CN115369173A - 基因标志物组合在预测膀胱尿路上皮癌预后中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因标志物组合在预测膀胱尿路上皮癌预后中的应用。用于膀胱尿路上皮癌预后预测的基因标志物组合包括AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1。实验证明，通过检测本发明提供的生物标志物组合可以预测膀胱尿路上皮癌预后好坏，具有较高的准确性。本发明具有重要的应用价值。

Description

基因标志物组合在预测膀胱尿路上皮癌预后中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基因标志物组合在预测膀胱尿路上皮癌预后中的应用。
背景技术
膀胱癌(BC)是全世界最普遍的泌尿生殖***恶性疾病之一，其中90％以上是尿路上皮癌，每年诊断出约43万例新病例，造成超过16.5万人死亡。膀胱尿路上皮癌具有复杂的生物学行为，以其高复发率和易转移而闻名。膀胱尿路上皮癌的发病机制的驱动因素仍未完全确定，其开始和进展被认为是一个复杂的过程，涉及大量的基因表达，遗传和表观遗传改变，功能障碍和多种信号通路的变化。
伴有***转移的尿路上皮癌患者的预后较差，许多患者被认为无法治愈。尽管技术有所进步，但横断面成像对检测***转移仍然相对不敏感，而现在人们越来越认识到***阳性疾病是异质性的，其管理必须根据***分期进行个体化。
表观基因组的改变参与着各种人体器官的致癌作用，而DNA甲基化改变是最重要的表观基因组变化之一，导致染色体不稳定和肿瘤相关基因的异常表达。在尿路上皮癌中广泛的表观遗传修饰因子经常被体细胞突变失活，而且DNA甲基化改变在尿路上皮癌中也很常见，这些都进一步凸显了表观遗传在尿路上皮癌发展和疾病进展中的作用。
因此，通过研究膀胱尿路上皮癌区域***转移相关的异常甲基化修饰基因及其功能，寻找一种基因层次构建一个膀胱尿路上皮癌的预测预后模型对研究膀胱尿路上皮癌的治疗是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供膀胱尿路上皮癌相关的基因标志物组合及其在预测膀胱尿路上皮癌预后中的应用，能够得到更准确的膀胱尿路上皮癌预后的预测。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备预测膀胱尿路上皮癌预后的产品中的应用。
进一步，所述生物标志物包括AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1中的一个或多个。
进一步，所述生物标志物是AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1的组合。
进一步，所述生物标志物是异常甲基化修饰差异表达基因。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、***中的一种或多种。
进一步，所述检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂中的一个或多个。
进一步，所述检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、PCR-ASO探针法、高通量测序平台方法、芯片法。
进一步，所述试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂中的一种或多种。
进一步，所述探针包括DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。
进一步，所述探针是可以完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合的任何长度。
进一步，所述探针的长度包括10、13、15、20、25、30、40、50、60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。
进一步，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。
进一步，所述探针自身互补序列少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样本、含有细胞的体液、游离漂浮核酸、痰液、唾液、尿液、脑脊液腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、皮肤拭子、口服拭子、鼻拭子、洗涤物或灌洗物、吸出物、刮屑、骨髓标本、组织活检标本、手术标本中的一种或多种。
进一步，所述试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术检测样本中生物标志物或其功能片段的存在、不存在和/或量的试剂。
进一步，所述蛋白免疫技术检测样本中生物标志物或其功能片段的存在、不存在和/或量的试剂包括抗体。
进一步，所述抗体为标记抗体，其作用在于对生物标志物或其功能片段具有特异性。
本发明提供了一种用于预测膀胱尿路上皮癌预后的产品。
进一步，所述产品包括结果判断构件，用于分析检测出的前面所述的生物标志物的表达水平的结果，输出膀胱尿路上皮癌预后生存预测结果。
进一步，所述产品包括检测构件，用于检测所述生物标志物的表达水平。
进一步，所述检测出的生物标志物的表达水平的结果是由所述的检测构件检测得出。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台、***中的一种或多种。
进一步，所述产品包括检测生物标志物的试剂。
进一步，所述生物标志物包括AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1中的一个或多个。
进一步，所述生物标志物是AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1的组合。
进一步，所述检测生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂中的一个或多个。
进一步，所述检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、PCR-ASO探针法、高通量测序平台方法、芯片法。
进一步，所述检测生物标志物的试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂中的一种或多种。
进一步，所述探针包括DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。
进一步，所述探针是完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合的任何长度。
进一步，所述探针的长度包括10、13、15、20、25、30、40、50、60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。
进一步，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。
进一步，所述探针自身互补序列少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样本、含有细胞的体液、游离漂浮核酸、痰液、唾液、尿液、脑脊液腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、皮肤拭子、口服拭子、鼻拭子、洗涤物或灌洗物、吸出物、刮屑、骨髓标本、组织活检标本、手术标本中的一种或多种。
进一步，所述试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术检测样本中生物标志物或其功能片段的存在、不存在和/或量的试剂。
进一步，所述蛋白免疫技术检测样本中生物标志物或其功能片段的存在、不存在和/或量的试剂包括抗体。
进一步，所述抗体为标记抗体，其作用在于对生物标志物或其功能片段具有特异性。
进一步，所述检测构件包括检测试剂和/或检测装置。
进一步，所述检测试剂包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒中的一种或多种。
进一步，所述检测装置包括qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置、电化学发光检测装置中的一种或多种。
进一步，所述结果判断构件包括分析模块，用于根据前面所述的生物标志物的表达水平，分析出受试者膀胱尿路上皮癌预后生存预测结果。
进一步，所述分析模块使用的分析公式为RiskScore＝-AKAP7基因的表达水平×0.380+DFNA5基因的表达水平×0.116-HSD17B2基因的表达水平×0.019+MTRF1L基因的表达水平×0.259-PLCG2基因的表达水平×0.155-RPS6KA1基因的表达水平×0.236-STIM2基因的表达水平×0.402-SULT1C2基因的表达水平×0.287-TRABD基因的表达水平×0.155-TRMT1基因的表达水平×0.030+UST基因的表达水平×0.187-ZNRD1基因的表达水平×0.504。
进一步，所述AKAP7的Gene ID为9465；DFNA5的Gene ID为1687；HSD17B2的Gene ID为3294；MTRF1L的Gene ID为54516；PLCG2的Gene ID为5336；RPS6KA1的Gene ID为6195；STIM2的Gene ID为57620；SULT1C2的Gene ID为6819；TRABD的Gene ID为80305；TRMT1的Gene ID为55621；UST的Gene ID为10090；ZNRD1的Gene ID为30834。
进一步，所述结果判断构件包括输入模块，用于输入前面所述的生物标志物的表达水平。
进一步，所述结果判断构件包括输出模块，用于输出所述分析模块的分析结果。
在本发明的上下文中，所使用的术语“样本”是指获得自或衍生自受试者的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、***、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物中的一种或其组合。
在本发明上下文中，所使用的术语“探针”是指能够选择性结合特定预期目标生物分子的任何分子，可间接地或直接地、共价地或非共价地结合至本文公开的任何底物和/或反应产物和/或蛋白酶的任何分子或与其相关，并且其相关或结合可使用本文公开的方法检测。本发明上下文中的探针包括荧光探针、抗体或基于吸光度的探针。如果是基于吸光度的探针，发色团pNA(对硝基苯胺)可用作检测和/或定量本文公开的靶核酸序列的探针；也可以是包含荧光分子或底物的核酸序列，该荧光分子或底物在暴露于酶时变为发荧光的，并且该核酸序列与一种核酸序列的片段互补。
一般实时荧光定量PCR检测过程中，探针会被设计成熔解温度超过正向和反向引物10℃，这使得探针在退火及延伸过程中会完全结合在PCR产物上。典型的，例如Taqman探针，会在具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，在延伸过程中发生探针的水解，使得探针中的荧光基团和猝灭基团远离，从而破坏荧光基团和猝灭基团间的共振能量传递，使得荧光基团发出的荧光可以被仪器检测到，同时随着PCR产物的逐渐增多，荧光信号会在一定时间内呈现指数级别的上升，最后在荧光定量PCR仪上呈现“S”型的扩增曲线。用于实时荧光定量PCR的反应试剂包括但不限于：目标基因靶序列的正反向引物、Taqman荧光探针、优化的PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶等。
本发明中所述的产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员熟知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明上下文中，所使用的术语“生物标志物”是指基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。该术语通常是指一种基因的浓度、含量或两种或更多种基因的浓度、含量。
在本发明中本领域技术人员通过已知的测定法进行生物标志物表达量的测定，具体测定法包括多分析物谱测试、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法、蛋白质印迹测定法、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光测定法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定法或狭线印迹测定法。
在本发明的上下文中，所使用的术语“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。
附图说明
图1是膀胱尿路上皮癌相关基因的筛选图，A：每个λ下的置信区间，B：每个自变量的变化轨迹，横轴代表自变量λ的log值，纵轴代表自变量的系数；
图2是用Riskscores模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后得到的风险评分图；
图3是用Riskscores模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后得到的生存曲线图，；
图4是用Riskscores模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后的3年、5年ROC曲线图；
图5是用Riskscores-2模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后得到的风险评分图；
图6是用Riskscores-2模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后得到的生存曲线图；
图7是用Riskscores-2模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后的3年、5年ROC曲线图；
图8是用Riskscores-2模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后得到的风险评分图；
图9是用Riskscores-2模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后得到的生存曲线图；
图10是用Riskscores-2模型进行膀胱尿路上皮癌预后预测后的3年、5年ROC曲线图；
图11是特征基因AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、STIM2生存分析图，A：特征基因AKAP7，B：特征基因DFNA5，C：特征基因HSD17B2，D：特征基因MTRF1L，E：特征基因PLCG2，F：特征基因STIM2；
图12是特征基因SULT1C2、TRABD、UST、RPS6KA1、TRMT1、ZNRD1生存分析图，A：特征基因SULT1C2，B：特征基因TRABD，C：特征基因UST，D：特征基因RPS6KA1，E：特征基因TRMT1，F：特征基因ZNRD1；
图13是TCGA数据中Riskscores模型12个特征基因在癌和癌旁的差异表达箱线图；
图14是TCGA数据中Riskscores模型12个特征基因在N0和N1-N3的差异表达箱线图；
图15是在GSE13507数据中验证Riskscores模型12个特征基因在癌和癌旁的差异表达箱线图；
图16是在GSE13507数据中验证Riskscores模型12个特征基因在N0和N1-N3的差异表达箱线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k近邻分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。
受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)：是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以敏感性(真阳性率)为纵坐标，1-特异性(假阳性率)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
实施例1与膀胱尿路上皮癌相关的生物标志物的筛选
1、筛选方法
(1)筛选所采用的数据及预处理的方法
为了筛选可用于膀胱尿路上皮癌预后预测的生物标志物，从基因表达综合数据库(GEO)和癌症基因组图谱数据库(TCGA)中下载与膀胱尿路上皮癌相关的公共基因表达数据。对于TCGA中的数据集，甲基化数据和基因表达的RNA测序数据(FPKM值)和临床信息从UCSC Xena(https：//gdc.xenahubs.net)下载，然后将FPKM值转化为每千碱基百万(TPM)值的转录本；从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载数据集GSE13507，并基于GPL6102进行注释。
从基因表达综合数据库(GEO)和癌症基因组图谱数据库(TCGA)下载并初步处理的数据需要进一步做以下处理：
1)去掉没有临床随访信息的样本；
2)去掉生存时间未知，小于0天和没有生存状态的样本；
3)去掉没有N分期的样本；
4)将探针转为Gene Symbol；
5)一个探针对应多个基因，去除该探针；
6)具有多个Gene Symbol的表达情况取其平均值；
其中，TCGA数据集作为发现队列，GEO数据集作为验证队列。
综合分析数据的基因表达谱，在TCGA数据中，其中RNA测序数据有19个癌旁样本，236个N0期(非***转移)样本，127个N1-N3期(***转移)的样本。甲基化数据有21个癌旁样本，240个N0期样本，133个N1-N3期的样本。在GSE13507数据集中有58个对照样本，149个N0期样本，15个N1-N3期的样本。
(2)膀胱尿路上皮癌中差异表达基因的分析
首先对甲基化的整体数据集的进行随机选择，在N0期和N1-N3期的样本各选择了40个样本进行差异甲基化分析。通过对PCA和相关性聚类热图进行质控，去除了异常数据，最终选定了其中22个N0期样本和24个N1-N3期的样本，如表1所示。
表1选定的N0期样本和N1-N3期样本信息
Figure BDA0003860249860000101
采用CHAMP包基于N0和N1-N3的分组对甲基化数据进行差异甲基化分析，差异甲基化位点的筛选标准设置为adj.P.Val<0.05。使用“llimma”包对TCGA的数据集基于N0和N1-N3的分组进行差异表达分析，从而获取膀胱尿路上皮癌***转移相关的差异基因，差异基因的筛选标准设置为adj.P.Val<0.05。取低甲基化和高表达的基因交集，高甲基化和低表达的基因交集，以获得膀胱尿路上皮癌***转移相关异常甲基化调控的差异表达基因。以此来研究甲基化异常修饰对膀胱尿路上皮癌***转移的关系。
2、筛选结果
通过R软件的CHAMP包，在甲基化数据中进行差异表达分析。设置差异甲基化的筛选阈值为FDR<0.05，与非***转移样本相比，在***转移组中鉴定出了87589个差异甲基化位点，共14900个差异甲基化基因，包括4608个高甲基化基因和13834个低甲基化基因。
通过R软件的limma包，在RNA测序数据中进行差异表达分析。设置基因差异表达的筛选阈值为FDR<0.05，与非***转移样本相比，在***转移组中鉴定出了213个差异基因，其中有146个上调的差异基因，67个下调的差异基因。
对mRNA差异表达基因和差异甲基化基因取交集以获得异常甲基化调控的差异表达基因，选择高表达的基因和低甲基化的基因做交集，共得到了低甲基化高表达共83个；低表达的基因和高甲基化的基因做交集，共得到了高甲基化低表达基因共16个，结果如表2所示。
表2低甲基化高表达基因与高甲基化低表达基因的筛选结果
Figure BDA0003860249860000111
Figure BDA0003860249860000121
Figure BDA0003860249860000131
Figure BDA0003860249860000141
实施例2预测膀胱尿路上皮癌预后的RiskScore模型的构建
本实施例根据N0和N1-N3的分组分析了区域***转移对生存的影响，发现发生了区域***转移的病人生存期更短。
1、膀胱尿路上皮癌预后预测中异常甲基化修饰基因的筛选方法
基于16个高甲基化低表达基因在TCGA数据中使用Lasso(Least absoluteshrinkage and selection operator,Tibshirani(1996))方法对变量进行筛选，以减少风险模型的基因数量。最终利用多因素Cox回归模型，来构建缺氧和上皮-间充质转化相关基因的风险评分(Risk scores)模型，将用来构建风险评分的基因定义为特征基因，然后以风险评分的中位数为分界点，将患者分为高危组和低危组。接下来，通过Kaplan-Meier分析风险评分的生存曲线，时间依赖ROC曲线来验证模型的准确性。
2、膀胱尿路上皮癌预后预测中异常甲基化修饰基因的筛选结果
在实验组数据集中，将筛选得到的特征基因应用于LASSO Cox回归模型，以构建TCGA数据集中BLCA患者总生存率的预测模型，使用最小的部分似然偏差对应获得最佳的λ值，最后获得了12个特征基因(AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST和ZNRD1)。构建风险评分模型，如图1所示。最终的公式如下：
RiskScore＝-AKAP7基因的表达水平×0.380+DFNA5基因的表达水平×0.116-HSD17B2基因的表达水平×0.019+MTRF1L基因的表达水平×0.259-PLCG2基因的表达水平×0.155-RPS6KA1基因的表达水平×0.236-STIM2基因的表达水平×0.402-SULT1C2基因的表达水平×0.287-TRABD基因的表达水平×0.155-TRMT1基因的表达水平×0.030+UST基因的表达水平×0.187-ZNRD1基因的表达水平×0.504。
实施例3预测膀胱尿路上皮癌预后的RiskScore模型诊断效能验证分析
根据RiskScore的中位数，将样本分为高风险组和低风险组，可以观察到高风险组中死亡样本比例较高，如图2所示。使用Kaplan-Meier生存曲线分析进行Risk score高低风险组之间的分析显示，高风险评分组的患者的整体生存期(OS)显著低于低风险评分组，如图3所示。
采用R包“survivalROC”绘制Riskscore模型预测膀胱尿路上皮癌预后3年和5年的ROC曲线图，如图4所示，Riskscores模型在TCGA-BLCA数据集总体生存期预测显示出较高的诊断效能，预后3年的AUC值为0.737，最佳临界值点为-4.646391，敏感性为0.7995313，特异性为0.5809149，预后5年的AUC值为0.753，最佳临界值点为-4.658629，敏感性为0.802755，特异性为0.6286845。
同时研究过程中也分析了另两种风险模型RiskScore-2和RiskScore-3在膀胱尿路上皮癌预后预测中的诊断效能。
风险模型RiskScore-2的具体公式如下：
RiskScore-2＝(ARHGAP29基因的表达水平×0.03)+(AKAP7基因的表达水平×-0.13)+(EFEMP1基因的表达水平×0.07)+(EPN2基因的表达水平×0.31)+(LAMA2基因的表达水平×0.16)+(RPS6KA1基因的表达水平×-0.13)+(SLC1A6基因的表达水平×0.08)+(STIM2基因的表达水平×-0.20)+(SULT1C2基因的表达水平×-0.09)+(TMEM109基因的表达水平×0.02)+(TRABD基因的表达水平×-0.06)+(ZNRD1基因的表达水平×-0.27)。
根据RiskScore-2的中位数，将样本分为高风险组和低风险组，可以观察到高风险组中死亡样本比例较高，如图5所示。使用Kaplan-Meier进行Risk score高低风险组之间的分析显示，高风险评分组的患者的整体生存期(OS)显著低于低风险评分组，如图6所示。
采用R包“survivalROC”绘制RiskScore-2模型预测膀胱尿路上皮癌预后3年和5年的ROC曲线图，如图7所示，RiskScore-2模型在TCGA-BLCA数据集总体生存期预测显示出较一定的诊断效能，预后3年的AUC值为0.706，最佳临界值点为-0.867563，敏感性为0.7098813，特异性为0.5894742，预后5年的AUC值为0.739，最佳临界值点为-0.867563，敏感性为0.7155109，特异性为0.6521389。
风险模型RiskScore-3的具体公式如下：
RiskScore-3＝(ARHGAP29基因的表达水平×0.144)+(CCL11基因的表达水平×-0.016)+(DHDDS基因的表达水平×-0.152)+(EFEMP1基因的表达水平×0.069)+(EPN2基因的表达水平×0.403)+(KDELR2基因的表达水平×0.006)+(KRT23基因的表达水平×0.013)+(LAMA2基因的表达水平×0.269)+(RHPN2基因的表达水平×-0.065)+(RTN3基因的表达水平×0.013)+(SLC1A6基因的表达水平×0.114)+(TMEM109基因的表达水平×0.088)。
根据RiskScore-3的中位数，将样本分为高风险组和低风险组，可以观察到高风险组中死亡样本比例较高，如图8所示。使用Kaplan-Meier进行Risk score高低风险组之间的分析显示，高风险评分组的患者的整体生存期(OS)显著低于低风险评分组,如图9所示。
采用R包“survivalROC”绘制RiskScore-3模型预测膀胱尿路上皮癌预后3年和5年的ROC曲线图，如图10所示，RiskScore-3模型在TCGA-BLCA数据集总体生存期预测显示出较一定的诊断效能，预后3年的AUC值为0.700，最佳临界值点为2.20097，敏感性为0.6388349，特异性为0.6505406，预后5年的AUC值为0.730，最佳临界值点为2.056632，敏感性为0.7831543，特异性为0.568363。
实施例4预测膀胱尿路上皮癌预后的RiskScore模型中各个特征基因的诊断效能验证分析
1、对Riskscore模型中单个特征基因的分析方法
基于TCGA-BLCA数据集每个样本中特征因子的表达值，根据表达中位数将其分为高表达和低表达两组，在R中使用Kaplan-Meier分析了特征基因对生存的影响。
分别基于癌和癌旁、N0和N1-N3的分组，在R中使用"wilcox.test"检验方法，分析了特征基因在基因水平的表达差异性。并在GSE13507数据集中进行特征基因的分组表达差异的验证。
2、对Riskscore模型中单个特征基因的分析结果
基于实验组每个样本中特征因子的表达值，根据表达中位数将其分为高表达和低表达两组，在R中使用Kaplan-Meier分析了特征基因对生存的影响，发现AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、STIM2、SULT1C2、TRABD、UST基因对生存没有显著影响(P>0.05)，而RPS6KA1、TRMT1、ZNRD1基因高表达组的患者的总体生存期更长，如图11、图12所示。
随后根据TCGA-BLCA中临床数据，对12个基因在癌和癌旁与N0和N1-N3这两种分组中进行差异分析，结果如图13、图14所示，发现在癌和癌旁的分组中，相对于癌旁样本，AKAP7、PLCG2、UST在BLCA样本中低表达，RPS6KA1、TRABD、TRMT1、ZNRD1在BLCA样本中高表达；在N0和N1-N3的分组中，相对于N0样本，AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1均在N1-N3样本中低表达。其中AKAP7、PLCG2、UST既在BLCA样本中低表达，又在N1-N3样本中低表达。AKAP7、PLCG2、UST既和疾病的发生相关，又和疾病的转移相关。此外，我们还在GSE13507数据集中对这12个特征基因在癌和癌旁与N0和N1-N3这两种分组中的差异表达进行了验证，结果如图15、图16所示，其中在癌和癌旁的分组中，AKAP7、RPS6KA1、TRMT1、UST的表达与实验组中一致；在N0和N1-N3的分组中，AKAP7的表达与实验组中一致，其余11个基因的表达差异不显著，但DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、UST、ZNRD1也和实验组中的表达趋势一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备预测膀胱尿路上皮癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1中的一个或多个；
优选地，所述生物标志物是AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1的组合；
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、***中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂中的一个或多个。
3.根据权利要求1-2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂中的一种或多种。
4.一种用于预测膀胱尿路上皮癌预后的产品，其特征在于，所述产品包括结果判断构件，用于分析检测出的权利要求1中所述的生物标志物的表达水平的结果，输出膀胱尿路上皮癌预后生存预测结果；
优选地，所述产品包括检测构件，用于检测所述生物标志物的表达水平；
优选地，所述检测出的生物标志物的表达水平的结果是由所述的检测构件检测得出；
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台、***中的一种或多种；
优选地，所述产品包括检测生物标志物的试剂；
优选地，所述生物标志物包括AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1中的一个或多个；
优选地，所述生物标志物是AKAP7、DFNA5、HSD17B2、MTRF1L、PLCG2、RPS6KA1、STIM2、SULT1C2、TRABD、TRMT1、UST、ZNRD1的组合。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述检测生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂中的一个或多个。
6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述检测生物标志物的试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述检测构件包括检测试剂和/或检测装置；
优选地，所述检测试剂包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒中的一种或多种；
优选地，所述检测装置包括qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置、电化学发光检测装置中的一种或多种。
8.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述结果判断构件包括分析模块，用于根据权利要求4中所述的生物标志物的表达水平，分析出受试者膀胱癌预后生存预测结果；
优选地，所述分析模块使用的分析公式为RiskScore＝-AKAP7基因的表达水平×0.380+DFNA5基因的表达水平×0.116-HSD17B2基因的表达水平×0.019+MTRF1L基因的表达水平×0.259-PLCG2基因的表达水平×0.155-RPS6KA1基因的表达水平×0.236-STIM2基因的表达水平×0.402-SULT1C2基因的表达水平×0.287-TRABD基因的表达水平×0.155-TRMT1基因的表达水平×0.030+UST基因的表达水平×0.187-ZNRD1基因的表达水平×0.504；
优选地，所述结果判断构件包括输入模块，用于输入权利要求4中所述的生物标志物的表达水平；
优选地，所述结果判断构件包括输出模块，用于输出所述分析模块的分析结果。
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