CN115404237B - 用于检测突变SARS-CoV-2病毒的组合产品、试剂盒、用途及方法 - Google Patents
用于检测突变SARS-CoV-2病毒的组合产品、试剂盒、用途及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术及医学领域，具体而言，涉及一种用于检测突变SARS‑CoV‑2病毒的组合产品、试剂盒、用途及方法。本发明的针对N501Y、P681H及HV 69‑70del分别设计引物探针，使其灵敏度高，且能够对突变进行特异性检出。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体而言，涉及一种用于检测突变SARS-CoV-2病毒的组合产品、试剂盒、用途及方法。
背景技术
目前，用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)筛查的核酸检测试剂盒，其引物探针的设计区域多位于N基因、ORF1ab基因或者E基因。在其检测区域未发生变异的情况下，能够对不同型别的变异株进行检测，但是不能够对变异株的关键突变位点进行区分，因此很难在临床治疗和防控上提供更为精确的指导。而一旦其检测区域发生突变，则检测灵敏度会受到一定程度的影响，导致阳性检出率急剧降低。
因此，本领域急需一种既能对新型冠状病毒进行高效检出，又能对关键突变位点进行鉴别检测的相关技术和产品。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明采用的设计方案，可以对N501Y、P681H及HV 69-70del突变同时进行高效检测，因此能够同时起到病毒筛查检测及对关键突变的区分检测，且能够适用于不同样本类型检测，能够很好的解决上述难点。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明的第一方面涉及引物探针组合产品，包括a和/或b：
a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1～6所示的引物以及SEQ ID NO：7～9所示的探针；
b)核苷酸序列为SEQ ID NO：10～15所示的引物以及SEQ ID NO：16～18所示的探针。
本发明的第二方面涉及含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
本发明的第三方面涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于检测突变的SARS-CoV-2病毒的试剂盒中的应用。
本发明的第四方面涉及一种检测突变SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)获取待检测样本中的核酸；
b)使用如上所述的引物探针组合产品，或如上所述的试剂盒，以所述核酸为模板进行扩增以确定所述样本中是否存在N501Y、P681H及HV 69-70del三种突变形式的SARS-CoV-2病毒中的至少一种。
本发明的有益效果为：
本发明的针对N501Y、P681H及HV 69-70del分别设计引物探针，使其灵敏度高，且能够对突变进行特异性检出。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中表1中的引物探针组合对有突变的阳性样本进行扩增时所对应的扩增曲线；
图2为本发明一个实施例中表2中的引物探针组合对有突变的阳性样本进行扩增时所对应的扩增曲线；
图3为本发明一个实施例中表1中的引物探针组合对无突变的阴性样本进行扩增时所对应的扩增曲线；
图4为本发明一个实施例中表2中的引物探针组合对无突变的阴性样本进行扩增时所对应的扩增曲线；
图5为本发明一个实施例中表1中的引物探针组合扩增不同浓度样本所对应的扩增曲线；
图6为本发明一个实施例中表2中的引物探针组合扩增不同浓度样本所对应的扩增曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一个方面涉及引物探针组合产品，包括a和/或b：
a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1～6所示的引物以及SEQ ID NO：7～9所示的探针；
b)核苷酸序列为SEQ ID NO：10～15所示的引物以及SEQ ID NO：16～18所示的探针。
上述引物和探针采用ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)即突变阻滞扩增***进行突变检测，其原理在于利用DNA聚合酶缺少3'-5'外切酶活性的特点，在一定反应体系或条件下，PCR引物3'末端的错配导致PCR扩增效率急剧降低，甚至不扩增。因此针对已知突变位点，设计适当的引物及荧光探针，通过荧光PCR方法达到对突变位点进行检测的目的。
本发明的设计方案在于，针对N501Y、P681H及HV 69-70del分别设计引物探针，使其灵敏度高，且能够对突变进行特异性检出，根据检测结果能够对野生型及突变型新型冠状病毒进行区分，能够为疫情防控及患者治疗提供有效的指导，是防疫更科学更精准。
本发明所提供的新型冠状病毒关键突变检测体系，其灵敏度均可达到200copies/mL；且具有良好的检测特异性性，检测1×106copies/mL的野生型新冠型冠状病毒核酸及其他与新型冠状病毒核酸序列具有同源相似性的病原微生物核酸样本时无非特异扩增，能够满足临床所需。
通过NCBI查找新型冠状病毒S基因上N501Y、P681H及HV 69-70del突变所位于的序列区域(Genbank登陆号：NC_045512.2:21519-25412)，进行引物探针设计，扩增序列及引物探针如下所示。本发明以此构建PCR检测体系对上述三个突变进行检测，具体检测序列及位点如下所示(加下划线部分为本发明所检测的突变位点的碱基变化)。
ACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCT{ATACATG>A，HV 69-70del}TACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACT{A>T，N501Y}ATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTC{C>A，P681H}TCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAA
在一些实施方式中，所述的引物探针组合产品还包括用于检测SARS-CoV-2基因保守区段的质控引物和/或质控探针。
SARS-CoV-2基因保守区段可以选自新冠病毒的任何基因，例如ORF1ab基因、S基因、E基因、M基因、N基因，作为优选的方案，SARS-CoV-2基因保守区段不从S基因中选出。在一些实施方式中，所述保守区段来自SARS-CoV-2N基因。
在一些实施方式中，所述质控引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：19～20所示，所述质控探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示。
针对N基因保守区域进行引物探针设计，通过N基因的扩增对样本中的新型冠状病毒核酸含量进行质控，避免因核酸浓度过高造成假阳性检测结果，或因核酸浓度过低导致假阴性结果。
保守区段是相对于待检测样本的突变频繁度而言的，其可选用SARS-CoV-2中公知的突变频率较低的核酸片段以保证质控引物能够稳定地检测到样本中存在SARS-CoV-2。在一些实施方式中，保守区域能够在严格条件下与SEQ ID NO：19～20所示引物以及SEQ IDNO：21所示探针杂交；“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。在一些具体的实施方式中，保守区域含有SEQ ID NO：22所示序列。
N基因检测区域序列(GenBank:LC528233.2)
CTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGG(SEQ ID NO：22)
另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与表1和表2中提供的引物或探针具有大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
术语“％同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，％同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST(Altschul etal.,1990、J Mol Biol 215:3,403-410；Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res25:17,3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述探针标记有可检测的信号物质。
在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
在一些实施方式中，所述探针标记有荧光物质。
在一些实施方式中，所述荧光物质可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。
在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。
在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。
在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazole orange,YO)系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。
在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
在一些优选的实施方式中，每条探针上的所述荧光物质独立地选自AMCA、Atto425、Atto 590、FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY5.5、CY3、Texas Red、TFAM、TAMRA、VIC以及JOE中的一种或两种。
在一些优选的实施方式中，SEQ ID NO：7～9所示的探针上的荧光物质在同一反应体系下可被区分；进一步的，SEQ ID NO：7～9、21所示的探针上的荧光物质在同一反应体系下可被区分。
在一些优选的实施方式中，SEQ ID NO：16～18所示的探针上的荧光物质在同一反应体系下可被区分；进一步的，SEQ ID NO：16～18、21所示的探针上的荧光物质在同一反应体系下可被区分。
荧光物质在同一反应体系下可被区分例如指可采用不同的荧光通道对彼此进行分型。可以是其他荧光通道的不同组合；同时不同的靶标也可以对应不同的荧光通道，如可以采用任何一个荧光通道作为内标检测通道。
荧光团通常标记在引物或探针序列的5'端，但通过改变修饰键(例如-OH或-NH键)也可以将其置于3'端或进行中间修饰，也可3'端、5'端、中间修饰中选取至少两种同时修饰。
本发明还涉及如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述的试剂盒还含有dNTPs、Mg2+、适用于ARMS-PCR体系的DNA聚合酶(特别是Taq酶)、逆转录酶、PCR缓冲液、RNA酶抑制剂、阳性对照以及阴性对照中的至少一种；
所述阴性对照和阳性对照均为含有能够与待检测突变位点的检测引物在严格条件下互补配对序列的SARS-CoV-2核酸片段；所述阴性对照为不含有待检测突变位点；所述阳性对照含有待检测突变位点。
优选的，试剂盒中的核酸组分，例如引物、探针、阳性对照以及阴性对照以干粉形式存放于试剂盒中。阳性对照以及阴性对照也可以以质粒的方式存在。
各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。
本发明还涉及溶液，其由如上所述的试剂盒中的各成分以及模板核酸混合得到。
溶液也可以理解为反应体系，其中，当试剂盒中同时含有a组分和b组分时，两个组分优选位于两个不同的溶液体系中。
在反应混合物的一个优选实施方式中，参比DNA(阴性对照和/或阳性对照)的量可以与待定量的DNA片段的检测极限对应的浓度存在。此外，取决于应用，可以设置靶DNA和参比DNA以1:1的比率存在，并且此外以特定的量存在。
本发明还涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于检测突变的SARS-CoV-2病毒的试剂盒中的应用。
本发明所提供的上述引物探针组合产品可用于检测突变的SARS-CoV-2病毒，特别是位于S基因的N501Y、P681H及HV 69-70del三种突变形式中的至少一种。
因而特别地，本发明还是涉及一种用于检测突变SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包括：
a)获取待检测样本中的核酸；
b)使用如上所述的引物探针组合产品，或如上所述的试剂盒，以所述核酸为模板进行扩增以确定所述样本中是否存在N501Y、P681H及HV 69-70del三种突变形式的SARS-CoV-2病毒中的至少一种。
所述方法可用于诊断突变的SARS-CoV-2感染，或者检测环境中的SARS-CoV-2病毒。
在一些实施方式中，在步骤b)中，进行扩增时，SEQ ID NO：1～6或SEQ ID NO：10～15所示的引物中，各引物的浓度均为0.2μM～0.4μM，也可以选择0.3μM、0.33μM、0.36μM。
在一些实施方式中，在步骤b)中，进行扩增时，SEQ ID NO：7～9或SEQ ID NO：16～18所示的探针中，各探针的浓度均为0.1μM～0.2μM，也可以选择0.15μM、0.17μM、0.19μM。
作为示例性的优选方案，扩增体系中各成分的浓度为表3所示。
所述方法基于ARMS-PCR(突变阻滞扩增***)法进行扩增。进一步为ARMS-Taqman法。
在某些实施方案中，生物样品是体液。体液可以是从受试者身体的任何地方(例如外周部位)分离出来的液体，包括但不限于，例如血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、脑脊液、胸腔积液、***抽吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴***的液体、***、脑脊液、器官内***液体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水及其组合。例如，体液是尿液、血清或脑脊液。检测SARS-CoV-2所用的样本优选为受试者的上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本、肛拭子、抗凝血和血清标本等。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本(尤其是下呼吸道标本)和发病7天内急性期血清以及发病后第3～4周的恢复期血清。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
本实施例所用引物探针的组合如表1和表2所示。
表1 N基因及突变联合检测引物探针组合1
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | SEQ ID NO | 修饰 |
| NY-F1 | CAATCATATGGTTTCCAACCCAGTT | 1 | 无 |
| NY-R1 | GTCCACAAACAGTTGCTGGTGC | 2 | 无 |
| NY-P1 | TGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCT | 7 | 5’FAM；3’BHQ1 |
| HV-F1 | CAATGTTACTTGGTTCCATGCTACCT | 3 | 无 |
| HV-R1 | GGACTGGGTCTTCGAATCTAAAGTAGTA | 4 | 无 |
| HV-P1 | CTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACC | 8 | 5’HEX；3’BHQ1 |
| PH-F1 | CGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTGTA | 5 | 无 |
| PH-R1 | GGGTATGGCAATAGAGTTATTAGAGTAAGC | 6 | 无 |
| PH-P1 | CGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTC | 9 | 5’CY5；3’BHQ2 |
| N-F1 | GCTGGCAATGGCGGTGATG | 19 | 无 |
| N-R1 | TGGCCTTTACCAGACATTTTGC | 20 | 无 |
| N-P1 | CTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAG | 21 | 5’ROX；3’BHQ2 |
表2 N基因及突变联合检测引物探针组合2
样本检测实施例1
阳性样本：人工合成的含N501Y、HV69-70del及P681H突变的核酸序列；
阴性样本：不含N501Y、HV69-70del及P681H突变的新冠灭活病毒提取的核酸，采用新冠核酸检测试剂盒进行浓度标定。
检测流程：
1.将上述阳性样本根据标定的理论浓度稀释至200copies/mL；
2.将标定浓度的阴性样本稀释至106copies/mL；
3.采用上述引物表1、表2中的引物探针组合，分别按照下表的试剂配方配制PCR反应液，所述体系包括引物探针组合，dNTP、Mg2+，逆转录酶、DNA聚合酶(taq酶)，PCR buffer，RNA酶抑制剂(RNasin)等，本实施例各组份的浓度或用量如表3所示。
表3
4.检测：采用上述配制好的试剂进行检测，每个反应采用20uL样本+30uLPCR反应液，重复检测30次，分别在试剂准备间和样本处理室加好试剂和样本后，盖好PCR管盖，并转移至PCR扩增室。
5.荧光PCR反应与结果分析
将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测N501Y突变；选择HEX通道(Reportere:HEX,Quencher:None)检测HV69-70del缺失突变；选择ROX通道(Reportere:ROX,Quencher:None)检测N基因；选择CY5通道(Reportere：CY5,Quencher:None)检测基因P681H突变；
3)荧光定量PCR反应条件为表4所示：
表4
PCR扩增循环分为两个阶段，第一个阶段为逆转录，通过逆转录合成互补的cDNA。
第二个阶段为扩增及荧光信号收集阶段，退火温度为55～62℃，优选的为60℃。
4)结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)。扩增曲线如图1～图4所示，本发明所提供的2套联合检测引物探针组合，灵敏度均能达到200copies/mL(重复检测30次，检出率达100％)，检测106copies/mL的野生型样本无非特异性扩增(重复检测30次，无非特异性扩增)。
样本检测实施例2
样本类型：咽拭子及鼻咽拭子提取的核酸样本
样本特征：经测序验证为含N501Y、P681H、HV 69-70del突变的临床新型冠状病毒核酸样本，核酸样本来源于长沙市传染病医院。
采用我司新型冠状病毒核酸检测试剂对样本进行浓度标定，并按照标定浓度将样本按照梯度依次稀释至20000copies/mL,2000copies/mL,200copies/mL，然后按照样本检测实施1的方法进行检测，各浓度样本重复检测30次，检测结果显示，当样本浓度为200copies/mL时，阳性检出率达100％，扩增曲线如图5～图6所示，由此可说明，采用本发明的检测试剂能够对临床样本的突变进行高效检出，其检测灵敏度能够达到200copies/mL。
样本检测实施3，特异性验证
采用经测序验证不含N501Y、HV69-70del、P681H突变的新型冠状病毒核酸样本以及与新型冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体核酸样本作为待测样本。检测样本如表5所示。
表5
对上述样本的检测结果如表6所示，所有样本的突变检测结果均为阴性，由此可知本发明所提供的检测试剂具有良好的特异性。
表6
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 用于检测突变SARS-CoV-2病毒的组合产品、试剂盒、用途及方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
caatcatatg gtttccaacc cagtt 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gtccacaaac agttgctggt gc 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
caatgttact tggttccatg ctacct 26
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
ggactgggtc ttcgaatcta aagtagta 28
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
cgctagttat cagactcaga ctaattgta 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
gggtatggca atagagttat tagagtaagc 30
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
tgttggttac caaccataca gagtagtagt actttct 37
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
ctgggaccaa tggtactaag aggtttgata acc 33
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
cggcgggcac gtagtgtagc tagtc 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
aatcatatgg tttccaaccc aatt 24
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
gacacatttg tttttaacca aattagtaga c 31
<210> 12
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
caatgttact tggttccatg ctgtct 26
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 13
ccagcctctt attatgttag acttctcag 29
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 14
gctagttatc agactcagac taatgcta 28
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<213> artificial sequence
<400> 15
gtggtaacac taatagtaaa atttgtgggt 30
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<400> 16
ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttct 39
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<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 17
ctctgggacc aatggtacta agaggtttga ta 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 18
cgggcacgta gtgtagctag tcaatccatc a 31
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<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
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gctggcaatg gcggtgatg 19
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tggcctttac cagacatttt gc 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 21
ctcttgcttt gctgctgctt gacag 25
<210> 22
<211> 350
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 22
ctacgcagaa gggagcagag gcggcagtca agcctcttct cgttcctcat cacgtagtcg 60
caacagttca agaaattcaa ctccaggcag cagtagggga acttctcctg ctagaatggc 120
tggcaatggc ggtgatgctg ctcttgcttt gctgctgctt gacagattga accagcttga 180
gagcaaaatg tctggtaaag gccaacaaca acaaggccaa actgtcacta agaaatctgc 240
tgctgaggct tctaagaagc ctcggcaaaa acgtactgcc actaaagcat acaatgtaac 300
acaagctttc ggcagacgtg gtccagaaca aacccaagga aattttgggg 350
Claims (13)
1.引物探针组合产品，包括a和/或b：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~6所示的引物以及SEQ ID NO：7~9所示的探针；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：10~15所示的引物以及SEQ ID NO：16~18所示的探针。
2. 根据权利要求1所述的引物探针组合产品，其还包括用于检测SARS-CoV-2 基因保守区段的质控引物和/或质控探针。
3. 根据权利要求2所述的引物探针组合产品，所述保守区段来自SARS-CoV-2 N基因。
4. 根据权利要求2所述的引物探针组合产品，所述质控引物的核苷酸序列为SEQ IDNO：19~20所示，所述质控探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示。
5.根据权利要求1~4任一项所述的引物探针组合产品，所述探针标记有荧光物质。
6. 根据权利要求5所述的引物探针组合产品，每条探针上的所述荧光物质独立地选自AMCA、Atto 425、Atto 590、FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY5.5、CY3、Texas Red、TFAM、TAMRA、VIC以及JOE中的一种或两种。
7.含有权利要求1~6任一项所述的引物探针组合产品的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其还含有dNTPs、Mg2+、适用于ARMS-PCR体系的DNA聚合酶、逆转录酶、PCR缓冲液、RNA酶抑制剂、阳性对照以及阴性对照中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述阴性对照和阳性对照均为含有能够与待检测突变位点的检测引物在严格条件下互补配对的SARS-CoV-2核酸片段；所述阴性对照不含有待检测突变位点；所述阳性对照含有待检测突变位点。
10.权利要求1~6任一项所述的引物探针组合产品在制备用于检测突变的SARS-CoV-2病毒的试剂盒中的应用。
11.一种非疾病诊断和治疗目的的检测突变SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a）获取待检测样本中的核酸；
b）使用权利要求1~6任一项所述的引物探针组合产品，或权利要求7~9任一项所述的试剂盒，以所述核酸为模板进行扩增以确定所述样本中是否存在N501Y、P681H及HV 69-70del三种突变形式的SARS-CoV-2病毒中的至少一种。
12. 根据权利要求11所述的方法，在步骤b）中，进行扩增时，SEQ ID NO：1~6或SEQ IDNO：10~15所示的引物中，各引物的浓度均为0.2µM~0.4µM。
13. 根据权利要求11所述的方法，在步骤b）中，进行扩增时，SEQ ID NO：7~9或SEQ IDNO：16~18所示的探针中，各探针的浓度均为0.1µM~0.2µM。
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