH/sdAb或scFv结合一种或多种第二共受体。在示例性实施方案中，WNT替代物包含至少四条多肽，其包括结合LRP5/6或一个或多个FZD的两条重链多肽和两条轻链多肽，其中WNT替代物还包含结合LRP5/6或一个或多个FZD的Fab。例如，Fab可以包含每条融合至两条重链多肽之一的两条多肽，和每条融合至两条轻链多肽之一的两条多肽，或者它可以包含每条融合至两条重链多肽之一的两条多肽以及每条都与融合至重链多肽的两条多肽之一结合的两条另外的多肽，从而产生第二Fab。本文所公开的其他构型可被用于产生不同的替代分子。
还考虑了Ig分子，其中一个Ig的VL结构域和VH结构域附接有第二抗体的VL结构域和VH结构域。对于同型二聚体，这种形式称为Fv-Ig或2Fv-Ig。来自第二Ig的VL结构域和VH结构域经由短肽连接子附接到第一Ig的VL结构域和VH结构域的N-末端。这种形式保留了天然抗体对细胞表面受体或对多于一种受体或共受体复合物的亲合力(参见，例如，Wu等人(2007)Nature Biotechnol.25:1290-1297)
在某些实施方案中，抗原结合形式是替代分子，其包含含有两个或更多个结合区的一种或多种多肽。为了说明的目的，两个或更多个结合区可以是第一受体结合区或第二受体结合区，或者它们可以包含一个或多个第一受体结合区和一个或多个第二受体结合区。结合区可以直接连接或连续，或者可以通过连接子(例如多肽连接子，或非肽连接子等)分开。连接子的长度以及因此结合结构域之间的间距可以被用于调节信号强度，并且可以根据替代分子的所期望的用途进行选择。结合结构域之间的强制距离可以变化，但在某些实施方案中，可以小于约100埃、小于约90埃、小于约80埃、小于约70埃、小于约60埃或小于约50埃。在一些实施方案中，连接子是刚性连接子，在其他实施方案中，连接子是柔性连接子。在连接子是肽连接子的某些实施方案中，其长度可为约1-30个氨基酸、约5-15个氨基酸或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸，并且具有足够的长度和氨基酸组成以加强结合结构域之间的距离。在一些实施方案中，连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基或由一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
替代分子可以被多聚化，例如通过Fc结构域、通过串接、卷曲的卷、多肽拉链、生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白多聚化等。如本领域已知的，替代分子也可以与诸如PEG、Fc等的部分连接以增强体内稳定性。
在某些实施方案中，如在上述测定中测量的，例如如在TOPFIash测定中测量的(参见，例如，Molinaar(1996)Cell 86:391-399)，与由中性物质或阴性对照诱导的β-连环蛋白信号传导相比，替代分子增强或增加共受体通路信号传导，例如，在WNT-β-连环蛋白信号传导的情况下，至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。这些测定中可以包括阴性对照。例如，当测量时，例如当在TOPFIash测定中测量时，与不存在WNT替代分子时的活性相比，WNT替代分子可将β-连环蛋白信号传导增强2×、5×、10×、100×、1000×、10000×或更多的倍数。
在某些实施方案中，替代分子(和WNT超级激动剂和WNT增强剂或RSPO模拟物)的功能特性可以使用技术人员已知的多种方法来评估，包括例如亲和力/结合测定(例如，表面等离子体共振、竞争性抑制测定)、细胞毒性测定、细胞活力测定、应答于天然分子/配体的细胞增殖或分化测定、使用体外或体内模型的癌细胞和/或肿瘤生长抑制，包括但不限于本文所描述的任一种。也可以测试替代分子对一种或两种共受体内化、体外和体内功效等的影响。可以使用技术人员已知的完善的方案(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；Current Protocolsin Immunology(编辑:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,EthanM.Shevach,Warren Strober 2001John Wiley&Sons,NY,NY)；或可商购获得的试剂盒进行此类测定。
在某些实施方案中，替代分子(例如，抗FZD抗体的抗原结合片段)的结合区包含抗共受体抗体的一个或多个CDR。在这点上，已经显示在一些情况下可以进行仅转移抗体的VHCDR3，同时仍保留所期望的特异性结合(Barbas等人，PNAS(1995)92:2529-2533)。还参见，McLane等人，PNAS(1995)92:5214-5218,Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2161-2162)。
本文还公开了用于获得特异性针对共受体的抗体或抗原结合结构域的方法，该方法包括通过添加、缺失、取代或***的方式在本文中列出的VH结构域或作为VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域的氨基酸序列中提供一个或多个氨基酸，任选地将由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，并测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合，以鉴定特异性结合成员或特异性针对一种或多种共受体并任选地具有一种或多种所期望的特性的抗体抗原结合结构域。VL结构域可以具有基本上如本文所列的氨基酸序列。可以采用类似的方法，其中本文所公开的VL结构域的一种或多种序列变体与一种或多种VH结构域组合。
免疫结合通常是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异性针对的抗原之间发生的非共价类型的相互作用，例如通过说明而非限制的方式，由于静电、离子、亲水和/或疏水吸引或排斥、空间力、氢键、范德华力和其他相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)来表示，其中较小的Kd代表较大的亲和力。可以使用本领域熟知的方法对所选多肽的免疫结合特性进行量化。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同样影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)都可以通过计算浓度和实际结合和解离速率来确定。Koff/Kon的比率能够消除与亲和力无关的所有参数，并因此等于解离常数Kd。一般参见Davies等人(1990)AnnualRev.Biochem.59:439-473。
在某些实施方案中，本文所述的替代分子或其结合区具有以下的亲和力：小于约10,000nM、小于约1000nM、小于约100nM、小于约10nM、小于约1nM，或小于约0.1nM，并且在一些实施方案中，抗体可以对一种或多种共受体具有甚至更高的亲和力。
免疫球蛋白的恒定区显示出比可变区更少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生物化学事件。在人类中，有五种不同类型的抗体，其包括IgA(其包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(其包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)和IgM。这些抗体类别之间的区别特征是它们的恒定区，尽管V区中可能存在更细微的差异。本文所公开的分子可以包含任何类别、亚类或同种型的抗体恒定区。
抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，赋予被称为效应功能的一系列重要功能能力。对于IgG，Fc区包含Ig结构域CH2和CH3以及通向CH2的N-末端铰链。IgG类的一个重要的Fc受体家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体和免疫***细胞臂之间的通信(Raghavan等人，1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ravetch等人，2001,AnnuRev Immunol 19:275-290)。在人类中，该蛋白家族包括FcγRI(CD64)，其包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，其包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，其包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人，2002,Immunol Lett 82:57-65)。这些受体通常具有介导与Fc结合的细胞外结构域、跨膜区和可介导细胞内一些信号传导事件的细胞内结构域。这些受体在多种免疫细胞中表达，所述免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞和T细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的位点，通常导致细胞内的信号传导事件和重要的后续免疫应答，如炎症介质的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。
介导细胞毒性和吞噬效应功能的能力是抗体破坏靶向的细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后导致靶细胞裂解的细胞介导反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等人，1996,Annu RevCell Dev Biol12:181-220；Ghetie等人，2000,Annu Rev Immunol 18:739-766；Ravetch等人，2001,Annu Rev Immunol 19:275-290)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞吞噬的细胞介导反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。所有FcγR在Cg2(CH2)结构域的N-末端和前面的铰链处结合Fc上的相同区域。这种相互作用在结构上得到了很好的表征(Sondermann等人，2001,J MolBiol309:737-749)，并且已经解决了与人FcγRIIIb的细胞外结构域结合的人Fc的几种结构(pdb登录代码1E4K)(Sondermann等人，2000,Nature 406:267-273)(pdb登录代码1IIS和1IIX)(Radaev等人，2001,J Biol Chem276:16469-16477)。
不同的IgG亚类对FcγR具有不同的亲和力，其中与IgG2和IgG4相比，IgGl和IgG3通常对受体的结合要好得多(Jefferis等人，2002,Immunol Lett 82:57-65)。所有FcγR结合IgG Fc上的相同区域，但亲和力不同：高亲和力结合物FcγRI对IgG1的Kd为10-8M-1，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII通常分别以10-6和10-5结合。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外结构域具有96％的同一性；然而，FcγRIIIb没有细胞内信号传导结构域。此外，虽然FcγR、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发激活的正调节因子，其特征在于具有具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞内结构域，但FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，并因此是抑制性的。因此前者被称为激活受体，且FcγRIIb被称为抑制受体。受体在不同免疫细胞上的表达模式和水平也不同。另一个复杂程度是人类蛋白质组中存在许多FcγR多态性。具有临床意义的特别相关的多态性是V158/F158 FcγRIIIa。人IgG1对V158同种异型的亲和力比对F158同种异型的亲和力更大。这种亲和力差异，以及推测其对ADCC和/或ADCP的影响，已被证明是抗CD20抗体利妥昔单抗(
Figure BDA0003813636360000361
IDECPharmaceuticals Corporation的注册商标)功效的重要决定因素。具有V158同种异型的对象对利妥昔单抗治疗应答良好；然而，具有较低亲和力F158同种异型的对象反应较差(Cartron等人，2002,Blood 99:754-758)。大约10％-20％的人是V158/V158纯合子，45％是V158/F158杂合子，且35％-45％的人是F158/F158纯合子(Lehrnbecher等人，1999,Blood94:4220-4232；Cartron等人，2002,Blood 99:754-758)。因此，80％-90％的人是不良应答者，也就是说，它们至少有一个F158 FcγRIIIa等位基因。
Fc区也参与补体级联的激活。在经典补体通路中，C1及其C1q亚基与IgG或IgM的Fc片段结合，后者与抗原形成复合物。在本发明的某些实施方案中，对Fc区的修饰包括改变(增强或降低)如本文所述的FZD特异性抗体激活补体***的能力的修饰(参见例如美国专利7,740,847)。为了评估补体激活，可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,202:163(1996))。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了具有修饰的Fc区的替代分子，该修饰的Fc区具有改变的功能特性，如降低或增强的CDC、ADCC或ADCP活性，或增强的对特定FcγR的结合亲和力或增加的血清半衰期。本文所考虑的其他修饰的Fc区描述于，例如，已发布的美国专利7,317,091；7,657,380；7,662,925；6,538,124；6,528,624；7,297,775；7,364,731；公开的美国申请US2009092599；US20080131435；US20080138344；和公开的国际申请WO2006/105338；WO2004/063351；WO2006/088494；WO2007/024249中。
在结构上，Fc区对于msAb的正确组装可能是重要的。特别地，对CH3结构域的修饰，如杵进臼(参见，例如，WO1996/027011；和WO1998/050431)或Azymetric突变(参见，例如，WO2012/58768)可以防止重链错配。本发明在某些Fc实施方案中利用这些突变。
本文所公开的替代分子也可以被修饰以包括表位标签或标记，例如用于纯化或诊断应用。本领域已知有许多用于制备抗体缀合物的连接基团，包括，例如公开于以下中的那些：美国专利第5,208,020号或EP专利0 425 235B1和Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)。连接基团包括二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如上述专利中所公开的，优选二硫基和硫醚基。
在某些实施方案中，且其抗原结合片段针对一种共受体和/或抗体及其抗原结合片段针对替代分子中存在的其他共受体是单克隆的。在某些实施方案中，它们是人源化的。
IV.WNT信号增强分子(WNT增强剂)
RSPO能够放大WNT信号。RSPO的最小功能单元由两个Furin结构域组成，Furin结构域1与ZNRF3/RNF43 E3连接酶结合，且Furin结构域2与LGR4-6结合，将RSPO、LGR和E3连接酶的三元复合物结合在一起。这使得整个复合物的内化和去除ZNRF3/RNF43远离其破坏靶标。单独的Furin结构域1没有功能，但它能够与ZNRF3和RNF43结合。在具体实施方案中，当与WNT或WNT替代分子组合使用时(例如，接触细胞)，与仅使用WNT或WNT替代物时相比，WNT信号增强分子增加信号传导，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。
本文所述的负责增强WNT信号传导的作用模块或E3连接酶结合结构域可以是但不限于可与ZNRF3/RNF43连接酶结合的任何功能部分，例如多肽、抗体或其片段、或有机化学品。在具体实施方案中，作用模块，例如包含RSPO的Furin结构域1的多肽，单独或与组织特异性靶向模块一起(其在非靶组织中可能基本上无活性，以最小化潜在的脱靶效应)。作用模块与至少一种WNT受体或受体结合结构域融合或结合，并且当E3连接酶ZNRF3/RNF43被募集到三元组时，使得它们重新定位在细胞表面上、隔离，和/或从细胞表面清除。
在某些实施方案中，作用模块或E3连接酶结合结构域包含RSPO多肽(例如，RSPO1-4中的任一个)的片段或变体，或其功能片段或变体。在具体实施方案中，作用模块包含野生型RSPO的片段，并且在其他实施方案中，作用模块包含含有一种或多种氨基酸修饰的RSPO片段。RSPO可以是本领域已知的任何RSPO或其同源物，包括来自任何动物物种的RSPO，包括但不限于哺乳动物物种，如人RSPO。RSPO已被鉴定和描述，并且它们的多肽和编码多核苷酸序列是本领结构域已知的和可获得的。在具体实施方案中，RSPO多肽是人RSPO或在其他脊椎动物或非脊椎动物中发现的同源物，例如小鼠RSPO。它们的同源物和变体可从一般数据库搜索中获得，如https://www.dot.ncbi.dot.nlm.dot.nih.dot.gov/protein/。本发明包括(但不限于)作用模块，其包含任何这些或其他RSPO(特别是RSPO 2)的片段和变体或由任何这些或其他RSPO(特别是RSPO 2)的片段和变体组成。在不同的实施方案中，任何RSPO多肽及其片段的变体包含与野生型RSPO多肽相比，一种或多种氨基酸修饰(例如缺失、添加或取代)。修饰可以存在于RSPO变体或其片段的任何区域中，包括但不限于Furin结构域1和/或Furin结构域2。在具体实施方案中，RSPO是在Furin结构域2中含有突变(例如F105R和F109A)的RSPO 2，导致LGR4-6结合被取消。这种突变的RSPO被称为“RSPO2RA”。应当理解，Furin结构域1或Furin结构域2之外的氨基酸修饰可以改变所得变体，使得所得变体与野生型RSPO或其片段相比具有降低的LGR4-6结合活性。
在某些实施方案中，作用模块包含RSPO序列或由RSPO序列组成，例如全长或野生型RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3或RSPO-4，任选地人RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3或RSPO-4，或其变体或片段。在具体实施方案中，它是与相应的野生型RSPO-1-4序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的RSPO-1-4变体。在某些实施方案中，作用模块包含含有一种或多种氨基酸修饰的全长RSPO(例如，RSPO-1-4中的任一种)或由包含一种或多种氨基酸修饰的全长RSPO(例如，RSPO-1-4中的任一种)组成，包括但不限于本文所公开的那些中的任一种。在某些实施方案中，作用模块包含野生型或修饰的RSPO(例如，RSPO-1-4中的任一种)的片段或由野生型或修饰的RSPO(例如，RSPO-1-4中的任一种)的片段组成。在具体实施方案中，片段能够结合ZNRF3和/或RNF43。在某些实施方案中，作用模式包含RSPO蛋白的Furin结构域1、或RSPO蛋白的片段或变体。在某些实施方案中，作用模块包含与RSPO Furin结构域1具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的一种或多种(例如，RSPO蛋白(例如，RSPO-1-4)的1个、2个或3个或更多个Furin结构域1，或其变体或由与RSPO Furin结构域1具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的一种或多种(例如，RSPO蛋白(例如，RSPO-1-4)的1个、2个或3个或更多个Furin结构域1，或其变体组成。在某些实施方案中，作用模块包含RSPOFurin 1结构域或其变体或片段和RSPO Furin 2结构域或其变体或片段。在某些实施方案中，作用模块包含结合ZNRF3/RNF43的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，作用模块特异性结合ZNRF3或RNF43。ZNRF3/RNF43结合分子的实例描述于WO2020014271中。
在某些实施方案中，作用模块或E3连接酶结合结构域包含RSPO(例如，人RSPO 1或人RSPO 2)的一个或多个Furin结构域1或其变体。在某些实施方案中，作用模块包含RSPO的一个或多个Furin结构域1，但其不包含RSPO的Furin结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含RSPO的一个或多个Furin结构域1，并且其包含RSPO的修饰的或变体Furin结构域2，例如，与野生型Furin结构域2相比具有降低的活性的Furin结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含具有RSPO的修饰的或变体Furin结构域2的RSPO蛋白，例如，与野生型Furin结构域2相比具有降低的活性的Furin结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含两个或更多个Furin结构域1或其变体，或Furin结构域1或其变体的多聚体。在某些实施方案中，作用模块包含变体RSPO Furin 1结构域，其包含一个或多个点突变，例如，在对应于人RSPO 2的K58、H76、S77、R86和/或N91的氨基酸残基处。在某些实施方案中，作用模块包含变体RSPO Furin2结构域，其包含一个或多个点突变，例如，在对应于F105、F109(例如，“RSPO2RA”)，和/或人RSPO 2的K121的氨基酸残基处。在具体实施方案中，作用模块包含RSPO的修饰的或变体Furin结构域1，其与野生型Furin结构域1相比具有增加的活性，例如，结合ZNRF3/RNF43。作用模块或E3连接酶结合结构域还可以包含另外的部分或多肽序列，例如，另外的氨基酸残基，以稳定其所存在的WNT信号增强分子的结构。在某些实施方案中，作用模块包含肽或多肽，其与RSPO没有明显的/强序列同源性，但与RSPO对ZNRF3/RNF43的结合亲和力相比，对ZNRF3/RNF43具有相当或更高的结合亲和力。
在某些实施方案中，作用模块或E3连接酶结合结构域包含RSPO多肽(例如，人RSPO)的Furin结构域1或其功能片段或变体，以及RSPO多肽(例如，人RSPO)的修饰的或变体Furin结构域2，其中与相应的野生型Furin结构域2相比，修饰的Furin结构域2与LGR4-6具有降低的结合亲和力。在某些实施方案中，Furin结构域2包含一个或多个点突变，例如，在对应于人RSPO 2的F105和/或F109的氨基酸残基处。技术人员可以通过将它们的氨基酸序列与人RSPO 2比较，容易地确定其他RSPO多肽中相应的氨基酸残基。在某些实施方案中，作用模块或E3连接酶结合结构域包含Furin结构域1或其变体以及Furin结构域2或其变体，其中Furin结构域1和/或Furin结构域2包含一个或多个点突变。作用模块或E3连接酶结合结构域中的一个或多个点突变(与相应的野生型RSPO序列相比)可发生于Furin结构域1和/或Furin结构域2内的任何氨基酸残基处，包括但不限于，例如，在氨基酸残基K58、H76、S77、R86、N91、F105、F109或K121处，以及可被修饰以减少与LGR4-6的结合亲和力的其他残基处。已鉴定出对其功能活性重要的人RSPO 1的Furin结构域1和Furin结构域2的区域，其包括保守性亲水性残基S48、N51、R66、R70和Q71，和较低保守性疏水性残基L46、L54、I62和L64，它们对结合E3连接酶很重要。另外，在人RSPO 1Furin结构域1中，氨基酸残基K59、S78、D85、R87、N88和N92与LGR5形成疏水相互作用表面，并且FSHNF氨基酸序列已被鉴定为对疏水表面很重要的环。
在具体实施方案中，包含RSPO Furin结构域1和/或Furin结构域2的作用模块或E3连接酶结合结构域可以包含这些区域、表面或氨基酸残基中的任一个内的一个或多个突变。在具体实施方案中，包含RSPO Furin结构域1和/或Furin结构域2的作用模块可以包含超出这些区域、表面或氨基酸残基的一个或多个突变或其他改变，其通过影响结合表面的结构和/或稳定性而间接包含LGR4-6结合。在某些实施方案中，包含RSPO Furin结构域1和/或Furin结构域2的作用模块可以在任何氨基酸残基处包含一个或多个突变，其包括但不限于所附实施例中所示那些中的任一个。在具体实施方案中，作用模块包含在氨基酸残基F105和/或F109(例如，RSPO2RA)处包含氨基酸取代的Furin 1结构域和修饰的Furin结构域2。在具体实施方案中，作用模块包含修饰的Furin 1结构域和修饰的Furin 2结构域，其中在某些实施方案中，修饰的Furin 1结构域在氨基酸R65、R69和/或Q70处包含一种或多种氨基酸修饰，并且修饰的Furin结构域在氨基酸F105和/或F109处包含一种或多种氨基酸修饰。在具体实施方案中，例如，在完整长度RSPO蛋白的上下文中，修饰的Furin结构域2具有的与LGR4-6的结合亲和力比相应的野生型Furin结构域2的结合小80％、小50％、小20％或小10％。
在某些实施方案中，作用模块或E3连接酶结合结构域包含RSPO多肽(例如，人RSPO)的Furin结构域1或其功能片段或变体，以及RSPO多肽(例如，人RSPO)的未修饰的Furin结构域2。虽然在某些实施方案中，与相应的野生型Furin结构域2相比，对LGR4-6的结合亲和力降低的修饰的Furin结构域2对于增加组织靶向的特异性是更期望的，但在具体实施方案中，与没有靶向模块且在某些情况下具有实用性的野生型RSPO相比，与靶向模块组合的未修饰的Furin结构域2具有改善的组织靶向性。
在某些实施方案中，作用模块或E3连接酶结合结构域包含野生型或修饰的RSPOFurin结构域1，例如，来自RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3、RSPO-4(任选地人RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3或RSPO-4)中的任一个。在具体实施方案中，作用模块包含RSPO Furin 1结构域和野生型或修饰的RSPO Furin 2结构域，例如，来自RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3、RSPO-4(任选地人RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3或RSPO-4)中的任一个。在具体实施方案中，作用模块包含第一RSPOFurin 1结构域和第二野生型或修饰的RSPO Furin 1结构域，例如，来自RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3、RSPO-4(任选地人RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3或RSPO-4)中的任一个。在具体实施方案中，例如，在完整长度RSPO蛋白的上下文中，修饰的Furin结构域2与LGR4-6具有与相应野生型Furin结构域2的结合相当的结合亲和力，或者与LGR4-6的结合亲和力比相应野生型Furin结构域2的结合小80％、小50％、小20％或小10％。在某些实施方案中，作用模块包含特异性结合ZNRF3和/或RNF43的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，作用模块包含结合人RNF43(hRNF43,NCBI参考序列XP_011523257.1)或人ZNRF3(hZNRF3；NCBI参考序列NP_001193927.1)的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，作用模块是抗体或其抗原结合片段，其包含：a)WO2020014271的任何抗体所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列(例如，参见表2A)；和/或b)WO2020014271的任何抗体所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列(例如，参见表2A)，或所述抗体或其抗原结合片段的变体，其包含一种或多种氨基酸修饰，其中所述变体在所述CDR序列中包含少于8个氨基酸取代。
V.WNT超级激动剂结构
本发明涵盖WNT超级激动剂分子，特别是含有WNT替代物(例如，FZD结合剂和LRP结合剂)与WNT增强剂(例如，RSPO蛋白或E3连接酶结合剂)组合的分子。令人惊讶地发现，包含WNT替代物和WNT增强剂的分子充当WNT超级激动剂，并比WNT替代物诱导更高水平的WNT信号传导通路活性。特别地，基于以前PROTAC的研究，即Deshaies,R.J.,Nature,第580卷,2020年4月16日,第329页)，预期将E3连接酶结合结构域融合至WNT替代物将增强WNT替代物的靶受体的泛素化，并产生拮抗作用。类似地，之前的研究表明，Disheveled与WNT受体结合并作为衔接子将ZNRF3和RNF43 E3泛素连接酶靶向WNT受体，导致它们的降解(Jiang,X.等人，2015,Molecular Cell 58,522–533)。因此，令人惊讶且出乎意料地发现本文所公开的WNT增强剂(或RSPO模拟物，其中E3连接酶结合结构域融合至FZD或LRP结合结构域)和WNT超级激动剂使得细胞表面上FZD蛋白水平增加并实际上刺激了WNT信号传导通路。
在某些实施方案中，如上述测定中所测量的，例如如TOPFlash测定中所测量的(参见，例如，Molinaar(1996)Cell 86:391-399)，与由中性物质或阴性对照诱导的β-连环蛋白信号传导相比，WNT超级激动剂分子增强或增加共受体通路信号传导，例如，在WNT-β-连环蛋白信号传导的情况下，至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％,110％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子包含结合一种或多种FZD的第一结合结构域；结合LRP5/6的第二结合结构域；和包含WNT增强剂的第三结构域，例如，其中所述WNT增强剂包含E3连接酶结合结构域。这些结构域可以存在于一种、两种、三种或四种多肽上。当存在于多于一种的多肽上时，两种或更多种多肽可以彼此结合以形成WNT超级激动剂。表4和图8A-图8B中提供了本公开所考虑的各种WNT超级激动剂结构的非限制性实例。
在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子包含本文针对WNT替代分子所公开的任何结构，同时还包含WNT增强剂结构域和任选地靶向模块。在一些实施方案中，WNT增强剂结构域包含RSPO蛋白或其功能变体或片段。在一些实施方案中，WNT增强剂结构域结合一种或多种E3连接酶。在具体实施方案中，WNT增强剂结构域未实质上结合LGR。在具体实施方案中，WNT增强剂结构域是缺少LGR结合区的突变的RSPO。
在一些实施方案中，WNT超级激动剂分子还包含靶向模块，例如，结合特定细胞类型或组织类型的靶向模块。在WNT超级激动剂的某些实施方案中，一种或多种WNT增强剂结构域融合至WNT替代分子中存在的任何多肽的任一端。在具体实施方案中，在WNT超级激动剂中存在1个、2个、3个或4个WNT增强剂结构域。
在某些实施方案中，WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂包含或具有结构，其包括但不限于：串联scFv、scFv-IgG、Fv-IgG、Fab-IgG、VHH-IgG或Fv-Fab(参见，例如，图1A的一般结构和图2A、2D、2E、3A、3J、3L、3M、4、7、8A、8B以及表3和4的特定结构)。
串联scFv超级激动剂通过将第一scFv连接或直接融合至第二scFv分子的C-末端或N-末端来产生和组装。在一种形式中，第一scFv可以结合一种或多种FZD受体，且第二scFv可以结合一种或多种LRP受体。在可选的形式中，第一scFv可以结合一种或多种LRP受体，且第二scFv可以结合一种或多种FZD受体。scFv分子之一也可以在其C-末端连接或直接融合至Fc分子的N-末端。在WNT超级激动剂的某些实施方案中，WNT增强剂连接或融合至第一scFv的N-末端，该N-末端进而连接或融合至第二scFv的N-末端，第二scFv的N-末端连接或融合至Fc分子的N-末端。在可选的实施方案中，WNT增强剂与Fc分子的C-末端连接或融合，后者进而与一个scFv分子的C-末端连接或融合，该scFv分子在其N-末端连接或融合至第二scFv分子的C-末端。
Fab-IgG分子，其中FZD和LRP结合物都是Fab，可以以各种方法组装，如电荷配对、杵进臼、Fab的重链和轻链的交叉等。在电荷配对中，抗LRP6 Fab或抗FZD Fab的重链(VH-CH1)结构域(通过直接融合或连接子，例如1-30或5-15个氨基酸(例如5、10或15-mer氨基酸)的连接子)与抗FZD或抗LRP结合剂的重链(VH-CH1-CH2-CH3)N-末端串联融合。在某些实施方案中，也被称为串联Fab(FiT)，抗LRP6和抗FZD的VH-CH1结构域均包含三个氨基酸突变(抗LRP6 Fab中的Q39D、Q105D、S183K；抗FZD Fab中的Q39K、Q105K、S183E)，各自与它们自己的伴侣轻链正确配对，其中还包含三个互补的氨基酸突变(抗LRP6轻链中的Q38K、A/S43K、S176E；抗FZD轻链中的Q38D、A/S43D、S176K)。抗LRP6和抗FZD Fab的顺序可以颠倒，其中抗FZD结合剂是Fab，并与IgG形式的抗LRP结合剂融合。在某些实施方案中，WNT增强剂可以与Fab连接，至离IgG结构域最远的Fab Vh或Vl的N-末端。在其他实施方案中，WNT增强剂与IgG结构域的C-末端连接。
IgG上Fab形式的HC-LC交叉方法：抗LRP6结合剂的轻链(VL-CL)结构域(通过直接融合或连接子，例如1-30个或5-15个氨基酸(例如5、10或15-mer氨基酸)的连接子)与抗FZD结合剂的重链(VH-CH1-CH2-CH3)的N-末端串联融合。第二构建体是抗LRP6结合剂的VH-CH1，且第三构建体是抗FZD结合剂的VL-CL。与上述实例类似，抗LRP6和抗FZD结合剂的顺序可以颠倒，其中抗FZD结合剂Fab融合至IgG形式的抗LRP结合剂的N-末端。同样如上所述，WNT增强剂可以与离IgG结构域最远的交叉Fab的VH或VL的N-末端连接，或与IgG结构域的C-末端连接。
在某些实施方案中，WNT超级激动剂的WNT替代物区是Fv-IgG。可以使用的不同结构形式的示例性实例提供于图1A以及图8A和图8B，以及表4中。在具体实施方案中，WNT超级激动剂是具有以下组成的Fv-IgG，其包括结合至少一种FZD受体的至少一个结合结构域、结合LRP受体的至少一个结合结构域，以及至少一种RSPO蛋白(突变的或野生型)或结合E3泛素连接酶的至少一个结合结构域。在一些实施方案中，LRP结合结构域是与结合FZD受体的Fab的N-末端连接的VHH或Fab片段，其在FZD Fab的C-末端处融合至Fc结构域(参见，例如，图2A、图2D、图2E、图3A、图3J、图3L、图3M、图4A、图8A、图8B和表4)。在一些实施方案中，FZD结合结构域是与结合LRP5/6的Fab的N-末端连接的VHH或Fab片段，其在LRP5/6Fab的C-末端处融合至Fc结构域。在其他实施方案中，Fv-IgG包含LRP5/6VHH和FZD Fab，其中RSPO蛋白或E3连接酶结合剂与Fc结构域的C-末端连接。可选地，RSPO或E3连接酶结合剂可以与Fab的重链或轻链的C-末端连接(参见，例如，图3J、图8A和8B，以及表4)。
在某些实施方案中，例如，如图8A或图8B中所示的，WNT超级激动剂的WNT替代蛋白区是包含4条连接的多肽的Fv-IgG。在某些实施方案中，Fv-IgG包含两条重链多肽和两条轻链多肽。在某些实施方案中，每条重链多肽包含Fc区、抗FZD抗体的可变区和抗LRP5/6抗体的可变区，其中两个可变区存在于Fc区的N-末端，并且其中两个可变区可以为任一顺序。在一实施方案中，重链从N-末端到C-末端包含：抗LRP5/6抗体可变区、抗FZD可变区和Fc区。在具体实施方案中，一个或两个可变区存在于Fab内。重链还可以包含另外的序列，诸如例如，Fc区和可变区(或Fab)之间的铰链区。在具体实施方案中，两条轻链多肽各自包含抗FZD抗体的可变区和抗LRP5/6抗体的可变区，其中两个可变区可以是任一顺序，并且其中任一或两个可变区存在于Fab中。在具体实施方案中，E3连接酶结合结构域融合至一条或两条重链的C-末端或N-末端。在具体实施方案中，E3连接酶结合结构域融合至一条或两条轻链的C-末端或N-末端(参见，例如，图8B)。在具体实施方案中，WNT超级激动剂分子的两条重链多肽是相同的，并且彼此结合。在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子的两条重链多肽是不同的，例如，当WNT超级激动剂分子仅包括一个E3连接酶结合结构域时。为了将不具有E3连接酶结构域的重链与具有E3连接酶结构域的重链适当组合，可将两条不同的重链工程化以选择性地彼此结合以产生异二聚体，例如，通过将杵进臼氨基酸修饰引入两条不同的多肽中以促进它们的结合。
另外，Fv-IgG或其他形式结构可以包括组织或细胞靶向结构域，其可以连接在与RSPO或E3连接酶结合剂相似的位点处，或者可以是结合组织/细胞特异性靶标的全长抗体，其中WNT受体结合结构域和RSPO/E3连接酶结合结构域连接在上述不同位点处。
在具体实施方案中，WNT超级激动剂中存在的任何结构域直接连接，或可经由连接子(例如多肽连接子或非肽连接子等)分开。连接子的长度，并因此，结合结构域之间的间距可用于调节信号强度，并可根据WNT超级激动剂分子所期望的用途进行选择。各种连接的结合结构域中的任一个之间的强制距离可以变化，但在某些实施方案中可以小于约100埃、小于约90埃、小于约80埃、小于约70埃、小于约60埃或小于约50埃。在一些实施方案中，连接子是刚性连接子，在其他实施方案中，连接子是柔性连接子。在其中连接子是肽连接子的某些实施方案中，其长度可以为约1-30个氨基酸、约5-15个氨基酸、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸，并且具有足够的长度和氨基酸组成，以增强结合结构域之间的距离。在一些实施方案中，连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基或由一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。
在具体实施方案中，WNT超级激动剂包含本文针对WNT替代分子所公开的FZD结合结构域和LRP5/6结合结构域的任何比率。在具体实施方案中，WNT超级激动剂包含本文针对WNT替代分子所公开的FZD结合结构域和LRP5/6结合结构域的任何比率，并且还包含一个或两个E3连接酶结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的WNT超级激动剂分子或其一个或多个结合区的亲和力小于约10,000nM、小于约1000nM、小于约100nM、小于约10nM、小于约1nM，或小于约0.1nM，并且在一些实施方案中，抗体可以对一种或多种共受体具有甚至更高的亲和力。
在具体实施方案中，WNT超级激动剂包含本文所公开的一种或多种多肽序列(例如，在实施例中)或其功能变体或片段。
VI.靶向分子
本文所公开的任何分子，例如，WNT超级激动剂、WNT替代物和WNT增强剂(RSPO模拟物)还可以包含细胞或组织特异性的结合结构域。
特定细胞类型和特定组织内的细胞可以包含一种或多种细胞或组织特异性表面分子(如细胞表面受体)。如本文所用的，如果与一种或多种其他细胞或组织类型或任何其他细胞或组织相比，更大量的分子存在于特定细胞或组织类型上，则称该分子是细胞或组织特异性的。在某些实施方案中，更大量是与一种或多种其他细胞或组织类型，或任何其他细胞或组织类型中的量相比，为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍的量。在具体实施方案中，例如，与一种或多种其他非靶向器官、组织或细胞类型相比，细胞特异性表面分子在靶器官、组织或细胞类型，例如希望增强WNT信号传导例如以治疗或预防疾病或病症的器官、组织或细胞类型上的表达增加或增强。在某些实施方案中，分别与一种或多种其他器官、组织或细胞类型相比，细胞特异性表面分子在靶器官、组织或细胞类型的表面上优先表达。例如，在具体实施方案中，如果分别与在一种或多种、5种或更多种、所有其他器官、组织或细胞，或平均所有其他器官、组织或细胞中的表达相比，细胞表面受体在靶器官、组织或细胞中以高出以下的水平表达：至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍，则认为细胞表面受体是组织特异性的或细胞特异性的细胞表面分子。在某些实施方案中，组织特异性或细胞特异性细胞表面分子是细胞表面受体，例如包含位于细胞表面膜内的区域和靶向模块可以结合的细胞外区域的多肽受体。在不同的实施方案中，本文所述的方法可以通过特异性靶向仅在靶组织或包括靶组织的组织子集上表达的细胞表面分子，或通过特异性靶向与所有、大多数或大量其他组织相比在靶组织上具有更高水平表达的细胞表面分子来实施，例如，相比在至少2种、至少5种、至少10种或至少20种其他组织上，在靶组织上的表达更高。
靶向的组织可以被靶向模块结合，例如特异性结合组织特异性受体的结合结构域。靶组织可以是任何组织，例如任何哺乳动物组织或细胞类型。在某些实施方案中，靶组织可以存在于任何器官中。在某些实施方案中，靶组织分别是骨组织、肝组织、皮肤组织、胃组织、肠组织、口腔黏膜组织、肾组织、中枢神经***组织、乳腺组织、味蕾组织、卵巢组织、内耳组织(包括耳蜗和前庭组织)、毛囊、胰腺组织、视网膜组织、角膜组织、心脏组织或肺组织，并且靶向模块分别与优先在以下组织上表达的组织特异性细胞表面分子(例如细胞表面受体)结合：骨组织、肝组织、皮肤组织、胃组织、肠组织、口腔黏膜组织、肾组织、中枢神经***组织、乳腺组织、味蕾组织、卵巢组织、内耳组织(包括耳蜗和前庭组织)、毛囊、胰腺组织、视网膜组织、角膜组织、心脏组织或肺组织。
靶向模块可以结合任何细胞类型，例如任何组织、器官或动物内的任何细胞，其包括但不限于哺乳动物(如人类)。在某些实施方案中，组织特异性WNT替代物信号增强组合分子结合特定细胞类型，例如与靶组织相关的特定细胞类型。例如，在肝组织中，靶向模块可以结合肝细胞、肝细胞的前体细胞和干细胞、胆道细胞和/或内皮细胞或其他血管细胞。例如，在骨组织中，靶向模块可以结合成骨细胞、成骨细胞的前体细胞、间充质干细胞、产生骨、软骨和/或存在于骨组织中的其他细胞的干细胞和前体细胞。存在于各种组织(包括但不限于本文所述的组织)中的细胞类型是本领域已知的，并且在不同的实施方案中，本文所述的组织特异性WNT信号增强分子可以结合它们中的任何一种。
VII.WNT增强剂结构(RSPO模拟物)
在一些实施方案中，具有RSPO活性的RSPO模拟物是期望的。在某些实施方案中，本公开提供了RSPO模拟物，其包含：(i)FZD结合结构域或LRP5/6结合结构域(但不是两者)；和E3连接酶结合结构域。WNT增强剂可以作为RSPO模拟物运行。在某些实施方案中，RSPO模拟物可以具有图2A、图2D或图2E中所描绘的结构。在具体实施方案中，RSPO模拟物将具有突变的RSPO(RSPO2RA)和特异性针对WNT受体(例如，FZD或LRP)的至少一个结合结构域。如果FZD受体表达限于特定器官、组织或细胞，则具有FZD结合结构域的RSPO模拟物可用作组织或细胞特异性RSPO模拟物。
VIII.连接子
在某些实施方案中，WNT替代物、增强剂和/或靶向模块彼此直接结合或融合，而在其他实施方案中，它们被连接子(例如多肽连接子或非肽基连接子等)分开。在具体实施方案中，连接子是Fc连接子，例如，抗体Fc结构域的能够与另一Fc连接子二聚化(例如经由一个或多个二硫键)的区域。在另一具体实施方案中，连接子是白蛋白(例如人血清白蛋白)，其中靶向和作用模块位于白蛋白的N-末端和C-末端上。
在某些实施方案中，特别是当连接两条多肽时，连接子由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。在具体实施方案中，连接子包含长度为1至约40个氨基酸残基、1至约30个氨基酸残基、1至约20个氨基酸残基、5至约15个氨基酸残基或1至约10个氨基酸残基，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在某些实施方案中，连接子中的氨基酸残基来自20种经典氨基酸，并且在某些实施方案中，选自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和/或丝氨酸。在某些实施方案中，连接子包含一个或多个非天然氨基酸。在一些实施方案中，肽基连接子由空间上不受阻碍的大部分氨基酸组成，如通过肽键连接的甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。某些连接子包括聚甘氨酸、聚丝氨酸和聚丙氨酸，或任意这些的组合。一些示例性肽基连接子是聚(Gly)1-8，特别是(Gly)3、(Gly)4(SEQ ID NO:1)、(Gly)5(SEQ ID NO:2)、(Gly)6(SEQ ID NO:3)、(Gly)7(SEQ ID NO:4)和(Gly)8(SEQ ID NO:5)，以及聚(Gly)4Ser(SEQ ID NO:6)、聚(Gly-Ala)2(SEQ ID NO:7)、聚(Gly-Ala)3(SEQ ID NO:8)、聚(Gly-Ala)4(SEQ ID NO:9)和聚(Ala)1-8(SEQ ID NO:10-14)。肽基连接子的其他具体实例包括(Gly)5Lys(SEQ ID NO:15)和(Gly)5LysArg(SEQ ID NO:16)。为了解释上述命名法，例如，(Gly)3Lys(Gly)4意指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:17)。Gly和Ala的其他组合也是有用的。另外，肽基连接子还可以包含非肽基片段，如式--CH2--CH2--CH2--CH2--CH2--CH2--的6碳脂肪族分子。可以改变肽基连接子以形成如本文所述的衍生物。
示例性的非肽基连接子包括，例如，烷基连接子，如--NH--(CH2)s--C(O)--，其中s＝2-20。这些烷基连接子还可以被任何非空间位阻基团取代，如低级烷基(例如，C1-C6)低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。本发明的主题组合物的非肽部分，如非肽基连接子或非肽半衰期延长部分可以通过常规有机化学反应合成。可用于连接结合结构域的化学基团包括如本领域已知的氨基甲酸酯；酰胺(胺加羧酸)；酯(醇加羧酸)、硫醚(卤代烷加巯基；马来酰亚胺加巯基)、席夫碱(胺加醛)、脲(胺加异氰酸酯)、硫脲(胺加异硫氰酸酯)、磺酰胺(胺加磺酰氯)、二硫化物、腙、脂质等。
结构域之间的连接可以包含间隔物(例如烷基间隔物)，其可以是直链或支链的，通常是直链的，并且可以包括一个或多个不饱和键；通常具有1至约300个碳原子；更通常为约1至25个碳原子；并且可以是约3至12个碳原子。这种类型的间隔物还可包含杂原子或官能团，其包括胺、醚、磷酸二酯等。具体目标结构包括：(CH2CH2O)n，其中n为1至约12；(CH2CH2NH)n，其中n为1至约12；[(CH2)n(C＝O)NH(CH2)m]z，其中n和m为1至约6，并且z为1至约10；[(CH2)nOPO3(CH2)m]z，其中n和m为1至约6，且z为1至约10。此类连接子可包括聚乙二醇，其可为直链或支链。
在某些实施方案中，结构域可以通过同或异双功能连接子连接。示例性实体包括：叠氮基苯甲酰肼、N-[4-(对叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺)、辛二酸二磺基琥珀酰亚胺酯、己二酰亚胺二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛、NHS-PEG-MAL；琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯；3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)；N,N'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚胺；N,N'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)；或4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)；间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)，后者为MBS的一种延伸的链类似物。在某些实施方案中，这些交联连接子的琥珀酰亚胺基与伯胺反应，并且硫醇反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的硫醇形成共价键。
其他有用的试剂包括：同双功能交联剂，包括双马来酰亚胺己烷(“BMH”)；p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；二亚胺代己二酸二甲酯(其对氨基有特异性)；苯酚-1,4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯基-对二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；二重氮联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)；邻苯并***基氧基四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、二环己基碳化二亚胺、溴-三(吡咯烷)溴化鏻(PyBroP)；N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)；4-吡咯烷基吡啶；N-羟基苯并***等。
IX.核酸和多肽
在某些实施方案中，本发明还提供了编码存在于本文所公开的分子(例如，WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂)中的多肽的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。这些和相关的实施方案可以包括编码结合一种或多种共受体的抗体片段的多核苷酸。如本文所用的，术语“分离的多核苷酸”意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸，或它们的一些组合，由于其来源，分离的多核苷酸：(1)不与其中分离的多核苷酸是在自然界中发现的所有或部分多核苷酸相关；(2)与天然不与其相连的多核苷酸相连，或(3)在自然界中不作为较大序列的一部分存在。分离的多核苷酸可以包括天然存在的和/或人工的序列。
如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及表达或可能适于表达蛋白质、多肽、肽等的较小的工程化的基因片段。此类片段可以是天然分离的，或由技术人员合成修饰。
技术人员也将认识到，多核苷酸可以是单链的(编码或反义的)或双链的，并且可以是DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括HnRNA分子，其包含内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子，以及不包含内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于根据本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料连接。多核苷酸可包含天然序列或可包含编码此类序列的变体或衍生物的序列。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文所述抗体的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与编码WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂内的多肽的天然或原始多核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的序列同一性。尽管如此，本公开内容明确考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。在某些实施方案中，具体考虑了已针对哺乳动物表达进行密码子优化的序列。
因此，在本发明的另一实施方案中，诱变方法(如位点特异性诱变)可用于制备本文所述多肽的变体和/或衍生物。通过这种方法，可以通过诱变编码它们的基础多核苷酸来对多肽序列进行特定修饰。这些技术提供了一种简单的方法来准备和测试序列变体，例如，通过将一种或多种核苷酸序列变化引入多核苷酸中，来并入一种或多种前述考虑。
位点特异性诱变允许通过使用编码所期望的突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来产生突变体，以提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列，以在横过的缺失连接的两侧形成稳定的双链体。可以在选择的多核苷酸序列中采用突变以改进、改变、减少、修饰或以其他方式改变多核苷酸本身的性质，和/或改变所编码多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
在某些实施方案中，本发明的发明人考虑诱变编码存在于本文所公开的分子(例如WNT替代物、WNT增强剂或WNT超激动剂)中的多肽的多核苷酸序列，以改变编码多肽的一种或多种性质(如结合亲和力、或特定Fc区的功能、或Fc区对特定FcγR的亲和力)。位点特异性诱变技术在本领域中是众所周知的，并且广泛用于产生多肽和多核苷酸的变体。例如，位点特异性诱变通常用于改变DNA分子的特定部分。在此类实施方案中，采用通常包含约14至约25个核苷酸左右长度的引物，其在被改变的序列连接的两侧有约5至约10个残基。
如本领域技术人员将理解的，位点特异性诱变技术经常采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体易于商购获得，并且它们的用途通常为本领域技术人员所熟知。双链质粒也常用于定点诱变，其消除了将目的基因从质粒转移到噬菌体的步骤。
使用定点诱变制备选定的编码肽的DNA区段的序列变体提供了一种产生潜在有用物种的方法，并且不意味着限制，因为存在其他方法，其中可以获得肽的序列变体和编码它们的DNA序列。例如，编码所期望的肽序列的重组载体可以用诱变剂(如羟胺)处理以获得序列变体。有关这些方法和方案的具体细节可在以下的教导中找到：Maloy等人，1994；Segal,1976；Prokop和Bajpai,1991；Kuby,1994；和Maniatis等人，1982；出于该目的，每篇文献均以引用方式并入本文。
在许多实施方案中，将编码本文所公开的分子(例如，WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂)的多肽的一种或多种核酸，直接引入宿主细胞中，并将细胞在足以诱导编码多肽表达的条件下孵育。
本公开的替代多肽可以使用本领域技术人员熟知的标准技术结合本文所提供的多肽和核酸序列来制备。多肽序列可用于确定编码由此公开的特定多肽的适当核酸序列。根据本领域技术人员熟知的标准方法，可以优化核酸序列以反映各种表达***的特定密码子“偏好”。
根据某些相关实施方案，提供了包含如本文所述的一种或多种构建体(例如，包含编码替代分子或其多肽的核酸的载体)的重组宿主细胞；以及产生编码产物的方法，该方法包括从其编码核酸表达。通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞可以方便地实现表达。在通过表达产生之后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段，然后根据期望使用。
多肽和编码核酸分子和载体可以被分离和/或纯化，例如从它们的自然环境，以基本上纯的或同质的形式，或者在核酸的情况下，不含或基本上不含除编码具有所期望功能的多肽的序列之外的来源的核酸或基因。核酸可以包含DNA或RNA，并且可以是全部或部分合成的。除非上下文另有要求，否则本文中提及的核苷酸序列涵盖具有特定序列的DNA分子，并且涵盖具有其中U取代T的特定序列的RNA分子。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的***是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒***。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞和许多其他细胞。一种常见的、优选的细菌宿主是大肠杆菌。存在于本文所公开的分子(例如WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂)内的多肽可以在原核或真核细胞中重组产生。
多肽(例如抗体及其抗原结合片段)在原核细胞(如大肠杆菌)中的表达在本领域中已得到充分确立。关于综述，参见例如Pluckthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。本领域技术人员也可以在培养中的真核细胞中表达，作为产生抗体或其抗原结合片段的选择，参见最近的综述，例如Ref,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573-576；Trill J.J.等人(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560。
可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强剂序列、标志物基因和其他合适的序列。载体可以是合适的质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒。更多细节参见，例如，Molecular Cloning:a LaboratoryManual:第2版,Sambrook等人，1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操作核酸的许多已知技术和方案(例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中和基因表达以及蛋白质分析中)详细描述于Current Protocols in Molecular Biology,第二版,Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,1992或其随后的更新中。
在某些实施方案中，本发明还提供了一种方法，该方法包括在表达***中使用如上所述的构建体以表达存在于本文所公开的分子(例如WNT替代物、WNT增强剂，或WNT超级激动剂)内的特定多肽。术语“转导”用于指通常通过噬菌体将基因从一种细菌转移到另一种细菌。
考虑了本文所述的任何多肽的氨基酸序列修饰。例如，可能需要提高替代分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。例如，本文所公开的分子(例如WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂)的氨基酸序列变体可以通过将适当的核苷酸变化引入编码抗体或其链的多核苷酸中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以获得最终的替代分子，前提是最终构建体具有所期望的特征(例如，与一种或多种共受体的高亲和力结合)。氨基酸变化也可能改变抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。本发明的多肽的上述任何变化和修饰可以包括在本发明的抗体中。
本公开提供了本文所公开的任何多肽(例如，替代分子、超级激动剂或其抗体或抗原结合片段的多肽)的变体。在某些实施方案中，变体与本文所公开的多肽具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，此类变体多肽至少约50％、至少约70％，并且在某些实施方案中，至少约90％结合一种或多种第一共受体，和/或一种或多种第二共受体，和/或E3连接酶，以及本文具体阐述的分子。在其他实施方案中，与本文阐述的分子相比，此类变体分子以更大的亲和力结合一种或多种第一共受体，和/或一种或多种第二共受体，例如，其定量结合至少约105％、106％、107％、108％、109％或110％以及本文具体阐述的抗体序列。
在具体实施方案中，本文所公开的分子，例如，WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂或其结合区，例如，Fab、scFv或VHH可以包含：a)重链可变区，其包含：i.氨基酸序列与本文所述的选定抗体的重链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR3区相同的CDR3区；和/或b)轻链可变结构域，其包含：i.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；其中所述抗体特异性结合选定靶标。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段是变体抗体或其抗原结合片段，其中所述变体包含与选定抗体相同的重链和轻链，除了在VH和VL区的CDR区中包含多达8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸取代。在这点上，在选定抗体的CDR区中可能有1、2、3、4、5、6、7、8个，或在某些实施方案中，9、10、11、12、13、14、15或更多个的氨基酸取代。取代可以在VH和/或VL区的CDR中。(参见例如，Muller,1998,Structure 6:1153-1167)。
在具体实施方案中，本文所公开的分子(例如，WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂或其结合区(例如，Fab、scFv或VHH/sdAb))可以具有：a)重链可变区，其具有与本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区至少80％相同、至少95％相同、至少90％相同、至少95％相同或至少98％相同或99％相同的氨基酸序列；和/或b)轻链可变区，其具有与本文所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或至少98％相同或99％相同的氨基酸序列。
一种多肽与另一种多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这意味着，当比对时，当比较两个序列时，该百分比的氨基酸是相同的。序列相似性可以以多种不同方式确定。为了确定序列同一性，可以使用可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上获得的方法和计算机程序(包括BLAST)来比对序列。另一种比对算法是FASTA，可在来自Oxford MolecularGroup,Inc.的全资子公司Madison,Wis.,USA的遗传计算组(Genetics Computing Group，GCG)包中获得。其他比对技术描述于Methods in Enzymology,第266卷:Computer Methodsfor Macromolecular Sequence Analysis(1996),编辑Doolittle,Academic Press,Inc.,a division of Harcourt Brace&Co.,San Diego,Calif.,USA。特别感兴趣的是允许序列中存在空位的比对程序。Smith-Waterman是一种允许序列比对中出现空位的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。而且，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。
感兴趣的是使用Smith和Waterman的局部同源算法(Advances in AppliedMathematics 2:482-489(1981)来确定序列同一性的BestFit程序。空位生成罚分的范围通常为1到5，通常为2到4，并且在许多实施方案中将是3。空位延伸罚分的范围通常从约0.01到0.20，并且在许多情况下将是0.10。程序具有由输入的待比较的序列确定的默认参数。优选地，使用由程序确定的默认参数确定序列同一性。该程序也可从Madison,Wis.,USA的遗传计算组(GCG)包中获得。
另一感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于Current Methods in SequenceComparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,SelectedMethods and Applications,第127-149页,1988,Alan R.Liss,Inc.。百分比序列同一性由FastDB基于以下参数计算：错配罚分：1.00；空位罚分：1.00；空位大小罚分：0.33；和加入罚分：30.0。
在具体实施方案中，本文所公开的分子(例如，WNT替代物、WNT增强剂或WNT超级激动剂或其结合区(例如，Fab、scFv或VHH))可以包含：a)重链可变区，其包含：i.氨基酸序列与本文所述的选定抗体的重链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR3区相同的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包含：i.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；其中所述抗体特异性结合选定靶标(例如，FZD受体，如FZD1)。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段是变体抗体，其中所述变体包含与选定抗体相同的重链和轻链，除了在VH和VL区的CDR区中有多达8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸取代之外。在这点上，在选定抗体的CDR区中可能有1、2、3、4、5、6、7、8个的氨基酸取代，或在某些实施方案中，9、10、11、12、13、14、15更多个的氨基酸取代。取代可以在VH和/或VL区中的CDR中。(参见例如，Muller,1998,Structure 6:1153-1167)。
代表性多肽的三维结构(例如，如本文所提供的WNT替代分子的变体FZD结合区或LRP5/6结合区)的确定可通过常规方法进行，使得如为了确定如此来源的结构变体是否保留目前所公开的物种的空间填充特性，可以对利用选定的天然或非天然氨基酸取代、添加、缺失或***一种或多种氨基酸进行虚拟建模。参见例如Donate等人，1994Prot.Sci.3:2378；Bradley等人，Science 309:1868-1871(2005)；Schueler-Furman等人，Science 310:638(2005)；Dietz等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:1244(2006)；Dodson等人，Nature450:176(2007)；Qian等人，Nature 450:259(2007)；Raman等人，Science 327:1014-1018(2010)。可用于这些和相关实施方案(如用于合理设计结合区)的计算机算法的一些另外的非限制性实例包括VMD，它是一种分子可视化程序，用于使用3-D图形和内置脚本显示、动画化和分析大型生物分子***(参见Theoretical and Computational Biophysics Group,University of Illinois at Urbana-Champagne网站，ks.uiuc.edu/Research/vmd/)。许多其他计算机程序在本领域中是已知的并且可供技术人员使用，并且允许从能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径)确定原子大小；GRID，其旨在确定对不同化学基团的高亲和力区域，从而增强结合；蒙特卡罗搜索，其计算数学对齐；以及CHARMM(Brooks等人(1983)J.Comput.Chem.4:187-217)和AMBER(Weiner等人(1981)J.Comput.Chem.106:765)，其解决力场计算，和分析(还参见，Eisenfield等人(1991)Am.J.Physiol.261:C376-386；Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46:49-54；Froimowitz(1990)Biotechniques 8:640-644；Burbam等人1990)Proteins 7:99-111；Pedersen(1985)Environ.Health Perspect.61:185-190；和Kini等人(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。各种合适的计算计算机程序也可商购获得，如从
Figure BDA0003813636360000591
(Munich，德国)。
所附实施例阐述了可存在于WNT替代物、WNT超级激动剂和WNT增强剂中的多种多肽序列。特别地，表3提供了存在于示例性WNT替代物和WNT增强剂中的多肽序列，且表4提供了存在于示例性WNT超级激动剂和WNT增强剂中的多肽序列。这些表还提供了所公开的每个分子的结构，这些结构已列出或可以从分子名称中容易地辨别出来。表2中提供了存在于各种分子中的示例性结合结构域，其完整序列显示在表3和表4中。实施例中所描述的各种结合结构域和分子可以以其他方向或构型进行修饰或组合，其包括但不限于实施例或图中所示的各种构型中的任何一种。例如，FZD结合结构域和LRP5/6结合结构域的位置可以在所示结构内存在的任何多肽中切换。本公开还包括本文所公开的任何多肽的多肽变体或其结合结构域，此类多肽变体与本文所公开的多肽或其结合结构域具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
X.组合物
还公开了包含本文所述替代分子和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。
在其他实施方案中，还公开了包含含有编码本文所述替代分子的核酸序列的多核苷酸和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。在具体实施方案中，药物组合物还包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码天然存在的共受体配体多肽的核酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸是DNA或mRNA(例如修饰的mRNA)。在具体实施方案中，多核苷酸是修饰的mRNA，其还包含5’帽序列和/或3’尾序列(例如多聚A尾)。在其他实施方案中，多核苷酸是包含与编码序列可操作连接的启动子的表达盒。在某些实施方案中，编码替代分子的核酸序列和编码天然存在的共受体配体多肽的核酸序列存在于同一多核苷酸中。
在其他实施方案中，还公开了包含表达载体(例如病毒载体)和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述表达载体包含含有编码本文所述替代分子的核酸序列的多核苷酸。在具体实施方案中，药物组合物还包含表达载体(例如病毒载体)，其包含含有编码天然存在的共受体配体多肽的核酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中，编码替代分子的核酸序列和编码天然存在的共受体配体多肽的核酸序列存在于相同的多核苷酸(例如表达盒)中。
本发明还涉及药物组合物，其包含含有表达载体的细胞和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，所述表达载体包含含有与编码替代分子的核酸可操作地连接的启动子的多核苷酸。在具体实施方案中，药物组合物还包含含有表达载体的细胞，所述表达载体包含含有与编码对应于受体的天然配体的多肽的核酸序列可操作地连接的启动子的多核苷酸。在具体实施方案中，细胞是从待治疗对象获得的异源细胞或自体细胞。在具体实施方案中，细胞是干细胞，例如脂肪来源的干细胞或造血干细胞。
主题分子，单独或组合，可以与药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和试剂组合，用于制备通常安全、无毒和期望的制剂，并且包括对哺乳动物(例如人或灵长类动物)使用可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下是气体。此类载体、稀释剂和赋形剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。补充的活性化合物也可以掺入制剂中。用于制剂的溶液或悬浮液可以包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯类；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；去污剂，如吐温20，以防止聚集；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。pH值可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节。在具体实施方案中，药物组合物是无菌的。
药物组合物还可包括无菌水性溶液或分散物以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散物的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些情况下，组合物是无菌的并且应该是流体，从而它可以被吸入注射器或从注射器递送至对象。在某些实施方案中，它在制造和储存条件下是稳定的并且被保存以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是例如溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及它们的合适混合物。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散物的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以延长内部组合物的吸收。
可以通过将所需量的替代分子(或编码多核苷酸或包含其的细胞)掺入适当的溶剂中来制备无菌溶液，根据需要，利用具有以上列举的成分的一种或组合，然后过滤灭菌。通常，分散物是通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备的，该无菌媒介物含有基本分散介质和来自上面列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所期望成分的粉末。
在一实施方案中，药物组合物与将保护抗体或其抗原结合片段免于从体内快速消除的载体(如控释制剂，其包括植入物和微囊化递送***)一起制备。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。这些材料也可以商购获得。脂质体悬液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。
将药物组合物配制成剂量单位形式可能是有利的，以便于使用和剂量的均匀性。如本文所用的的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算可与所需的药物载体结合产生所期望治疗效果的预定量的活性抗体或其抗原结合片段。剂量单位形式的规格取决于并直接依赖于抗体或其抗原结合片段的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及复合此类活性抗体或其抗原结合片段以用于治疗个体领结构域中固有的限制。
药物组合物可以连同施用说明一起包含在容器、包装或分配器(例如注射器，例如预装注射器)中。
本发明的药物组合物包括任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或任何其他化合物，其在施用于包括人的动物后能够(直接或间接)提供生物活性抗体或其抗原结合片段。
本发明包括本文所述的WNT替代分子的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物所期望的生物活性并且不赋予其不期望的毒理学作用的盐。多种药学上可接受的盐在本领域中是已知的，并且描述于例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,第17版,Alfonso R.Gennaro(编辑),Mark Publishing Company,Easton,PA,USA,1985(及其更新的版本)，“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”,第3版,James Swarbrick(Ed.),Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA,2007，和J.Pharm.Sci.66:2(1977)中。而且，对于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。
药学上可接受的碱加成盐利用金属或胺(如碱金属和碱土金属或有机胺)形成。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺类包括N-N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见，例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts,”J.Pharma Sci.,1977,66,119)。通过将游离酸形式与足量的所需碱接触来以常规方式产生盐来制备所述酸性化合物的碱加成盐。可以通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸来再生游离酸形式。游离酸形式与它们各自的盐形式在某些物理性质(如在极性溶剂中的溶解度)上有些不同，但是对于本发明的目的，在其他方面盐等价于它们各自的游离酸。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其他蛋白质)混合的治疗有效量的WNT替代分子或其药学上可接受的盐。示例性的氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、醋酸盐、林格氏和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，该制剂在4℃下稳定至少六个月。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、无菌水和普通技术人员已知的其他缓冲剂，如Good等人(1966)Biochemistry 5:467描述的那些。缓冲剂的pH可以在6.5至7.75的范围内，优选7至7.5，且最优选7.2至7.4。
XI.使用方法
仅出于说明性目的，WNT超级激动剂分子、WNT替代分子和WNT增强剂分子(RSPO模拟物)，包括本文所公开的那些，可用于治疗其中组织再生是必要或有益的各种疾病或病症。可以治疗的对象包括但不限于哺乳动物，例如人类。此类疾病包括但不限于：增加骨生长或再生、骨移植、骨折愈合、骨质疏松症和骨质疏松性骨折的治疗、椎体压缩性骨折、脊柱融合、矫形装置的骨整合、肌腱-骨整合、牙齿生长和再生、牙种植、牙周病、颌面重建和下颌骨坏死。还包括：脱发症的治疗；提高感觉器官的再生，例如听力丧失的治疗(包括内部和外部听觉毛细胞、前庭功能减退的治疗)、黄斑变性的治疗，各种视网膜病的治疗，包括但不限于玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、视网膜变性的其他疾病、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、干性AMD、Fuchs营养不良、其他角膜疾病等；中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和影响血脑屏障的其他病况的治疗；脊椎损伤、其他脊椎疾病的治疗。本发明的组合物还可用于口腔粘膜炎的治疗、短肠综合征、炎性肠病(IBD)、其他胃肠道病症的治疗；代谢综合征、血脂异常的治疗、糖尿病的治疗、胰腺炎、其中外分泌或内分泌胰腺组织受损伤的病况的治疗；其中期望增强的表皮再生的病况，例如，表皮创伤愈合、糖尿病足溃疡，涉及牙、指甲或真皮发育不全等的综合征、其中血管生成是有益的病况的治疗；心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭的治疗；增强的造血细胞生长，例如，来自骨髓的造血干细胞移植物的增强、动员的外周血、免疫缺陷、移植物抗宿主病等的治疗；急性肾损伤、慢性肾病的治疗；肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)的治疗、增强的肺组织再生。本发明的组合物还可用于增强的肝细胞再生，例如肝再生、肝硬化的治疗、肝移植的增强、急性肝衰竭的治疗、具有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后慢性肝病的治疗、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪变性的非酒精性肝病或脂肪性肝炎等。本发明的组合物可以治疗疾病和病症，包括但不限于其中期望再生的细胞生长的病况。
在具体实施方案中，WNT超级激动剂分子、WNT替代分子和WNT增强剂分子(RSPO模拟物)(包括本文中所公开的那些)可用于在对象中诱导骨形成或增加骨密度。例如，可向对象施用有效量的WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子。在具体实施方案中，向对象施用WNT超级激动剂分子或包含结合FZD5、FZD8和FZD9的FZD结合结构域的WNT替代分子。
在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子、WNT替代分子和WNT增强剂分子(RSPO模拟物)(包括本文中所公开的那些)可用于再生对象的唾液腺、诱导对象唾液腺生长或唾液腺组织生长。该方法可用于治疗对象的唾液过少或口腔干燥。例如，向对象施用有效量的WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子。在具体实施方案中，向对象施用WNT超级激动剂分子或包含结合FZD1、FZD2和FZD7的FZD结合结构域的WNT替代分子。
在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子、WNT替代分子和WNT增强剂分子(RSPO模拟物)(包括本文中所公开的那些)可用于保存细胞、组织、器官或类器官(例如，用于移植的组织或器官)。例如，可在体内或离体将细胞、组织、器官或类器官与WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子接触。在保存用于移植的细胞、组织或器官的上下文中，可将细胞、组织、器官或类器官与WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子接触，同时仍然在供体中(即在从供体去除之前)和/或在从供体去除之后。该方法可以维持或增强细胞、组织或器官的活力，例如，在存储期间或在移植到受体中之前。在具体实施方案中，在包含WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子的组合物或溶液中灌注细胞、组织或器官。在某些实施方案中，将某些器官组织与WNT超级激动剂分子接触，以维持该组织的活力。在具体实施方案中，器官组织是待移植至有需要的受体中的供体器官组织。在某些实施方案中，在体内利用包含本文所公开的WNT超级激动剂分子的溶液灌注供体器官组织，例如，在从供体去除器官组织之前。在某些实施方案中，在离体下利用包含本文所公开的WNT超级激动剂分子的溶液灌注供体器官组织，例如，在存储期间或在从供体运输到受体期间。在具体实施方案中，与未接触Wnt信号增强分子相比，与Wnt信号增强分子接触的器官组织保留的移植活力要长至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。在某些实施方案中，器官组织是肝组织。
在某些实施方案中，WNT超级激动剂分子、WNT替代分子和WNT增强剂分子(RSPO模拟物)(包括本文中所公开的那些)可用于表达和/或维持离体组织，例如，皮肤组织。在具体实施方案中，组织分离自供体或患者。可以在体内或离体将组织(例如，在…存在下维持或培养)与WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子接触。在某些实施方案中，在离体下接触组织，例如，通过用包含WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子的组合物灌注。
在另一实施方案中，WNT超级激动剂分子、WNT替代分子和WNT增强剂分子(RSPO模拟物)(包括本文中所公开的那些)可用于产生或维持类器官或类器官培养物。例如，类器官培养物可以与WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子接触，例如，通过在包含WNT超级激动剂分子、WNT替代分子或WNT增强剂分子的培养基中培养类器官。在某些实施方案中，通过使其与本文所公开的一种或多种WNT超级激动剂分子接触来生成、培养或维持类器官培养物。在具体实施方案中，WNT超级激动剂分子存在于用于培养或维持类器官组织的培养基中。
在具体实施方案中，药物组合物通过肠胃外施用，例如静脉内、经口、直肠或通过注射施用。在一些实施方案中，它是局部施用的，例如，局部或肌内施用。在一些实施方案中，将组合物施用于靶组织，例如骨、关节、耳组织、眼组织、胃肠道、皮肤、伤口部位或脊椎。
本发明的方法可以在体内或离体实施。在一些实施方案中，靶细胞或组织与替代分子的接触是离体进行的，随后将细胞或组织，例如活化的干细胞或祖细胞植入对象中。技术人员可以根据所治疗的疾病或病症确定合适的施用部位和施用途径。
剂量和给药方案可以取决于容易由医生确定的多种因素，如疾病或病症的性质、对象的特征和对象的病史。在具体实施方案中，施用或提供给对象的替代分子的量在约0.01mg/kg至约50mg/kg、0.1mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约50mg/kg的对象体重的范围内。
在本说明书中所提及和/或在申请数据表中所列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均通过引用整体并入本文。
从上文可以理解，尽管为了说明的目的已经在本文中描述了本发明的特定实施方案，但是在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，除所附权利要求外，本发明不受其他限制。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，且并不旨在限制发明人认为是其发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保关于所用数字的准确性(例如数量、温度等)，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，且压力是大气压或接近大气压。
可以在诸如以下的标准教科书中找到分子生物学、细胞生物学和生物化学中的一般方法：“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版”(Sambrook等人，HarborLaboratory Press 2001)；“Short Protocols in Molecular Biology,第4版”(Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons 1999)；“Protein Methods”(Bollag等人，John Wiley&Sons1996)；“Nonviral Vectors for Gene Therapy”(Wagner等人编辑，Academic Press1999)；“Viral Vectors”(Kaplift&Loewy编辑，Academic Press 1995)；“ImmunologyMethods Manual”(I.Lefkovits编辑，Academic Press 1997)；和“Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures in Biotechnology”(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容通过引用并入本文中。本公开中所提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech获得。
产生重组分子，其将WNT受体FZD和/或LRP共受体的激动剂与E3连接酶受体ZNRF3或RNF43的激动剂组合在一起，以产生WNT信号传导“超级激动剂”
以下实施例中采用的材料和方法包括如下内容。
蛋白产生
所有重组蛋白均通过瞬时转染在Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific)中产生。将FvFab蛋白首先使用
Figure BDA0003813636360000671
His标签纯化树脂(Sigma-Aldrich)进行纯化。首先使用MiniChrom MabSelect SuRe(Repligen)纯化基于异二聚体Fc的蛋白质，然后通过
Figure BDA0003813636360000672
His标签纯化树脂和抗Flag M2亲和凝胶(Sigma-Aldrich)进行优化。除非另有说明，否则首先使用MiniChrom MabSelect SuRe纯化其他蛋白质。使用1×HBS缓冲液(20mMHEPES pH 7.4,150mM NaCl)，用Superdex 200Increase10/300GL(GE Healthcare LifeSciences)尺寸排阻色谱(SEC)进一步优化所有蛋白质。之后，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳检查蛋白质，且估计纯度>90％。
SuperTop Flash(STF)测定
如先前所报道的({Chen,2020#65})，WNT信号传导活性使用HEK293细胞测量，该细胞含有由WNT应答启动子(Super Top Flash报告子测定，STF)控制的荧光素酶基因。简而言之，在3μM IWP2存在下处理前24小时，将细胞以每孔10,000个的密度接种在96孔板中，以抑制内源性WNT的产生。然后将重组蛋白添加到有或没有20nM Fc-RSPO2的细胞中过夜。重组人WNT3A(R&D systems)用作阳性对照。用荧光素酶细胞培养裂解试剂(Promega)裂解细胞，并使用供应商建议的程序用荧光素酶测定***(Promega)测量荧光素酶活性。
细胞流式细胞术
在补充有10％FBS的DMEM中，用终浓度为10nM的RSPO衍生分子处理用过表达ZNRF3(Gen-Script OHu22977)的质粒瞬时转染的HEK293细胞24h。使用Gibco无酶解离缓冲液解离细胞，洗涤，并重新悬浮在FACS缓冲液(1×PBS，具有1％BSA，具有0.02％叠氮化钠)中。将细胞与1nM F12578 IgG一起孵育1h。洗涤后，将细胞与山羊抗人IgG Alexa Fluor 647(Invitrogen,Carlsbad,CA)一起孵育40min。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并使用SONYSH800S流式细胞仪(BD Biosciences)进行多通道分析。将数据用FlowJo软件(FlowJo,Ashland,OR)处理，且荧光信号显示在直方图中。
原代细胞和类器官扩增
小鼠小肠类器官(#70931STEMCELL Technologies)按Sato等人，2009中所述进行维持和扩增。简而言之，适合的扩增培养基包含高级DMEM、10mM HEPES、1×GlutaMAX、1×青霉素-链霉素、1×B27、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、50ng/mL重组人EGF、50ng/mL重组人Noggin和500ng/mL重组人R-脊椎蛋白1(参见表1)。
人小肠类器官由斯坦福的Calvin Kuo实验室赠送。按Sato等人，2011(Sato等人，2011)中所述维持和扩增类器官。简而言之，适合的扩增培养基包含高级DMEM、10mM HEPES、1×GlutaMAX、1×青霉素-链霉素、1×B27、1×N2、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、50ng/mL重组人EGF、50ng/mL重组人Noggin、500ng/mL重组人R-脊椎蛋白1、0.5nM L6-F12578替代物Wnt、10nM重组胃泌素、500nM A83-01和10μM SB202190(参见表1)。
小鼠肝细胞类器官从原代CD1鼠肝细胞(#MSCP20 Thermo Fisher)生长，并按Hu等人，2018中所述进行扩增。简而言之，适合的扩增培养基包含高级DMEM、10mM HEPES、1×GlutaMAX、1×青霉素-链霉素、1×B27、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、50ng/mL重组人EGF、50ng/mL重组人Noggin、500ng/mL重组人R-脊椎蛋白1、10nM重组胃泌素、3μM CHIR99021、25ng/mL重组HGF、50ng/mL FGF7、50ng/mL FGF10、10mM烟酰胺和500nM A83-01(参见表1)。
人肾类器官由原代人肾近端小管上皮细胞(PCS-400-010)建立，并按Schutgens等人，2019中所述进行维持和扩增。简而言之，适合的扩增培养基包含高级DMEM、10mM HEPES、1×GlutaMAX、1×青霉素-链霉素、1×B27、50ng/mL重组人EGF、100ng/mL重组人FGF10、500nM A83-01和500ng/mL重组人R-脊椎蛋白1(参见表1)。
生长效率测定
对于生长效率测定，使用1×TrypLE(12605010GIBCO)在37℃下将所有类器官系(小鼠小肠、人小肠和人肾)消化成小的、接近单细胞的悬浮液、片段10分钟。用原代单细胞进行小鼠肝细胞生长效率。对于所有细胞类型，基础培养基由不含RSPO1、替代物Wnt和/或CHIR99021，并补充有1μM porcupine抑制剂Wnt-C59(#5148Tocris)和10μM Y-27632(#5092280001MilliporeSigma)的扩增培养基组成。如图3所示，实验条件由500ng/mL RSPO1、100ng/mL重组人Wnt-3a、1nM替代物WNT L6-F12578(对于小鼠小肠类器官为0.1nM)或1nMWNT超级激动剂L6-F12578-RSPO2RA(对于小鼠小肠类器官为0.1nM)中的一种或组合组成。所有条件下的所有细胞都接种在96孔板中的15μL Matrigel液滴中，并浸没在120μL实验培养基中。小鼠小肠、人小肠和人肾类器官在测量前扩增7天，且在测量前将小鼠肝细胞类器官扩增14天。大约每3天更换一次培养基。每个实验由每个板的三个技术重复组成，并重复三次。根据制造商的方案，使用在SpectraMax Paradigm微板读数仪(Molecular Devices)上测量的细胞活力测定CellTiter-Glo(G9683 Promega)对生长效率进行定量。
表1.类器官试剂
类器官试剂
组分 目录号
高级DMEM Thermo Scientific 12634-010
HEPES Thermo Scientific 15630080
GlutaMAX Thermo Scientific 35050061
青霉素-链霉素 Thermo Scientific 15140122
B27 Thermo Scientific 17504044
N2 Thermo Scientific 17502048
烟酰胺 Sigma-Aldrich N0636
N-乙酰半胱氨酸 Sigma-Aldrich A9165
A83-01 Tocris 2939
CHIR99021 Tocris 4423
SB202190 Tocris 126410
重组人EGF Peprotech AF-100-15
重组人FGF7 Peprotech 100-19
重组人FGF10 Peprotech 100-26
重组人Noggin Peprotech 120-10C
重组人HGF Peprotech 100-39H
人胃泌素I Tocris 30061
重组人R-脊椎蛋白1 R&D 4645RS
重组人Wnt-3a R&D 5036WN
替代物WNT L6-F12578 内部生产
WNT超级激动剂L6-F12578-RSPO2RA 内部生产
Matrigel<sup>TM</sup>GFR膜基质 克隆CB40230C
鼠研究和双能量X射线吸光测定法(DEXA)：
除了Surrozen,Inc.的机构动物护理和使用委员会(the Institutional AnimalCare and Use Committee，IACUC)的指导和批准外，所有动物实验还根据国家伦理准则进行。12周大的C57Bl/6J雌性小鼠获自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)，且每笼饲养4只。在第0、3、7和10天经腹膜内施用3mg/kg的蛋白质处理剂。在第0、7和13天，使用FaxitronUltraFocus(Faxitron Bioptics,Tucson,Arizona)，经由体内DEXA方法测量动物的骨矿物质密度(BMD)和脂肪含量。在通过异氟烷成像期间对动物进行麻醉，并且样本ROI包括整个鼠骨骼，除了颈椎上方的物质之外，因为头骨的放射照相强度增加。使用随附的Vision DXA软件计算BMD和脂肪含量。在第14天处死动物，并收集肝脏、小肠和唾液腺进行组织学检查。
实施例1
WNT替代物形式
创建了用于有效的、选择性的WNT替代物生成的新的模块化和灵活的平台(参见，例如，WO 2020/010308)。该平台的一个关键特征是需要FZD和LRP的多聚化，两个FZD和一种或两种LRP结合剂的最佳化学计量，以最大程度地激活WNT/β-连环蛋白。该平台是基于串联scFv抗体片段形式构建的(参见表3)。为了了解另外的多价抗体形式是否可以产生活性替代物WNT，测试了如图1A、图4A和表3所示的Fv-IgG、Fab-IgG、scFv-IgG形式。这些形式还提供了抗体分子上不同结合臂之间的不同距离和几何形状，从而可以评估形式和几何形状对活性的贡献。
为每种构建体选择了某些FZD和LRP结合剂。表2提供了所用组分的命名法。
表2：WNT替代物形式组分
Figure BDA0003813636360000711
Figure BDA0003813636360000721
选择LRP6E3E4结合剂YW211.31.57(参见例如US 8,846,041；指定为“L1”)和FZD1、2、7、5、8结合剂18R5(Gurney等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.109:1171-11722；指定为“F1”)以图1A、图4A和表3中所示的形式组合，以生成以下构建体：L6F12578(scFv-Fc)、L6-F12578(Fv-IgG)和L6-F12578(Fab-IgG)。作为阴性对照，使用了抗GFP结合剂。这些蛋白质经由蛋白质A亲和柱和随后的尺寸排阻色谱(SEC)纯化，并在WNT应答性HEK293 Super TOP-FLASH(STF)报告细胞中进行测试。
如图1B所示，虽然所有三种形式均产生活性替代物WNT，但L6-F12578(Fv-IgG)产生最高E最大值，EC50为0.81nM，而L6-F12578(Fab-IgG)产生最低E最大值，EC50为0.39nM。L6-F12578(scFv-Fc)效力最低，E最大值与Fv-IgG相似。这些替代物WNT对RSPO处理有反应，同时保持效力和E最大值的相对范围；添加RSPO增加了所有三种替代物的E最大值和效力(图1C)。
由于Fv-IgG形式产生了最活跃的分子、更容易制造，并且具有更期望的生物物理特性，例如，与更不稳定且具有聚集倾向的串联scFv相比，它是一种更稳定的形式，因此我们关注Fv-IgG以进行另外的WNT模拟生成。为了测试这种形式的一般适用性，我们选择了另外的具有不同特异性的FZD结合剂用于与LRP结合剂L6进行模拟组装。这些另外的FZD结合剂R2H1(US 2016/0194394，FZD1、2、7结合剂，在本文中称为F127)、2919(WO 2017/127933，FZD5、8结合剂，在本文中称为F58)、5044(US 2016/0194394，FZD4结合剂，在本文中称为F4)、5063(US2016/0194394，FZD4结合剂，在本文中称为F4-2)、3SC10(WO 2019/126399，FZD4、9结合剂，在本文中称为F49)、hB9L9.3(US 2016/0194394，FZD10结合剂，在本文中称为F10)、F7.B(Pavlovic等人，(2018)mAbs 10(8):1157–1167，FZD1、2、4、5、7、8结合剂，在本文中称为F7B)和F2.I(Pavlovic等人，(2018)mAbs 10(8):1157–1167,FZD1、2、4、5、7、8结合剂，在本文中称为F2I)涵盖通过β-连环蛋白发送信号的8种FZD。分别结合FZD1、2、7、FZD5、8、FZD1、2、4、5、7、8和FZD1、2、4、5、7、8的新的WNT模拟物L6-F127(Fv-IgG)、L6-F58(Fv-IgG)、L6-F7B(Fv-IgG)和L6-F2I(Fv-IgG)，在WNT应答性HEK293 STF细胞上高度活跃(图1D、1L)。因为HEK293细胞不表达或表达低水平的FZD4、FZD9和FZD10(数据未显示)，亲本细胞对L6-F4(Fv-IgG)、L6-F49(Fv-IgG)和L6-F10(Fv-IgG)未显示显著的应答(图1G、1I、1K)。然而，L6-F4(Fv-IgG)、L6-F49(Fv-IgG)、L6-F10(Fv-IgG)和L6-F4-2(Fv-IgG)在分别过表达FZD4、FZD9、FZD10和FZD4的HEK293 STF细胞中诱导强力的信号传导，这与其对这3种受体的结合特异性一致(图1F、1H、1J、1M)。这些WNT模拟物是允许研究β-连环蛋白依赖性FZD的一组有价值的分子。
我们之前已经表明，在串联scFv形式中，与FZD和LRP的多价结合对于信号传导很重要，并且具有一个FZD和一个LRP结合臂的双特异性串联scFv分子在诱导Wnt信号传导方面是弱的或无活性的(Chen等人，2020)。为了评估Fv-IgG形式的化合价要求，我们以双特异性Fv-Fab形式生成了这组FZD/LRP结合剂，其中FZD和LRP结合臂各有一个(图1A)。如图1E-1K中所示的，这些与FZD和LRP单价结合的双特异性均未诱导Wnt信号传导的显著激活，进一步证实了先前观察到的串联scFv、VHH-IgG形式的效价要求也适用于其他抗体形式。由于Fv-IgG分子将在后续部分中进一步研究，为简洁起见，Fv-IgG名称将从分子名称中移除。
表3：WNT替代分子的形式和序列；斜体下划线＝连接子；粗体＝VH或VL。形式在图7中图示
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实施例2
WNT超级激动剂分子的产生
为了补充这组替代物激动剂，还尝试产生一组有效的拮抗剂分子以研究通过特定FZD的WNT信号传导。先前的研究表明，与WNT竞争结合FZD的抗体可以用作拮抗剂(Gurney等人，同上)，然而，这种方法需要抗体以相对高的浓度连续存在。另外，并非所有产生的FZD结合抗体都起拮抗剂的作用，例如，如果它们不与WNT竞争结合受体。因此，对于研究和治疗开发来说，一个有效的和FZD选择性拮抗剂平台将是非常需要的。
ZNRF3和RNF43是靶向WNT受体(FZD和LRP)以进行降解的膜结合的E3连接酶(Hao等人(2012)Nature 485:195-200；和Koo等人(2012)Nature 488:665-669)。基于E3连接酶的活性，构建构建体以测试FZD和E3连接酶结合剂之间的融合是否会充当WNT信号传导的拮抗剂。
通过将对照GFP抗体或FZD结合抗体F12578与突变的RSPO2片段融合来利用RSPO2的E3连接酶结合活性。突变的RSPO2片段包含furin结构域Fu1Fu2，其在Fu2结构域中具有双F105R/F109A突变(图2A，命名为“RSPO2RA”)。RSPO2RA片段失去了结合LGR的能力(并因此失去了WNT信号增强活性)，但保留了结合E3连接酶的能力(Xie等人(2013)EMBO Rep.14:1120-1126)。与野生型RSPO2Fu1Fu2-Fc融合(Fc-RSPO2)相比，RSPO2RA突变体与阴性对照抗GFP抗体的融合显著降低了WNT信号增强活性。在测试的最高剂量下仅观察到适度的活性(图2B)。令人惊讶的是，虽然RSPO2RA突变体与F12578的融合(F12578-RSPO2RA)本身没有活性，但融合蛋白在WNT3A存在下导致双相曲线，其中在较低剂量下，它增强而不是抑制WNT3A信号传导(图2B)。为了了解导致信号增强的机制，我们进行了FACS分析以评估细胞表面上的FZD受体水平。如图2C所示，如通过抗FZD抗体检测到的那样，用F12578-RSPO2RA处理的细胞显示FZD水平增加。这些结果表明，F12578-RSPO2RA不是作为降低FZD水平的抑制剂，而是至少部分以RSPO模拟物方式起作用，增加受体水平并增强Wnt信号传导。
为了理解这一观察结果的普遍适用性，产生了RSPO2RA与其他FZD结合剂、结合FZD1、2、7、5、8的R2M3(“F6”)和结合FZD7的1791(“F7”)之间的另外的融合蛋白。在这些情况下，RSPO2RA融合至FZD结合抗体重链的N-末端。如图2D所示，RSPO2RA-F6和RSPO2-F7也以RSPO模拟物的方式表现，并在低剂量下增强WNT3A活性。还产生了RSPO2RA与其重链上的F6Fab的N-末端的融合，RSPO2RA-F6_Fab。如图2E所示，单价融合蛋白也增强了WNT3A活性。这些结果令人惊讶地表明，与RSPO2RA或通常的E3连接酶结合剂融合的FZD结合剂不是作为降低FZD水平的抑制剂，而是以RSPO模拟物的方式起作用并增强WNT信号传导。这些新型RSPO模拟分子的结构和序列如表4所示。
由于这种方法产生了增强剂而不是预测的拮抗剂的令人惊讶的结果，因此进一步研究了图1的替代分子，特别是Fv-Ig结构，与E3连接酶结合剂组合是否会产生WNT超级激动剂。为此，如图3A中所示的，生成了三特异性、六价分子。如图3B中所示的，这种类型的分子同时具有WNT替代物和RSPO活性，如构建体L6-F12578-RSPO2RA所例示的。这种WNT超级激动剂活性转化为不同的FZD结合剂，例如，L6-F127-RSPO2RA、L6-F58-RSPO2RA、L6-F4-RSPO2RA、L6-F49-RSPO2RA、L6-F10-RSPO2RA、L6-F7B-RSPO2RA、L6-F2I-RSPO2RA、L6-F4-2-RSPO2RA(图3C-3K)。如图3J所示，还构建了另外的形式，其中RSPO2RA与WNT模拟分子的不同位置连接，其活性显示在3K中。表4描述了测试的不同组分/形式。
表4：WNT增强剂和WNT超级激动剂的结构和序列
斜体加粗：RSPO2RA
斜体加粗下划线：抗Lrp_VHH
斜体下划线：连接子
加粗：VH或VL
“F”指示Fzd结合剂，且“aGFP”指示抗GFP抗体序列
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制备了具有RSPO2RA与其他FZD和LRP结合剂(例如，R2M3(“F6)和26(“L2”))融合的另外的构建体，其在IgG分子的不同位置处具有RSPO2RA融合。例如，RSPO2RA蛋白与IgG重链或轻链的C-末端融合。如图3H和3I所示，所有这些FZD-RSPO2RA融合产生RSPO模拟物活性，且LRP结合剂的另外的融合导致超级激动剂活性。因此，这些结果证明了一种生成RSPO模拟物以及WNT超级激动剂分子的方法，这些分子可以靶向FZD受体的特定子集。
如图4A、图7和图8中所示的，为了进一步评估不同组分之间的形式和化学计量，在FZD和LRP结合剂和RSPO突变体之间产生另一组分子。这些不同分子的活性如图4B和图4C所示。
实施例3
WNT超级激动剂分子在类器官培养物扩增中取代WNT和R-脊椎蛋白
哺乳动物体中的多个组织由WNT驱动的成体干细胞维持。R-脊椎蛋白的局部分泌通常会进一步增强短程Wnt信号。在这个角色中，R-脊椎蛋白充当干细胞生长因子，但仅在存在WNT的情况下充当干细胞生长因子。WNT激动剂在干细胞生态位中的这种关键相互作用在成体干细胞来源的类器官培养物中得到了概括。通过在培养基中提供生态位信号，类器官可以作为自组织结构进行维护和扩增。大多数用于上皮类器官培养的培养基都补充有R-脊椎蛋白。如果类器官细胞(诸如例如鼠小肠类器官中的Paneth细胞)分泌它们自己的WNT蛋白，则单独添加R-脊椎蛋白就足够了(Sato等人，2009)。没有内源性WNT来源的类器官培养物(如人肠道类器官)需要添加WNT的或WNT模拟物(Sato等人，2011,Janda等人，2017)。获得用于类器官培养基的高质量WNT蛋白和/或R-脊椎蛋白可能既费力又昂贵。为了测试单个WNT超级激动剂分子是否可以替代类器官培养基中的WNT和R-脊椎蛋白，我们测试了在L6-F12578-RSPO2RA存在下几种不同类器官培养物的生长效率。
我们首先检查了WNT超级激动剂在小鼠小肠类器官扩增中的适用性。鼠细胞在porcupine抑制剂C59的存在下生长，以阻断任何内源性WNT分泌。单独添加RSPO1、WNT3A或L6-F12578对这些细胞的生长几乎没有影响(图5A、5B)。正如预期的那样，WNT3A加RSPO1以及L6-F12578加RSPO1在7天内刺激了大型囊性类器官的生长。如图5A-B所示，单独的0.1nM的WNT超级激动剂L6-F12578-RSPO2RA足以刺激最大的生长。添加重组RSPO1并没有进一步增强增殖。接下来，我们研究了人小肠类器官，它们在其扩增培养基中需要外源WNT和RSPO1。虽然人小肠类器官对重组WNT3A没有应答，但用单独的L6-F12578观察到的生长量略有增加(图5C-5D)。与小鼠中相似，仅以1nM添加L6-F12578-RSPO2RA显示出与L6-F12578和RSPO1组合等效的活性水平(图5C-D)。为了进一步研究WNT超级激动剂在其他细胞类型和组织中的适用性，我们测试了小鼠肝细胞和人肾小管的扩增，这两种培养***依赖于其培养基中R-脊椎蛋白的存在(Hu等人，2018,Schutgens等人，2019)。与小鼠和人肠道的实验设置类似，添加porcupine抑制剂C59以阻断任何内源性WNT信号，并且对于小鼠肝细胞，我们另外从基础培养基中去除了GSK3抑制剂CHIR99021。在14天的过程中，与单独的L6-F12578相比，在L6-F12578-RSPO2RA中培养的鼠肝细胞以更高的速率扩增。在两种条件下添加重组RSPO1进一步增强了生长(图5E、图5F)。RSPO1对L6-F12578-RSPO2RA的附加影响可能是由于对RSPO1和RSPO2的敏感性不同，但需要进一步研究。在单独的L6-F12578-RSPO2RA中培养的人肾小管在一周内迅速扩增至L6-F12578和RSPO1组合的相似水平，并且优于重组WNT3A加RSPO1或单独的替代物WNT(图5G、图5H)。总之，WNT超级激动剂可以替代来自小鼠和人类肠道、肝脏和肾脏的类器官培养物中的WNT3A和RSPO。我们预计L6-F12578-RSPO2RA和其他WNT超级激动剂在各种其他类器官模型中的表现优于重组WNT、RSPO和WNT和RSPO条件培养基。
实施例4
WNT模拟分子的体内效应
不同FZD特异性的WNT模拟物的效果之前尚未得到充分探索。为了测试具有不同FZD特异性的WNT模拟物的体内作用，将图1中描述的WNT模拟物组于第0、3、7和10天在C57Bl/6J小鼠中以3mg/kg经腹膜内给药。由于我们之前已经确定了FZD1、2、7WNT模拟物对体内骨形成的影响(PCT公开WO 2019/126398)，我们测试了其他FZD特异性是否也可以影响骨形成。与第0天的基线相比，L6-F12578、L6-F127、L6-F58和L6-F4组中的全身骨矿物质密度(BMD)在第13天分别增加了39％、38％、29％和11％(P<0.001)(图6A)。类似地，在第13天，L6-F12578、L6-F127、L6-F58和L6-F4组中的股骨和腰椎骨的BMD增加了多达60％(P<0.001)(图6B、图6C)。这些数据不仅证实了我们之前发现的FZD1、2、7特异性WNT模拟物诱导骨形成，而且表明FZD5、8特异性WNT模拟物和FZD4特异性WNT模拟物也可以诱导骨形成。
还评估了各个治疗组的体重，并且用L6-F12578和L6-F127组处理的动物显示出显著降低(图6D)。如通过DEXA分析在第7天和第13天看到的那样，这种体重减轻可能主要是由于体脂含量降低(图6E)。在第14天，与媒介物组相比，在处理的动物中观察到的其他显著变化是L6-F12578、L6-F127、L6-F4和L6-F10组中的唾液腺重量分别显著增加了101％(P<0.001)、114％(P<0.001)、29％(p<0.01)和22％(P<0.05)(图6F)，其中L6-F12578和L6-F127的影响最为明显。我们观察到L6-F12578、L6-F127组中的小鼠在第7-14天期间的湿毛皮和毛皮颜色变化(棕色)。在几个处理组中也观察到肝脏和肠道重量的显著增加(图6G、图6H)。L6-F12578组中肝脏重量增加了28％(P<0.001)，且L6-F4组中增加了48％(P<0.001)，且L6-F12578、L6-F58、L6-F4和L6-F49组中小肠重量分别增加了21％(P<0.05)、31％(P<0.001)、30％(p<0.01)和24％(P<0.05)。
在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均通过引用整体并入本文中。
从上述内容可以理解，尽管为了说明的目的已经在本文中描述了本发明的特定实施方案，但是在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改，并且上述各种实施方案可以组合以提供其他的实施方案。因此，除所附权利要求外，本发明不受其他的限制。如果需要，可以修改实施方案的方面，以采用本文公开的各种专利、申请和出版物的概念，以提供其他的实施方案。可以根据以上详细描述对实施方案进行这些和其他改变。一般而言，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制为在说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求所赋予的等价物的完整范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
参考文献
Chen,H.,Lu,C.,Ouyang,B.,Zhang,H.,Huang,Z.,Bhatia,D.,Lee,S.J.,Shah,D.,Sura,A.,Yeh,W.C.,et al.(2020).Development of Potent,Selective Surrogate WNTMolecules and Their Application in Defining Frizzled Requirements.Cell ChemBiol 27,598-609 e594.
Gurney,A.,Axelrod,F.,Bond,C.J.,Cain,J.,Chartier,C.,Donigan,L.,Fischer,M.,Chaudhari,A.,Ji,M.,Kapoun,A.M.,et al.(2012).Wnt pathway inhibitionvia the targeting of Frizzled receptors results in decreased growth andtumorigenicity of human tumors.Proc Natl Acad Sci U S A 109,11717-11722.
Hao,H.X.,Xie,Y.,Zhang,Y.,Charlat,O.,Oster,E.,Avello,M.,Lei,H.,Mickanin,C.,Liu,D.,Ruffner,H.,et al.(2012).ZNRF3 promotes Wnt receptorturnover in an R-spondin-sensitive manner.Nature 485,195-200.
Hu,H.,Gehart,H.,Artegiani,B.,C,L.O.-I.,Dekkers,F.,Basak,O.,van Es,J.,Chuva de Sousa Lopes,S.M.,Begthel,H.,Korving,J.,et al.(2018).Long-TermExpansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.Cell 175,1591-1606 e1519.
Janda,C.Y.,Dang,L.T.,You,C.,Chang,J.,de Lau,W.,Zhong,Z.A.,Yan,K.S.,Marecic,O.,Siepe,D.,Li,X.,et al.(2017).Surrogate Wnt agonists that phenocopycanonical Wnt and beta-catenin signalling.Nature 545,234-237.
Koo,B.K.,Spit,M.,Jordens,I.,Low,T.Y.,Stange,D.E.,van de Wetering,M.,van Es,J.H.,Mohammed,S.,Heck,A.J.,Maurice,M.M.,et al.(2012).Tumour suppressorRNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wntreceptors.Nature 488,665-669.
Sato,T.,Stange,D.E.,Ferrante,M.,Vries,R.G.,Van Es,J.H.,Van den Brink,S.,Van Houdt,W.J.,Pronk,A.,Van Gorp,J.,Siersema,P.D.,et al.(2011).Long-termexpansion of epithelial organoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,andBarrett's epithelium.Gastroenterology 141,1762-1772.
Sato,T.,Vries,R.G.,Snippert,H.J.,van de Wetering,M.,Barker,N.,Stange,D.E.,van Es,J.H.,Abo,A.,Kujala,P.,Peters,P.J.,et al.(2009).Single Lgr5 stemcells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymalniche.Nature 459,262-265.
Schutgens,F.,Rookmaaker,M.B.,Margaritis,T.,Rios,A.,Ammerlaan,C.,Jansen,J.,Gijzen,L.,Vormann,M.,Vonk,A.,Viveen,M.,et al.(2019).Tubuloidsderived from human adult kidney and urine for personalized diseasemodeling.Nat Biotechnol 37,303-313.
Xie,Y.,Zamponi,R.,Charlat,O.,Ramones,M.,Swalley,S.,Jiang,X.,Rivera,D.,Tschantz,W.,Lu,B.,Quinn,L.,et al.(2013).Interaction with both ZNRF3 andLGR4 is required for the signalling activity of R-spondin.EMBO Rep 14,1120-1126.

Claims (62)

1.WNT超级激动剂分子，其包含：
a)Frizzled(FZD)结合结构域；
b)LRP5/6结合结构域；和
c)E3连接酶结合结构域，
其中所述超级激动剂分子激活细胞中经典的WNT信号传导通路。
2.如权利要求1所述的超级激动剂分子，其中：
a)所述FZD结合结构域结合一种或多种FZD受体；
b)所述LRP5/6结合结构域结合LRP5和/或LRP6中的一种或多种；并且
c)所述E3连接酶结合结构域结合ZNRF3和/或RNF43。
3.如权利要求1或权利要求2所述的超级激动剂分子，其包含一种或多种多肽，其中至少一种多肽包含融合至LRP5/6结合结构域的FZD结合结构域，并且其中至少一种多肽包含融合至FZD结合结构域或LRP5/6结合结构域的E3连接酶结合结构域。
4.如权利要求3所述的超级激动剂分子，其中融合结合结构域直接融合在一起和/或经由肽连接子融合。
5.如权利要求4所述的超级激动剂分子，其中所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸。
6.如权利要求5所述的超级激动剂分子，其中所述肽连接子的长度为约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
7.如权利要求4-6中任一项所述的超级激动剂分子，其中所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。
8.如权利要求1-7中任一项所述的超级激动剂分子，其中所述结合结构域中的至少一种选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。
9.如权利要求1-8中任一项所述的超级激动剂分子，其中所述结合结构域中的至少一种与Fc片段融合，任选地其中所述Fc片段来自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体同种型或α、δ、ε、γ或μ抗体重链。
10.如权利要求9所述的超级激动剂分子，其具有表3或表4中所示的结构。
11.如权利要求10所述的超级激动剂分子，其具有Fv-IgG结构。
12.如权利要求1-10中任一项所述的超级激动剂，其中所述WNT增强剂包含选自以下的E3连接酶结合结构域：突变的R-脊椎蛋白(RSPO)蛋白及抗体或其功能片段。
13.如权利要求12所述的超级激动剂分子，其中与野生型RSPO相比，所述突变的RSPO蛋白具有与富含亮氨酸重复的G-蛋白受体4-6(LGR4-6)的减少的结合。
14.如权利要求12所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域结合锌和环指3(ZNRF3)和/或环指蛋白43(RNF43)。
15.如权利要求14所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。
16.如权利要求15所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域直接或经由连接子与Fv-IgG的Fc片段的C-末端融合，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。
17.如权利要求15所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域直接或经由连接子与以下的C-末端融合：
a)FZD结合结构域的轻链或其片段；
b)FZD结合结构域的重链或其片段；
c)LRP5/6结合结构域的轻链或其片段；或
b)LRP5/6结合结构域的重链或其片段，
任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。
18.如权利要求15所述的超级激动剂分子，其中结合E3泛素连接酶的结合结构域直接或经由连接子与以下的N-末端融合：
a)FZD结合结构域的轻链或其片段；
b)FZD结合结构域的重链或其片段；
c)LRP5/6结合结构域的轻链或其片段；或
b)LRP5/6结合结构域的重链或其片段，
任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。
19.如权利要求1-18中任一项所述的超级激动剂分子，其包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％的序列同一性的多肽的组合。
20.药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的WNT超级激动剂分子和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
21.治疗患有与减少的WNT信号传导相关的疾病或病症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1-19中任一项所述的WNT超级激动剂分子或权利要求20所述的药物组合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述疾病或病症选自：口腔粘膜炎、短肠综合征、炎性肠病(IBD)、其他胃肠道病症；代谢综合征的治疗、血脂异常、糖尿病的治疗、胰腺炎的治疗、其中外分泌或内分泌胰腺组织受损伤的病况；其中期望增强的表皮再生的病况，例如，表皮创伤愈合、糖尿病足溃疡的治疗、涉及牙、指甲或真皮发育不全等的综合征、其中血管生成是有益的病况；心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭；免疫缺陷、移植物抗宿主病、急性肾损伤、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、急性肝衰竭、具有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪变性的非酒精性肝病或脂肪性肝炎，听力丧失的治疗，包括听觉毛细胞的内部和外部损失、前庭功能减退，黄斑变性，各种视网膜病的治疗，包括但不限于玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、视网膜变性的其他疾病、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、干性AMD、Fuchs营养不良、其他角膜疾病，中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和影响血脑屏障的其他病况；骨疾病、脊椎损伤、其他脊椎疾病和脱发症。
23.生成、培养或维持器官、组织、细胞或类器官培养物的方法，其包括使所述器官、组织、细胞或类器官培养物与以下接触：
a)权利要求1-19中任一项所述的WNT超级激动剂分子；或
b)权利要求20所述的药物组合物。
24.如权利要求23所述的方法，其用于离体维持所述器官或组织活力，包括：
a)离体使获自供体的器官或组织与包含所述WNT超级激动剂分子或所述药物组合物的组合物接触，任选地通过灌注使获自供体的器官或组织与包含所述WNT超级激动剂分子或所述药物组合物的组合物接触；或
b)在体内使供体器官或组织与包含所述WNT超级激动剂分子或所述药物组合物的组合物接触。
25.如权利要求23所述的方法，其用于生成或维持所述类器官培养物，包括接触所述类器官培养物，任选地通过在包含所述WNT超级激动剂分子的培养基中培养所述类器官培养物。
26.用于在对象中诱导骨形成或增加骨密度的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1-19中任一项所述的WNT超级激动剂分子或权利要求20所述的药物组合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述WNT超级激动剂分子结合FZD5、FZD8和FZD9。
28.用于再生对象的唾液腺或诱导对象的唾液腺生长的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1-19中任一项所述的WNT超级激动剂分子或权利要求20所述的药物组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其用于治疗所述对象的唾液过少。
30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述WNT超级激动剂分子结合FZD1、FZD2和FZD7。
31.R-脊椎蛋白(RSPO)模拟物，其包含结合WNT受体的第一结合组合物和结合E3泛素连接酶的第二结合组合物。
32.如权利要求31所述的RSPO模拟物，其中所述第一结合组合物结合FZD受体或LRP受体，任选地LRP5和/或LRP6。
33.如权利要求31或权利要求32所述的RPSO模拟物，其中所述第一结合组合物选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。
34.如权利要求31或权利要求32所述的RSPO模拟物，其中所述第二结合组合物是RSPO蛋白，任选地突变的RSPO蛋白，或结合E3泛素连接酶的抗体或其片段。
35.如权利要求31-34中任一项所述的RSPO模拟物，其中所述结合组合物直接融合在一起或经由肽连接子融合。
36.如权利要求35所述的RSPO模拟物，其中所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸。
37.如权利要求36所述的RSPO模拟物，其中所述肽连接子的长度为约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
38.如权利要求35-37中任一项所述的RSPO模拟物，其中所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。
39.如权利要求31-38中任一项所述的RSPO模拟物，其包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％的序列同一性的多肽的组合。
40.药物组合物，其包含权利要求31-39中任一项所述的RSPO模拟物和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
41.治疗患有与减少的WNT信号传导相关的疾病或病症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求31-39中任一项所述的RSPO或权利要求40所述的药物组合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述疾病或病症选自：口腔粘膜炎、短肠综合征、炎性肠病(IBD)、其他胃肠道病症；代谢综合征的治疗、血脂异常、糖尿病的治疗、胰腺炎的治疗、其中外分泌或内分泌胰腺组织受损伤的病况；其中期望增强的表皮再生的病况，例如，表皮创伤愈合、糖尿病足溃疡的治疗、涉及牙、指甲或真皮发育不全等的综合征、其中血管生成是有益的病况；心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭；免疫缺陷、移植物抗宿主病、急性肾损伤、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、急性肝衰竭、具有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪变性的非酒精性肝病或脂肪性肝炎，听力丧失的治疗，包括听觉毛细胞的内部和外部损失、前庭功能减退，黄斑变性、玻璃体视网膜病变的治疗、糖尿病性视网膜病变、视网膜变性的其他疾病、Fuchs营养不良、其他角膜疾病，中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和影响血脑屏障的其他病况；脊椎损伤；骨疾病；其他脊椎疾病和脱发症。
43.WNT替代物，其包含：
a)Frizzled(FZD)结合结构域；和
b)LRP5/6结合结构域，
其中所述超级激动剂分子激活细胞中经典的WNT信号传导通路。
44.如权利要求43所述的WNT替代物，其中
a)所述FZD结合结构域结合一种或多种FZD受体；并且
b)所述LRP5/6结合结构域结合LRP5和/或LRP6。
45.如权利要求43或权利要求44所述的WNT替代物，其中所述FZD结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。
46.如权利要求43-45中任一项所述的WNT替代物，其中所述LRP5/6结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab′2片段、双链抗体和Fv片段。
47.如权利要求43-46中任一项所述的WNT替代物，其中所述结合结构域直接融合在一起或经由肽连接子融合。
48.如权利要求47所述的WNT替代物，其中所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸。
49.如权利要求48所述的WNT替代物，其中所述肽连接子的长度为约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
50.如权利要求47-49中任一项所述的WNT替代物，其中所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。
51.如权利要求43-50中任一项所述的WNT替代物，其包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽的组合。
52.药物组合物，其包含权利要求43-51中任一项所述的RSPO模拟物和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
53.治疗患有与减少的WNT信号传导相关的疾病或病症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求43-51中任一项所述的WNT替代物或权利要求52所述的药物组合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述疾病或病症选自：口腔粘膜炎、短肠综合征、炎性肠病(IBD)、其他胃肠道病症；代谢综合征的治疗、血脂异常、糖尿病的治疗、胰腺炎的治疗、其中外分泌或内分泌胰腺组织受损伤的病况；其中期望增强的表皮再生的病况，例如，表皮创伤愈合、糖尿病足溃疡的治疗、涉及牙、指甲或真皮发育不全等的综合征、其中血管生成是有益的病况；心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭；免疫缺陷、移植物抗宿主病、急性肾损伤、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、急性肝衰竭、具有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪变性的非酒精性肝病或脂肪性肝炎，听力丧失的治疗，包括听觉毛细胞的内部和外部损失、前庭功能减退、黄斑变性、玻璃体视网膜病变的治疗、糖尿病性视网膜病变、视网膜变性的其他疾病、Fuchs营养不良、其他角膜疾病，中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和影响血脑屏障的其他病况；骨疾病、脊椎损伤、其他脊椎疾病和脱发症。
55.生成、培养或维持器官、组织、细胞或类器官培养物的方法，其包括使所述器官、组织、细胞或类器官培养物与以下接触：
a)权利要求43-51中任一项所述的WNT替代分子；或
b)或权利要求52所述的药物组合物。
56.如权利要求55所述的方法，其用于离体维持所述器官或组织的活力，包括：
a)离体使获自供体的器官或组织与包含所述WNT替代分子或所述药物组合物的组合物接触，任选地通过灌注使获自供体的器官或组织与包含所述WNT替代分子或所述药物组合物的组合物接触；或
b)在体内使供体器官或组织与包含所述WNT替代分子或所述药物组合物的组合物接触。
57.如权利要求55所述的方法，其用于生成或维持所述类器官培养物，包括接触所述类器官培养物，任选地通过在包含所述WNT替代分子的培养基中培养所述类器官培养物。
58.用于在对象中诱导骨形成或增加骨密度的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求43-51中任一项所述的WNT替代分子或权利要求52所述的药物组合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述WNT替代分子结合FZD5、FZD8和FZD9。
60.用于再生对象的唾液腺或诱导对象的唾液腺生长的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求43-51中任一项所述的WNT替代分子或权利要求52所述的药物组合物。
61.如权利要求60所述的方法，其用于治疗所述对象的唾液过少。
62.如权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述WNT替代分子结合FZD1、FZD2和FZD7。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7305543B2 (ja) 2017-01-26 2023-07-10 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子およびその使用
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CN113651891B (zh) * 2021-08-02 2023-08-04 苏州天梯生物医药有限公司 双特性抗体在制备治疗先天性α-肌营养不良症药物中的应用
KR20230089159A (ko) * 2021-12-13 2023-06-20 연세대학교 산학협력단 인간 타액선 조직으로부터 분리된 기저 세포 또는 내강 세포 유래 오가노이드의 최적 배양 방법
CA3240866A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 Surrozen Operating, Inc. Wnt-surrogate agents and methods for lacrimal gland regeneration

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11993645B2 (en) * 2017-01-11 2024-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions comprising R-Spondin (RSPO) surrogate molecules
JP7305543B2 (ja) * 2017-01-26 2023-07-10 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子およびその使用
US11773171B2 (en) * 2017-12-19 2023-10-03 Surrozen Operating, Inc. WNT surrogate molecules and uses thereof
AU2019297522A1 (en) * 2018-07-05 2021-01-28 Surrozen Operating, Inc. Multi-specific Wnt surrogate molecules and uses thereof
EP3820499A4 (en) * 2018-07-09 2022-07-13 Surrozen Operating, Inc. TISSUE-SPECIFIC WNT SIGNAL ENHANCING MOLECULES AND THEIR USES

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