CN115407002A - 一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于反相‑离子交换混合模式固相萃取的植物内源小肽的纯化方法。该方法将植物内源小肽经过溶剂提取，提取液与吸附材料作用，植物内源小肽吸附于材料表面，经淋洗去除基质杂质后，再通过洗脱将吸附在固相萃取材料上的植物小肽洗脱而得。该方法简单、快速、易操作，所用分离材料为商品化固相萃取柱，易获取。整个处理流程容易学习和上手，可供相关科研人员方便的使用，在植物激素调控、生物标志物筛选等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法。
背景技术
小肽是指由天然氨基酸通过肽键首尾相连而成的链状聚合物，其结构介于氨基酸与蛋白质之间，通常由不多于50个氨基酸组成，分子量小于10KDa。活性小肽广泛存在于植物王国中，在维持和调节其正常生理活动中扮演着重要角色。除了番茄***素(TomSys)，人们在植物中还发现了AtPep、导管分化抑制因子(TDIF)等数十种内源活性调节肽，它们参与调控了植物生长发育的各个生理过程，特别是在细胞-细胞间的短距离信息交流中起到了关键作用。由于这些植物内源活性小肽具有类似植物激素的作用模式，在极低的生理浓度下即可发挥其生理功能，他们又被称为植物小肽激素。随着“拟南芥基因组计划”的完成及后续其他植物基因组的测序研究，植物小肽激素的发现、鉴定及生理调控机制研究步入了快车道，吸引着越来越多植物生理学家的目光，成为了植物生理学领域的热点研究课题。
值得注意的是，无论是未知植物活性小肽的发现与鉴定，还是已有植物小肽激素的调控机制探索，亦或是小肽类生物标志物的筛选都离不开内源植物小肽的高效纯化和全面分析。传统植物激素家族分子量小，每类植物小肽激素多含有相似的分子骨架或母核结构，物化性质较为接近，这就给分析方法的开发带来了很大的便利。而植物小肽激素由氨基酸组成，氨基酸个数、种类、序列及各种翻译后修饰的存在致使植物活性肽的结构和理化性质具有极大的多样性，其检测和分析面临着更严峻的挑战。
目前，由于其良好的分离能力、较高的灵敏度及优秀的序列鉴定与分析能力，LC-MS技术被广泛应用于植物小肽的检测。高分辨质谱和多级质谱技术的结合极大提高了小肽结构的解析能力和准确性。可是，植物基质往往成分复杂，而植物活性肽含量很低，直接对植物样本提取液进行检测难以获得理想的结果，而且基质中的无机盐等组分容易对质谱造成不可逆损伤。故而，在检测之前需要对植物基质中的内源小肽进行富集和纯化。目前，植物小肽的纯化方法多综合絮凝沉降除蛋白和后期除盐、高效液相色谱、葡萄糖凝胶色谱、快速柱层析、免疫纯化等步骤，在部分植物小肽的分析中表现出色，但仍有较大的改进空间。其一，面对不同的基质或不同的目标小肽，纯化流程不一，所需分离材料各异，有的分离材料无法通过商业化途径获取。其二，像免疫纯化等部分操作对分析人员的技术要求较高，带来了一定的学习时间成本。因此，建立一套简便易行的植物小肽纯化方法是解决这些问题的最佳选择。
从结构上可知，小肽的基本组成单元为氨基酸，不同氨基酸的组合和排列赋予了小肽结构的多样性。不同氨基酸的亲水性、疏水性、酸性、碱性各异，致使小肽的性质也表现出显著的差异性。基于这些结构特点，植物小肽可以通过反相作用或离子交换作用保留在分离材料上，疏水性越强的反相保留越强，亲水性越强的离子交换作用越强。若同时赋予分离材料反相和离子交换作用位点，则能更大程度的富集多类小肽，而且还可以选择合适的淋洗溶剂去除杂质的同时避免目标小肽的流失。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于反相-离子交换混合模式固相萃取的植物内源小肽的纯化方法。
本发明提供的纯化植物内源小肽的方法，包括如下步骤：
1)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a；
所述处理a为上样于1种装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物I；
2)将步骤1)所得结合物I依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到所述植物内源小肽。
本发明提供的筛选植物内源小肽的方法，包括：
3)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理b；
所述处理b为依次上样于2种保留机制互补的装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物II和III；
4)将步骤3)所得结合物II和III分别进行淋洗和洗脱，收集洗脱液并合并于同一容器中，浓缩，得到所述植物内源小肽。
上述方法的所述步骤1)和步骤3)中，所述植物内源小肽是指内源存在于植物体内、未经过蛋白酶解的小肽，具体可为已知的植物小肽激素，也可以是未知的植物小肽，更具体为TomSys、TDIF等；
所述植物原料具体可为水稻、拟南芥或番茄等；
所述提取溶剂为质量百分浓度为50％-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为0.1％-2％的三氟乙酸水溶液；
所述植物原料的用量不超过1000mg或不超过200mg或不超过100mg；具体为50mg-1000mg，具体可为50mg-500mg，更具体可为50mg-200mg，再具体可为100mg；
所述植物原料与提取溶剂的用量比为100mg：0.5-5mL；
所述提取步骤中，提取方法为各种常规方法，如超声、涡旋、离心或静置等；
所述提取包括涡旋混匀，超声，4℃下过夜放置并离心；具体的，所述超声中，时间为1-60min；具体为2-10min；超声功率为200-300W；所述离心步骤中，离心转速为9000-20000rpm；离心力为10000-20000g；离心时间为10-20min；
所述装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱包括混合模式强阳离子交换柱(Mixed-Mode Strong Cation-Exchange,MCX)、混合模式弱阳离子交换柱(Mixed-Mode Weak Cation-Exchange,WCX)、混合模式强阴离子交换柱(Mixed-ModeStrong Anion-Exchange,MAX)和混合模式弱阴离子交换柱(Mixed-Mode Weak Anion-Exchange,WAX)，上述固相萃取柱均可从Waters公司购买。
处理a的目的是借助于反相作用或离子交换作用将提取液中的小肽萃取结合到固相萃取吸附剂上。
由步骤1)和3)可知，该方法的样品前处理过程只需1-2个Oasis固相萃取柱进行纯化，且使用的固相萃取小柱均可方便的从商品化途径购买。
所述步骤2)和步骤4)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂。
所述淋洗溶剂选自选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、三氟乙酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液；
所述甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度均为0.1-10％；更具体为5％；
所述三氟乙酸水溶液中，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；更具体为1％；
所述含甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；
所述淋洗具体为用质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、水、甲醇依次淋洗；
所述步骤2)和步骤4)洗脱步骤中，洗脱为一步完成或分步完成；
所述一步完成中，所用洗脱试剂为含有三氟乙酸或氨水的甲醇溶液；其中，MCX小柱或WAX小柱使用含NH4OH的甲醇水溶液，NH4OH的质量百分浓度为1-5％；甲醇的质量百分浓度为60-80％，其余成分为水；
WCX小柱或MAX小柱使用含三氟乙酸的甲醇水溶液，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；具体为2％；甲醇的质量百分浓度为60-98％，具体为80％；其余成分为水；
所述分步完成包括：第一步选用酸性水溶液或碱性水溶液破坏离子交换作用；第二步选用甲醇水溶液或乙腈水溶液作为洗脱试剂；
所述第一步中，所述酸性水溶液为三氟乙酸水溶液或氨水溶液，其中MCX小柱或WAX小柱使用氨水溶液，NH4OH的质量百分浓度为1-5％；WCX小柱或MAX小柱使用三氟乙酸水溶液，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；具体为2％；
所述第二步中，所述甲醇水溶液中，甲醇的质量百分浓度为60-100％；所述乙腈水溶液中，乙腈的质量百分浓度为60-100％。
另外，上述方法在下述任意一种中的应用，也属于本发明的保护范围：
a、植物小肽的定量分析；
b、植物小肽的定性分析；
c、植物内源活性小肽的筛选；
d、植物内源活性小肽的鉴定。
本发明还要求保护一种分析植物内源小肽的方法，包括如下步骤：将所述方法所得纯化产物溶于溶剂中，进行LC-MS/MS检测。
具体的，所述溶剂选自含有酸的乙腈水溶液、含有酸的甲醇水溶液和含有酸的水溶液中至少一种；
具体的，所述酸为甲酸或三氟乙酸；所述酸在所述酸的乙腈水溶液、含有酸的甲醇水溶液和含有酸的水溶液中的质量百分浓度为0.05-2％；具体为0.1％；
所述含有酸的乙腈水溶液中，乙腈的质量百分浓度为0-10％；具体为5％；
所述含有酸的甲醇水溶液中，甲醇的质量百分浓度为0-10％；具体为5％。
本发明提供的方法简单、快速、易操作，所用分离材料为商品化固相萃取柱，易获取。整个处理流程容易学习和上手，可供相关科研人员方便的使用。
附图说明
图1为内***肽和神经肽的加标回收实验典型色谱图。植物基质为水稻未成熟种子(100mg FW)，***肽和神经肽的标品加入量均为100ng。
图2为拟南芥茎和花中内源TDIF的多反应监测色谱图；
图3为番茄叶片中内源TomSys的多反应监测色谱图；
图4为WAX与WCX富集不同小肽效果对比图；
图5为耐盐小肽标志物候选化合物在不同水稻品系中的盐响应行为对比，纵坐标表示盐处理后与盐处理前化合物的含量之比，横坐标表示化合物的分子量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。所述浓度如无特别说明，均为质量百分浓度。
实施例1、水稻基质下内***肽和神经肽的加标回收实验
液氮下研磨植物组织(野生型水稻日本晴未成熟种子、穗花或幼苗)至粉末状，称取100mg植物材料粉末置入2mL离心管中，加入1mL 80％甲醇，然后加入内***肽(endomorphin)和神经肽(neuropeptide)各200ng，涡旋混合均匀。250W的功率下超声2min，4℃下放置1h。15000rpm下离心15min，取上清液，将上清液上样至Oasis WCX固相萃取柱(6cc,150mg)，以水、甲醇和2％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含2％三氟乙酸的90％甲醇水溶液洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。结果如下图所示，WCX可以富集加入至水稻基质中的目标小肽，在水稻未成熟种子、穗花和幼苗中内***肽的总回收率为67％、52％和48％，在水稻未成熟种子、穗花和幼苗中神经肽的总回收率为76％、87％和73％。
实施例2、拟南芥基质下内***肽和神经肽的加标回收实验
液氮下研磨植物组织(野生型拟南芥Col-0花、茎、果荚和全苗)至粉末状，称取100-200mg植物材料粉末置于2mL离心管中，加入1-1.5mL 80％甲醇，然后加入内***肽(endomorphin)和神经肽(neuropeptide)各200ng，涡旋混合均匀，250W的功率下超声2min。4℃下放置1h。15000rpm下离心15min，取上清液，将上清液上样至Oasis WCX固相萃取柱(6cc,150mg)，以水、甲醇和2％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含2％三氟乙酸的90％甲醇水溶液洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。结果表明，不同拟南芥组织中均可成功检出外源加入的目标小肽标品，各拟南芥组织中，WCX对内***肽的加标总回收率均高于90％，对神经肽的加标总回收率均高于67％。
实施例3、植物小肽激素的加标回收实验
液氮下研磨水稻剑叶至粉末状，称取100mg植物材料粉末置于2mL离心管中，加入1mL 80％甲醇，然后加入包括TomSys、Atpep1、Pep6、CLE19(Clavata3/embryo surroundingregion-related 19)、CLE40、TDIF、GmRIC1(Glycine max Rhizobia-induced CLE1)各200ng，涡旋混合均匀，250W的功率下超声2min。4℃下过夜放置。15000rpm下离心15min，取上清液，将上清液上样至Oasis WCX固相萃取柱(3cc,60mg)，以水、甲醇和2％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用甲醇洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。7种植物小肽激素的加标回收情况如表1所示，可见WCX对7种典型的植物小肽激素具有良好的富集效果。
表1水稻基质中植物小肽激素加标回收结果
实施例4、拟南芥中TDIF的测定
液氮下研磨植物材料(拟南芥茎和花)至粉末状，称取三份(命名为A、B、C)1g植物材料粉末置于2mL离心管中，加入10mL 1％的三氟乙酸水溶液，然后向A、B和C样品中加入0ng、1ng和10ng TDIF标品，涡旋混合均匀，250W的功率下超声10min。4℃下过夜放置。15000rpm下离心15min，取上清液，将上清液上样至Oasis WCX固相萃取柱(6cc,150mg)，以水、和0.1％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含2％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果在拟南芥茎和花中均检测到内源TDIF(图2)，结合加标结果计算可得内源TDIF含量为0.18ng/g(茎)和0.21ng/g(花)。
实施例5、番茄叶片中TomSys的测定
液氮下研磨机械伤害后的番茄叶片至粉末状，称取三份(命名为A、B、C)1g植物材料粉末置于2mL离心管中，加入10mL 1％的三氟乙酸水溶液，然后向A、B和C样品中加入0ng、1ng和10ng TDIF标品，涡旋混合均匀，250W的功率下超声10min。4℃下过夜放置。15000rpm下离心15min，取上清液，将上清液上样至Oasis WCX固相萃取柱(6cc,150mg)，以水、和0.1％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含2％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果如图3所示，可检测到番茄叶片中的内源TomSys，结合加标结果计算可得内源TomSys含量为1.07ng/g。
实施例6、水稻未成熟种子基质下WAX和WCX的小肽纯化效果对比
称取研磨好的水稻未成熟种子300mg放入7mL离心管中，加入3mL 80％的甲醇和不同序列结构的小肽标品各400ng，涡旋混合均匀，250W的功率下超声2min。4℃下放置1h。15000rpm下离心15min，取上清液，将上清液平均分成两份，分别上样至Oasis WCX固相萃取柱(6cc,150mg)和Oasis WAX固相萃取柱(6cc,150mg)，用水、甲醇、水和质量百分浓度为2％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含甲醇洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％三氟乙酸的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。如图4所示，对于不同序列结构的小肽而言，WAX和WCX的富集效果具有显著差异，WAX适合于更偏酸性的Caspase-1，而WCX更适合于偏中性或碱性的Endomorphin和Neuropeptide。可见，WAX和WCX对小肽的富集行为具有互补性，使得它们的结合使用将有助于获取更为全面的植物内源小肽信息，从而为植物小肽激素的发现与筛选提供必要的技术支撑。
实施例7、水稻中耐盐小肽标志物的筛选
称取研磨好的水稻茎基部100mg放入2mL离心管中，加入1mL 80％甲醇，涡旋混合均匀，250W的功率下超声2min。4℃下过夜放置。15000rpm下离心15min，取上清液，上样至Oasis WCX固相萃取柱(6cc,150mg)，收集流穿液上样于Oasis WAX固相萃取柱(6cc,150mg)。对于WCX小柱，用水、甲醇、水和质量百分浓度为2％的三氟乙酸水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含甲醇洗脱小肽。对于WAX小柱，用水、甲醇、水和5％的NH4OH的水溶液依次淋洗固相萃取柱，然后用含甲醇洗脱小肽。将收集的WAX和WCX洗脱液合并，氮气浓缩吹干后，用100μL含0.1％三氟乙酸的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。通过对盐处理前后不同品系的小肽组成与变化的对比分析，最终找到10几种可能与耐盐行为有关的小肽候选化合物，部分化合物的盐响应差异见图5。
实施例8、MAX和WCX小柱对CLE家族小肽纯化效果对比
液氮下研磨水稻剑叶至粉末状，称取200mg植物材料粉末置于7mL离心管中，加入2mL 80％甲醇，然后加入包括CLE19、CLE40、TDIF和CLV3各400ng，涡旋混合均匀，250W的功率下超声2min。4℃下过夜放置。20000rpm下离心10min，取上清液，将上清液平分为两份，分别上样至WCX小柱(3cc,60mg)和MAX小柱(3cc,60mg)，以水、甲醇依次淋洗固相萃取柱，然后用含2％三氟乙酸和80％甲醇的水溶液洗脱小肽，收集的洗脱液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。MAX和WCX的富集效果对比见下表，可见WCX对4种CLE家族的植物小肽激素的富集效果要明显优于MAX。
表2 MAX和WCX对CLE小肽的富集效果对比
实施例9、水稻剑叶基质下WAX、MCX、MAX和WCX小柱的小肽纯化效果对比
称取研磨好的水稻剑叶150mg放入2mL离心管中，加入1.5mL 1％的三氟乙酸水溶液，涡旋混合均匀，250W的功率下超声2min。4℃下放置1h。20000rpm下离心15min，离心取上清液，加入适量1％的三氟乙酸水溶液定容至15mL，取出4mL溶液，均分为四份，每份加入小肽标品100ng，分别上样于WAX、MCX、MAX和WCX小柱，用水淋洗，MCX和WAX用含5％NH4OH和80％MeOH的水溶液洗脱，WCX和MAX用含2％三氟乙酸和80％MeOH的水溶液洗脱，收集的洗脱
液吹干后，用100μL含0.1％甲酸和5％乙腈的水溶液复溶，最后5μL进入LC-HRMS分析。结果如下表所示，4种小柱对不同结构和性质的小肽具有不同的富集效果，合理组合阴、阳离子小柱将能覆盖更多的小肽，从而应用于小肽筛选和小肽互作的相关研究中。
表3、4种小柱的小肽纯化效果对比
以上实施例揭示了本发明的具体操作内容，但是本发明不局限于上述实施方式和实施例，在不脱离本发明的精神和范围内，任何本领域技术人员还可以做些修改和完善。
Claims (9)
1.一种纯化植物内源小肽的方法，包括：
1)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a；
所述处理a为上样于1种装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物I；
2)将步骤1)所得结合物I依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到所述植物内源小肽。
2.一种筛选植物内源小肽的方法，包括：
3)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理b；
所述处理b为依次上样于2种保留机制互补的装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物II和III；
4)将步骤3)所得结合物II和III分别进行淋洗和洗脱，收集洗脱液并合并于同一容器中，浓缩，得到所述植物内源小肽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤3)中，所述提取溶剂为质量百分浓度为50％-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为0.1％-2％的三氟乙酸水溶液；
所述植物原料的用量不超过1000mg或不超过200mg或不超过100mg；
所述植物原料与提取溶剂的用量比为100mg：0.5-5mL；
所述提取包括涡旋混匀，超声，4℃下过夜放置并离心；具体的，所述超声中，时间为1-60min；具体为2-10min；超声功率为200-300W；所述离心步骤中，离心转速为9000-20000rpm；离心力为10000-20000g；离心时间为10-20min；
所述混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱选自混合模式强阳离子交换柱(Mixed-Mode Strong Cation-Exchange，MCX)、混合模式若阳离子交换柱(Mixed-Mode Weak Cation-Exchange，WCX)、混合模式强阴离子交换柱(Mixed-Mode StrongAnion-Exchange，MAX)和混合模式弱阴离子交换柱(Mixed-Mode Weak Anion-Exchange，WAX)中至少一种。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤4)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述淋洗溶剂选自选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、三氟乙酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液；
所述甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度均为0.1-10％；
所述三氟乙酸水溶液中，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；
所述含甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤4)洗脱步骤中，洗脱为一步完成或分步完成；
所述一步完成中，所用洗脱试剂为含有三氟乙酸或氨水的甲醇溶液；其中，MCX小柱或WAX小柱使用含NH4OH的甲醇水溶液，NH4OH的质量百分浓度为1-5％；甲醇的质量百分浓度为60-80％，其余成分为水；
WCX小柱或MAX小柱使用含三氟乙酸的甲醇水溶液，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；甲醇的质量百分浓度为60-98％，其余成分为水；
所述分步完成包括：第一步选用酸性水溶液或碱性水溶液破坏离子交换作用；第二步选用甲醇水溶液或乙腈水溶液作为洗脱试剂；
所述第一步中，所述酸性水溶液为三氟乙酸水溶液或氨水溶液，其中MCX小柱或WAX小柱使用氨水溶液，NH4OH的质量百分浓度为1-5％；WCX小柱或MAX小柱使用三氟乙酸水溶液，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；
所述第二步中，所述甲醇水溶液中，甲醇的质量百分浓度为60-100％；所述乙腈水溶液中，乙腈的质量百分浓度为60-100％。
7.权利要求1-6任一所述方法在下述任意一种中的应用：
a、植物小肽的定量分析；
b、植物小肽的定性分析；
c、植物内源活性小肽的筛选；
d、植物内源活性小肽的鉴定。
8.一种分析植物内源小肽的方法，包括如下步骤：将权利要求1-6中任一方法所得纯化产物溶于溶剂中，进行LC-MS/MS检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述溶剂选自含有酸的乙腈水溶液、含有酸的甲醇水溶液和含有酸的水溶液中至少一种；
具体的，所述酸为甲酸或三氟乙酸；所述酸在所述酸的乙腈水溶液、含有酸的甲醇水溶液和含有酸的水溶液中的质量百分浓度为0.05-2％；
所述含有酸的乙腈水溶液中，乙腈的质量百分浓度为0-10％；
所述含有酸的甲醇水溶液中，甲醇的质量百分浓度为0-10％。
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