CN115369060B

CN115369060B - 一种***酮降解菌及菌剂

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Publication number: CN115369060B
Application number: CN202211036684.1A
Authority: CN
Inventors: 施艳红; 操海群; 胡芃; 高全; 肖金京; 王莹
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2022-08-29
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2042-08-29
Also published as: CN115369060A

Abstract

本发明属于环境微生物学工程与技术领域，具体的，本发明通过筛选获得了一种高效降解***酮的降解菌嗜麦芽寡养单胞菌SM3，并且制备了包含该降解菌的固定化菌剂。本发明的降解菌已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：24515，保藏日期：2022年3月11日。本发明还利用海藻糖‑聚乙烯醇‑活性炭对该降解菌进行固定，能够有效的保持***酮降解菌的活力，本发明的技术方案为***酮的降解提供了新的思路，具有较好的应用前景。

Description

一种***酮降解菌及菌剂

技术领域

本发明属于环境微生物学工程与技术领域，具体的本发明涉及一种高效降解***酮的降解菌嗜麦芽寡养单胞菌SM3，以及包含该降解菌的固定化菌剂。

背景技术

***酮（Triadimefon，CAS: 43121-43-3），1-4- 氯苯氧基）-3,3-二甲基-1-1,2,4-***-1-基）- 2-丁酮‚分子式为Ｃ₁₄Ｈ₁₆ClN₃O₂，是由德国拜耳公司研制的一种广泛用于防治植物病害的杀菌剂，其具有高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强等特性。但是***类杀菌剂其残留大量流失到环境中同样会对人类社会造成危害。美国中南部大豆种植地的地表水中检测到***酮残留量约为0.291-1.150 μg/L，虽为痕量水平，但仍能对水生动物和人类健康构成潜在威胁。相关报告表明，***酮经胃肠吸收和体循环后会产生基因、神经等毒性，对非靶标生物具有生殖发育毒性、内分泌干扰、致癌致畸作用等。

***酮的降解有光化学降解、有很多学者研究采用太阳光、紫外光、汞灯等在不同的介质中降解***酮，也有学者报道采用活化过硫酸钠降解***酮、采用臭氧氧化降解***酮，但是这样的方法都存在时间长、成本高、受到pH、温度等影响降解效率等多方面的问题。

随着技术的发展以及人们对微生物的筛选和认识增加，采用微生物降解农药残留已经开始得到广泛的利用。微生物降解农药残留具有成本低、易操作，而且不会因使用化学试剂带来二次污染。CN201910125508 .7公开了从汾酒厂新鲜大曲中分离得到可以降解***酮的中间苍白杆菌，其能对超标数十倍的***酮残留进行有效降解；CN 201911118613.4公开了通过筛选获得了一株粪产碱杆菌WZ-2能够用于降解***类杀菌剂；筛选获得更多的，效果更好的***酮类降解菌，为降解水体、土壤中的***酮提出了迫切的要求。

发明内容

为进一步推广生物降解农药残留，尤其是降解水体中的***酮污染，本发明经过广泛的筛选获得一种新的可以降解***酮的菌株，为降解***酮提供了新的思路。具体的：

本发明提供了一种的***酮降解菌，所述降解菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：24515，保藏日期：2022年3月11日。

本发明的一个方面，本发明提供了一种嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）SM3在降解***酮中的应用。

本发明的一个方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂为液体菌剂、冻干粉菌剂、固定化菌剂，所述菌剂包括嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3。所述液体菌剂为将嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3的发酵产物，还包括必要稳定剂、营养剂、分散剂等；为保持微生物的活力和稳定性便于长期保存和使用，将微生物的发酵产物制备为冻干粉剂也是一种可行的方法，冻干粉剂的制备中可以将微生物与海藻糖、甘油等冻干保护剂、稳定剂一起进行冻干。固定化菌剂，微生物的固定化可以采用多种载体，特别是各种形式的多孔载体，形成多样化的孔径方便微生物的固定和稳定。多孔载体可以是蒙脱石、多孔二氧化硅、多孔碳、聚合物高分子多孔微球、多孔膜微囊载体等。

本发明的一个方面，本发明还提供了一种固定化菌剂。本发明以筛选出的***酮降解菌Stenotrophomonas maltophilia（命名为SM3）作为固定化对象，以海藻酸钠-聚乙烯醇-活性炭（PSC）为复合载体，对制备的固定化菌球（PSC-SM3）进行性能表征，通过本发明固定方法制备菌球能够高效降解水体中的***酮。优选的，固定化菌剂中海藻酸钠为1-4份、聚乙烯醇（PVA）为4-16份、活性炭为2-7份。

本发明的一个方面，本发明提供了一种降解***酮的固定化菌剂的制备方法，所述方法包括将海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭、***酮降解菌悬液混合均匀，将混合液滴加到交联剂中，交联后取出用缓冲液中洗涤，吸干水份，保存备用；所述***酮降解菌为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3。

有益效果

本发明通过大量的筛选获得了能够高效降解***酮的降解菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3，为研究***酮的降解以及了解嗜麦芽寡养单胞菌的特性提供了新的思路。同时本发明制备的复合物海藻糖-聚乙烯醇-活性炭（PSC）复合物能够有效的固定降解菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3并且保持其高度的活力，为微生物的固定提供了解决方案。总之，本发明的技术方案为合理评价固定化细胞技术修复水体***酮污染提供了理论价值与实际应用意义。

附图说明

图1：海藻糖-聚乙烯醇-活性炭（PSC）包埋SM3的小球形态图。

图2：PSC的扫描电镜显微图。

图3：PSC-SM3的扫描电镜显微图。

图4：PSC包埋菌株SM3（PSC-SM3）降解生活污水中的***酮的效果。

图5：PSC包埋菌株SM3（PSC-SM3）降解工业废水中的***酮的效果。

图6：PSC包埋菌株SM3（PSC-SM3）降解农田灌溉水中的***酮的效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。

实施例1

1.1 ***酮降解菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3的获得与鉴定

将稳定培养的肠道菌菌液以5%的接种量接入含有***酮（50 mg/L）的富集培养基中，充入氮气保证无氧环境，37 ℃恒温振荡器（180 r/min）中避光培养3-5天，重新接种至含有***酮的富集培养基中，重复培养三次，取稳定培养的菌液以2%的接种量接种至用***酮作为唯一碳源的无机盐培养基中，培养3天后转接至新的无机盐培养基中，如此培养2-3周。

选取生长情况较好的菌液用无菌水稀释（10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7），再涂布至LB（Luria-Bertani）固体培养基上，37 ℃培养48 h。将单菌落转接至无机盐固体培养基（含有100 mg/L的***酮）上，挑取单菌于含 50 mg/L ***酮的液体无机盐培养基中。37 ℃、180r/min的摇床中培养 48 h，HPLC检测培养液中***酮的含量，选择生长良好、传代稳定且降解能力好的菌株保存备用。其中分离得到一株革兰氏阴性菌，该菌在LB培养基上呈淡黄色、圆形、光滑、湿润***的小菌落，有刺鼻的氨味，命名为SM3。

将菌株SM3进行16S rRNA扩增并测序，得到的结果在NCBI进行比对，并把相似度高的序列进行同源性分析构建***进化树。进一步结合《常见细菌***鉴定手册》进行分析，SM3被鉴定为Stenotrophomonas maltophilia，与其关系最为密切的为Stenotrophomonas- maltophilia KV24，相似性达99.4%，该菌为黄单胞菌属，在水、土壤、人和动物的体表以及胃肠道中广泛存在。

1.2 嗜麦芽寡养单胞菌SM3菌液的制备：

嗜麦芽寡养单胞菌SM3培养基的配制：LB（Luria-Bertani）培养基（g/L）：酵母膏5g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，调节pH 7.2±0.1；若配置固体培养基，加入2%琼脂粉。所有器皿与培养基均于120℃下高压灭菌20 min。

将嗜麦芽寡养单胞菌SM3接种至LB培养基中，于30℃、转速150 r/min的恒温摇床中培养24 h（OD600=1），6000 r/min条件下离心后，再以以10×PBS洗涤离心两次，每次5min，洗涤后重悬于10mL的10×PBS缓冲液中于4 ℃冰箱备用。

实施例2

嗜麦芽寡养单胞菌SM3固定化菌球的制备

将于-80 ℃冰箱储存的SM3菌种接入LB培养基，培养至OD₆₀₀为1时，将菌悬液置于高速离心机6000 r•min^-1条件下，以10×PBS作为溶剂离心2次，每次5min，洗涤后重悬于10mL的10×PBS缓冲液中于4 ℃冰箱备用。采用包埋法制备固定化菌球。将1.5%海藻酸钠（SA）、6%聚乙烯醇（PVA）、2.5%活性炭（AC）、0.02g/mL菌悬液混合均匀，将混合液注入5mL注射器滴加到1.5%交联剂CaCl₂中，8 h后取出于10×PBS缓冲液中洗涤后，用滤纸吸干表面水分置于4 ℃冰箱中储存备用，制备的固定化小球SEM观察如图3所示，能明显观察到PSC表面有杆状菌附着，且面积较大，这说明细菌可以包埋在PSC的内部，制备出固定化***酮降解菌。综上所述，用PSC作为载体，制备固定化微生物用于***酮污染水体的生物修复的方法是可行的。其中，10×磷酸缓冲盐溶液（10×PBS）：称取14.4 g KH₂PO₄、2 g Na₂HPO₄、80gNaCl、2.7g KCl溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可得0.1M PBS缓冲液。

实施例3

嗜麦芽寡养单胞菌SM3固定化菌球（PSC-SM3）降解***酮的效率测试

***酮生产和使用过程中都会产生含***酮的废水，我国《杂环类农药工业水污染物排放标准》（GB21523-2008）中规定***酮原药生产企业废水处理设施总排放口的排放标准为5 mg/L。因此，本发明设定四个浓度值模拟***酮废水，在生活污水、工业废水、农田灌溉水中添加***酮溶液使其最终浓度分别达到1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，置于室外自然环境中。分别在1 d、3 d、5 d、7 d、14 d取等量的废水进行提取净化后，检测其***酮残留量，对应初始底物量计算PSC-SM3对***酮的降解率，以此评价固定化小球投加于水体中对***酮的降解效果。

PSC-SM3降解生活污水中1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L***酮的效果分别如图4所示。折线图表示以***酮初始添加量为对照，PSC-SM3对***酮的去除效果。柱状图表示经实际修正后，以未固定的SM3为对照，对***酮的去除效果。从折线图可以看出，***酮添加浓度为1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L下，PSC-SM3对***酮的去除效果均随着时间缓慢上升，且在7 d时均达到70%左右。而***酮添加浓度为10 mg/L时，PSC-SM3在1-7 d内对***酮的降解速率明显减缓，7 d时为53.60%。且随着初始底物量的增大，PSC-SM3在1 d时对***酮的降解也有所下降，1 mg/L、2 mg/L***酮作用下，1 d的降解率为47.45%、53.58%，5 mg/L、10mg/L***酮作用下，1 d的降解率为32.18%、31.26%。PSC-SM3对1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10mg/L***酮在14 d的最终降解率分别为80.21%、80.03%、79.72%、76.64%。同时，与单独使用SM3相比PSC-SM3的***酮的降解率在各个浓度均显著的提高，P<0.05。

PSC-SM3降解工业废水中1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L***酮的效果如图5所示。折线图表示以***酮初始添加量为对照，PSC-SM3对***酮的去除效果。柱状图表示经实际修正后，以未固定的SM3为对照，对***酮的去除效果。从折线图可以看出，7 d内，PSC-SM3对四种浓度***酮的降解效率在***酮添加浓度10 mg/L时有所减缓，为47.52%，1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L作用下降解率均处于60%左右。随着初始底物量的增大，PSC-SM3在1 d时对***酮的降解也有所下降，1 mg/L、2 mg/L***酮作用下，1 d的降解率为43.24%、38.39%，5 mg/L、10 mg/L***酮作用下，1 d的降解率为21.87%、27.99%。PSC-SM3对1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L***酮在14 d的最终降解率均高于80%，分别为89.50%、86.86%、81.06%、80.72%。同时，与单独使用SM3相比PSC-SM3的***酮的降解率在各个浓度均显著的提高，P<0.05。

PSC-SM3降解农田灌溉水中1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L***酮的情况分别如图6所示。折线图表示以***酮初始添加量为对照，PSC-SM3对***酮的去除效果。柱状图表示经实际修正后，以未固定的SM3为对照，对***酮的去除效果。从折线图可以看出，随着初始底物量的增大，PSC-SM3在1 d时对***酮的降解也有所下降，1 mg/L、2 mg/L***酮作用下，1 d的降解率为44.64%、40.34%，5 mg/L、10 mg/L***酮作用下，1 d的降解率为28.30%、26.31%。10 mg/L***酮作用下，1~7 d内PSC-SM3对***酮的降解较1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L***酮作用下明显缓慢，7 d时为45.05%，1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L***酮作用下在53.37%~73.99。2 mg/L***酮作用下，PSC-SM3随时间对***酮的降解率呈几乎差不多的趋势增长，而1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L***酮作用下，1~7 d内的降解速率均较为平缓，7~14 d增长较快。PSC-SM3对1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L***酮在14 d的最终降解率分别为84.50%、84.39%、76.76%、74.47%。同时，与单独使用SM3相比PSC-SM3的***酮的降解率在各个浓度均显著的提高，P<0.05。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims

1.一种***酮降解菌，其特征在于，所述降解菌为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）SM3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：24515，保藏日期：2022年3月11日。

2.根据权利要求1所述的降解菌在降解***酮中的应用。

3.一种降解***酮的菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的降解菌。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂、冻干粉菌剂、固定化菌剂。

5.根据权利要求4所述菌剂，其特征在于，所述固定化菌剂还包含海藻糖、聚乙烯醇和活性炭。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述固定化菌剂中海藻酸钠为1-4份、聚乙烯醇（PVA）为4-16份、活性炭为2-7份。

7.一种降解***酮的固定化菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括将海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭、***酮降解菌悬液混合均匀，将混合液滴加到交联剂中，交联后取出用缓冲液中洗涤，吸干水份，保存备用；所述***酮降解菌为权利要求1所述的降解菌。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括将1.5%海藻酸钠、6%聚乙烯醇、2.5%活性炭、0.02g/mL菌悬液混合均匀，将混合液注入5mL注射器滴加到1.5%交联剂CaCl₂中，8 h后取出于10×PBS缓冲液中洗涤后，用滤纸吸干表面水分置于4 ℃冰箱中储存备用。