CN115364123B - 一种侧孢短芽孢杆菌及其在反刍寄生虫防治中的应用 - Google Patents

一种侧孢短芽孢杆菌及其在反刍寄生虫防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗寄生虫兽药技术领域，具体涉及一种侧孢短芽孢杆菌及其在反刍寄生虫防治中的应用。在所述用途中，所述反刍动物消化道寄生虫选自线虫、绦虫或球虫，所述反刍动物优选牛或羊。本发明所述侧孢短芽孢杆菌或其代谢产物具有广谱抗反刍动物消化道寄生虫的作用，可对虫卵和幼虫产生抑制发育和杀灭的效果，不产生耐药性，无药物残留。本发明还发现将侧孢短芽孢杆菌与其他常用防治反刍寄生虫的药物联用能够产生协同增效的抗反刍寄生虫作用，可以显著降低其他常用防治反刍寄生虫药物的用量，进而降低其毒副作用。

Description

一种侧孢短芽孢杆菌及其在反刍寄生虫防治中的应用
技术领域
本发明属于抗寄生虫兽药技术领域，具体涉及一种侧孢短芽孢杆菌及其在反刍寄生虫防治中的应用。
背景技术
寄生虫病是世界上分布最广、种类最多、危害严重的一类疾病。它不仅妨碍畜牧养殖业的健康发展，造成重大经济损失，而且一些人畜共患的寄生虫病，威胁人体的健康，影响公共卫生的安全。反刍动物牛、羊的寄生虫病一直是牛、羊养殖过程的常见病，且对牛、羊的健康带来严重的威胁，使动物机体消瘦，营养不良，若不能及时治疗甚至能造成牛、羊的死亡，给养殖户造成较大经济损失。
目前，常见的反刍动物驱虫药主要包括有机磷类、伊维菌素、多拉菌素、吡喹酮等，剂型主要有溶液剂、浇泼剂、注射剂等。使用有机磷类药物驱虫，如果在药浴后处置不当，会给环境带来严重污染。溶液剂、浇泼剂、注射剂等常规剂型在使用时易受到环境、放牧方式等因素的限制，一般只适合于规模化的圈养方式的反刍动物使用，施用过程中存在给药不方便，需要消耗大量人力和物力的问题。而且一旦在用药过程中不能彻底杀死寄生虫，放牧的牛、羊排出的带有虫卵的粪便会污染牧草，这将增加反刍动物反复感染、发病的可能性。
反刍动物消化道寄生虫主要有线虫、球虫和绦虫等几大类，且混合感染的情况较为普遍(参见，例如，刘林科等，“我国部分地区羊消化道寄生虫感染情况调查及球虫种类鉴定”，畜牧与兽医，2021年第53卷第4期，第117页-第123页)，因此开发能够同时杀灭上述几种寄生虫且毒性较低并对环境友好的兽药将是未来的发展方向。
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)是一种杆状的、产内生孢子的兼性厌氧细菌，能够产生其特有的独木舟状伴孢体 (canoe-shaped parasporal body，CSPB)紧紧地依附于芽孢一侧，从而使其芽孢侧生。侧孢短芽孢杆菌是既能抗菌杀虫又有医用价值的微生物资源。早期研究主要集中在杀虫活性上，国外研究较多，已有生物杀虫剂成品上市。侧孢短芽孢杆菌具有多种生物活性，且表现出广谱抗菌活性，尤其是对细菌和真菌。此外，侧孢短芽孢杆菌也是哺乳动物和鸟类的益生菌，其所产生的特有抗生素已应用于医药领域。
但是，目前尚无将侧孢短芽孢杆菌用于防治反刍动物消化道寄生虫，如线虫、绦虫等方面的报道。
发明内容
为了解决现有技术中用于防治反刍动物消化道寄生虫的广谱抗寄生虫药物不足的问题，本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌及其在反刍寄生虫防治中的应用。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)或其代谢产物在制备防治反刍寄生虫药物中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述反刍寄生虫是反刍动物消化道寄生虫。
作为可选的方式，在上述用途中，所述反刍动物消化道寄生虫选自以下一种或多种：线虫、绦虫或球虫。
优选地，所述侧孢短芽孢杆菌具有广谱抗反刍动物消化道寄生虫的作用，所述反刍动物消化道寄生虫为线虫、绦虫和球虫。
作为可选的方式，在上述用途中，所述反刍动物选自牛、羊、羊驼、羚羊、骆驼或鹿。
作为可选的方式，在上述用途中，所述反刍动物选自牛或羊。
作为可选的方式，在上述用途中，所述侧孢短芽孢杆菌的分类命名为：侧孢短芽孢杆菌CB-42(Brevibacillus laterosporu CB-42)，保藏编号CCTCC NO：M 2022755，保藏时间为2022年5月30日，保藏地点为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
作为可选的方式，在上述用途中，所述侧孢短芽孢杆菌的代谢产物为蛋白酶。
作为可选的方式，在上述用途中，所述侧孢短芽孢杆菌的代谢产物为碱性蛋白酶BLG4。
所述碱性蛋白酶BLG4是从侧孢短芽孢杆菌G4中纯化出的分子量为30kDa的蛋白酶，碱性蛋白酶BLG4可以使线虫、绦虫和球虫角质层的外层剥落，包含物渗出，导致虫体死亡。
作为可选的方式，在上述用途中，所述药物还包含其他防治反刍寄生虫的药物。
作为可选的方式，在上述用途中，所述其他防治反刍寄生虫的药物选自以下一种或多种：伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素、阿苯达唑、芬苯达唑、硝氯酚或三氯苯达唑。
优选地，所述药物包含或由以下组成：侧孢短芽孢杆菌和伊维菌素。
优选地，所述药物包含或由以下组成：侧孢短芽孢杆菌和阿苯达唑。
优选地，所述药物包含或由以下组成：侧孢短芽孢杆菌和三氯苯达唑。
更优选地，在所述药物中，以重量比计算，侧孢短芽孢杆菌和其他防治反刍寄生虫药物的比例为10:1-1:10。
另外更优选地，在所述药物中，以重量比计算，侧孢短芽孢杆菌和其他防治反刍寄生虫药物的比例为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
进一步优选地，在所述药物中，以重量比计算，侧孢短芽孢杆菌和其他防治反刍寄生虫药物的比例为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1 或4:1。
在所述药物中，侧孢短芽孢杆菌与其他防治反刍寄生虫的药物联用能够产生协同增效的抗反刍寄生虫作用，进而可以显著降低其他防治反刍寄生虫药物的用量。
在第二个方面中，本发明提供了一种具有防治动物寄生虫作用的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，所述侧孢短芽孢杆菌的分类命名为：侧孢短芽孢杆菌CB-42(Brevibacillus laterosporu CB-42)，保藏编号CCTCC NO：M 2022755，保藏时间为2022年5 月30日，保藏地点为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
优选地，所述动物选自反刍动物、家禽、家畜、水禽或水产动物，所述寄生虫选自以下一种或多种：线虫、绦虫或球虫。
另外优选地，所述反刍动物选自牛、羊、羊驼、羚羊、骆驼或鹿。
更优选地，所述反刍动物选自牛或羊。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
(1)本发明所述侧孢短芽孢杆菌或其代谢产物具有广谱抗反刍动物消化道寄生虫的作用，可对虫卵和幼虫产生抑制发育和杀灭的效果，不产生耐药性，无药物残留。
(2)本发明还发现将侧孢短芽孢杆菌与其他常用防治反刍寄生虫的药物联用能够产生协同增效的抗反刍寄生虫作用，可以显著降低其他常用防治反刍寄生虫药物的用量，进而降低其毒副作用。
附图说明
图1为河北省张家口市张北县圣达养殖场的实验场地和实验动物照片。
图2为河北省张家口市张北县圣达养殖场的实验场地和实验动物照片。
图3采用麦克马斯特氏虫卵计数法进行检测的试验过程照片。
图4采用麦克马斯特氏虫卵计数法进行检测的试验过程照片。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例：侧孢芽孢杆菌杀虫试验报告
1材料与方法
1.1主要器材
冰箱、显微镜、加热电炉、电子天平、烧杯、平皿、西林瓶、胶头滴管、玻片、玻璃棒、密封袋、一次性手套等。
1.2主要试剂
侧孢芽孢杆菌CCTCC M 2022755 CB-42、阿苯达唑粉剂、饱和食盐水溶液(饱和盐水配制：将400g食盐在1000mL沸水中溶解，制成饱和盐溶液，冷却后备用)。
1.3试验动物与地点
试验动物：选取未做驱虫、散养、以放牧为主要饲养方式的羊群 (80-90kg)进行试验，如图1和图2所示。通过检测最终确认100 头寄生虫阳性的羊，从中随机选择部分羊只进行杀虫试验。
试验地点：河北省张家口市张北县圣达养殖场
1.4粪便样品采集方法
在放牧季节通过直肠采取新鲜粪便样本，每只约20g左右，然后将粪便装入干净的密封袋，尽量挤净空气。标记采集粪便的时间、羊体性别、年龄、体重等信息并编号，置于保温箱，邮寄至实验室后放入4℃冰箱，两日内完成检测。
1.5粪便虫卵检查
用饱和食盐水漂浮法检查羊只绦虫卵、线虫卵、球虫卵及原虫卵囊，确定羊只感染寄生虫情况。具体方法如下：
①取粪便2g放在平皿中，用玻璃棒轻轻将粪便压碎，然后加入 10倍的饱和盐水，用玻璃棒搅拌混合；
②用纱布将粪水过滤到小烧杯中；
③将过滤后的粪水倒入干净的西林瓶，至管内粪水接近水平于管口，然后用胶头滴管向西林瓶内滴加粪水，以滴至液面稍稍凸出瓶口但不溢出为好。静置30min；
④用盖玻片蘸取静置后的粪汁液面，置于载玻片上，镜检。
1.6麦克马斯特氏虫卵计数。
对前述虫卵检测呈阳性羊只的粪便样本，进一步采用麦克马斯特氏法进行虫卵计数：如图3和图4所示，取2g粪便放入烧杯中碾碎，加入饱和食盐水58mL，振荡混合；然后将粪水过滤到另一个烧杯中；将过滤后的粪水边搅拌混匀边用胶头吸管吸取少量滴入麦克马斯特计数室内，放于显微镜上，静置3min。静置后使用显微镜低倍镜认真观察，计数两个计数室内的全部虫卵，取平均值后的数值乘以200，即为每克粪便中虫卵数(eggs per gram，EPG)。
每克粪便虫卵数＝两个刻度室虫卵数平均值×200。
1.7侧孢芽孢杆菌杀虫试验方案
本次驱虫试验选取前期确定的寄生虫感染阳性羊48只，随机平均分成四组，每组12只，其中A组为空白对照组，B组为侧孢短芽孢杆菌单用组，C组为阿苯达唑单用组，D组为侧孢短芽孢杆菌+阿苯达唑组。首先对四组的羊只进行粪便虫卵计数，记录驱虫前各组羊的EPG；A组每头羊灌服生理盐水2mL，B组每只羊灌服2mL(含侧孢芽孢杆菌9mg，用生理盐水混悬)，C组按照说明书每只羊灌服2mL(含阿苯达唑粉剂1mg，用生理盐水混悬)，D组每只羊灌服2mL(含侧孢芽孢杆菌9mg和阿苯达唑粉剂1mg，用生理盐水混悬)。然后于给药后第四天时取粪便并计数其EPG值；同时进行第二次给药，于第一次给药后第七天进行第二次粪检，并记录驱虫后 EPG值。
取样和检测：按照第1.4部分所述，灌服前、灌服后第4天和第7 天粪便取粪便约20g。采用显微镜观察结果，计数虫卵。
1.8驱虫效果的判定
在驱虫后，分别观察和记录各组羊只的临床状况，同时计数各组羊只的虫卵数、羊只的寄生虫率、实验组和对照组间虫卵减少率和寄生虫感染减少率，具体公式如下：
麦克马斯特法：
(1)每克粪便中虫卵数量(EPG)＝[(n1+n2)/(2×0.15)]×60÷2
其中(n1+n2)/2为平均每个计数室内虫卵数，0.15为每个计数室有效体积为0.15mL，60为粪液总体积为60mL，2为所用粪便克数为2g。
(2)羊只寄生虫率(％)＝阳性数量/样本总数*100
(3)实验组和对照组间虫卵减少率＝(对照组虫卵平均值－实验组平均值)/对照组虫卵平均值
(4)实验组和对照组间寄生虫感染减少率＝(对照组阳性只数－实验组阳性只数)/对照组阳性只数
2结果与分析
2.1各给药组饲喂绵羊4天杀虫效果
结果如表1所示，用药4天后，B组侧孢短芽孢杆菌单用组、C 组阿苯达唑单用组和D组侧孢短芽孢杆菌+阿苯达唑组的虫卵阳性率和虫卵平均值与A组空白对照组相比均不同程度降低。其中，B组和D组的变化幅度较为明显，C组动物尽管给予了常用广谱抗寄生虫药物阿苯达唑，但是可能给药剂量较低，因此用药4天后，其表现出的抗寄生虫效果不太明显，虫卵阳性率和虫卵平均值分别为92％和685个。但是，出乎预料的是，如D组所示，当将低剂量阿苯达唑与侧孢短芽孢杆菌联用后，虫卵阳性率和虫卵平均值与单独的B 组和D组相比均显著降低，D组的虫卵阳性率和虫卵平均值分别为 67％和268个。
并且，根据本领域公知的金正均计算公式(例如，参见，金正均，“合并用药中的相加”，中国药理学报，1980年12月，1(2)70-76)，对协同指数q值进行判定，q值由以下的公式求得：q＝ PA+B/(PA+PB-PA×PB)。式中PA、PB和PA+B分别为B组、C组和 D组虫卵减少率或寄生虫感染减少率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1，说明两药合用后产生协同作用，q＝1说明两药合用后产生相加作用。经计算得到，针对虫卵减少率或寄生虫感染减少率， D组的q值分别为1.39和1.61。由此可见，用药4天后，侧孢短芽孢杆菌+阿苯达唑联用可有效驱除1-2.5岁绵羊体内线虫、绦虫和球虫的寄生虫卵，并且两者联用产生了协同增效作用。
表1虫卵阳性率和虫卵平均值
2.2各给药组饲喂绵羊7天杀虫效果
结果如表2所示，与用药4天后结果的变化趋势一致，用药7天后，B组侧孢短芽孢杆菌单用组、C组阿苯达唑单用组和D组侧孢短芽孢杆菌+阿苯达唑组的虫卵阳性率和虫卵平均值与A组空白对照组相比均不同程度降低。其中，B组和D组的变化幅度较为明显，C 组动物尽管给予了常用广谱抗寄生虫药物阿苯达唑，但是可能给药剂量较低，因此用药7天后，其表现出的抗寄生虫效果仍不太强，虫卵阳性率和虫卵平均值分别为75％和425个。但是，出乎预料的是，如 D组所示，当将低剂量阿苯达唑与侧孢短芽孢杆菌联用后，虫卵阳性率和虫卵平均值与单独的B组和D组相比均显著降低，D组的虫卵阳性率和虫卵平均值分别为8％和36个。
并且，根据如上所述的计算公式，经计算得到，针对虫卵减少率或寄生虫感染减少率，D组的q值分别为1.34和1.21。由此可见，用药7天后，侧孢短芽孢杆菌+阿苯达唑联用可有效驱除1-2.5岁绵羊体内线虫、绦虫和球虫的寄生虫卵，并且两者联用产生了协同增效作用。
表2虫卵阳性率和虫卵平均值
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）在制备防治反刍动物寄生虫药物中的用途，其特征在于：所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）CB-42，所述侧孢短芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2022755，保藏时间为2022年5月30日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，所述反刍动物寄生虫选自以下一种或多种：线虫、绦虫或球虫。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述反刍动物选自牛、羊、羊驼、羚羊、骆驼或鹿。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物还包含其他防治反刍动物寄生虫的药物，所述其他防治反刍动物寄生虫的药物选自以下一种或多种：伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素、阿苯达唑、芬苯达唑、硝氯酚或三氯苯达唑。
4.一种具有防治动物寄生虫作用的侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus），其特征在于：所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）CB-42，所述侧孢短芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2022755，保藏时间为2022年5月30日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心。
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