CN115353949A - 离心式多重数字pcr微液滴生成芯片 - Google Patents

离心式多重数字pcr微液滴生成芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，包括：盘体，所述盘体的内部设置有相互独立且密封的多个液滴生成单元，所述液滴生成单元包括依次连通的反应底物池、微流控通道、微液滴收集池、油池连接通道和油池，所述盘体的中心设置有中轴安装孔，所述反应底物池、油池、微液滴收集池沿远离所述中轴安装孔的方向依次设置，所述盘体上开设有与所述反应底物池连通的加样孔以及与所述油池连通的加油孔。本发明采用离心力驱动的多通量阶梯乳化原理生成多重单分散体积液滴，实现了扩增体系溶液的快速分割及多重与自动化，实现了纳升级液滴的多通量生成，样品分区化速度更为高效、简便，同时可获得更多均一、稳定的微液滴。

Description

离心式多重数字PCR微液滴生成芯片
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，特别是涉及一种离心式多重数字PCR微液滴生成芯片。
背景技术
在传统PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，利用微液滴形成装置将含有核酸分子的反应体系分割为成千上万个油包水的微液滴，即成千上万个独立的PCR反应体系。微流控芯片技术与PCR技术相结合的微滴式数字PCR 技术，相比于传统数字PCR，其灵敏度和精度有了很大提升，且操作简单，样品消耗量少。
此外，由于微滴式数字PCR的反应特点，所需样本量极少，单DNA模板出现在单个微滴体系中而未被检出的可能性非常低，比起第二代的实时荧光定量 PCR来说是一个巨大的进步。微滴式数字PCR在检测领域有着多种不可替代的优势，尤其适用于微量DNA检测与定量，并且使用灵活，可以按照需要调整通量和灵敏度，为核酸检测提供了更可靠的结果。
液滴微流控技术是在微尺度下利用连续相的流体剪切力来破坏离散相的表面张力，将离散相分割成纳升级甚至皮升级液滴的一种技术。液滴微流控芯片具有体积小、精度高，液滴之间完全隔离等优点，是一种非常优异的微反应器。常用的液滴生成方法有“T”型通道法、流式聚焦法和同轴法。在稳定的正压或者负压的驱动下，这3种液滴生成方法具有良好的一致性和生成速率。
通过微流控技术与PCR技术相结合的微滴式数字PCR技术，是近年来迅速发展起来的一种突破性的检测和定量核酸的技术。要实现微滴式数字核酸扩增分析，微滴的形成是微滴式数字PCR技术实现的关键环节，必须依赖于能高效发生高度单分散液滴的装置，且液滴的发生过程必须尽可能简单。装置兼容通用的标准设备可降低整个***的复杂性，乃至可以提供给非专业用户直接使用。离心式微流控技术是众多微流控驱动手段的其中一种，它的优势在于省去了以往依靠外部驱动液流的繁杂设计，同时离心转台各向受力具有均匀性，能支持转盘上多个微流芯片/结构的并发操作。
目前，离心微流控技术已经很好地集成完善了基本的液流操作，通过离心力驱动下的微流体控制，利用油水两相阶梯乳化液滴发生技术同步高效生产体积大小不一的多重体积单分散液滴，将混合有PCR反应底物(聚合酶，脱氧核糖核苷酸三磷酸，引物，探针，缓冲液等)及检测目标模板快速在线分割为pL-nL 体积的多重体积微反应器单层阵列，进行后续的PCR快速扩增。离心式微流控芯片也是未来微流控技术面向市场应用最具竞争力的形态与载体。
液滴的数量、生成速率和液滴一致性是影响液滴微技术应用的关键因素，为实现更高通量的液滴生成，大部分研究者采用“T”型通道法、流式聚焦法和同轴法进行阵列，并行液滴制备，这种阵列结构虽然提高了生成速率，但由于各个生成液滴结构的尺寸和流速误差，生成的液滴尺寸差异很大，影响样品的等量分配以及最终的精度和灵敏度。另一种是采用液滴多级分割方法，将生成的液滴逐步分割成小液滴，以提高生成速率，但是，各个微分割结构存在加工差异，使得液滴分割不对称，制备的液滴尺寸差异大。以上两种多通量液滴生成技术因尺寸差异过大，对液滴的生成效果产生影响。
最近几年，阶梯乳化已成为另一种产生稳定尺寸液滴的重要方法，其主要特点就是可以同时使用平行的大规模喷嘴、微流控通道等阵列以实现高通量的液滴生产。传统阶梯乳化方法利用压力或注射泵驱动来产生液滴，整个装置笨重、复杂且集成度低。而且液滴容易积聚在喷嘴处，不仅干扰后续的液滴形成，降低了液滴产生的速率，还会导致液滴尺寸分布变宽。
现有技术中的PCR微液滴生成芯片未采用密封结构，会因其余混杂因素带来影响。此外，目前国内研究以柔性微管为主，但是柔性微管的制作非常复杂，需要耗费人工制作。
发明内容
本发明提供了一种离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，以解决至少一个上述技术问题。
为解决上述问题，作为本发明的一个方面，提供了一种离心式多重数字PCR 微液滴生成芯片，包括：盘体，所述盘体的内部设置有相互独立且密封的多个液滴生成单元，所述液滴生成单元包括依次连通的反应底物池、微流控通道、微液滴收集池、油池连接通道和油池，所述盘体的中心设置有中轴安装孔，所述反应底物池、油池、微液滴收集池沿远离所述中轴安装孔的方向依次设置，所述盘体上开设有与所述反应底物池连通的加样孔以及与所述油池连通的加油孔。
优选地，所述微流控通道呈弧形延伸。
优选地，所述微流控通道呈L形。
优选地，所述反应底物池的截面呈扇环形。
优选地，所述微液滴收集池的截面呈圆形。
优选地，所述盘体上开设有多个定位孔。
本发明能够通过离心力沿微流控通道泵送液体，无需复杂的流体驱动设备，仅需使用普通的电机便能实现微流体的驱动，在不使用任何泵的情况下实现液滴的形成，利用密度差和离心力的作用来简单快速地获得单分散液滴，同时在离心过程中可把生成的液滴从喷嘴处移除。与其他液滴生成装置相比，每个喷嘴的通量高，装置简单，无死体积。
本发明采用离心力驱动的多通量阶梯乳化原理生成多重单分散体积液滴，实现了扩增体系溶液的快速分割及多重与自动化，实现了纳升级液滴的多通量生成。相比传统产生均质液滴的技术T型交叉或者流动聚焦等液滴发生技术，样品分区化速度更为高效，也更加简便，同时可获得更多均一、稳定的微液滴。
本发明利用离心力和阶梯乳化原理生成多重单分散体积液滴，并对离心力大小(转速大小及转动加速度)、离心式多重数字PCR微液滴生成芯片的微结构尺寸进行反复模拟与验证，实现了两种方式同步工作的可能。
本发明以微流控通道代替了复杂的超净间加工流程，极大地降低了加工难度和减少了加工时间，还兼具良好的进样能力，采用密封结构有效地避免了其余混杂因素带来的影响，省去了以往依靠外部驱动液流的繁杂设计，同时离心力各项受力具有均匀性，能支持多单元结构的并发操作。
附图说明
图1示意性地示出了本发明的透视图；
图2示意性地示出了一个液滴生成单元的示意图；
图3示意性地示出了本发明的剖视图1；
图4示意性地示出了本发明的剖视图2；
图5示意性地示出了本发明的立体图。
图中附图标记：1、盘体；2、反应底物池；3、微流控通道；4、微液滴收集池；5、油池连接通道；6、油池；7、中轴安装孔；8、加样孔；9、加油孔； 10、定位孔。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
作为本发明的一个方面，提供了一种离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，包括：盘体1，所述盘体1的内部设置有相互独立且密封的多个液滴生成单元，盘体1为圆盘状，盘体1上有多个相同结构的独立微滴生成单元，各独立单元均为密封状态。
进一步地，所述液滴生成单元包括依次连通的反应底物池2、微流控通道3、微液滴收集池4、油池连接通道5和油池6，所述盘体1的中心设置有中轴安装孔7，所述反应底物池2、油池6、微液滴收集池4沿远离所述中轴安装孔7的方向依次设置，所述盘体1上开设有与所述反应底物池2连通的加样孔8以及与所述油池6连通的加油孔9。
其中，微液滴收集池4与油池6通过油池连接通道5连通，样本通过微流控通道3控制液滴产生大小，并利用离心力驱动在微液滴收集池4内收集液滴。
优选地，所述微流控通道3呈弧形延伸。优选地，所述微流控通道3呈L 形。这样，微流控通道3呈弧形弯曲的L形。作为优选，微流控通道大体呈折线形，且拐角处为弧形。折线形加弧形设计主要是为了样品从样品池顺利进入油池内，达到无样品损耗使液滴快速生成的最理想效果。
优选地，所述反应底物池2的截面呈扇环形。优选地，所述微液滴收集池4 的截面呈圆形。
优选地，所述盘体1上开设有多个定位孔10，通过四个定位孔10与一个定位孔10，可与离心驱动装置连接固定。
使用时，将反应底物从加样孔8注入反应底物池2，反应底物在离心力作用下通过微流控通道3，在微液滴收集池4内产生均一性较强的油包水的微液滴。油相从加油孔9注入油池6，油池6内的油相通过油池连接通道5进入微液滴收集池4，在离心力的作用下，油相将完全进入微液滴收集池4。
在上述技术方案中，本发明可基于离心力驱动下的微流体控制，即确定微流控通道尺寸及离心力大小，当转速达到1500rpm左右时，可以在微液滴收集池4内产生大量(>15000个)直径在120μm附近的均一性较强的油包水液反应滴。
在图1至图5所示的实施例中，本发明中的离心式液滴生成芯片包括沿其圆周上分布的八个独立的液滴生成单元，以提高通量，可满足八个样品同时生成液滴的需要。在生成液滴时，所有微流控通道同时制备液滴，可实现高通量的液滴制备，可利用本发明在微电机带动下做圆周运动时所产生的离心力作为液流的驱动力，与阶梯乳化装置结合使用。
本发明能够通过离心力沿微流控通道泵送液体，无需复杂的流体驱动设备，仅需使用普通的电机便能实现微流体的驱动，在不使用任何泵的情况下实现液滴的形成，利用密度差和离心力的作用来简单快速地获得单分散液滴，同时在离心过程中可把生成的液滴从喷嘴处移除。与其他液滴生成装置相比，每个喷嘴的通量高，装置简单，无死体积。
本发明采用离心力驱动的多通量阶梯乳化原理生成多重单分散体积液滴，实现了扩增体系溶液的快速分割及多重与自动化，实现了纳升级液滴的多通量生成。相比传统产生均质液滴的技术T型交叉或者流动聚焦等液滴发生技术，样品分区化速度更为高效，也更加简便，同时可获得更多均一、稳定的微液滴。
本发明利用离心力和阶梯乳化原理生成多重单分散体积液滴，并对离心力大小(转速大小及转动加速度)、离心式多重数字PCR微液滴生成芯片的微结构尺寸进行反复模拟与验证，实现了两种方式同步工作的可能。
本发明以微流控通道代替了复杂的超净间加工流程，极大地降低了加工难度和减少了加工时间，还兼具良好的进样能力，采用密封结构有效地避免了其余混杂因素带来的影响，省去了以往依靠外部驱动液流的繁杂设计，同时离心力各项受力具有均匀性，能支持多单元结构的并发操作。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，其特征在于，包括：盘体(1)，所述盘体(1)的内部设置有相互独立且密封的多个液滴生成单元，所述液滴生成单元包括依次连通的反应底物池(2)、微流控通道(3)、微液滴收集池(4)、油池连接通道(5)和油池(6)，所述盘体(1)的中心设置有中轴安装孔(7)，所述反应底物池(2)、油池(6)、微液滴收集池(4)沿远离所述中轴安装孔(7)的方向依次设置，所述盘体(1)上开设有与所述反应底物池(2)连通的加样孔(8)以及与所述油池(6)连通的加油孔(9)。
2.根据权利要求1所述的离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，其特征在于，所述微流控通道(3)呈弧形延伸。
3.根据权利要求2所述的离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，其特征在于，所述微流控通道(3)呈L形。
4.根据权利要求1所述的离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，其特征在于，所述反应底物池(2)的截面呈扇环形。
5.根据权利要求4所述的离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，其特征在于，所述微液滴收集池(4)的截面呈圆形。
6.根据权利要求1所述的离心式多重数字PCR微液滴生成芯片，其特征在于，所述盘体(1)上开设有多个定位孔(10)。
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