CN115353616B - 一种聚乙二醇化脂质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型聚乙二醇化脂质，还涉及包含该聚乙二醇化脂质的脂质体、含该聚乙二醇化脂质的脂质体核酸药物组合物及其制剂和应用，式中n1为20‑250的整数。本发明涉及的一种包含如下结构所示的聚乙二醇化脂质的阳离子脂质体，能够提高核酸药物的装载率和转运率。本发明涉及的一种前述阳离子脂质体核酸药物组合物制剂有很好的细胞相容性和较高的基因转染力，能提高核酸药物的治疗和/或预防疗效。

Description

一种聚乙二醇化脂质
本申请是2021年07月23日提交的发明名称为“一种阳离子脂质、含该阳离子脂质的脂质体、含该脂质体的核酸药物组合物及其制剂和应用”的第202110839008.7号中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于药物输送领域，具体涉及一种药用载体聚乙二醇化脂质，包含该聚乙二醇化脂质的脂质体、含该聚乙二醇化脂质的脂质体核酸药物组合物及其制剂和应用。
背景技术
脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型囊泡体。脂质体纳米颗粒包含脂质体和核酸类药物，其结构类似生物膜，是生物相容性好且无毒的纳米材料，它可以包封水溶性和脂溶性药物，具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物、保护封装的核酸在血清中免受降解和清除等优点。此外，纳米脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。因而，脂质体纳米颗粒被广泛用于药物输送领域。
基于前述的这些优点，脂质体纳米颗粒作为一种新型的疫苗载体越来越受到关注，正逐渐用于抗病毒疫苗、抗细菌疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等的研制开发。中性脂质体和表面携带正电荷的阳离子脂质体是最常用的纳米疫苗载体。其中，阳离子脂质体不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应，因此阳离子脂质体在疫苗领域广泛地用于封装、转运核酸类药物。
阳离子脂质体封装、转运核酸类药物的过程为，首先，阳离子脂质体-核酸药物复合物的形成：阳离子脂质体表面带有正电荷，而核酸带有负电荷，二者通过静电相互作用形成阳离子脂质体-核酸药物复合物；其次，阳离子脂质体-核酸药物复合物表面的整体带有正电荷，通过静电相互作用吸附到带负电荷的细胞表面，通过细胞内吞作用进入细胞，形成内涵体；再者，阳离子脂质体中的阳离子脂质与内涵体中带负电荷的脂质发生静电相互作用，带负电荷的脂质由内涵体的腔外翻转到腔内，与正电荷脂质形成中性离子对，核酸类药物脱离阳离子脂质体后进入细胞质；最后，转染入细胞的核酸类药物在细胞内发挥相应功能。在核酸类药物递送进细胞、到核酸分子在体内表达病原体(例如细菌和病毒)或肿瘤抗原特有的肽或蛋白(抗原)片段、到最后激发特定的免疫应答的整个过程中，阳离子脂质体发挥着重要的作用。
阳离子脂质体通常由阳离子脂质和辅脂质(例如1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和/或胆固醇，更优选为DOPE)在适当的条件下复合而成，其中，阳离子脂质通过静电与核酸相互作用，而辅脂质则起到防止脂质氧化或将配体连接至脂质体的表面的作用或者可以减少脂质颗粒的聚集。阳离子脂质，一般为两亲性分子，具有含有一个或者多个烃基的脂质亲和性区域、和含有至少带一个正电的极性头基(headgroup)的亲水性区域。阳离子脂质与核酸等巨大分子通过形成以总电荷计带正电的复合体，细胞膜表面总的带负电荷，这样使得核酸等巨大分子容易通过细胞的原生质膜进入细胞质，提高核酸药物的转运率。
尽管阳离子脂质用于药物输送取得了最新的进展，但本领域内仍然需要适合于常规治疗用途的改进的阳离子脂质。
发明内容
本发明提供了新型阳离子脂质、包含所述阳离子脂质的阳离子脂质体以及含有该阳离子脂质体的核酸药物组合物及其制剂，阳离子脂质体核酸药物组合物制剂能将核酸类药物递送至细胞内，提高核酸类药物的转运率，从而提高核酸类药物的治疗效果。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现,
本发明的一种实施方案：
一种阳离子脂质，结构如通式(1)所示：
Figure BDA0003804810810000021
其中，N为氮支化中心；
L1、L2为连接键或二价连接基，所述二价连接基各自独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-O(CRcRc)sO-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种，其中，所述Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基，s为2、3或4；
L3为连接键、-L4-、-Z-L4-Z-、-L4-Z-L5-、-Z-L4-Z-L5-或-L4-Z-L5-Z-；所述L4、L5为碳链连接基，各自独立地为-(CRaRb)t-(CRaRb)o-(CRaRb)p-，其中，t、o、p各自独立地为0-12的整数，且t、o、p不同时为0，Ra和Rb每次出现时各自独立地为氢原子或烷基；所述Z每次出现时各自独立为-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-和
Figure BDA0003804810810000022
中任一种，其中Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
B1、B2各自独立地为连接键或C1-30亚烷基；
R1、R2各自独立地为C2-30脂肪烃基；
R3为氢原子、-Rd、-ORd、-NRdRd、-SRd、-(C＝O)Rd、-(C＝O)ORd、-O(C＝O)Rd、-O(C＝O)ORd或
Figure BDA0003804810810000023
其中，Rd每次出现时各自独立地为C1-12烷基，G1为k+1价的末端支化基团，j为0或1，F含有功能性基团R01，j为0时，G1不存在，j为1时，G1引出k个的F，k为2-8的整数；
A选自-(CRaRb)sO-、-O(CRaRb)s-、-(CRaRb)sS-、-S(CRaRb)s-、-(CRaRb)sO(CRaRb)sS-、-(CRaRb)sS(CRaRb)sO-、-(CRaRb)sNRc(CRaRb)sS-、-(CRaRb)sS(CRaRb)sNRc-、-(CRaRb)sNRc(CRaRb)sO-和-(CRaRb)sO(CRaRb)sNRc-中任一种，其中，s为2、3或4，Ra和Rb每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
当A为-(CRaRb)sO-或-O(CRaRb)s-时，n为2-6的整数；当A不为-(CRaRb)sO-或-O(CRaRb)s-时，n为1-6的整数；
所述烷基、亚烷基、烷氧基、脂肪烃基各自独立地为取代的或未取代的。
本发明还提供了另外一种实施方案：
一种阳离子脂质体，包含结构如式(1)所示的阳离子脂质。
本发明还提供了另外一种实施方案：
一种脂质体核酸药物组合物，含有阳离子脂质体和药物，且所述的阳离子脂质体含有结构如式(1)所示的阳离子脂质和核酸药物。
本发明还提供了另一种实施方案：
一种脂质体核酸药物组合物制剂，含有前述的脂质体核酸药物组合物和药学上可接受的稀释剂或赋形剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的新型阳离子脂质是氮支化的，支化中心的氨，在生理pH条件下容易质子化产生部分正电荷，能和带负电荷的核酸结合，从而提高核酸药物的装载率。
本发明的新型阳离子脂质制备的阳离子脂质体核酸药物组合物表面带有正电荷，通过静电相互作用吸附到带负电荷的细胞表面，利用细胞内吞作用进入细胞，形成内涵体。本发明的阳离子脂质末端含有羟基、氨基、羧基等基团，在酸性条件下易质子化，而内涵体呈酸性状态，质子化后产生部分正电荷，与内涵体中带负电荷的脂质发生静电相互作用，带负电荷的脂质由内涵体的腔外翻转到腔内，与正电荷脂质形成中性离子对，使得药物脱离阳离子脂质体从内涵体逃逸后进入细胞质，从而提高核酸药物的转运率。
本发明的新型阳离子脂质制备的阳离子脂质体核酸药物组合物具有较高的血清稳定性、较强的基因复合能力、较高的生物相容性、较强的基因转染效果，有助于提高药物的基因治疗效果，尤其是核酸类药物的基因治疗效果。
本发明的新型阳离子脂质的末端还可以含有荧光性基团或靶向基团，由该阳离子脂质的阳离子脂质体核酸药物组合物，能兼具荧光或者靶向功能，进一步提高核酸药物的基因治疗和/或诊断效果。
实施方式
术语说明
在本发明中，除非另外指明，否则各术语具有以下含义。
本发明中，当涉及到的结构具有同分异构体时，没有特别指定的情况下，可以为其中任一种异构体。例如对于存在顺反异构体的结构，既可以为顺式结构也可以为反式结构；存在E/Z异构体的结构，既可以为E结构也可以为Z结构；有旋光性时可以为左旋或右旋。
本发明中，数值区间的释义，既包括短横线标记的数值区间(如1-6)，也包括波浪线标记的数值区间如(1～6)。本发明中，在没有特别说明的情况下，以区间形式标记的整数区间均可表示该区间范围内所有整数构成的组，且该范围包括两个端点。如整数范围1-6表示1、2、3、4、5、6构成的组。本发明中的数值范围，包括但不限于整数、非整数、百分数、分数表示的数值范围，如无特别说明，均包括两个端点。
本发明中，式(2-1)到式(2-10)指包含式(2-1)、式(2-2)、式(2-3)、式(2-4)、式(2-5)、式(2-6)、式(2-7)、式(2-8)、式(2-9)和式(2-10)。
本发明中的数值涉及“约”、“左右”一般指±10％的数值范围，部分情况可放大到±15％，但不超过±20％。以预设数值为基数。例如，类固醇脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比约为40％，一般可认为包括类固醇脂质的摩尔百分比为30％-50％的情形。
本发明中，除非特别说明，否则术语“包括”、“包含”和“含有”以及类似的表述应在本说明书和权利要求书中以开放性和包含性的含义解释为“包括但不限于”。
本发明中两个或多个对象“各自独立地优选”，当具有多级的优选情况时，并不要求均选自同级的优选组，可以一个为大范围的优选、一个为小范围的优选，也可以一个为最大范围、另一个为任一种优选情况，也可以选自同级的优选，例如，“R1、R2各自独立地优选为直链状烷基；更优选为C1-25直链状烷基；更优选为C1-17直链状烷基”，可以R1为C1-25直链状烷基，R2为C1-17直链状烷基，或者R1为C1-17直链状烷基，R2为C1-25直链状烷基，或者R1和R2同时为C1-25直链状烷基，或者R1和R2同时为C1-17直链状烷基。
本发明中的二价连接基，例如亚烃基、亚烷基、亚芳基、酰胺键等，没有特别限定的情况下，其连接其它基团时可选两个连接端中的任一个，例如在C-CH2CH2-和-CH2-D之间以酰胺键作为二价连接基时，可以为C-CH2CH2-C(＝O)NH-CH2-D或C-CH2CH2-NHC(＝O)-CH2-D。
本发明的结构式中，当连接基的端基与连接基含有的取代基易发生混淆时，采用
Figure BDA0003804810810000041
来标记连接基中连接其它基团的位置，如在结构式
Figure BDA0003804810810000042
中，采用的
Figure BDA0003804810810000043
来标记二价连接基中连接其它基团的两个位置，前述两个结构式分别表示-CH(CH2CH2CH3)2-、-CH2CH2CH(CH3)2-CH2CH2-。
本发明中，基团中的碳原子数范围以下标形式标注在C的下标位置，表示该基团具有的碳原子数，例如C1-12表示“具有1至12个碳原子”、C1-30表示“具有1至30个碳原子”。“取代的C1-12烷基”指C1-12烷基的氢原子被取代得到的化合物。“C1-12取代的烷基”指烷基的氢原子被取代后得到的化合物中具有1-12个碳原子。又如当一个基团可选自C1-12亚烷基时，可选自下标所示范围中任一种碳原子数的亚烷基，即可选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12亚烷基中任一种亚烷基。本发明中，在没有特别说明的情况下，以区间形式标记的下标均表示可选自该范围内任一整数，该范围包括两个端点。
本发明中的杂原子没有特别限定，包括但不限于O、S、N、P、Si、F、Cl、Br、I、B等。
本发明中，将所述用于取代的杂原子称为“取代原子”，所述用于取代的任一基团称为“取代基”。
本发明中，“取代的”意指任何上述基团(例如，脂肪烃基、烃基、烷基或亚烷基)其中至少一个氢原子被与非氢原子连接的键取代，该非氢原子例如，但不限于：诸如F、Cl、Br和I的卤素原子；氧代基团(＝O)；羟基(-OH)；烃氧基(-ORd，其中Rd为C1-12烷基)；羧基(-COOH，)；胺基团(-NRcRc，两个Rc各自独立地为H、C1-12烷基)；C1-12烷基和环烷基。在一些实施方案中，所述取代基为C1-12烷基。在其他实施方案中，所述取代基为环烷基。在其他实施方案中，所述取代基为卤代基团，例如氟代。在其他实施方案中，所述取代基为氧代基团。在其他实施方案中，所述取代基为羟基。在其他实施方案中，所述取代基为烷氧基。在其他实施方案中，所述取代基为羧基。在其他实施方案中，所述取代基为胺基团。
本发明中，“原子间隔”或“原子间距”指沿着主链所间隔的主链原子数，不考虑侧基和侧链的因素，通常也是最短的原子间距，可用来表示连接基的长度；例如A-CO-NH-B中A与B的原子间隔为2，A-p-Ph-CH2-B中A与B的原子间隔为5(p-Ph为对位苯撑)，又如A-CH(CH2CH2CH2CH3)-B的原子间隔为1。参与构成原子间隔的“主链原子”只能是非氢原子。其中，对于含环状结构的二价连接基，其原子间隔指沿成环原子计算的最短原子数，例如对位苯撑也即1,4-亚苯基的原子间隔为4，间位苯撑的原子间隔为3，邻位苯撑的原子间隔为2。又如–CH2–、–CH(CH3)–、–C(CH3)2–、–CH(CH2Ph)2–、–C(CH2OX)–的原子间隔均为1。
本发明中，“碳链连接基”指主链原子全部为碳原子的连接基，而侧链部分则允许杂原子或含杂原子的基团取代主链碳的氢原子。“主链原子”为杂原子时，也称为“主链杂原子”，如A-S-CH2-B、A-O-CH2-B、
Figure BDA0003804810810000051
(原子间隔记为4)视为含有主链杂原子。碳链连接基可以分为亚烃基和侧基含杂原子的碳链连接基；所述侧基含杂原子的碳链连接基包括但不限于氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨代(通过碳氮双键与主链碳相连)、醚键形式的氧杂烃基、硫醚键形式的硫杂烃基、叔氨基形式的氮杂烃基等。“碳链连接基”主链全部由碳原子构成，碳链的侧基允许含有杂原子。也即由亚甲基或取代的亚甲基连接而成。所述取代的亚甲基可以被一个一价取代基、二个一价取代基或一个二价取代基(如二价氧，如与二价亚甲基共同构成三元环
Figure BDA0003804810810000052
)取代。所述取代的亚甲基可以是一个氢原子被取代(如-CH(CH3)-)，也可以是两个氢原子分别被取代(如-(CH3)C(OCH3)-)，还可以是两个氢原子同时被取代(如羰基、硫代羰基、-C(＝NH)-、-C(＝N+H2)-)，还可以是环状侧基(如
Figure BDA0003804810810000053
原子间隔记为1)。
本发明中的仲氨键、联氨键指“-NH-”两端均被亚烃基封端，如-CH2-NH-CH2-；而如-C(＝O)-NH-则称为酰胺键，不视为含有仲氨键。
本发明中，对于一个化合物、一个基团或一个原子，可以同时被取代和被杂化，例如硝基苯基取代氢原子，又如-CH2-CH2-CH2-被替换为-CH2-S-CH(CH3)-。
本发明中，“连接键”指只起连接作用，不含有任何原子，当某个基团定义可以为连接键时，也即表示该基团可以不存在。
本发明中，“每次出现时各自独立地为”不仅指的是不同基团里面可以各自独立地为定义里的任一选项，还表示同一个基团里不同位置上出现时同样可以各自独立地为定义里的任一选项，例如，-Z-L4-Z-中，“Z每次出现时各自独立为-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-和
Figure BDA0003804810810000054
中任一种，其中Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基”，在“-Z-L4-Z-”基团中，两个Z基团可以相同或不同，在基团“-NRcC(＝O)NRc-”中，两个Rc可以相同或不同，各自独立地为氢原子或C1-12烷基。
本发明中的“基团”含有至少1个原子，指化合物失去一个或多个原子形成的自由基。相对于化合物，失去部分基团后形成的基团也称为残基。基团的价态没有特别限定，作为举例可以分为一价基团、二价基团、三价基团、四价基团、……、一百价基团等。其中，价态大于等于2的基团统称为连接基。连接基还可以只含有一个原子，如氧基、硫基。
本发明中，“烃”指由碳原子和氢原子组成的碳氢化合物。
本方明中，按烃基类别，烃分为脂肪烃和芳烃两种。不含苯环、烃基取代的苯环中任一种结构的烃定义为脂肪烃。含有至少一个苯环或烃基取代的苯环的烃定义为芳烃。且芳烃中可以含有脂肪烃基结构，如甲苯、二苯基甲烷、2,3-二氢茚等。
本方明中，按饱和度情况，烃分为饱和烃、不饱和烃两种。所有的芳烃均为不饱和烃。饱和的脂肪烃又称为烷烃。不饱和的脂肪烃的不饱和度没有特别限定。作为举例，包括但不限于烯烃(含双键)、炔烃(含三键)、二烯烃(含两个共轭双键)等。当芳烃中脂肪烃部分为饱和结构时，也称为芳烷烃，如甲苯。
本发明中，对于烃的结构没有特别限制，可以为不含侧基的直链结构、含侧基的支链结构、含环状结构、树状结构、梳状结构、超支化结构等形式。没有特别定义的情况下，优选不含侧基的直链结构、含侧基的支链结构、含环状结构，分别对应直链烃、支链烃、环烃。其中，不含环状结构的烃统称为开链烃，包括但不限于不含侧基的直链结构、含侧基的支链结构。开链烃属于脂肪烃。所以直链烃也可以成为直链脂肪烃。支链烃也可以成为支链脂肪烃。
本发明中，烃中任一位置的碳原子被杂原子取代形成的化合物，统称为杂烃。
本发明中，脂杂烃指脂肪烃来源的杂烃，包括脂杂环烃和脂杂开链烃等。饱和脂杂烃为杂烷烃。
本发明中，“烃基”指烃失去至少一个氢原子后形成的残基。根据失去的氢的数量，可以分为一价烃基(失去一个氢原子)、二价烃基(失去两个氢原子，也称为亚烃基)、三价烃基(失去三个氢原子)等，依次类推，当失去n个氢原子时，形成的烃基的价态即为n。没有特别指定的情况下，本发明中的烃基特指一价烃基。
本发明中的烃基的来源没有特别限制，例如可以源自脂肪烃或芳烃，也可以源自饱和烃或不饱和烃，也可以源自直链烃、支链烃或环烃，还可以源自烃或杂烃等等。从饱和度的角度，例如可以源自烷烃、烯烃、炔烃、二烯烃等；对于环烃，例如可以源自脂环烃或芳烃、单环烃或多环烃；对于杂环烃，例如可以源自脂杂环烃或芳杂环烃。
本发明中，“脂肪烃基”指脂肪烃失去至少一个氢原子后形成的残基。没有特别指定的情况下，本发明中的脂肪烃基特指一价脂肪烃基。脂肪烃基包含饱和脂肪烃基和不饱和脂肪烃基。
本发明中，“烷基”指的是由烷烃形成的烃基，没有特别指定的情况下，指失去任一位置的氢原子形成的烃基，可以是直链的或支链的，可以是被取代的或未取代的。具体地，如丙基指正丙基、异丙基中任一种，亚丙基指1,3-亚丙基、1,2-亚丙基、异亚丙基中任一种。
本发明中，“不饱和烃基”指的是不饱和烃失去氢原子形成的烃基。不饱和烃失去不饱和碳上氢原子形成的烃基，可以分为烯基、炔基、二烯基等等，作为举例如丙烯基、丙炔基。不饱和烃失去饱和碳上的氢原子形成的烃基根据不饱和键的不同，例如称为烯烃基、炔烃、二烯烃基等，具体地如烯丙基、炔丙基。
本发明中，“烯基”或“烯基基团”意思指包括两个或更多个碳原子(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个碳碳双键的被取代的或未取代的直链或分支链烯基。标记“C2-15烯基”意思指包括2-15个碳原子和至少一个碳碳双键的被取代的或未取代的直链或分支链烯基，即烯基可以包括一个、两个、三个、四个或更多个碳碳双键。除非另外具体说明，否则本文所述的烯基是指未取代和被取代的烯基两种
本发明中，“炔基”或“炔基基团”意思指包括两个或更多个碳原子(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个碳碳三键的任选被取代的直链或分支链烃。标记“C2-15炔基”意思指包括2-15个碳原子和至少一个碳碳三键的被取代的或未取代的直链或分支链炔基。炔基可以包括一个、两个、三个、四个或更多个碳碳三键。除非另外具体说明，否则本文所述的炔基是指未取代和被取代的炔基两种。
本发明中，“分子量”表征一个化合物分子的质量大小，“平均分子量”表征宏观物质中通式化合物组分的质量大小，且没有特别规定时，“平均分子量”一般指“数均分子量”Mn。对于数均分子量，既可以为多分散性嵌段或物质的分子量，也可以为单分散性嵌段或物质的分子量。没有特别写明时，“分子量”与“平均分子量”的计量单位为道尔顿，Da。还可以用“聚合度”表征聚乙二醇链的分子量大小，具体指一个化合物分子中重复单元(氧化乙烯基单元、EO单元)的数量。相应地，用“平均聚合度”、优选“数均聚合度”来表征重复单元数量的平均值、数均值。
本发明中的百分数，“约”一般指±0.5％。
本发明中基团的“可稳定存在”和“可降解”是一对相对的概念。
本发明中，“可降解”(be degradable or can be degraded)指发明化学键的断裂，且断裂为彼此独立地至少两个残基。如果经化学变化后改变了结构，但整个连接基仍仅为一个完整的连接基，那么该连接基仍归到“可稳定存在”的范畴。所述可降解的条件没有特别限制，既可为体内生理条件，也可为体外模拟生理环境或其它条件，优选在体内生理条件及体外模拟生理条件。所述生理条件没有特别限制，包括但不限于血清、心、肝、脾、肺、肾、骨骼、肌、脂肪、脑、***、小肠、生殖腺等部位，可以指细胞内，也可指细胞外基质中，可以指正常生理组织，也可以指病变生理组织(如肿瘤、炎症等)。所述体外模拟环境没有特别限制，包括但不限于生理盐水、缓冲液、培养基等。所述可降解的速度没有特别限制，例如既可以为酶作用下的快速降解，也可以指生理条件下的缓慢水解等。所述的体内生理条件包括治疗时的生理条件，如紫外照射、热疗等情况。包括但不限于在光、热、低温、酶、氧化还原、酸性、碱性、生理条件、体外模拟环境等条件下可降解，优选在光、热、酶、氧化还原、酸性、碱性等条件下可降解。所述可降解指在上述任一条件下的刺激下发生降解。所述光条件包括但不限于可见光、紫外光、红外光、近红外光、中红外光等光照条件。所述热条件指高于正常生理温度，通常指高于37℃的温度条件，且通常低于45℃，优选低于42℃。所述低温条件指低于人体生理温度，优选低于25℃，更优选≤10℃，具体举例如冷藏温度、冷冻温度、液氮治疗温度、2～10℃、4～8℃、4℃、0℃、-20±5℃等。所述酶条件没有特别限制，生理条件下可生成的酶均包含在内，作为举例，如肽酶、蛋白酶、裂解酶等。所述氧化还原条件没有特别限制，如巯基与二硫键之间的氧化还原转变、氢化还原转变。所述酸性、碱性条件主要指正常组织、病变组织、处于治疗期的器官或组织等体内部位的pH条件，比如胃为酸性条件，肿瘤部位也往往偏酸性。这里的可降解指可通过体内代谢作用发生降解(如生理作用、如酶、如氧化还原等)、在体内特定部位因微环境刺激而发生降解(如酸性、碱性)、或在临床治疗刺激下发生降解(如光、如热、如低温)等。需要说明的是，有机化学中相对于生物体而言的一些极端条件，如强酸、强碱、高温(如100℃以上)等条件下的键断裂，并不包括在本发明的可降解条件的范畴。又如，虽然醚键可在如氢溴酸的强酸条件下发生断裂，但本发明中始终将其归为可稳定存在的连接基。
本发明中，“可稳定存在”指连接基能保持作为一个完整的连接基存在(一个连接基与其相邻的基团稳定地共价相连接)，则定义为“可稳定存在”(be stable or canremain stable)，其中，允许发生能保持连接基完整性的化学变化。所述化学变化没有特别限制，包括但不限于异构化转变、氧化、还原、离子化、质子化、去质子化、取代反应等。可稳定存在的条件没有特别限制，包括但不限于光、热、低温、酶、氧化还原、中性、酸性、碱性、生理条件、体外模拟环境等条件下可稳定存在，优选在光、热、酶、氧化还原、酸性、碱性等条件下可稳定存在。这里的稳定存在指不进行特殊刺激(如特殊部位的pH条件、治疗时的光、热、低温等)的条件下，在体内代谢循环中可保持稳定的连接，不因发生链的断裂而导致分子量降低(只要仍能保持整体性)。
本发明中，对同一个连接基而言，“可稳定存在”并非绝对的概念，比如酰胺键在酸性或碱性条件下相比于酯键要稳定地多，本发明中的“可稳定存在”的连接基包含了酰胺键。但是，比如肽键，由一分子氨基酸的α-羧基和一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的一种酰胺键，当遇到特定酶作用时，则可以断裂，因此也包括在“可降解”的连接基中。同样地，氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基等既可以为可稳定存在的连接基，也可以为可降解的连接基。更普遍地，氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基等更倾向会发生缓慢降解，而非肽键的酰胺键则在体内循环过程中可稳定存在。又如常见的酯键可在酸、碱条件下降解，而包含在特殊结构的中酯键还可在紫外光条件下发生降解。又比如，即使某些化学键在特定酶作用下能发生降解，但如果其在临床使用时，如果循环路径不经过或者基本不经过该特定酶环境(比如定点给药的情况下)，相应的化学键仍可以视为是可稳定存在的。
本发明中，为了更明确地对化合物结构的可降解性质进行定义，提供一个参考的判断标准，即在一个有限的时间区间内的考察化学键接保持一特定百分比(如90％)为界。以90％为例，通常以官能化聚乙二醇修饰产物的药代动力学曲线为参考，以符合临床评价标准的剂量百分比为基准。例如，对于静脉给药的PEG化药物，当血药浓度(以有效药物成分计，包括PEG化的药物以及降解后的非PEG化成分)低于初始浓度的15％(或者更符合该药物临床评价的其他比例)时，以其余85％为基数，如果一种连接基保持化学键接的比例超过90％则在本发明中属于可稳定存在的基团，反之如果低于90％则属于可降解的基团。已公开文献中所报道的水解稳定、酶降解等也一并纳入本发明中。以水解稳定为例，囊括已公开文献中所报道的水解稳定时的水解速率，优选指生理条件下的水解速率低于每天1-2％(一般取2％)，质量或摩尔量。典型化学键的水解速率可参考大多标准化学手册。
本发明中，“羟基保护基”包含可作为通常的羟基的保护基而使用的所有的基团。羟基保护基，优选为烷酰基(例如乙酰基、叔丁酰基)、芳烷酰基(例如苄酰基)、苄基、三苯甲基、三甲基硅基、叔丁基二甲硅基、烯丙基、缩醛基或缩酮基。乙酰基的脱去一般在碱性条件下进行，最常用的是NH3/MeOH的氨解和甲醇阴离子催化的甲醇解；苄基在中性溶液中室温下钯催化氢解很容易除去苄基，也可用金属纳在乙醇或液氨中还原裂去；三苯甲基一般是通过催化氢解除去；三甲基硅基通常使用含氟离子的试剂(如四丁基氟化胺/无水THF等)除去；叔丁基二甲硅醚较为稳定，能够承受醇性氢氧化钾的酯水解条件以及温和的还原条件(如Zn/CH3OH等)，可用氟离子(如Bu4N+F-)在四氢呋喃溶液中脱去，也可用含水乙酸于室温下脱去。
本发明中，“羧基保护基”是指能通过水解、羧基保护基的去保护反应而转化为羧基的保护基。羧基保护基，优选为烷基(例如甲基、乙基、叔丁基)或芳烷基(例如苄基)，更优选为叔丁基(tBu)、甲基(Me)或乙基(Et)。本发明中，“被保护的羧基”是指羧基被适合的羧基保护基保护后所形成的基团，优选为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基。所述羧基保护基可以在酸或碱的催化下水解除去，偶尔也可用热解反应消去，例如叔丁基可以在温和的酸性条件下除去，苄基可以通过氢解脱去。脱除羧基保护基的试剂选自TFA、H2O、LiOH、NaOH、KOH、MeOH、EtOH及其组合，优选为TFA和H2O的组合、LiOH和MeOH的组合、或LiOH和EtOH的组合。被保护的羧基脱保护，从而产生相应的游离酸，所述脱保护在碱存在下进行，所述碱和由所述脱保护形成的所述游离酸形成药学可接受的盐。
本发明中，“氨基保护基”，包含可作为通常的氨基的保护基而使用的所有的基，例如芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基或甲硅烷基等。氨基保护基优选为Boc叔丁氧羰基、Moz对甲氧基苄氧羰基及Fmoc9-芴亚甲氧羰基。脱除氨基保护基的试剂选自TFA、H2O、LiOH、MeOH、EtOH及其组合，优选为TFA和H2O的组合、LiOH和MeOH的组合、或LiOH和EtOH的组合。脱除Boc保护基的试剂为TFA或HCl/EA；优选TFA。脱除Fmoc保护基反应所用的脱保护剂为含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
本发明中，“羧基活化”是指用羧基活化剂对羧基进行活化处理，羧基活化后能够促进缩合反应更好的进行，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。“羧基活化基”是羧基活化剂的残基。所述羧基活化剂为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)中一种或多种的组合，优选为NHS/EDCI、NHS/DCC、HONb/DCC的组合，最优选为NHS/EDCI的组合。
本发明中，“阳离子”是指相应的结构永久地、或非永久地能响应某些条件(例如pH)而带有正电荷。因此，阳离子既包括永久性阳离子，也包括可阳离子化的。永久性阳离子是指相应的化合物或基团或原子在其环境的任何pH值或氢离子活性下均带正电荷。典型地，因季氮原子的存在而产生正电荷。当化合物携带多个这样的正电荷时，它可以被称为永久性阳离子。可阳离子化的是指化合物或基团或原子在较低pH下带正电荷并且在其环境的较高pH下不带电荷。另外，在不能测定pH值的非水性环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在高氢离子浓度下带正电荷并且在低氢离子浓度或活性下不带电荷。它取决于可阳离子化的或可聚阳离子化的化合物的各个性质，特别是相应的可阳离子化基团或原子的pKa，在所述pH或氢离子浓度下它带电荷或不带电荷。在稀释的水性环境中，可以使用所谓的海森巴赫(Henderson-Hasselbalch)方程来估计带有正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的分率，该方程是本领域技术人员公知的。例如，在一些实施例中，如果某化合物或部分是可阳离子化的，则优选的是，它在约1至9，优选地4至9、5至8或甚至6至8的pH值下，更优选地在等于或低于9、等于或低于8、等于或低于7的pH值下，最优选地在生理pH值(例如约7.3至7.4)下，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电荷。在其他实施例中，优选的是，可阳离子化的化合物或部分在生理pH值(例如约7.0-7.4)下主要是中性的，但在较低pH值下变为带正电荷的。在一些实施例中，可阳离子化的化合物或部分的pKa的优选范围是约5至约7。
本发明中，“阳离子脂质”指整体含有正电荷或可电离的脂质。阳离子脂质除了本发明结构通式(1)所示的，还包括但不限于N,N-二油基-N,N-氯化二甲铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-溴化二甲铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(DODMA)、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)和2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)中任一种及其混合物。
本发明中，“聚乙二醇化脂质”指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质除了本发明结构通式(2)所示的，还包括但不限于聚乙二醇-1,2二肉豆蔻酸甘油酯(PEG-DMG)、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、PEG-胆固醇、聚乙二醇-二酰基甘油(PEG-DAG)，聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)，具体地包括聚乙二醇500-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇500-硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇500-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇2000-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)等。
本发明中，“中性脂质”指在选定的pH下以无电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质物质中的任一种，优选为磷脂。此类脂质包括但不限于1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)中任一种及其组合物。中性脂质可以是合成的或天然来源的。
本发明中，“类固醇脂质”选自胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中任一种及其混合物
本发明中，“氨基酸残基”包括从氨基上除去氢原子和/或从羧基上除去羟基和/或从巯基上除去氢原子和/或氨基被保护和/或羧基被保护和/或巯基被保护的氨基酸。不严密地说，氨基酸残基可以被称为氨基酸。本发明中的氨基酸的来源，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以为天然来源，也可以是非天然来源，还可以为两者的混合。本发明中的氨基酸结构类型，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以指L-型，也可以指D-型，还可以为两者的混合。
本发明中的“官能团源”指具有反应活性或具有潜在的反应活性、具有光敏性质或具有潜在的光敏性质、具有靶向性或具有潜在的靶向性。所述“潜在的”，指经过选自包括但不限于官能化修饰(如接枝、取代等)、脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团等的化学过程可以转变为反应性基团，经过光、热、酶、特异结合分子、体内微环境等外界刺激下能发光或产生靶向性。所述发光没有特别限制，包括但不限于可见光、荧光、磷光等。
本发明中的变化形式指经过氧化、还原、水合、脱水、电子重排、结构重排、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、被取代、脱保护、改变离去基团等中任一种化学变化过程，能够转变为目标反应性基团的结构形式。
本发明中“反应性基团的变化形式”，指一个反应性基团经过氧化、还原、水合、脱水、电子重排、结构重排、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、被取代、脱保护、改变离去基团等至少一个化学变化过程后仍具有活性的形式(仍是反应性基团)，或者经过被保护后的非活性形式。
本发明中的“微修饰”，指经过简单的化学反应过程即可完成的化学修饰过程。所述简单的化学反应过程主要指脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、离去基团的转变等化学反应过程，“微变化形式”与“微修饰”相对应，指经历脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、离去基团的转变等简单的化学反应过程后能形成目标反应性基团的结构形式。所述离去基团的转变，如酯形式向酰氯形式的转变。
本发明中，“佐剂或佐剂组分”典型地是可以改变(例如增强)其他药剂(例如药物或疫苗)的功效的(例如药理学或免疫学)药剂或组合物。通常，该术语在本发明的上下文中是指用作免疫原和/或其他药学活性化合物的载剂或辅助物质的化合物或组合物。它应在广义上解释，并且是指能够增加掺入所考虑的佐剂中或与该佐剂共同施用的抗原的免疫原性的广泛物质。在本发明中，佐剂将优选地增强本发明的活性剂的特异性免疫原性作用。典型地，“佐剂”或“佐剂组分”具有相同的含义并且可以互换使用。佐剂可以分为例如免疫增强剂、抗原递送***或甚至其组合。
本发明中，“N/P比”是指阳离子脂质中的氮原子与核酸中磷酸的摩尔比。
本发明中，“核酸”是指DNA或RNA或其修饰的形式，其包含在DNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”)或在RNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，尿嘧啶“U”)。
本发明中，“RNA”是指可能天然存在或非天然存在的核糖核酸。例如，RNA可以包括修饰过的和/或非天然存在的组分，如一个或多个核碱基、核苷、核苷酸或连接子。RNA可以包括帽结构、链终止核苷、茎环、聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。RNA可以具有编码所关注多肽的核苷酸序列。例如，RNA可以是信使RNA(mRNA)。翻译编码特定多肽的mRNA，例如在哺乳动物细胞内部体内翻译mRNA可以产生编码的多肽。RNA可以选自由以下组成的非限制性组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、mRNA、单链向导RNA(sgRNA)、cas9 mRNA及其混合物。
本发明中，反义寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA)可以在体外或体内抑制靶基因和靶蛋白质的表达。
本发明中，FLuc mRNA能表达荧光素酶蛋白，其在萤光素底物的存在下发射出生物光，所以FLuc常用于哺乳动物细胞培养以测量基因表达和细胞活度。
本发明中，“抑制靶基因的表达”指核酸沉默、减少或抑制靶基因表达的能力。为检验基因沉默的程度，使测试样品(例如，表达靶基因的培养基中的细胞样品)接触抑制靶基因表达的核酸。将测试样品或测试动物中的靶基因的表达与未接触或未施用核酸的对照样品(例如，表达靶基因的培养基中的细胞样品)中的靶基因的表达相比较。对照样品中的靶基因的表达可以指定为100％的值。在特定的实施方案中，当测试样品中的靶基因表达水平相对于对照样品或对照哺乳动物中的靶基因表达水平为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，即实现了抑制靶基因的表达。
本发明中，确定靶基因表达水平的方法包括不限于斑点印迹、northern印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及表型测定。
本发明中，“转染”是指将一个物种(例如RNA)引入细胞中。转染可以例如在体外、离体或体内发生。
本发明中，“抗原”典型地是指可以被免疫***识别，优选地被适应性免疫***识别，并且能够触发抗原特异性免疫应答，例如通过作为适应性免疫应答的一部分形成抗体和/或抗原特异性T细胞的物质。典型地，抗原可以是或可以包含可以由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白。在本发明的意义上，抗原可以是所提供的核酸分子(优选地如本文所定义的mRNA)的翻译产物。在此上下文中，包含至少一个表位的肽和蛋白的片段、变体和衍生物也被理解为抗原。
本发明中，“递送”是指将实体提供至目标。例如，将药物和/或治疗剂和/或预防剂递送至受试者，所述受试者为人类和/或其它动物的组织和/或细胞。
本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。具体地，例如赋形剂包括但不限于抗黏附剂、抗氧化剂、黏合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(色素)、缓和剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷墨水、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合用水。更具体地赋形剂包括但不限于丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸氢二钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮(crospovidone)、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸苯酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E(α-生育酚)、维生素C、木糖醇。
本发明的药物组合物可以***地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。
本发明中，疫苗为提供至少一种抗原或抗原功能的预防性或治疗性材料。抗原或抗原功能可以刺激身体的适应性免疫***提供适应性免疫应答。
本发明，治疗，是指为了抵御疾病、障碍或病症而对患者进行的处理和护理，意在包括延迟疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓和症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症。待治疗的患者优选哺乳动物，尤其是人。
1.1.一种阳离子脂质，其特征在于，结构如通式(1)所示：
Figure BDA0003804810810000121
其中，N为氮支化中心；
L1、L2为连接键或二价连接基，所述二价连接基各自独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-O(CRcRc)sO-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种，其中，所述Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基，s为2、3或4；
L3为连接键、-L4-、-Z-L4-Z-、-L4-Z-L5-、-Z-L4-Z-L5-或-L4-Z-L5-Z-；所述L4、L5为碳链连接基，各自独立地为-(CRaRb)t-(CRaRb)o-(CRaRb)p-，其中，t、o、p各自独立地为0-12的整数，且t、o、p不同时为0，Ra和Rb每次出现时各自独立地为氢原子或烷基；所述Z每次出现时各自独立为-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-和
Figure BDA0003804810810000131
中任一种，其中Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
B1、B2各自独立地为连接键或C1-30亚烷基；
R1、R2各自独立地为C2-30脂肪烃基；
R3为氢原子、-Rd、-ORd、-NRdRd、-SRd、-(C＝O)Rd、-(C＝O)ORd、-O(C＝O)Rd、-O(C＝O)ORd或
Figure BDA0003804810810000132
其中，Rd每次出现时各自独立地为C1-12烷基，G1为k+1价的末端支化基团，j为0或1，F含有功能性基团R01，j为0时，G1不存在，j为1时，G1引出k个的F，k为2-8的整数；
A选自-(CRaRb)sO-、-O(CRaRb)s-、-(CRaRb)sS-、-S(CRaRb)s-、-(CRaRb)sO(CRaRb)sS-、-(CRaRb)sS(CRaRb)sO-、-(CRaRb)sNRc(CRaRb)sS-、-(CRaRb)sS(CRaRb)sNRc-、-(CRaRb)sNRc(CRaRb)sO-和-(CRaRb)sO(CRaRb)sNRc-中任一种，其中，s为2、3或4，Ra和Rb每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
当A为-(CRaRb)sO-或-O(CRaRb)s-时，n为2-6的整数；当A不为-(CRaRb)sO-或-O(CRaRb)s-时，n为1-6的整数；
所述烷基、亚烷基、烷氧基、脂肪烃基各自独立地为取代的或未取代的。
1.1.1.L1、L2、L3、L4、L5、L7、L8、Z、Z1、Z2
本发明中，L1、L2、L3、L4、L5、L7、L8、Z、Z1、Z2的结构没有特别限制，各自独立地包括但不限于直链结构、支链结构或含环状结构。
本发明中，L1、L2、L3、L4、L5、L7、L8、Z、Z1、Z2的非氢原子数没有特别限制，各自独立地优选1～50个非氢原子；更优选1～20个非氢原子；更优选1～10个非氢原子。所述非氢原子为碳原子或杂原子。所述杂原子包括但不限于O、S、N、P、Si、B等。非氢原子的个数为1时，非氢原子可以为碳原子或杂原子。非氢原子的个数大于1时，非氢原子的种类没有特别限制；可以为1种，也可以为2种或2种以上；非氢原子的个数大于1时，可以为碳原子与碳原子、碳原子与杂原子、杂原子与杂原子中任一种组合。
本发明中，两个相同或不同的反应性基团经反应可形成二价连接基。其反应条件，与反应生成的二价连接基类型有关，可采用现有公开技术。例如：氨基分别与活性酯、甲酸活性酯、磺酸酯、醛、α,β-不饱和键、羧酸基团、环氧化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯反应得到酰胺基、尿烷基、氨基、亚胺基(可进一步还原成仲氨基)、氨基、酰胺基、氨基醇、脲键、硫脲键等二价连接基；巯基分别与含有活性酯、甲酸活性酯、磺酸酯、巯基、马来酰亚胺、醛、α,β-不饱和键、羧酸基团、碘代乙酰胺、酸酐反应得到硫酯基、硫代碳酸酯、硫醚、二硫化物、硫醚、硫代半缩醛、硫醚、硫酯、硫醚、酰亚胺等二价连接基；不饱和键与巯基反应得到硫醚基；羧基或酰卤分别与巯基、氨基反应得到硫酯基、酰胺基等基团；羟基与羧基、异氰酸酯、环氧化物、氯甲酰氧基反应得到酯基、氨基甲酸酯基、醚键、碳酸酯基等二价连接基；羰基或醛基与氨基、肼、酰肼反应得到亚胺键、腙、酰腙等二价连接基；叠氮、炔基、烯基、巯基、叠氮、二烯、马来酰亚胺、1,2,4-***啉-3,5-二酮、二硫代酯、羟胺、酰肼、丙烯酸酯、烯丙基氧基、异氰酸酯、四氮唑等反应性基团发生点击化学反应可生成含包括但不限于三氮唑、异恶唑、硫醚键等结构的各种二价连接基。
L1、L2、L3、L4、L5、L7、L8、Z、Z1、Z2的稳定性没有特别限制，当中任一个二价连接基或任一个与相邻杂原子基团组成的二价连接基各自独立地为可稳定存在的连接基STAG或可降解的连接基DEGG。
1.1.1.1.L1、L2
本发明中，L1、L2为连接键或二价连接基，所述二价连接基各自独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种，所述Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基。
本发明的一种具体实施方案中，更优选L1、L2各自独立地为连接键、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-O(CH2)sO-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O-、-SC(＝O)NH-和-NHC(＝O)S-中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，更优选L1、L2其中一个为连接键，另一个为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-O(CH2)sO-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O-、-SC(＝O)NH-和-NHC(＝O)S-中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，更优选L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-O(CH2)sO-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O-、-SC(＝O)NH-和-NHC(＝O)S-中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，更优选L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)O-中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，更优选L1和L2同时为-O(C＝O)-或同时为-(C＝O)O-或同时为-O(C＝O)O-。
本发明的一种具体实施方案中，Rc优选为氢原子；或者Rc优选为C1-12烷基，更优选为C1-8烷基，更优选为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基中任一种。
1.1.1.2.L7、L8
本发明中，L7、L8各自独立地为连接键或二价连接基，所述二价连接基选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种，所述Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基。
本发明的一种具体实施方案中，Rc优选为氢原子；或者Rc优选为C1-12烷基，更优选为C1-8烷基，更优选为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基中任一种。
1.1.1.3.L3
本发明中，L3为-L4-、-Z-L4-Z-、-L4-Z-L5-、-Z-L4-Z-L5-或-L4-Z-L5-Z-；所述L4、L5为碳链连接基，各自独立地为-(CRaRb)t-(CRaRb)o-(CRaRb)p-，其中，t、o、p各自独立地为0-12的整数，Ra和Rb每次出现时各自独立地为氢原子或烷基；所述Z每次出现时各自独立为-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-和
Figure BDA0003804810810000141
中任一种，其中Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基。
本发明的一种具体实施方案中，Rc优选为氢原子。
本发明的一种具体实施方案中，L3为-(CH2)t-、-(CH2)tZ-、-Z(CH2)t-、-(CH2)tZ(CH2)t-和-Z(CH2)tZ-中任一种，其中，t为1-12的整数，Z为-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-和
Figure BDA0003804810810000151
中任一种。优选L3为-(CH2)t-、-(CH2)tO-、-(CH2)tC(＝O)-、-(CH2)tC(＝O)O-、-(CH2)tOC(＝O)-、-(CH2)tC(＝O)NH-、-(CH2)tNHC(＝O)-、-(CH2)tOC(＝O)O-、-(CH2)tNHC(＝O)O-、-(CH2)tOC(＝O)NH-、-(CH2)tNHC(＝O)NH-、-O(CH2)t-、-C(＝O)(CH2)t-、-C(＝O)O(CH2)t-、-OC(＝O)(CH2)t-、-C(＝O)NH(CH2)t-、-NHC(＝O)(CH2)t-、-OC(＝O)O(CH2)t-、-NHC(＝O)O(CH2)t-、-OC(＝O)NH(CH2)t-、-NHC(＝O)NH(CH2)t-、-(CH2)tO(CH2)t-、-(CH2)tC(＝O)(CH2)t-、-(CH2)tC(＝O)O(CH2)t-、-(CH2)tOC(＝O)(CH2)t-、-(CH2)tC(＝O)NH(CH2)t-、-(CH2)tNHC(＝O)(CH2)t-、-(CH2)tOC(＝O)O(CH2)t-、-(CH2)tNHC(＝O)O(CH2)t-、-(CH2)tOC(＝O)NH(CH2)t-、-(CH2)tNHC(＝O)NH(CH2)t-、-O(CH2)tO-、-C(＝O)(CH2)tC(＝O)-、-C(＝O)O(CH2)tC(＝O)O-、-OC(＝O)(CH2)tOC(＝O)-、-C(＝O)O(CH2)tOC(＝O)-、-OC(＝O)(CH2)tC(＝O)O-、-OC(＝O)O(CH2)tOC(＝O)O-、-C(＝O)NH(CH2)tC(＝O)NH-、-NHC(＝O)(CH2)tNHC(＝O)-、-NHC(＝O)(CH2)tC(＝O)NH-、-C(＝O)NH(CH2)tNHC(＝O)-、-NHC(＝O)O(CH2)tNHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH(CH2)tOC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O(CH2)tOC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH(CH2)tNHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH(CH2)tNHC(＝O)NH-、-C(＝O)(CH2)tO-、-C(＝O)(CH2)tC(＝O)O-、-C(＝O)(CH2)tOC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)tOC(＝O)O-、-C(＝O)(CH2)tNHC(＝O)O-、-C(＝O)(CH2)tOC(＝O)NH-和-C(＝O)(CH2)tNHC(＝O)NH-中任一种。
1.1.2.可稳定及可降解基团的说明
本发明中的可稳定存在的连接基STAG或可降解的连接基DEGG，可存在于上述L3、L4、L5、L7、L8、Z、Z1、Z2中任一种二价连接基，或存在于任一种二价连接基与相邻杂原子基团组成的二价连接基。
1.1.2.1.本发明中可稳定存在的二价连接基STAG
可稳定存在的二价连接基STAG可稳定存在的条件没有特别限制，在包括但不限于光、热、低温、酶、氧化还原、酸性、碱性条件、生理条件、体外模拟环境等任一条件下可稳定存在，优选在光、热、酶、氧化还原、酸性、碱性等任一条件下可稳定存在。
可稳定存在的二价连接基STAG的类型没有特别限制，包括但不限于亚烷基、二价杂烷基、双键、三键、二价二烯基、二价环烷基、二价环烯基、二价环烯烃基、二价环炔烃基、芳环、脂杂环、杂苯环、芳并杂环、杂稠杂环、取代的亚烷基、取代的杂烷基、取代的二价杂烷基、取代的双键、取代的三键、取代的二烯、取代的二价环烷基、取代的二价环烯基、取代的二价环烯烃基、取代的二价环炔烃基、取代的芳环、取代的脂杂环、取代的杂苯环、取代的芳并杂环、取代的杂稠杂环、醚键、硫醚键、脲键、硫脲键、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、-P(＝O)-、不含活泼氢的二价硅基、含硼原子的二价连接基、仲氨基、叔氨基、羰基、硫代羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、烯胺基、三氮唑、4,5-二氢异恶唑、氨基酸及其衍生物骨架中任一种二价连接基、任两种或任两种以上基团构成的稳定二价连接基。
具体地，可稳定存在的二价连接基STAG包括但不限于文献CN104530413A、CN104530415A、CN104530417A中所描述及列举的结构。以CN104530417A为例，对应段[0627]～[0704]。两种或两种以上可稳定存在的二价连接基组合成STAG的方式没有特别限制。包括但不限于CN104530417A的段[704]。
1.1.2.2.本发明中可降解的二价连接基DEGG
可降解的二价连接基DEGG可降解的条件没有特别限制，在包括但不限于光、热、低温、酶、氧化还原、酸性、碱性、生理条件、体外模拟环境等任一条件下可降解，优选在光、热、酶、氧化还原、酸性、碱性等任一条件下可降解。
由任一种可降解的二价连接基DEGG与任一种可稳定存在的二价连接基STAG组合而成的二价连接基仍为一种可降解的连接基。对于含芳环的可降解的二价连接基，还可由芳环与可降解的二价连接基组合而成。
可降解的二价连接基DEGG的类型没有特别限制，包括但不限于含有二硫键、乙烯醚键、酯基、硫酯基、硫代酯基、二硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、二硫代氨基甲酸酯基、缩醛、环缩醛、缩硫醛、氮杂缩醛、氮杂环缩醛、氮硫杂缩醛、二硫代缩醛、半缩醛、硫代半缩醛、氮杂半缩醛、缩酮、缩硫酮、氮杂缩酮、氮杂环缩酮、氮硫杂缩酮、亚胺键、腙键、酰腙键、肟键、硫肟醚基、半卡巴腙键、硫代半卡巴腙键、肼基、酰肼基、硫代碳酰肼基、偶氮羰酰肼基、硫代偶氮羰酰肼基、肼基甲酸酯基、肼基硫代甲酸酯基、卡巴肼、硫代卡巴肼、偶氮基、异脲基、异硫脲基、脲基甲酸酯基、硫脲基甲酸酯基、胍基、脒基、氨基胍基、氨基脒基、亚氨酸基、亚氨酸硫酯基、磺酸酯基、亚磺酸酯基、磺酰肼基、磺酰脲基、马来酰亚胺、原酸酯基、磷酸酯基、亚磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、磷硅烷酯基、硅烷酯基、碳酰胺、硫代酰胺、磺酰胺基、聚酰胺、磷酰胺、亚磷酰胺、焦磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、硫代磷酰胺、乌头酰基、多肽片段、核苷酸及其衍生物骨架、脱氧核苷酸及其衍生物骨架中任一种二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合。
这里的氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、碳酰胺、磷酰胺等即可以作为可稳定存在的连接基，也可以作为可降解的连接基。因其使用的环境特点而异。
具体地，可降解的二价连接基DEGG包括但不限于文献CN104530413A、CN104530415A、CN104530417A中所描述及列举的结构。以CN104530417A为例，对应段[705]～[0725]。
1.1.3.B1、B2、B3、B4
本发明中，B1、B2各自独立地为连接键或C1-30亚烷基。
本发明的一种实施方案中，优选B1、B2各自独立地为连接键或者C1-20亚烷基；更优选B1、B2其中一个为连接键，另一个为C1-20亚烷基；更优选B1、B2各自独立地为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、亚十一烷基、亚十二烷基、亚十三烷基、亚十四烷基、亚十五烷基、亚十六烷基、亚十七烷基、亚十八烷基、亚十九烷基、亚二十烷基中任一种。
本发明中，B3、B4各自独立地为连接键或C1-12亚烷基。
1.1.4.R1、R2
本发明中，R1、R2各自独立地为C1-30脂肪烃基。
本发明的一种具体施方案中，优选R1、R2各自独立地为C5-30脂肪烃基，更优选为C10-30脂肪烃基，最优选为C10-20脂肪烃基。
本发明中的一种具体实施方案中，优选R1、R2各自独立地为直链状烷基、支链状烷基、直链状烯基、支链状烯基、直链状炔基或支链状炔基；优选为直链状烷基；更优选各自独立地为C1-25直链状烷基；更优选各自独立地为C1-17直链状烷基；最优选各自独立地为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、(Z)-十三烷-8-烯基、(Z)-十四烷-9-烯基、(Z)-十五烷-8-烯基、(Z)-十六烷-9-烯基、(Z)-十七烷-5-烯基、(Z)-十七烷-8-烯基、(E)-十七烷-8-烯基、(Z)-十七烷-10-烯基、(8Z,11Z)-十七烷-8,11-二烯基、(Z)-十八烷-6-烯基、(Z)-十八烷-9-烯基、(E)-十八烷-9-烯基、(Z)-十八烷-11-烯基、(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八烷-9,12,15-三烯基、(8Z,11Z,14Z)-十八烷-8,11,14-三烯基、(Z)-二十烷-11-烯基、(11Z,14Z)-二十烷-11,14-二烯基、(Z)-十九烷-10-烯基、(10Z,13Z)-十九烷-10,13-二烯基、2,6,10-三甲基十一烷-1,5,9-三烯基、3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六烷-2-烯基十三烷基中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，优选R1、R2各自独立地为支链状烷基、支链状烯基或支链状炔基，各自独立地为
Figure BDA0003804810810000171
其中，Re、Rf各自独立地为C1-C15烷基、C2-C15烯基和C2-C15炔基中任一种；更优选各自独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、烯丁基、戊烯基、烯戊基、己烯基、烯己基、庚烯基、烯庚基、辛烯基、烯辛基、壬烯基、烯壬基、癸烯基、烯癸基、乙炔基、丙炔基、炔丙基、丁炔基、炔丁基、戊炔基、炔戊基、己炔基、炔己基、庚炔基、炔庚基、辛炔基、炔辛基、壬炔基、炔壬基、癸炔基和炔癸基中任一种；更优选各自独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基中任一种。进一步优选R1、R2各自独立地选自以下结构中任一种：
Figure BDA0003804810810000172
Figure BDA0003804810810000181
Figure BDA0003804810810000182
其中，t为0-12的整数，优选t为0或1-12的整数。
1.1.5.R3、R
本发明中，R3为氢原子、-Rd、-ORd、-NRdRd、-SRd、-(C＝O)Rd、-(C＝O)ORd、-O(C＝O)Rd、-O(C＝O)ORd或
Figure BDA0003804810810000183
其中，Rd每次出现时各自独立地为C1-12烷基，G1为k+1价的末端支化基团，j为0或1，F含有功能性基团R01，j为0时，G1不存在，j为1时，G1引出k个的F，k为2-8的整数。
本发明中，R为氢原子、烷基、烷氧基、-(C＝O)Rd、-(C＝O)ORd、-O(C＝O)Rd、-O(C＝O)ORd或
Figure BDA0003804810810000184
其中，Rd为C1-12烷基，G1为k+1价的末端支化基团，j为0或1，F含有功能性基团，j为0时，G1不存在，j为1时，G1引出k个的F，k为2-8的整数。
1.1.5.1.Rd
本发明中，Rd每次出现时各自独立地为C1-12烷基。
本发明的一种具体实施方案中，Rd优选为C1-8烷基，具体地，Rd优选为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基。
1.1.5.2.G1
本发明中，j为0或1，j为0时，G1不存在，j为1时，G1存在，为k+1价的末端支化基团，引出k个含有功能性基团的F，其中，k为2-8的整数，优选k为2、3或4。
本发明的一种具体实施方案中，优选G1为三价或三价以上的支化基团时，优选G1为三价支化基团或四价支化基团；优选G1为三价支化基团；更优选G1为甘油、氨基酸残基的三价支化基团。
1.1.5.3.含有功能性基团R01的F
本发明的一种具体实施方案中，优选F的结构为-(Z2)q-(Z1)q1-R01，其中，q、q1各自独立地为0或1；Z1、Z2各自独立地为二价连接基；R01为能与生物相关物质相互反应的功能性基团。
本发明的一种更具体的实施方案中，R01优选自：反应性基团、反应性基团的变化形式、具有治疗靶向性的功能性基团、荧光性功能性基团；其中，所述变化形式包括反应性基团的前体、以其作为前体的活性形式、被取代的活性形式、被保护的形式、脱保护形式中任一种变化形式；其中，所述反应性基团的前体指经过氧化、还原、水合、脱水、电子重排、结构重排、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化中至少一个过程，可转变为该反应性基团的结构；其中，所述反应性基团的变化形式，指一个反应性基团经过氧化、还原、水合、脱水、电子重排、结构重排、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、被取代、脱保护中至少一个过程后仍具有活性的形式，或经过被保护后的非活性形式。
1.1.5.4.R3的具体举例
本发明的一种具体实施方案中，R优选含有氢原子、烷基、烷氧基、醇羟基、被保护的醇羟基、硫醇羟基、被保护的硫醇羟基、羧基、被保护的羧基、氨基、被保护的氨基、醛基、被保护的醛基、酯基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、被保护的马来酰亚胺基、二甲基氨基、烯基、烯酸酯基、叠氮基、炔基、叶酸基、罗丹明基和生物素基中任一种；更优选含有H、-(CH2)tOH、-(CH2)tSH、-OCH3、-OCH2CH3、-(CH2)tNH2、-(CH2)tC(＝O)OH、-C(＝O)(CH2)tC(＝O)OH、-C(＝O)CH3、-(CH2)tN3、-C(＝O)CH2CH3、-C(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-(CH2)tN(CH3)2、-(CH2)tCHO、
Figure BDA0003804810810000191
Figure BDA0003804810810000192
1.1.5.5.R3到氮支化中心的原子间隔
化合物中碳链长短，两个基团的原子间隔对化合物的性能有重大的影响。
本发明的一种具体实施方案中，R3到氮支化中心N的原子间隔数大于或等于6，优选为6-50，更优选为6-35，更优选为6-25，最优选为6-15。
具体举例，实施例1中R3(氢原子)到氮支化中心N的原子间隔为-CH2CH2OCH2CH2O-，则R3到氮支化中心N的原子间隔数为6；实施例2中，实施例4中，R3(-OH)到氮支化中心N的原子间隔为-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，则R3到氮支化中心N的原子间隔数为8；实施例8中，R3(氢原子)到氮支化中心N的原子间隔为-CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2OCH2CH2O-，则R3到氮支化中心N的原子间隔数为10。
1.1.6.A
本发明中，A选自-(CRaRb)sO-、-O(CRaRb)s-、-(CRaRb)sS-、-S(CRaRb)s-、-(CRaRb)sO(CRaRb)sS-、-(CRaRb)sS(CRaRb)sO-、-(CRaRb)sNRc(CRaRb)sS-、-(CRaRb)sS(CRaRb)sNRc-、-(CRaRb)sNRc(CRaRb)sO-和-(CRaRb)sO(CRaRb)sNRc-中任一种，其中，s为2、3或4，Ra、Rb和Rc各自独立地为氢原子或C1-12烷基。
本发明的一种具体实施方案中，A优选为-CH2CH2O-、-OCH2CH2-、-CH(CH3)CH2O-、-OCH(CH3)CH2-、-CH2CH2S-、-SCH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2NH-、-CH2CH2SCH2CH2O-或-CH2CH2OCH2CH2S-，更优选为-CH2CH2O-、-OCH2CH2-、-CH2CH2SCH2CH2O-或-CH2CH2OCH2CH2S-，最优选为-CH2CH2O-或-OCH2CH2-。
1.1.7.具体的结构通式举例
本发明的一种具体实施方案中，当结构通式(1)中的A为-CH2CH2O-、-OCH2CH2-、-CH(CH3)CH2O-、-OCH(CH3)CH2-、-CH2CH2S-、-SCH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2NH-、-CH2CH2SCH2CH2O-或-CH2CH2OCH2CH2S-时，本发明的阳离子脂质的结构优选满足以下结构式中任一种：
Figure BDA0003804810810000201
Figure BDA0003804810810000202
其中，L1、L2、L3、B1、B2、R1、R2、R3、n的定义与通式(1)中所述的一致。
本发明的一种具体实施方案中，当结构通式(1)中的L1、L2各自独立地为连接键、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-O(CH2)sO-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O-、-SC(＝O)NH-和-NHC(＝O)S-中任一种时，本发明的阳离子脂质的结构优选满足以下结构式中任一种：
Figure BDA0003804810810000203
Figure BDA0003804810810000211
Figure BDA0003804810810000221
Figure BDA0003804810810000222
其中，L3、B1、B2、R1、R2、R3、A、n的定义与通式(1)中所述的一致，式(2-1)到式(2-10)中，B1和B2都不为连接键，式(2-22)中B1为连接键；所述A优选为-CH2CH2O-、-OCH2CH2-、-CH2CH2S-、-SCH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2NH-、-CH2CH2SCH2CH2O-和-CH2CH2OCH2CH2S-中任一种，更优选为-CH2CH2O-、-OCH2CH2-、-CH2CH2NHCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2NH-、-CH2CH2SCH2CH2O-和-CH2CH2OCH2CH2S-中任一种。
1.1.8.具体的结构举例
本发明的一些具体实施方案，最终得到了结构如下所示的阳离子脂质，包括但不限于以下结构中任一种：
Figure BDA0003804810810000231
Figure BDA0003804810810000241
Figure BDA0003804810810000251
Figure BDA0003804810810000261
2.阳离子脂质的制备
本发明中，前述的任一种阳离子脂质的制备可以采用包括但不限于以下的方法：
2.1.方法1：
步骤一、用羧基活化剂对含有裸露羧基的酸A-1或A-1’的羧基端进行活化得到羧基端活化的酯A-2或A-2’，其中，B1’、B2’各自独立地为连接键或比B1、B2少一个亚甲基的亚烷基；R1’、R2’各自独立地为R1、R2或比R1、R2少一个亚甲基的脂肪烃基；R7为羧基活化基,且当B1’、L1中任一个不为连接键时，R1’为R1，当B1’、L1都为连接键时，R1’为比R1少1个亚甲基的脂肪烃基，当B2’、L2中任一个不为连接键时，R2’为R2，当B2’、L2都为连接键时，R2’为比R2少1个亚甲基的脂肪烃基；
步骤二：将羧基端活化的酯A-2或A-2’与含有氮源端基的伯胺衍生物A-3或A-3’进行缩合反应得到酰胺中间体A-4或A-4’；
步骤三：用还原剂将酰胺中间体A-4或A-4’还原为仲胺中间体A-5或A-5’；
步骤四：将仲胺中间体与双端官能化小分子A-6进行偶合反应得到阳离子脂质衍生物A-7或A-7’；其中，A-6两端的官能团可以相同或不同；其中，A-6的R3’端含有反应性基团R01或含有R01的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R01的基团；其中，A-6的F1含有活性官能团，能与仲胺中间体A-5或A-5’的氨基反应生成支化中心氮原子和二价连接基L3；
当R3’等于R3时，所得结构A-7或A-7’即对应通式(1)所示的结构；
当R3’不等于R3时，A-7或A-7’经末端微修饰得到A-8或A-8’对应通式(1)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团。
步骤一
Figure BDA0003804810810000271
步骤二
Figure BDA0003804810810000272
步骤三
Figure BDA0003804810810000273
步骤四
Figure BDA0003804810810000274
其中，L3、L1、L2、B1、B2、R3、R1、R2和n与通式(1)中所述的一致，这里就不再赘述。
本发明的一种具体实施方案中，前述方法1中A-1优选为R1’-COOH或者R2’-COOH，所述A-3优选为R1-NH2或者R2-NH2，所述羧基活化剂优选为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)中任一种，所述阳离子脂质优选采用以下路线进行制备：
Figure BDA0003804810810000281
2.2.方法2：
步骤一、将双端官能化小分子B-1与含有氮源端基的伯氨衍生物B-2或B-2’进行偶合反应得到仲胺衍生物B-3或B-3’；其中B-1两端的官能团可以相同或不同，B-1的R3’端含有反应性基团R01或含有R01的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R01的基团；其中，F1含有活性官能团，能与伯胺B-2或B-2’的氨基反应生成含有二价连接基L3的仲胺衍生物B-3或B-3’；
步骤二、仲胺衍生物B-3或B-3’与含有反应性基团FN的化合物B-4或B-4’进行烷基反应得到阳离子脂质衍生物B-5或B-5’；所述FN为能与氨基或者仲胺基反应的反应性基团，优选为-OMs、-OTs、-CHO、-F、-Cl、-Br；
当R3’等于R3时，所得结构B-5或B-5’即对应通式(1)所示的结构；
当R3’不等于R3时，将B-5或B-5’进行末端微修饰得到B-6或B-6’对应通式(1)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团。
步骤一
Figure BDA0003804810810000291
步骤二
Figure BDA0003804810810000292
其中，L3、L1、L2、B1、B2、R3、R1、R2和n与通式(1)中所述的一致，这里就不再赘述。
本发明的一种具体实施方案中，前述方法2中的B-3或B-3’为R1-NH2或者R2-NH2，所述B-4或B-4’为R2-L2-B2-Br或R1-L1-B1-Br，所述F1含有-OMS基。
2.3.方法3：
步骤一、将小分子C-1与小分子C-2反应生成含有二价连接基L1、一端为反应性基团FN、一端为脂肪烃基R1的小分子中间体C-3；其中，F3和F4各自独立地为反应性基团，能反应生成二价连接基L1；其中C-2为含有异官能团对F3和FN，所述FN为能与氨基或者仲胺基反应的反应性基团，优选为-OMs、-OTs、-CHO、-F、-Cl、-Br；
步骤二、两分子的小分子中间体C-3与含有氮源端基的伯氨衍生物C-4进行烷基化反应得到阳离子脂质C-5，其中，R3’端含有反应性基团R01或含有R01的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R01的基团；
当R3’等于R3时，所得结构C-5即对应通式(1)所示的结构；
当R3’不等于R3时，将C-5进行末端微修饰得到C-6对应通式(1)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团；其中，R1和R2相同，B1和B2相同，L1和L2相同。
其中，L3、L1、L2、B1、B2、R3、R1、R2和n与通式(1)中所述的一致，这里就不再赘述。
步骤一
Figure BDA0003804810810000301
步骤二
Figure BDA0003804810810000302
2.4.方法4：
步骤一、将小分子D-1与小分子D-2反应生成含有二价连接基L1、一端为羟基、一端为脂肪烃基R1的小分子中间体D-3；其中，F3和F4各自独立地为反应性基团，能反应生成二价连接基L1；其中D-2含有异官能团对F3和羟基；
步骤二、将小分子中间体D-3的羟基氧化成醛基，得到含有醛基的小分子中间体D-4，其中，B1’为比B1少一个亚甲基的亚烷基；
步骤三、将两分子含有醛基的小分子中间体D-4与含有氮源端基的伯氨衍生物D-5进行加成反应得到阳离子脂质D-6，其中，R3’端含有反应性基团R01或含有R01的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R01的基团；
当R3’等于R3时，所得结构D-6即对应通式(1)所示的结构；
当R3’不等于R3时，将D-6进行末端微修饰得到D-7对应通式(1)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团，其中，R1和R2相同，B1和B2相同，L1和L2相同。
步骤一
Figure BDA0003804810810000303
步骤二
Figure BDA0003804810810000304
步骤三
Figure BDA0003804810810000311
其中，L3、L1、L2、B1、B2、R3、R1、R2和n与通式(1)中所述的一致，这里就不再赘述。
2.5.制备过程中相关原料和/或步骤的说明
2.5.1.羧基活化剂、缩合剂、氧化剂、还原剂
本发明中，“羧基活化”是指用羧基活化剂对羧基进行活化处理，羧基活化后能够促进缩合反应更好的进行，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。“羧基活化基”是羧基活化剂的残基。所述羧基活化剂为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)中一种或多种的组合，优选为NHS/EDCI、NHS/DCC、HONb/DCC的组合，最优选为NHS/EDCI的组合。
本发明中，反应用到的缩合剂并不限制，但优选N,N’-二环己基羰二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，最优选为DCC。而一般缩合剂的用量为羧酸摩尔当量的1至20倍，优选为5-10倍，这个反应可以加入适当的催化剂(如4-二甲基氨基吡啶)。
本发明中，反应用到的氧化剂没有特别限制，只要能使底物的化合价升高的化合物或多种化合物的组合，优选苯基碘二(三氟乙酸酯)、1,4-苯醌、苄基三甲基三溴化铵、重铬酸吡啶盐、重铬酸钾、臭氧、氧气、次氟酸、次氯酸钠、醋酸高钴、醋酸钴、醋酸锰、醋酸鈀、醋酸铜、单过氧邻苯二甲酸、碘、N-碘代丁二酰亚胺、碘酰苯、2-碘酰苯甲酸、二甲基二氧环丙烷、二甲亚砜-草酰氯、二甲亚砜-醋酸酐、DDQ、二氯三(三苯基膦)钌、二氧化锰、二乙酰氧基碘苯、高碘酸、高碘酸钠、高碘酸钠-四氧化锇、高锰酸钾、高硼酸钠、过氧苯甲酸、过氧化二苯甲酰、过氧化镍、过氧化氢、过氧化氢异丙苯、过氧叔丁醇、过氧乙酸、间氯过氧苯甲酸、N-氯代丁二酰亚胺、氯铬酸吡啶、氯化鈀-氯化铜、尿素过氧化氢复合物、三苯基甲基四氟硼酸盐、三丁基氧化锡、三氟化钴、三氟氧钒、三氧化铬、三乙酸锰、TEMPO、硝酸铈铵、溴、N-氧化吡啶、氧化银、O-乙基过氧碳酸、乙酰丙酮锰、乙酰丙酮氧钒、异丙醇铝、过硫酸氢钾、二氯碘苯等中的一种或其组合，更优选氧气、次氯酸钠、双氧水、二氯碘苯、过硫酸氢钾等的一种或其组合，氧化剂的量为中间体化合物中羟基摩尔当量的1至50倍，优选1至20倍，更优选5至10倍。
本发明中，反应用到的还原剂没有特别限制，只要能将氨与醛或酮生成的希夫碱还原成氨基即可；优选硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷、二硼烷、二异丁基氢化铝、二异松莰基硼烷、硼氢化锂、硼氢化锌、硼烷-吡啶、硼烷-甲硫醚、硼烷-四氢呋喃等中的一种或组合；更优选氰基硼氢化钠，还原剂的当量为待修饰氨基摩尔当量的1至50倍，优选1至20倍，更优选5至10倍。
本发明中，反应温度为0至200℃，优选0至100℃，更优选为0至25℃，反应时间优选为10分钟至48小时，更优选为30分钟至24小时。得到的产物可通过萃取、重结晶、吸附处理、沉淀、反沉淀、薄膜透析或超临界提取等纯化方法加以纯化。
本发明中，反应的溶剂可以是无溶剂或非质子性溶剂，非质子性溶剂包括甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、***、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，优选四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺。
本发明中，反应用到的碱一般为有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、咪唑或二异丙基乙基胺)，优选三乙胺、吡啶。碱的用量为羧酸的摩尔当量的1至50倍，优选为1至10倍，更优选为2至3倍。
2.5.2.反应过程中涉及相关基团的“保护”和“脱保护”
本发明中，反应过程中还涉及相关基团的“保护”和“脱保护”过程。为防止该官能基对反应产生影响，通常对官能基进行保护。并且，官能基为2个以上时，选择性地仅使目标官能基进行反应，因此对其他官能基进行保护。保护基不仅稳定地保护作为对象的官能基，根据需要，还需轻松地被去除。因此在有机合成中，在适当的条件下仅将与指定的官能基键合的保护基脱保护是很重要的。
本发明中，“羧基保护基”是指能通过水解、羧基保护基的去保护反应而转化为羧基的保护基。羧基保护基，优选为烷基(例如甲基、乙基、叔丁基)或芳烷基(例如苄基)，更优选为叔丁基(tBu)、甲基(Me)或乙基(Et)。本发明中，“被保护的羧基”是指羧基被适合的羧基保护基保护后所形成的基团，优选为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基。所述羧基保护基可以在酸或碱的催化下水解除去，偶尔也可用热解反应消去，例如叔丁基可以在温和的酸性条件下除去，苄基可以通过氢解脱去。脱除羧基保护基的试剂选自TFA、H2O、LiOH、NaOH、KOH、MeOH、EtOH及其组合，优选为TFA和H2O的组合、LiOH和MeOH的组合、或LiOH和EtOH的组合。被保护的羧基脱保护，从而产生相应的游离酸，所述脱保护在碱存在下进行，所述碱和由所述脱保护形成的所述游离酸形成药学可接受的盐。
本发明中，“氨基保护基”，包含可作为通常的氨基的保护基而使用的所有的基，例如芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基或甲硅烷基等。氨基保护基优选为Boc叔丁氧羰基、Moz对甲氧基苄氧羰基及Fmoc9-芴亚甲氧羰基。脱除氨基保护基的试剂选自TFA、H2O、LiOH、MeOH、EtOH及其组合，优选为TFA和H2O的组合、LiOH和MeOH的组合、或LiOH和EtOH的组合。脱除Boc保护基的试剂为TFA或HCl/EA；优选TFA。脱除Fmoc保护基反应所用的脱保护剂为含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
本发明中，所述被羟基保护基保护的羟基没有特别限制，例如可以为醇羟基、酚羟基等的羟基。其中，所述由氨基保护基的氨基没有特别限制，例如可以来自伯胺、仲胺、联胺、酰胺等。本发明中氨基没有特别限制，包括但不限于伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵离子。
本发明中，被保护羟基的脱保护与羟基保护基的类型有关。所述羟基保护基的类型没有特别限制，以苄基、硅醚、缩醛、叔丁基对末端羟基进行保护为例，相应的脱保护方法有：
A：苄基的脱保护
苄基脱保护可以利用氢化还原剂和氢供体的氢化作用来实现，在这个反应体系中的含水量应小于1％，反应才能顺利进行。
氢化还原催化剂没有限制，优选为钯和镍，但是并不限制载体，但优选氧化铝或碳，更优选碳。钯的用量为含被保护羟基化合物的1至100wt％，优选为含被保护羟基化合物的1至20％wt％。
反应溶剂没有特别的限制，只要原料和产物均可以溶剂即可，但优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃，乙酸；更优选甲醇。并不特别限制氢供体，但优选氢气、环己烯、2-丙醇、甲酸铵等。反应温度优选为25至40℃。反应时间没有特别限制，反应时间与催化剂的用量成负相关，优选为1至5个小时。
B：缩醛、缩酮的脱保护
用于这类羟基保护的缩醛或缩酮化合物优选乙基乙烯基醚、四氢吡喃、丙酮、2,2-二甲氧基丙烷、苯甲醛等。而这类缩醛、缩酮的脱保护通过在酸性条件下实现，溶液pH优选0至4。酸没有特别限制，但优选乙酸、磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，更优选盐酸。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选水。反应温度优选0至30℃。
C：硅醚的脱保护
用于这类羟基保护的化合物包括三甲基硅醚、三乙基硅醚、二甲基叔丁基硅醚、叔丁基二苯基硅醚等。而这类硅醚的脱保护通过含氟离子的化合物，优选四丁基氟化铵、四乙基氟化铵、氢氟酸、氟化钾，更优选四丁基氟化铵、氟化钾。含氟试剂的用量在被保护羟基的摩尔当量的5至20倍，优选8至15倍引发剂，如果含氟的用量小于5倍被保护羟基的摩尔当量，会导致脱保护不完全；当脱保护试剂的用量大于20倍被保护羟基的摩尔当量，过量的试剂或化合物给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，从而引起副反应。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选非质子性溶剂，更优选四氢呋喃、二氯甲烷。反应温度优选0至30℃，当温度低于0℃，反应速度较慢，不能完全脱除保护基。
D：叔丁基的脱保护
叔丁基的脱保护在酸性条件下进行，溶液pH优选0至4。酸没有特别限制，但优选乙酸、磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，更优选盐酸。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选水。反应温度优选0至30℃。
末端的官能化方法中，优选q＝0，q1＝1，Z1为1,2-亚甲基。当q不为0，A与R01之间具有如氨基酸、琥珀酰基等连接基时，可采用本技术领域可生成Z2或Z1的现有技术(包括但不限于烷基化、缩合、click反应等等)，并参照下述的线性官能化放进行制备。
2.5.3.烷基化反应
本发明的烷基化反应优选基于羟基、巯基或氨基的烷基化的反应，依次对应于醚键、硫醚键、仲氨基或叔氨基的形成。举例如下：
2.5.3.1.底物醇与磺酸酯、卤代物发生烷基化
在碱的存在下，由底物醇与磺酸酯衍生物、卤代物亲核取代得到胺中间体。其中，磺酸酯、卤代物的摩尔当量是底物醇的1至50倍，优选1至5倍。当磺酸酯、卤代物的摩尔当量的摩尔当量小于底物醇的1倍摩尔当量，则反应取代不完全，难以纯化。而当磺酸酯、卤代物的摩尔当量大于底物醇的50倍时，过量的试剂给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，从而导致下一步副反应增加，增加纯化难度。
得到的产物为醚中间体和过量的磺酸酯、卤代物的混合物，其可以通过阴离子交换树脂、渗透、超滤等方式进行纯化。其中，阴离子交换树脂没有特别限制，只要目标产物可以在树脂上发生离子交换、吸附即可，优选以葡聚糖、琼脂糖、聚丙酸酯、聚苯乙烯、聚二苯乙烯等为骨架的叔胺或季铵盐的离子交换树脂。渗透、超滤的溶剂没有限制，一般可以水或者有机溶剂，其中有机溶剂没有特别限制，只要产物可以在里面溶解即可，优选二氯甲烷、三氯甲烷等。
反应溶剂没有受到限制，优选非质子性溶剂，如甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，更优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜或四氢呋喃。
碱包括有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、咪唑或二异丙基乙基胺)或无机碱(如碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙酸钠、碳酸钾或氢氧化钾)，优选有机碱，更优选三乙胺、吡啶。碱的摩尔量为磺酸酯或卤代物摩尔当量的1至50倍，优选为1至10倍，更优选为3至5倍。
2.5.3.2.底物胺与磺酸酯、卤代物发生烷基化
A.底物胺与磺酸酯、卤代物发生烷基化
在碱的存在下，由底物胺与磺酸酯衍生物、卤代物亲核取代得到胺中间体。其中，磺酸酯、卤代物的摩尔当量是底物胺的1至50倍，优选1至5倍。当磺酸酯、卤代物的摩尔当量的摩尔当量小于底物胺的1倍摩尔当量，则反应取代不完全，难以纯化。而当磺酸酯、卤代物的摩尔当量大于底物胺的50倍时，过量的试剂给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，从而导致下一步副反应增加，增加纯化难度。
得到的产物为胺中间体和过量的磺酸酯、卤代物的混合物，其可以通过阴离子交换树脂、渗透、超滤等方式进行纯化。其中，阴离子交换树脂没有特别限制，只要目标产物可以在树脂上发生离子交换、吸附即可，优选以葡聚糖、琼脂糖、聚丙酸酯、聚苯乙烯、聚二苯乙烯等为骨架的叔胺或季铵盐的离子交换树脂。渗透、超滤的溶剂没有限制，一般可以水或者有机溶剂，其中有机溶剂没有特别限制，只要产物可以在里面溶解即可，优选二氯甲烷、三氯甲烷等。
反应溶剂没有受到限制，优选非质子性溶剂，如甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，更优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜或四氢呋喃。
碱包括有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、咪唑或二异丙基乙基胺)或无机碱(如碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙酸钠、碳酸钾或氢氧化钾)，优选有机碱，更优选三乙胺、吡啶。碱的摩尔量为磺酸酯或卤代物摩尔当量的1至50倍，优选为1至10倍，更优选为3至5倍。
2.5.3.3.底物胺与醛类衍生物发生烷基化反应
由底物胺与醛类衍生物反应得到亚胺中间体后，在还原剂作用下得到中间体。其中，醛类衍生物的摩尔当量是底物胺的1至20倍，优选1至2倍，更优选1至1.5倍。当醛类衍生物的摩尔当量大于底物胺的20倍时，过量的试剂给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，增加纯化难度。当醛类衍生物的摩尔当量小于底物胺的1倍时，反应不完全，增加纯化难度。其中，反应后产物可以通过阳离子交换树脂、渗透、超滤等手段纯化得到中间体。所述的阳离子交换树脂没有特别的限制，只要能与季铵阳离子发生交换实现分离效果即可。渗透、超滤的溶剂没有限制，一般可以水或者有机溶剂，其中有机溶剂没有特别限制，只要产物可以在里面溶解即可，优选二氯甲烷、三氯甲烷等。
反应溶剂没有受到限制，优选有机溶剂，如甲醇、乙醇、水、甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺等；更优选水和甲醇。
还原剂没有特别限制，只有能过将亚胺还原成胺即可，优选硼氢化钠、氢化铝锂、氰基硼氢化钠、Zn/AcOH等，更优选氰基硼氢化钠。一般还原剂的用量为醛类衍生物物质的量的0.5至50倍，更优选1-10倍。
2.5.4.末端的线性官能化
末端线性官能化的方法没有特别限制，与最终的功能性基团或其被保护形式的类型相关。主要包括末端羟基的功能化和基于反应性基团的向目标功能性基团或其被保护形式的转变。
末端羟基的功能化的制备方法，从A的末端羟基出发，经官能化获得类A～类J的功能性基团或其被保护形式，具体的制备方法如文献CN104530417A中段落[0960]段到[1205]段记载的。反应通式如下：
Figure BDA0003804810810000351
其中，q、Z2、q1、Z1、R01的定义与上述的一致。
基于反应性基团向目标功能性基团或其被保护形式的转变，可以通过以下任一种方式实现：
方式一：直接修饰，基于反应性基团的直接修饰，得到目标功能性基团或其被保护形式。作为举例，如羧基向酰卤、酰肼、酯、硫酯、二硫代酯的转变，如羟基、巯基、炔基、氨基、羧基等向相应的被保护结构的转变等等。又如酸酐对羟基、氨基等的修饰等。
方式二：两个反应性基团之间的偶联反应，以含有1种反应性基团及目标功能性基团或其被保护形式的异官能化试剂为原料，通过其中一种反应性基团与A末端的反应性基团之间的反应，引入目标功能性基团或其被保护形式。两个反应性基团之间的反应方式、方法没有特别限制，其反应条件与反应生成的二价连接基类型有关，可采用现有公开技术。如烷基化、烯基加成反应、炔基加成反应、席夫碱反应联合还原反应、缩合反应等。其中，烷基化反应优选为基于巯基或氨基的烷基化的反应，依次对应于硫醚键、仲氨基或叔氨基的形成。其中缩合反应包括但不限于生成酯基、硫酯基、酰胺基、亚胺键、腙键、氨基甲酸酯基等的缩合反应。又如以含叠氮、炔基、烯基、三硫酯基、巯基、二烯基、呋喃基、12,4,5-四嗪基、氰酸根等基团与目标功能性基团或其被保护形式的异官能化试剂为原料，通过click反应引入目标功能性基团或其被保护形式。两个反应性基团之间的反应伴随新键的生成，新生成的二价连接基的典型代表为酰胺键、尿烷键、酯基、仲胺键、硫醚键、三氮唑基团等。
方式三：通过直接修饰与偶联反应的组合，获得目标功能性基团或其被保护形式。
本发明中，各制备方法中用到的原料可以购买获得或者自行合成获得。
本发明中制备的中间体、终产物都可通过包括但不限于萃取、重结晶、吸附处理、沉淀、反沉淀、薄膜透析或超临界提取等的纯化方法加以纯化。对终产物的结构、分子量的表征确认，可采用包括但不限于核磁、电泳、紫外-可见分光光度计、FTIR、AFM、GPC、HPLC、MALDI-TOF、圆二色谱法等表征方法。
3.1.阳离子脂质体
本发明中，一种阳离子脂质体，包含前文所述的任一种结构如通式(1)所示的阳离子脂质。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体除了含有结构如通式(1)所示的阳离子脂质，还有中性脂质、类固醇脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或者一种以上；更优选同时含有有中性脂质、类固醇脂质和聚乙二醇化脂质三种脂质。前述的中性脂质优选为磷脂
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体中的中性脂质优选包括但不限于1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)中任一种及其组合物。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体中的类固醇脂质优选为胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中任一种及其混合物。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体中的聚乙二醇化脂质优选为聚乙二醇-1,2二肉豆蔻酸甘油酯(PEG-DMG)、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、PEG-胆固醇、聚乙二醇-二酰基甘油(PEG-DAG)，聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)，具体地包括聚乙二醇500-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇500-硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇500-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇2000-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体中的聚乙二醇化脂质的结构优选如通式(2)所示：
Figure BDA0003804810810000361
或其药物可接受的盐、互变异构体或立体异构体，
其中，L7、L8各自独立地为连接键或二价连接基，所述二价连接基选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种，其中，Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
L3为连接键、-L4-、-Z-L4-Z-、-L4-Z-L5-、-Z-L4-Z-L5-或-L4-Z-L5-Z-；所述L4、L5为碳链连接基，各自独立地为-(CRaRb)t-(CRaRb)o-(CRaRb)p-，其中，t、o、p各自独立地为0-12的整数，且t、o、p不同时为0，Ra和Rb每次出现时各自独立地为氢原子或烷基；所述Z每次出现时各自独立为-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-O(C＝O)O-、-O-、-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-和
Figure BDA0003804810810000362
中任一种，其中Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
B3、B4各自独立地为连接键或C1-12亚烷基；
R1、R2各自独立地为C1-30脂肪烃基；
R为氢原子、烷基、烷氧基、-(C＝O)Rd、-(C＝O)ORd、-O(C＝O)Rd、-O(C＝O)ORd或
Figure BDA0003804810810000371
其中，Rd为C1-12烷基，G1为k+1价的末端支化基团，j为0或1，F含有功能性基团，j为0时，G1不存在，j为1时，G1引出k个的F，k为2-8的整数；
A为-(CRaRb)sO-或-O(CRaRb)s-，其中，s为2、3或4，Ra和Rb各自独立地为氢原子或C1-12烷基；
n1为20-250的整数；
所述烷基、亚烷基、烷氧基、脂肪烃基各自独立地为取代的或未取代的。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体中的聚乙二醇化脂质的结构如下所示：
Figure BDA0003804810810000372
其中，n1为20-250的整数。
本发明的一种具体实施方案中，优选前述的任一种阳离子脂质体中包含20-80％的式(1)所示的阳离子脂质、5-15％的中性脂质、25-55％的类固醇脂质和0.5-10％的聚乙二醇化脂质，所述百分比为各脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比。
本发明的一种具体实施方案中，优选前述的任一种阳离子脂质体中，阳离子脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为30-65％；更优选为约35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％。
本发明的一种具体实施方案中，优选前述的任一种阳离子脂质体中，中性脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为7.5-13％；更优选为约8％、9％、10％、11％、12％。
本发明的一种具体实施方案中，优选前述的任一种阳离子脂质体中，类固醇脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为35-50％，更优选为约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％。
本发明的一种具体实施方案中，优选前述的任一种阳离子脂质体中，聚乙二醇化脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为0.5-5％；优选为1-3％；更优选为约1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％。
3.2.阳离子脂质体的制备
本发明中，阳离子脂质体可以通过以下方法进行制备，包括但不限于薄膜分散法、超声分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法和/或注入法，优选为薄膜分散法、超声分散法和/或反相蒸发法。
本发明的阳离子脂质体的制备方法中，所述薄膜分散法可以包括以下步骤：
(1)称取阳离子脂质、类固醇脂质、中性脂质和聚乙二醇化脂质，将其在有机溶剂中充分溶解，摇匀，减压旋蒸除去有机溶剂，形成油膜，用真空泵抽干，除去有机溶剂；
(2)加入溶解有冷冻保护剂的磷酸盐缓冲液，水浴超声，形成半透明状乳液；
(3)将乳液加入到高压均质机中过压，之后将过压后的乳液加入脂质体挤出器中过膜，形成阳离子脂质体；和
(4)任选地，将所述阳离子脂质体在冷冻干燥机中干燥，形成阳离子脂质体粉末；
其中，优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和/或甲醇，更优选为三氯甲烷和甲醇；优选地，所述减压旋蒸的转速为30～300rpm，更优选为50～200rpm，最优选为100～170rpm；优选地，所述减压旋蒸的温度为10～200℃，更优选为20～100℃，最优选为40～80℃；
优选地，所述真空泵抽干时间为1～72h，更优选为5～48h，最优选为15～36h；
优选地，所述冷冻保护剂溶于磷酸盐缓冲液的质量浓度为0.1-80％，优选为1-50％，更优选为5～20％；
优选地，所述水浴超声的频率为10～300，更优选为30～200，最优选为60～150；
优选地，所述水浴超声的时间为0.1～5h，更优选为0.2～2h，最优选为0.25～1h；
优选地，所述高压均质机的压力为50～240MPa，更优选为80～200MPa，最优选为100～150MPa；
优选地，所述高压均质机的过压次数为1～50间的任意整数，更优选为3～20间的任意整数，最优选为5～10次间的任意整数；
优选地，所述脂质体挤出器的压力为50～300MPa，更优选为80～250MPa，最优选为120～200MPa；
优选地，所述脂质体挤出器的过膜次数为1～50间的任意整数，更优选为3～30间的任意整数，最优选为5～20间的任意整数；
优选地，所述冷冻干燥机的干燥时间为1～120h，更优选为5～72h，最优选为10～36h。
本发明的阳离子脂质体的制备方法中，阳离子脂质体：溶解有冷冻保护剂的磷酸盐缓冲液可以为1mg：(0.1～100)mL，优选为1mg：(0.3～50)mL，更优选为1mg：(0.5～5)mL。
4.1.阳离子脂质体核酸药物组合物
本发明的一种实施方案，一种阳离子脂质体核酸药物组合物，含有前文所述的任一种阳离子脂质体和核酸药物，其中，阳离子脂质体，包含前文所述的任一种结构如通式(1)所示的阳离子脂质。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体核酸药物组合物中，所述核酸类药物选自RNA、DNA、反义核酸、质粒、mRNA(信使RNA)、干扰核酸、适体、m iRNA抑制剂(antagomir)、微RNA(miRNA)、核酶及和小干扰RNA(siRNA)中任一种；优选为RNA、miRNA和siRNA中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，阳离子脂质体核酸药物组合物优选作为药物使用，选自以下任一种药物：治疗癌症、恶性肿瘤、抗感染剂、抗生素剂、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗。
本发明中，进一步优选所述药物包括但不限多柔比星、米托蒽醌、喜树碱、顺铂、博莱霉素、环磷酰胺、链脲佐菌素、放线菌素D、长春新碱、长春碱、胞嘧啶***糖苷、蒽环霉素、氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、拉奇霉素、美法兰、卡莫司汀、罗莫司丁、白消安、二溴甘露醇、丝裂霉素C、顺二氯二胺络铂(II)、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪、地布卡因、氯丙嗪、***、第莫洛、拉贝洛尔、可乐定、肼酞嗪、丙咪嗪、阿米替林、多虑平、苯妥英、苯海拉明、氯苯那敏、异丙嗪、庆大霉素、环丙沙星、头孢西丁、咪康唑、特康唑、益康唑、异康唑、布康唑、克霉唑、伊曲康唑、制霉菌素、奈替芬、两性霉素B、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼药、维生素、镇静剂以及成像剂、紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、柔红霉素、二羟基蒽二酮、光辉霉素、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、嘌呤霉素、类美登素。
本发明的一种具体实施方案中，优选所述阳离子脂质体与所述核酸的N/P比为(0.1～100)：1，更优选为(0.2～30)：1，最优选为(0.5～20)：1；
本发明的一种具体实施方案中，优选所述核酸药物组合物制剂工作液为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液或生理盐水，更优选为磷酸盐缓冲液或生理盐水，最优选为生理盐水；优选阳离子脂质体：工作液＝(0.05～20)g：100mL，更优选为(0.1～10)g：100mL，最优选为(0.2～5)g：100mL。
5.一种阳离子脂质体核酸药物组合物制剂
本发明中，一种阳离子脂质体核酸药物组合物制剂，含有前述的阳离子脂质体核酸药物组合物和药学上可接受的稀释剂或赋形剂，所述稀释剂或赋形剂优选为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液和生理盐水中任一种，更优选为磷酸盐缓冲液或生理盐水，最优选为生理盐水。
本发明中，阳离子脂质体核酸药物组合物制剂的制备，包含下述步骤：
(1)将所述阳离子脂质体在所述稀释剂或赋形剂中平衡；
(2)将核酸类药物加入平衡后的阳离子脂质体与稀释剂或赋形剂的混合物中进行复合；
其中，优选地，所述平衡时间为0.1～12h，优选为0.2～6h，更优选为0.5～3h；优选地，所述复合时间为0.1～12h，优选为0.2～5h，更优选为0.5～2h。
下面结合一些具体实施例对阳离子脂质、阳离子脂质体、阳离子脂质体核酸药物组合物的制备方法及阳离子脂质体核酸药物组合物的生物活性测试做进一步描述具体实施例为进一步详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。其中，制备阳离子脂质的实施例中，终产物通过核磁表征结构，或通过MALDI-TOF确认分子量。
实施例1：阳离子脂质(E1-1)
Figure BDA0003804810810000391
对应通式(1)，E1-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000392
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为782Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物2-己基癸酸(S1-1，100.00g，390.6mmol)溶于无水DCM(1L)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入1,6-己二醇(S1-2，92.19g，781.3mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，57.18g，468.7mmol)，分批加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，82.56g，430.0mmol)，反应液回至室温继续反应。反应16h后，TLC显示S1-1消耗完全，反应液用500mL 0.4N HCl/10％NaCl混合溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到小分子中间体醇衍生物S1-3(79.02g)。
步骤b：将上述缩合产物(S1-3，50.02g，140.5mmol)溶于500mLDCM溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(Tempo，11.00mg)和KBr溶液(20.06g，168.6mmol)，溶解于50mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(182.6mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪原料直至消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温后用500mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S1-4(23.12g)。
步骤c：将上述氧化产物(S1-4，20.00g，56.5mmol)溶于200mL THF和20mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入二甘醇胺(S1-5，2.82g，26.9mmol)和冰醋酸(1.61g，26.9mmol)，慢慢分批加入三乙酰基硼氢化钠(NaBH(OAc)3，17.49g，82.5mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E1-1(12.09g)。E1-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.07(t,4H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.49(m,4H),2.32(m,2H),1.71-1.22(m,64H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E1-1的分子量为781.76Da。
Figure BDA0003804810810000401
实施例2：阳离子脂质(E2-1)
Figure BDA0003804810810000402
对应通式(1)，E2-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000403
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为-CH3。总分子量约为796Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，10.00g，28.2mmol)溶于THF 100mL和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入1-(2-氨基乙氧基)-2-甲氧基乙烷(S2-1，1.61g，13.5mmol)和冰醋酸(0.81g，13.5mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(9.86g，47.1mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E2-1(5.93g)。E2-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.07(t,4H),3.71(t,2H),3.63(t,4H),3.30(s,3H),2.65(t,2H),2.49(m,4H),2.32(m,2H),1.70-1.22(m,64H),0.89(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E2-1的分子量为795.71Da。
Figure BDA0003804810810000411
实施例3：阳离子脂质(E3-1)
Figure BDA0003804810810000412
对应通式(1)，E3-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000413
A为-(CRaRb)sS-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为1，R3为-CH2CH2OH。总分子量约为782Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，5.00g，14.1mmol)溶于50mL THF和5mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入2-(2-氨基乙巯基)乙醇(S3-1，0.81g，6.7mmol)和冰醋酸(0.40g，6.7mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(5.00g，23.6mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用50mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E3-1(2.64g)。E3-1的核磁氢谱主要数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.06(t,4H),3.70(t,2H),2.75-2.45(m,10H),2.32(m,2H),1.70-1.22(m,64H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E3-1的分子量为782.37Da。
Figure BDA0003804810810000414
实施例4：阳离子脂质(E4-1)
Figure BDA0003804810810000421
对应通式(1)，E4-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为-CH2CH2-，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000422
A为-O(CRaRb)s-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为-OH。总分子量约为826Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，5.00g，14.1mmol)溶于50mL THF和5mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入三甘醇胺(S4-1，1.00g，6.7mmol)和冰醋酸(0.40g，6.7mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(5.00g，23.6mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用50mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化,收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E4-1(3.15g)。E4-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.08(t,4H),3.81-3.58(m,10H),2.65(t,2H),2.49(m,4H),2.32(m,2H),1.70-1.23(m,64H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E4-1的分子量为825.73Da。
Figure BDA0003804810810000423
实施例5：阳离子脂质(E5-1)
Figure BDA0003804810810000424
对应通式(1)，E5-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为-CH2CH2O-，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000425
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为-CH2CH2OH。总分子量约为869Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，5.00g，14.1mmol)溶于50mL THF和5mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入四甘醇胺(S5-1，1.29g，6.7mmol)和冰醋酸(0.40g，6.7mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(5.00g，23.6mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用50mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化,收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E5-1(3.54g)。E5-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.07(t,4H),3.85-3.55(m,14H),2.64(t,2H),2.49(m,4H),2.32(m,2H),1.70-1.22(m,64H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E5-1的分子量为869.37Da。
Figure BDA0003804810810000431
实施例6：阳离子脂质(E6-1)
Figure BDA0003804810810000432
对应通式(1)，E6-1中，L1、L2相同且均为-O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000433
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为750Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物2-己基癸醇(S6-1，24.20g，100.0mmol)溶于250mL THF溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入氢化钠(6.00g，150.0mmol，60％)，反应0.5h之后，慢慢滴加(6-溴己氧基)-叔丁基二甲基硅烷(S6-2，26.46g，90.0mmol)，反应液回至室温继续反应12h。TLC显示S6-1基本消耗完全，反应液用100mL水淬灭反应，将THF浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S6-3(25.25g)。
步骤b：将上述取代产物(S6-3，25.00g，54.8mmol)溶于250mL THF溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，加入四丁基氟化铵溶液(TBAF，110mL，1N in THF)。反应1h，TLC显示原料消耗完全，反应液用100mL水淬灭反应，将THF浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S6-4(16.33g)。
步骤c：将上述缩合产物(S6-4，16.28g，47.6mmol)溶于DCM 200mL溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入Tempo(4.00mg)和KBr溶液(0.29g，2.4mmol)，溶解于20mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(57.2mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪直至原料消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤旋干得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S6-5(12.94g，80％)。
步骤d：将上述氧化产物(S6-5，12.92g，38.0mmol)溶于150mL THF和15mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入实施例1步骤a中的S1-5(1.90g，18.1mmol)和冰醋酸(1.09g，18.1mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(13.44g，63.4mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤旋干得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化,收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E6-1(6.37g)。E6-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:3.84-3.55(m,14H),2.65(t,2H),2.48(m,4H),1.82-1.22(m,66H),0.86(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E6-1的分子量为753.96Da。
Figure BDA0003804810810000441
实施例7：阳离子脂质(E7-2)
Figure BDA0003804810810000442
对应通式(1)，E7-2中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为链接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000443
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000444
总分子量约为854Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物2-己基辛酸(S7-1，100.00g，438.6mmol)溶于无水DCM(1L)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入实施例1步骤a中的S1-2(92.19g，781.3mmol)和DMAP(57.18g，468.7mmol)，分批加入EDCI(82.56g，430.0mmol)，反应液回至室温继续反应。反应16h后，TLC显示S7-1消耗完全，反应液用500mL 0.4N HCl/10％NaCl混合溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S7-2(84.90g)。
步骤b：将上述缩合产物(S7-2，50.00g，152.4mmol)溶于500mLDCM溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入Tempo(11.00mg)和KBr溶液(20.06g，168.6mmol)，溶解于50mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(182.6mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪直至原料消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温用500mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S7-3(23.05g)。
步骤c：将上述氧化产物(S7-3，20.00g，61.3mmol)溶于200mL THF和20mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入化合物S7-4(21.73g，32.1mmol，S7-4为双Fmoc保护的赖氨酸与实施例1步骤c中S1-5偶合后得到的产物)和冰醋酸(1.61g，26.9mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(17.49g，82.5mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到含有两个Fmoc保护氨基的阳离子脂质E7-1(24.00g)。E7-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.20-7.80(m,16H)，4.37-4.45(d,4H),4.42(m,1H),4.25(t,2H),4.20(m,2H),4.07(t,4H),3.63(t,4H),2.69(m,2H),2.66(t,2H),2.49(m,4H),2.32(m,2H),1.76-2.00(m,2H),1.72-1.22(m,56H),1.24-1.66(m,4H),0.86(t,12H)。
Figure BDA0003804810810000451
步骤d：脱除Fmoc保护基。将上述浓缩产物E7-1(10.00g，7.7mmol)用20％哌啶/DMF溶液处理，旋蒸去除溶剂，二氯甲烷溶解，无水***沉淀，过滤，异丙醇重结晶，得到含有两个裸露的氨基的阳离子脂质E7-2(6.45g，98.1％)。E7-2的核磁氢谱主要数据如下：4.36(t,1H)。核磁氢谱中，Fmoc的特征峰消失。经MALDI-TOF测试，确定E7-2的分子量为853.85Da。
实施例8：阳离子脂质(E8-1)
Figure BDA0003804810810000452
对应通式(1)，E8-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为-CH2CH2-，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000461
A为-S(CRaRb)s-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为-OH。总分子量约为718Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物2-己基壬酸(S8-1，100.00g，537.6mmol)溶于无水DCM(1L)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入实施例1步骤a中的S1-2(92.19g，781.3mmol)和DMAP(57.18g，468.7mmol)，分批加入EDCI(82.56g，430.0mmol)，反应液回至室温继续反应。反应16h后，TLC显示S8-1消耗完全，反应液用500mL 0.4N HCl/10％NaCl混合溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S8-2(87.35g)。
步骤b：将上述缩合产物(S8-2，50.00g，174.8mmol)溶于500mLDCM溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入Tempo(11.00mg)和KBr溶液(20.06g，168.6mmol)，溶解于50mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(182.6mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪直至原料消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温用500mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S8-3(24.78g)。
步骤c：将上述氧化产物(S8-3，20.00g，70.4mmol)溶于200mL THF和20mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入
Figure BDA0003804810810000463
(S8-4，6.41g，35.4mmol)和冰醋酸(1.61g，26.9mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(17.49g，82.5mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E8-1(11.79g)。E8-1的核磁氢谱主要数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.07(t,4H),3.70(t,2H),2.81(m,4H),2.75-2.45(m,10H),2.32(m,2H),1.72-1.22(m,44H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E8-1的分子量为717.50Da。
Figure BDA0003804810810000462
实施例9：阳离子脂质(E9-2)
Figure BDA0003804810810000471
对应通式(1)，E9-2中，L1、L2相同且均为-O(C＝O)O-，L3为-CH2CH2NHC(＝O)-，B1、B2均为-CH2CH2-，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000472
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为744Da。
制备过程如下所示：
步骤a：在干燥洁净的1000mL圆底烧瓶中，将氨基Fmoc保护的N,N-二乙基-1,3-丙二胺琥珀酰亚胺碳酸酯
Figure BDA0003804810810000473
(S9-2，96.54g，233.2mmol)溶于二氯甲烷中，加入DMAP(62.59g，513.0mmol)搅拌混匀，将2-己基辛醇S9-1(100.0g，467.3mmol)加入反应液中，室温搅拌反应16h。反应完毕后将反应液旋干，用异丙醇重结晶，通过离子交换树脂纯化得到氨基Fmoc保护的乙胺衍生物S9-3(127.86g，93.9％)。
步骤b：将含Fmoc保护氨基的S9-3进行脱保护，将S9-3(50.00g，85.6mmol)用20％哌啶/DMF溶液处理，旋蒸去除溶剂，二氯甲烷溶解，将得到的粗反应液温度降至0～10℃后，氮气保护下向反应体系中加入化合物
Figure BDA0003804810810000474
(S9-4，13.00g，52.4mmol)和TEA(11.49g，77.1mmol)，反应液回至室温反应过夜。TLC显示原料消耗完全，反应液用100mL水淬灭反应，用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E9-1(27.54g)。E9-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.22(m,8H),3.75(t,2H),3.65(m,2H),3.59(t,2H),3.14(m,2H),2.65(t,2H),2.60(t,2H),2.51(t,4H),2.32(m,2H),1.82-1.22(m,40H),0.98(m,9H),0.88(t,12H),0.21(m,6H)。
步骤c：将上述取代产物(E9-1，20.00g，23.2mmol)溶于250mL THF溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，加入四丁基氟化铵溶液(TBAF，110mL，1N in THF)。反应1h，TLC显示原料消耗完全，反应液用100mL水淬灭反应，将THF浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E9-2(15.14g，87.7％)。核磁氢谱中，TBS的特征峰消失。经MALDI-TOF测试，确定E9-2的分子量为744.52Da。
Figure BDA0003804810810000481
实施例10：阳离子脂质(E10-1)
Figure BDA0003804810810000482
对应通式(1)，E10-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚庚基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000483
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000484
总分子量约为772Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物二戊基乙酸(S10-1，100.00g，499.5mmol)溶于无水DCM(1L)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入1,7-庚二醇(S10-2，132.00g，999.1mmol)和DMAP(73.12g，599.4mmol)，分批加入EDCI(105.48g，549.4mmol)，反应液回至室温继续反应。反应16h后，TLC显示S10-1消耗完全，反应液用500mL 0.4N HCl/10％NaCl混合溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S10-3(89.20g)。
步骤b：将上述缩合产物(S10-3，50.00g，159.1mmol)溶于500mLDCM溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入Tempo(12.40mg)和KBr溶液(22.72g，190.9mmol)，溶解于50mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(206.8mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪直至原料消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温用500mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S10-4(25.90g)。
步骤c：将上述氧化产物(S10-4，20.00g，64.0mmol)溶于200mL THF和20mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S10-5(5.50g，30.7mmol)和冰醋酸(1.84g，30.7mmol)，S10-5由S1-5与
Figure BDA0003804810810000491
反应得到。慢慢分批加入NaBH(OAc)3(19.80g，93.4mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E10-1(13.30g)。E10-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.13(m,4H),3.65-3.77(m,6H),3.48(d,4H),3.30(m,1H),3.01(m,4H),2.51(t,2H),2.13(m,2H),1.60-1.26(m,52H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E10-1的分子量为771.27Da。
Figure BDA0003804810810000492
实施例11：阳离子脂质(E11-2)
Figure BDA0003804810810000493
对应通式(1)，E11-2中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为-CH2CH2O-，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000494
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000495
总分子量约为869Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，10.00g，28.2mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S11-1(3.11g，13.5mmol)和冰醋酸(0.81g，13.5mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(10.00g，47.1mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氨基Boc保护的阳离子脂质E11-1(6.31g)。
Figure BDA0003804810810000501
步骤b：脱除Boc保护基。在干燥洁净的500mL圆底烧瓶中，配制三氟乙酸/二氯甲烷(1:2,v/v)的溶液，冰浴条件下缓慢滴加E11-1(5.00g，5.1mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应2小时。浓缩反应液，加入纯化水，用二氯甲烷萃取，将萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩滤液，重结晶得到含有裸露氨基的阳离子脂质E11-2(4.00g，90.3％)。E11-2的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.05(m,4H),3.71-3.57(m,10H),3.49(t,2H),3.01(m,4H),2.85(t,2H),2.51(t,2H),2.13(m,2H),1.60-1.25(m,64H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E11-2的分子量为868.70Da。
实施例12：阳离子脂质(E12-1)
Figure BDA0003804810810000502
对应通式(1)，E12-1中，R1，R2均为十四烷基，B1，B2为连接键，L1，L2为连接键，L3为连接键，A为-CH2CH2OCH2CH2NH-，n为1，R3为
Figure BDA0003804810810000503
总分子量约为568Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物S12-1(8.80g，50.0mmol)，甲苯(200mL)于140℃下共沸除水，蒸出60mL溶剂后，反应温度降至室温。加入三乙醇胺(TEA，14.90g，100.0mmol)和甲基磺酰氯(MsCl，10.31g，90.0mmol)，于室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入水(200mL)中，用EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，水相再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，用异丙醇于50℃下溶解，冰浴下重结晶，过滤得到化合物S12-2(11.68g，92％)。
步骤b：将上述化合物S12-2(10.00g，39.4mmol)加入100mL水中，于室温下搅拌溶解。加入碳酸钾(54.37g，394.0mmol)，化合物S12-3(41.96g，197.0mmol)和四正丁基溴化铵(1.26g，3.9mmol)，反应液于室温下搅拌反应72小时。反应结束后，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(100mL)反洗一次，保留有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物S12-4粗品。
通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物S12-4(9.59g)。
Figure BDA0003804810810000511
步骤c：将上述化合物S12-4(9.00g，24.3mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，9.72g，243.0mmol)，于冰浴下反应1小时。反应结束后，加入化合物S12-5(8.05g，29.2mmol)，冰浴下搅拌反应1小时后，反应液慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(300mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E12-1粗品。通过柱层析纯化(DCM:MeOH＝15:1)，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E12-1(10.24g，75％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:3.83-3.45(m,4H),2.64(m,4H),2.52(t,4H),2.42(t,4H),2.23(s,6H),1.56-1.46(m,4H),1.26-1.19(m,44H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确定E12-1的分子量为567.72Da。
实施例13：阳离子脂质(E13-1)
Figure BDA0003804810810000512
对应通式(1)，E13-1中，R1为十三烷基，R2为十四烷基，B1，B2为连接键，L1为羰基，L2为连接键，L3为连接键，A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为-CH2CHO。总分子量约为554Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物S13-1(7.40g，50.0mmol)，甲苯(200mL)于140℃下共沸除水，蒸出60mL溶剂后，反应温度降至室温。加入TEA(14.9g，100.0mmol)和MsCl(10.31g，90.0mmol)，于室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入水(200mL)中，用EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，水相再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，用异丙醇50℃下溶解，冰浴下重结晶，过滤得到化合物S13-2(10.17g，90％)。
步骤b：将上述化合物S13-2(10.17g，45.0mmol)加入250mL水中，于室温下搅拌溶解。加入碳酸钾(62.10g，450.0mmol)，化合物S12-3(47.93g，225.0mmol)和四正丁基溴化铵(1.45g，4.5mmol)，反应液于室温下搅拌72小时。反应结束后，用二氯甲烷(250mL*2)萃取两次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(250mL)反洗一次，保留有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物S13-3粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物S13-3(10.08g)。
步骤c：将上述化合物S13-3(10.00g，29.2mmol)，化合物S13-4(11.39g，35.0mmol)，TEA(6.53g，43.8mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓缩后，用100mL水溶解，EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，加入氯化钠，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，再用饱和NaCl(100mL)反洗一次。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E13-1(13.47g，83.4％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.87(s,1H),4.17(s,2H),3.83-3.45(m,6H),3.35(t,2H),3.16(t,2H),2.23(t,2H),1.56-1.46(m,4H),1.26-1.19(m,42H),0.86(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确定E13-1的分子量为553.54Da。
Figure BDA0003804810810000521
实施例14：阳离子脂质(E14-1)
Figure BDA0003804810810000522
对应通式(1)，E14-1中，R1为十三烷基，R2为十四烷基，B1，B2为连接键，L1为羰基，L2为连接键，L3为连接键，A为-(CRaRb)sO-，其中，Ra和Rb为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000523
总分子量约为620Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物S14-1(10.70g，50.0mmol)，甲苯(200mL)于140℃下共沸除水，蒸出60mL溶剂后，反应温度降至室温。加入TEA(14.90g，100.0mmol)和MsCl(10.31g，90.0mmol)，于室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入水(200mL)中，用EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，水相再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，用异丙醇50℃下溶解，冰浴下重结晶，过滤得到化合物S14-2(12.96g，88.8％)。
步骤b：将上述化合物S14-2(9.34g，32.0mmol)加入100mL水中，于室温下搅拌溶解。加入碳酸钾(44.16g，320.0mmol)，化合物S12-3(34.08g，160.0mmol)和四正丁基溴化铵(1.03g，3.2mmol)，反应液于室温下搅拌72小时。反应结束后，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(100mL)反洗一次，保留有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物S14-3粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物S14-3(8.39g，64.1％)。
步骤c：将上述化合物S14-3(7.65g，18.7mmol)，化合物S13-4(7.29g，22.4mmol)，TEA(4.18g，28.1mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓缩后，用100mL水溶解，EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，加入氯化钠，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，再用饱和NaCl(100mL)反洗一次。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E14-1(9.56g，82.6％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:3.83-3.45(m,8H),3.35(t,2H),3.16(t,2H),2.62-2.42(m,4H),2.34(t,2H),2.23(t,2H),2.00(s,1H),1.56-1.46(m,4H),1.26-1.19(m,42H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确定E14-1的分子量为619.15Da。
Figure BDA0003804810810000531
实施例15：阳离子脂质(E15-2)
Figure BDA0003804810810000532
对应通式(1)，E15-2中，R1为十四烷基，R2为十三烷基，B1，B2为连接键，L1为连接键，L2为羰基，L3为连接键，A为-(CRaRb)sO-，其中，Ra和Rb为氢原子，s为2，n为2，R3为-C(＝O)CH2CH2COOH。总分子量约为612Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物S15-1(15.30g，50.0mmol)，甲苯(250mL)于140℃下共沸除水，蒸出80mL溶剂后，反应温度降至室温。加入TEA(14.90g，100.0mmol)和MsCl(10.31g，90.0mmol)，于室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入水(200mL)中，用EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，水相再用二氯甲烷(150mL*2)萃取两次，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，用异丙醇于50℃下溶解，冰浴下重结晶，过滤得到化合物S15-2(16.88g，87.9％)。
步骤b：将上述化合物S15-2(10.00g，26.0mmol)加入100mL水中，于室温下搅拌溶解。加入碳酸钾(35.88g，260.0mmol)，化合物S12-3(27.69g，130.0mmol)和四正丁基溴化铵(0.84g，2.6mmol)，反应液于室温下搅拌72小时。反应结束后，用二氯甲烷(200mL*2)萃取两次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(200mL)反洗一次，保留有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物S15-3粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物S15-3(8.64g)。
步骤c：将上述化合物S15-3(8.00g，16.0mmol)，化合物S13-4(6.24g，19.2mmol)，TEA(3.58g，24.0mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓缩后，用100mL水溶解，EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，加入氯化钠，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，再用饱和NaCl(100mL)反洗一次。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物E15-1(9.52g，83.6％)。
步骤d：脱除Boc保护基。在干燥洁净的500mL圆底烧瓶中，配制三氟乙酸/二氯甲烷(1:2，v/v)的溶液，冰浴条件下缓慢滴加E15-1(9.52g，13.4mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应2小时。反应结束后，浓缩反应液，加入纯化水，用二氯甲烷萃取，将萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩滤液，重结晶得到阳离子脂质E15-2(7.53g，92.1％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:4.17(t,2H),3.71-3.60(m,4H),3.35(t,2H),3.16(t,2H),2.70-2.47(m,4H),2.23(t,2H),1.56-1.46(m,4H),1.26-1.19(m,42H),0.87(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确定E15-2的分子量为611.51Da。
Figure BDA0003804810810000541
实施例16：阳离子脂质(E16-2)
Figure BDA0003804810810000542
对应通式(1)，E16-2中，R1为十三烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000543
B1为连接键，B2为亚己基，L1为羰基，L2为-(C＝O)O-，L3为-CH2CH2-，A为-O(CRaRb)s-，其中，Ra和Rb为氢原子，s为2，n为2，R3为羟基。总分子量约为712Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物2-庚基癸酸(S16-1，10.00g，37.0mmol)溶于无水DCM(100mL)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入1,6-己二醇(S1-2，8.73g，74.0mmol)和DMAP(5.42g，44.4mmol)，分批加入EDCI(78.14g，407.0mmol)，反应液回至室温继续反应。反应16h后，TLC显示S16-1消耗完全，反应液用500mL 0.4N HCl/10％NaCl混合溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S16-2(8.10g)。
步骤b：将上述缩合产物(S16-2，8.00g，21.6mmol)溶于500mLDCM溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入Tempo(1.20mg)和KBr溶液(3.08g，25.9mmol)，溶解于50mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(17.5mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪直至原料消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温用50mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S16-3(3.98g)。
步骤c：将上述氧化产物S16-3(3.98g，10.8mmol)溶于50mL THF和5mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入胺衍生物(S16-4，2.58g，9.8mmol)和冰醋酸(0.58g，9.8mmol)，慢慢分批加入NaHB(OAc)3(6.23g，29.4mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到终产物S16-5(3.45g)。
步骤d：将上述化合物S16-5(3.45g，5.6mmol)，化合物S16-6(1.66g，6.7mmol)，TEA(1.25g，8.4mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓缩后，用100mL水溶解，EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，加入氯化钠，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，再用饱和NaCl(100mL)反洗一次。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到羟基TBS保护的阳离子脂质E16-1(3.91g，84.5％)。
步骤e：将上述产物E16-1(3.91g，4.7mmol)溶于THF(50mL)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，加入四丁基氟化铵溶液(TBAF，2mL，1N in THF)。反应1h，TLC显示原料消耗完全，反应液用10mL水淬灭反应，将THF浓缩除去，然后浓缩液用10mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物阳离子脂质E16-2(2.92g，87.5％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:4.08(t,2H),3.75-3.43(m,10H),3.35(t,2H),3.15(t,2H),2.26-2.25(m,3H),1.60-1.46(m,10H),1.32-1.25(m,46H),0.88(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E16-2的分子量为711.64Da。
Figure BDA0003804810810000551
实施例17：阳离子脂质(E17-2)
Figure BDA0003804810810000552
对应通式(1)，E17-2中，R1为十四烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000561
B1为连接键，B2为亚己基，L1为链接键，L2为-(C＝O)O-，L3为-CH2CH2-，A为-O(CRaRb)s-，其中，Ra和Rb为氢原子，s为2，n为2，R3为羟基。总分子量约为698Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将上述化合物S16-5(3.45g，5.6mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，2.24g，56.0mmol)，于冰浴下反应1小时。反应结束后，加入化合物S12-5(1.85g，6.7mmol)，冰浴下搅拌反应1小时后，反应液慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(300mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E17-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物E17-1(3.44g，75.8％)。
步骤b：将上述取代产物E17-1(3.44g，4.2mmol)溶于THF(50mL)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，加入四丁基氟化铵溶液(TBAF，2mL，1N in THF)。反应1h，TLC显示原料消耗完全，反应液用10mL水淬灭反应，将THF浓缩除去，然后浓缩液用10mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E17-2(2.57g，87.0％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:4.09(t,2H),3.73-3.48(m,10H),2.51(t,4H),2.26-2.25(m,3H),1.56-1.46(m,10H),1.32-1.25(m,48H),0.87(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E17-2的分子量为697.51Da。
Figure BDA0003804810810000562
实施例18：阳离子脂质(E18-1)
Figure BDA0003804810810000563
对应通式(1)，E18-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000564
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000565
总分子量约为956Da。
制备过程如下所示：
将实施例1中的氧化产物(S1-4，8.85g，25.0mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S18-1(3.35g，12.0mmol)和冰醋酸(0.72g，12.0mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(8.90g，42.0mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用DCM(100mL*2)萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E18-1(6.02g)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:4.26(s,2H),4.21(t,2H),4.07(t,4H),3.67(t,2H),3.52(t,2H),3.48(t,4H),3.30(d,2H),2.63(t,2H),2.53(t,4H),2.24(m,2H),1.66-1.50(m,13H),1.43-1.17(m,56H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E18-1的分子量为955.61Da。
Figure BDA0003804810810000571
实施例19：阳离子脂质(E19-2)
Figure BDA0003804810810000572
对应通式(1)，E19-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000573
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000574
总分子量约为882Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，8.85g，25.0mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S19-1(2.46g，12.0mmol)和冰醋酸(0.72g，12.0mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(8.90g，42.0mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到化合物E19-1(5.48g)。
步骤b：脱除Boc保护基。在干燥洁净的500mL圆底烧瓶中，配制三氟乙酸/二氯甲烷(1:2，v/v)的溶液，冰浴条件下缓慢滴加E19-1(5.00g，5.1mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应2小时。反应结束后，浓缩反应液，加入纯化水，用二氯甲烷萃取，将萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩滤液，重结晶得到阳离子脂质E19-2(4.13g，91.8％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:4.21(t,2H),4.07(t,4H),3.64(t,2H),3.52(t,2H),3.20(t,2H),3.06(t,2H),2.63(t,2H),2.52(t,4H),2.24(m,2H),1.87(m,2H),1.66-1.50(m,12H),1.45-1.17(m,52H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E19-2的分子量为881.78Da。
Figure BDA0003804810810000581
实施例20：阳离子脂质(E20-1)
Figure BDA0003804810810000582
对应通式(1)，E20-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000583
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000584
总分子量约为923Da。
制备过程如下所示：
Figure BDA0003804810810000585
将实施例1中的氧化产物(S1-4，8.85g，25.0mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S20-1(2.94g，12.0mmol)和冰醋酸(0.72g，12.0mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(8.90g，42.0mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E20-1(6.00g)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:4.30(t,2H),4.07(t,4H),3.67(t,2H),3.52(t,2H),2.86(t,4H),2.63(t,2H),2.53(t,4H),2.25(m,2H),1.66-1.50(m,12H),1.45-1.17(m,52H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E20-1的分子量为922.79Da。
实施例21：阳离子脂质(E21-1)
Figure BDA0003804810810000591
对应通式(1)，E21-1中，L1、L2相同且均为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000592
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为
Figure BDA0003804810810000593
总分子量约为933Da。
制备过程如下所示：
将实施例1中的氧化产物(S1-4，8.85g，25.0mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S21-1(3.06g，12.0mmol)和冰醋酸(0.72g，12.0mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(8.90g，42.0mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E21-1(5.65g)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:6.49(s,2H),4.25-4.10(m,6H),3.62(t,2H),3.52(t,2H),3.15(t,1H),2.63(t,2H),2.50(t,4H),2.32(t,2H),2.24(m,2H),1,89(m,2H),1.66-1.50(m,12H),1.45-1.17(m,52H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E21-1的分子量为932.79Da。
Figure BDA0003804810810000594
实施例22：阳离子脂质(E22-1)
Figure BDA0003804810810000595
对应通式(1)，E22-1中，L1、L2相同且均为-O(C＝O)-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000601
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为781Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物7-羟基庚酸(S22-1，14.60g，100.0mmol)溶于无水DCM(200mL)溶液中，置于氮气保护的烧瓶内，待上述混合液温度降至0～10℃后，向上述溶液中小心地加入7-十五烷醇(S22-2，45.60g，200.0mmol)和DMAP(14.64g，120.0mmol)，分批加入EDCI(21.12g，110.0mmol)，反应液回至室温继续反应。反应16h后，TLC显示S22-1消耗完全，反应液用100mL 0.4N HCl/10％NaCl混合溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到小分子中间体醇衍生物S22-3(20.79g)。
步骤b：将上述缩合产物(S22-3，20.00g，56.2mmol)溶于200mL DCM溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入Tempo(3.00mg)和KBr溶液(8.02g，67.4mmol)，溶解于50mL纯化水，慢慢滴加入NaClO溶液(73.1mmol)，待滴加完毕后，TLC跟踪原料直至消耗完毕。然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，反应液回至室温后用200mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到氧化产物S22-4(9.59g)。
步骤c：将上述氧化产物(S22-4，8.00g，22.6mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S1-5(1.19g，11.3mmol)和冰醋酸(0.68g，11.3mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(7.19g，33.9mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水MgSO4干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E22-1(4.76g)。E22-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.87(m,2H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.49(m,4H),2.30(t,4H),1.71-1.22(m,64H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E22-1的分子量为781.42Da。
Figure BDA0003804810810000602
实施例23：阳离子脂质(E23-1)
Figure BDA0003804810810000611
对应通式(1)，E23-1中，L1、L2相同且均为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000612
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为814Da。
制备过程如下所示：
步骤a：在氮气的保护下，将6-溴己基-4-硝基苯基碳酸酯(S23-1，4.48g，13.0mmol，其中S23-1是由对硝基苯基氯甲酸酯和6-溴正己醇反应制备得到的)溶于DCM(15mL)中，室温搅拌下滴加S22-2(11.86g，52.0mmol)，随后缓慢滴加吡啶(1.28mL，16.25mmol)超过10min，然后一次性加入DMAP(0.32g，2.6mmol)。室温搅拌反应16h，反应结束后用DCM进行萃取两次，合并有机相并用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S23-2(5.86g)。
步骤b：将S23-2(5.56g，12.8mmol)、S1-5(0.60g，5.8mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.68g，7.7mmol)在DMF(10mL)溶液中，于77℃下反应18h。反应结束后，将反应混合液冷却，并用己烷(3*10mL)萃取。合并己烷萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶柱层析进行纯化得到阳离子脂质E23-1(3.67g)。E23-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.21(t,4H),4.12(m,2H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.51(m,4H),1.72-1.25(m,64H),0.90(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E22-1的分子量为813.84Da。
Figure BDA0003804810810000613
实施例24：阳离子脂质(E24-1)
Figure BDA0003804810810000614
对应通式(1)，E24-1中，L1、L2相同且均为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为
Figure BDA0003804810810000615
R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000616
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为814Da。
制备过程如下所示：
步骤a：在氮气的保护下，将5-溴戊基-4-硝基苯基碳酸酯(S24-1，4.30g，13.0mmol，其中S24-1是由对硝基苯基氯甲酸酯和5-溴正戊醇反应制备得到的)溶于DCM(15mL)中，室温搅拌下滴加2-己基癸醇(S24-2，12.58g，52.0mmol)，随后缓慢滴加吡啶(1.28mL，16.25mmol)超过10min，然后一次性加入DMAP(0.32g，2.6mmol)。室温搅拌反应16h，反应结束后用DCM进行萃取两次，合并有机相并用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到化合物S24-3(6.14g)。
步骤b：将S24-3(5.56g，12.8mmol)、S1-5(0.60g，5.8mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.68g，7.7mmol)在DMF(10mL)溶液中，于77℃下反应18h。反应结束后，将反应混合物冷却，并用己烷(3*10mL)萃取。合并己烷萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶柱层析进行纯化得到阳离子脂质E24-1(3.58g)。E24-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.26(d,4H),4.20(t,4H),3.71(t,2H),3.64(t,4H),2.65(t,2H),2.50(m,4H),2.08(m,2H),1.72-1.18(m,60H),0.89(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E24-1的分子量为813.67Da。
Figure BDA0003804810810000621
实施例25：阳离子脂质(E25-1)
Figure BDA0003804810810000622
对应通式(1)，E25-1中，L1、L2相同且均为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1、为亚戊基，B2为亚庚基，R1为十一烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000623
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为786Da
制备过程如下所示：
步骤a：在氮气的保护下，将S24-2(10.59g，32.0mmol)溶于DCM(30mL)中，室温搅拌下滴加1-十一醇(S25-1，22.02g，128.0mmol)，随后缓慢滴加吡啶(3.2mL，40.0mmol)超过25min，然后一次性加入DMAP(0.78g，6.4mmol)。室温搅拌反应16h，反应结束后后用DCM进行萃取两次，合并有机相并用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到得到5-溴戊基碳酸十一烷基酯(S25-2，3.03g)。
步骤b：将上述产物S25-2(2.91g，8.0mmol)、S1-5(1.01g，9.6mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.36g，4.0mmol)在DMF(50mL)溶液中，在77℃下反应18h。反应结束后，将反应混合物冷却，并用己烷(3*50mL)萃取。合并己烷萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。其与第2次反应合并。粗产物通过硅胶柱层析进行纯化得到产物S25-3(2.33g)。
步骤c：上述化合物S25-4(2.33g，6.0mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，2.40g，60.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S25-4(3.43g，7.2mmol，S25-4是由7-溴庚基-4-硝基苯基碳酸酯和9-十七烷醇反应得到的,反应过程可参考实施例22)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(100mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E25-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到产物E25-1(3.56g)。E25-1的核磁氢谱主要数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.22(t,2H),4.16(t,4H),4.13(m,1H),3.70(t,2H),3.62(t,4H),2.65(t,2H),2.48(m,4H),,1.72-1.25(m,62H),0.90(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E25-1的分子量为785.66Da。
Figure BDA0003804810810000631
实施例26：阳离子脂质(E26-1)
Figure BDA0003804810810000632
对应通式(1)，E26-1中，L1、L2相同且均为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1为亚戊基，B2为亚己基，R1为十一烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000633
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为786Da。
制备过程如下所示：
步骤a：在氮气的保护下，将实施例23的化合物S23-1(11.04g，32.0mmol)溶于DCM(30mL)中，室温搅拌下滴加S26-1(34.56g，128.0mmol)，随后缓慢滴加吡啶(3.2mL，16.3mmol)超过25min，然后一次性加入DMAP(0.78g，6.4mmol)。室温搅拌反应16h，反应结束后用DCM进行萃取两次，合并有机相并用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S26-2(3.66g)
步骤b：将实施例25中的化合物S25-3(2.33g，6.0mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，2.40g，60.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S26-2(3.43g，7.2mmol)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(100mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E26-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到产物E26-1(3.57g)。E26-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.26(d,2H),4.21(t,2H),4.16(t,4H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.49(m,4H),2.07(m,1H),1.72-1.18(m,60H),0.90(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E26-1的分子量为785.67Da。
Figure BDA0003804810810000641
实施例27：阳离子脂质(E27-1)
Figure BDA0003804810810000642
对应通式(1)，E27-1中，L1为-O(C＝O)-，L2为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1为亚戊基，B2为亚庚基，R1为十一烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000643
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为770Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例25中的化合物S25-4(10.00g，21.0mmol)、化合物S1-5(1.84g，17.5mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.92g，10.5mmol)在DMF(20mL)溶液中，在77℃下反应18h。反应结束后，将反应混合物冷却，并用己烷(3*20mL)萃取。合并己烷萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶柱层析进行纯化得到S27-1(7.54g)。
步骤b：将上述化合物S27-1(5.68g，12.0mmol)溶于干燥的THF(60mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，4.80g，120.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S27-2(5.01g，14.4mmol，其中S27-2是由8-溴辛酸与1-壬醇反应制备得到的,反应过程可参考实施例16)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(200mL)搅拌混合。用EtOAc(200mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(200mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(200mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E27-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E27-1(6.93g)。E27-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.21(t,2H),4.12(m,1H),4.07(t,2H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.51(m,4H),2.37(t,2H),1.72-1.25(m,62H),0.90(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E27-1的分子量为769.69Da。
Figure BDA0003804810810000651
实施例28：阳离子脂质(E28-1)
Figure BDA0003804810810000652
对应通式(1)，E28-1中，L1为-(C＝O)O-，L2为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1为亚戊基，B2为亚庚基，R1为十一烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000653
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为770Da。
制备过程如下所示：
将上述化合物S27-1(5.68g，12.0mmol)溶于干燥的THF(60mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，4.80g，120.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S28-1(5.01g，14.4mmol，其中S28-1是由月桂酸与5-溴-1-戊醇反应制备得到的,反应过程可参考实施例16)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(200mL)搅拌混合。用EtOAc(200mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(200mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(200mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E28-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E28-1(6.87g)。E28-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.20(t,2H),4.12(m,1H),4.08(t,2H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.64(t,2H),2.50(m,4H),2.37(t,2H),1.72-1.25(m,62H),0.88(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E28-1的分子量为769.58Da。
Figure BDA0003804810810000654
实施例29：阳离子脂质(E29-1)
Figure BDA0003804810810000661
对应通式(1)，E29-1中，L1为-O(C＝O)O-，L2为-O(C＝O)-，L3为连接键，B1为亚戊基，B2为亚庚基，R1为十一烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000662
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为770Da。
制备过程如下所示：
将上述化合物S25-3(4.67g，12.0mmol)溶于干燥的THF(60mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，4.80g，120.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S29-1(6.62g，14.4mmol，其中S29-1是由8-溴辛酸与9-十七醇反应制备得到的,反应过程可参考实施例16)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(200mL)搅拌混合。用EtOAc(200mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(200mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(200mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E29-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E29-1(6.52g)。E29-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.86(m,1H),4.16(t,4H),3.70(t,2H),3.62(t,4H),2.65(t,2H),2.48(m,4H),2.30(t,2H),1.72-1.25(m,62H),0.88(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E29-1的分子量为769.47Da。
Figure BDA0003804810810000663
实施例30：阳离子脂质(E30-1)
Figure BDA0003804810810000664
对应通式(1)，E30-1中，L1为-O(C＝O)O-，L2为-(C＝O)O-，L3为连接键，B1为亚戊基，B2为亚庚基，R1为十一烷基，R2为
Figure BDA0003804810810000665
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为770Da。
制备过程如下所示：
将上述化合物S25-3(4.67g，12.0mmol)溶于干燥的THF(60mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，4.80g，120.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S30-1(6.62g，14.4mmol，其中S30-1是由2-辛基癸酸与7-溴-1-庚醇反应制备得到的，反应过程可参考实施例16)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(200mL)搅拌混合。用EtOAc(200mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(200mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(200mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E30-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E30-1(6.79g)。E30-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.16(t,4H),4.08(t,2H),3.70(t,2H),3.62(t,4H),2.65(t,2H),2.48(m,4H),2.25(m,1H),1.72-1.25(m,62H),0.88(t,9H)。经MALDI-TOF测试，确定E30-1的分子量为769.38Da。
Figure BDA0003804810810000671
实施例31：阳离子脂质(E31-1)
Figure BDA0003804810810000672
对应通式(1)，E31-1中，L1为-(C＝O)O-，L2为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000673
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为798Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例23的化合物S23-2(3.47g，8.0mmol)、S1-5(0.70g，6.7mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.36g，4.0mmol)在DMF(50mL)溶液中，在77℃下反应18h。反应结束后，将反应混合物冷却，并用己烷(3*50mL)萃取。合并己烷萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。其与第2次反应合并。粗产物通过硅胶柱层析进行纯化得到产物S31-1(2.70g)。
步骤b：上述化合物S31-1(2.75g，6.0mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，2.40g，60.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S31-2(3.01g，7.2mmol，S31-2是由6-溴正己醇和2-己基癸酸反应得到的,反应过程可参考实施例16)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(100mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E31-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E31-1(3.52g)。E31-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.21(t,2H),4.12(m,1H),4.08(t,2H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.51(m,4H),2.25(m,1H),1.72-1.25(m,64H),0.90(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E31-1的分子量为797.72Da。
Figure BDA0003804810810000681
实施例32：阳离子脂质(E32-1)
Figure BDA0003804810810000682
对应通式(1)，E32-1中，L1为-O(C＝O)-，L2为-O(C＝O)O-，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000683
A为-(CRaRb)sO-，Ra和Rb均为氢原子，s为2，n为2，R3为氢原子。总分子量约为798Da。
制备过程如下所示：
将实施例31的化合物S31-1(2.75g，6.0mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，2.40g，60.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S32-1(3.01g，7.2mmol，S32-1是由7-溴庚酸和7-十五烷醇反应得到的,反应过程可参考实施例16)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(100mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E32-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到阳离子脂质E32-1(3.63g)。E32-1的核磁氢谱主要数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.87(m,1H),4.21(t,2H),4.13(m,1H),3.70(t,2H),3.63(t,4H),2.65(t,2H),2.51(m,4H),2.30(t,2H),1.72-1.25(m,64H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E32-1的分子量为797.72Da。
Figure BDA0003804810810000684
实施例33：阳离子脂质(E33-1)
Figure BDA0003804810810000685
对应通式(1)，E33-1中，L1、L2相同且均为酯键，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000691
A为-(CRaRb)sO(CRaRb)sNRc，Ra、Rb和Rc均为氢原子，s为2，n为1，R3为
Figure BDA0003804810810000692
总分子量约为1204Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将实施例1中的氧化产物(S1-4，8.85g，25.0mmol)溶于100mL THF和10mL甲醇的混合溶液中，待上述溶液温度降至0℃后，向上述溶液中加入S1-5(1.25g，12.0mmol)和冰醋酸(0.72g，12.0mmol)，慢慢分批加入NaBH(OAc)3(8.90g，42.0mmol)，待加料完毕后，继续反应2h，TLC跟踪直至原料消耗完毕。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，反应液回至室温，将THF和甲醇浓缩除去，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物S33-1(4.89g)。
步骤b：在干燥洁净的1000mL圆底烧瓶中，加入溶于DMSO的叶酸(S33-2，3.75g，8.5mmol)，S33-1(3.90g，5.0mmol)，吡啶(40mL)和DCC(4.64g，22.5mmol)，室温下搅拌反应4h。反应结束后，用旋转蒸发仪减压浓缩去除吡啶，然后浓缩液用100mL DCM萃取两次，合并有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到阳离子脂质E33-1(5.59g，92.8％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)，δ:8.68(s,1H),7.68(d,1H),6.67(d,1H),4.51(d,2H),4.36(m,1H),4.06(m,4H),3.83-3.45(m,6H),2.63(t,2H),2.53(t,4H),2.34(t,2H),2.18(m,2H),2.08-1.94(m,2H),1.56-1.46(m,8H),1.36-1.19(m,56H),0.88(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E33-1的分子量为1203.87Da。
Figure BDA0003804810810000693
实施例34：阳离子脂质(E34-1)
Figure BDA0003804810810000694
对应通式(1)，E34-1中，L1、L2相同且均为酯键，L3为连接键，B1、B2均为亚己基，R1、R2均为
Figure BDA0003804810810000701
A为-(CRaRb)sO(CRaRb)sNRc，Ra、Rb和Rc均为氢原子，s为2，n为1，R3为
Figure BDA0003804810810000702
总分子量约为1006Da。
制备过程如下所示：
在干燥洁净的1000mL圆底烧瓶中，加入溶于DMF的生物素琥珀酰亚胺酯(S34-1，1.88g，5.5mmol)和溶于DCM的S33-1(3.90g，5.0mmol)，混合搅拌均匀后再加入三乙胺(2.3mL，16.5mmol)，室温下反应，用TLC监测直至反应完全。反应结束后，过滤，浓缩，柱纯化，搜集合并洗脱液，浓缩冻干得到阳离子脂质E34-1(3.65g，72.5％)。1H NMR(CDCl3)δ:4.18(s,2H),4.06(m,4H),3.84-3.55(m,6H),3.27(m,1H),2.83(d,2H),2.63(t,2H),2.52(t,4H),2.22-2.18(m,4H),1.70-1.40(m,12H),1.36-1.19(m,58H),0.87(t,12H)。经MALDI-TOF测试，确定E34-1的分子量为1006.62Da。
Figure BDA0003804810810000703
实施例35：阳离子脂质体的制备
本实施中，制备了5组阳离子脂质体进行比较，其中两组为阳性对照组，三组为实验组，必要时还会设置相应的空白对照组。
在这5组阳离子脂质体的组成中含有的中性脂质都为DSPC，含有的甾醇类脂质都为胆固醇，不同在于阳离子脂质和聚乙二醇化脂质两种组分，其中，阳性对照组1：含有聚乙二醇化脂质PEG-DMG，不含有阳离子脂质；阳性对照组2：阳离子脂质为DLin-MC3-DMA且含有聚乙二醇化脂质PEG-DMG，实验组1：阳离子脂质为P-9，聚乙二醇化脂质为PEG-DMG；实验组2：阳离子脂质为P-10，聚乙二醇化脂质为PEG-DMG，实验组3：阳离子脂质为本发明的P-9，含有本发明的聚乙二醇化脂质E35-1。
实施例35.1:阳离子脂质体1的制备(阳性对照组1)
步骤a：称取二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，3.0μmol)、胆固醇(12.0μmol)和和PEG缀合的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(PEG2k-DMG，
Figure BDA0003804810810000704
0.45μmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL的氯仿使固体充分溶解，摇匀；
步骤b：采用旋转蒸发仪在转速为140rpm、温度为55℃条件下，减压旋蒸除去溶剂氯仿，形成薄层油膜，用真空泵抽干12h，保证氯仿全部除去；
步骤c：往烧瓶中加入30mL含有10％乳糖的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，采用超声清洗仪，在频率为90％条件下，超声30min，形成半透明状乳液；
步骤d：将乳液加入到高压均质机中，在压力为100MPa条件下，过压5次；然后将乳液加入脂质体挤出器中，在压力150MPa条件下，过压10次，制备得到阳离子脂质体1，冷冻干燥24h后得到阳离子脂质体1粉末。
实施例35.2:阳离子脂质体2的制备(阳性对照组2)
步骤a：称取阳离子脂质DLin-MC3-DMA
Figure BDA0003804810810000711
15.0μmol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，3.0μmol)、胆固醇(12.0μmol)、和PEG2k-DMG(0.45μmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL的氯仿使固体充分溶解，摇匀；
步骤b：采用旋转蒸发仪在转速为140rpm、温度为55℃条件下，减压旋蒸除去溶剂氯仿，形成薄层油膜，用真空泵抽干12h，保证氯仿全部除去；
步骤c：往烧瓶中加入30mL含有10％乳糖的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，采用超声清洗仪，在频率为90％条件下，超声30min，形成半透明状乳液；
步骤d：将乳液加入到高压均质机中，在压力为100MPa条件下，过压5次；然后将乳液加入脂质体挤出器中，在压力150MPa条件下，过压10次，制备得到阳离子脂质体2，冷冻干燥24h后得到阳离子脂质体2粉末。
实施例35.3:阳离子脂质体3的制备(实验组1)
步骤a：称取本发明的阳离子脂质P-9(15.0μmol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，3.0μmol)、胆固醇(12.0μmol)、和PEG2k-DMG(0.45μmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL的氯仿使固体充分溶解，摇匀；
步骤b：采用旋转蒸发仪在转速为140rpm、温度为55℃条件下，减压旋蒸除去溶剂氯仿，形成薄层油膜，用真空泵抽干12h，保证氯仿全部除去；
步骤c：往烧瓶中加入30mL含有10％乳糖的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，采用超声清洗仪，在频率为90％条件下，超声30min，形成半透明状乳液；
步骤d：将乳液加入到高压均质机中，在压力为100MPa条件下，过压5次；然后将乳液加入脂质体挤出器中，在压力150MPa条件下，过压10次，制备得到阳离子脂质体3，冷冻干燥24h后得到阳离子脂质体3粉末。
实施例35.4:阳离子脂质体4的制备(实验组2)
步骤a：称取阳离子脂质P-10(15.0μmol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，3.0μmol)、胆固醇(12.0μmol)和PEG2k-DMG(0.45μmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL的氯仿使固体充分溶解，摇匀；
步骤b：采用旋转蒸发仪在转速为140rpm、温度为55℃条件下，减压旋蒸除去溶剂氯仿，形成薄层油膜，用真空泵抽干12h，保证氯仿全部除去；
步骤c：往烧瓶中加入30mL含有10％乳糖的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，采用超声清洗仪，在频率为90％条件下，超声30min，形成半透明状乳液；
步骤d：将乳液加入到高压均质机中，在压力为100MPa条件下，过压5次；然后将乳液加入脂质体挤出器中，在压力150MPa条件下，过压10次，制备得到阳离子脂质体4，冷冻干燥24h后得到阳离子脂质体4粉末。
实施例35.5:阳离子脂质体5的制备(实验组3)
实施例35.5.1聚乙二醇化脂质E35-1的制备
Figure BDA0003804810810000721
对应通式(2)，E35-1中，R1、R2为十四烷基，B3、B4为连接键，L7、L8为连接键，L3为-CH2CH2O-或-CH2CH2-，A为-OCH2CH2-或-CH2CH2O-，其中Ra和Rb为氢原子，s为2，n1≈45，R为甲基或甲氧基，总分子量约为2450Da。
制备过程如下所示：
步骤a：将化合物S35-1(20.00g，10.0mmol，mPEG-OH，Mw约2000，n1≈45，PDI＝1.03)，甲苯(200mL)于140℃下共沸除水，蒸出60mL溶剂后，反应降至室温。加入TEA(2.98g，20.0mmol)和MsCl(2.05g，18.0mmol)，于室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入水(200mL)中，用EtOAc(100mL*2)萃取两次，保留水相，水相再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，用异丙醇于50℃下溶解，冰浴下重结晶，过滤得到化合物S35-2(18.00g，90％)。
步骤b：上述化合物S35-2(18.00g，9.0mmol)加入80mL水，于室温下搅拌溶解。加入碳酸钾(12.42g，90.0mmol)，化合物S35-3(9.58g，45.0mmol)和四正丁基溴化铵(0.29g，0.9mmol)，反应液于室温下搅拌反应72小时。反应结束后，用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液(100mL)反洗一次，保留有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物S35-4粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到目标化合物S35-4(12.00g)。
步骤c：上述化合物S35-4(12.00g，6.0mmol)溶于干燥的THF(120mL)中，冰浴下缓慢加入NaH(60％，2.40g，60.0mmol)，于冰浴下反应1小时。加入化合物S35-5(8.28g，30.0mmol)，冰浴下搅拌反应1小时后，慢慢恢复至室温反应过夜。反应结束后，将反应置于冰浴下，缓慢加入2mL甲醇淬灭反应，搅拌30分钟后，加入水(300mL)搅拌混合。用EtOAc(150mL*2)萃取两次，保留水相，再用二氯甲烷(100mL*2)萃取两次，收集有机相合并，用饱和氯化钠(100mL)反洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到化合物E35-1粗品。通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到聚乙二醇化脂质E35-1(9.00g，75％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:3.85-3.45(m,182H),3.37(s,3H),3.15(t,2H),2.94(t,2H),2.62(t,2H),1.58-1.48(m,4H),1.36-1.19(m,44H),0.86(t,6H)。经MALDI-TOF测试，确定E35-1的分子量为2447Da，PDI＝1.03。
Figure BDA0003804810810000722
实施例33.5.2:阳离子脂质体5的制备(实验组3)
步骤a：称取阳离子脂质P-9(15μmol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，3μmol)和胆固醇(12μmol)、和本发明的实施例35.5.1中制得的聚乙二醇化脂质E35-1(0.45μmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL的氯仿使固体充分溶解，摇匀；
步骤b：采用旋转蒸发仪在转速为140rpm、温度为55℃条件下，减压旋蒸除去溶剂氯仿，形成薄层油膜，用真空泵抽干12h，保证氯仿全部除去；
步骤c：往烧瓶中加入30mL含有10％乳糖的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，采用超声清洗仪，在频率为90％条件下，超声30min，形成半透明状乳液；
步骤d：将乳液加入到高压均质机中，在压力为100MPa条件下，过压5次；然后将乳液加入脂质体挤出器中，在压力150MPa条件下，过压10次，制备得到阳离子脂质体5，冷冻干燥24h后得到阳离子脂质体5粉末。
实施例36：阳离子脂质体核酸药物组合物制剂的制备
步骤a：取0.03mL的生理盐水做为核酸类药物组合物制剂的工作液；
步骤b：称取0.1mg的阳离子脂质体，溶于生理盐水，平衡30min。按照复合比N/P比为10/1，称取1.00μg的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的生理盐水，复合30min，制备得到本发明所述的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂，其含有的阳离子脂质体分别对应实施例35中的5组阳离子脂质体(对照组1：阳离子脂质无且含有聚乙二醇化脂质PEG-DMG，对照组2：阳离子脂质为DLin-MC3-DMA且含有聚乙二醇化脂质PEG-DMG，实验组1：阳离子脂质为P-9且含有聚乙二醇化脂质PEG-DMG，实验组2：阳离子脂质为P-10且含有聚乙二醇化脂质PEG-DMG，实验组3：阳离子脂质为本发明的P-9且含有本发明的聚乙二醇化脂质E35-1，且这5组阳离子脂质体中含有的中性脂质都为DSPC，含有的甾醇类脂质都为胆固醇)。
实施例37：阳离子脂质体核酸药物组合物制剂的生物学活性测试
(1)基因复合能力的研究
本实施例中，采用凝胶渗透电泳实验考察本发明所述的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂的基因复合能力。称取0.8g的琼脂糖溶于40mL的TAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却，加入5μL的核酸染料GelGreen于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自然晾干。将不同的阳离子脂质体/siRNA核酸药物组合物制剂(实施例36所述)与2μL的LoadingBuffer的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为90V进行电泳实验，常温下电泳10min。结果显示，实验组基本不存在游离的siRNA，说明了本发明的阳离子脂质制备的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂有较强的基因(mRNA)复合能力。
(2)细胞毒性(生物相容性)的研究
采用MTT染色法测试本发明的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂的细胞毒性测试，用肝癌细胞HepG2作为细胞模型，以接种密度1×104个细胞/孔，将细胞悬浮液100μL/孔接种到96孔板中。接种之后，在37℃、4％CO2的细胞培养箱中孵育培养24h。将阳离子脂质体核酸药物组合物制剂溶解于培养基中配成所需浓度，必要时可以加适量助溶剂，吸弃旧培养基，每孔中加入含有1nM、10nM、100nM三个浓度阳离子脂质体核酸药物组合物制剂(N/P为10/1)的培养基100μL，空白对照组加入新鲜培养基100μL，每组每个浓度都是6个复孔。阳离子脂质体核酸药物组合物制剂与HepG2癌细胞共同孵育24h后，每个孔加入5mg/mL的MTT的PBS缓冲液20μL MTT与癌细胞孵育4h后，吸弃培养基和MTT缓冲液的混合液，加入DMSO 150μL/孔，用于溶解活细胞的紫色结晶物甲瓒，振荡充分后，用酶标仪测试490nm处的吸光度。根据测得的吸光值进行计算画图，结果显示，与空白对照组相比，本发明制备的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂在不同N/P条件下，细胞存活率均大于93％，说明本发明的聚乙二醇化脂质修饰的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂具有很好的生物相容性。
(3)核酸转运效率的研究
为了考察本发明的阳离子脂质制备的各组阳离子脂质体核酸药物组合物制剂的核酸转运率，本实验以稳定表达荧光素酶的Luc-Hela细胞为模型，考察N/P为10/1的各组阳离子脂质体核酸药物组合物制剂(实施例36所述)的核酸转运率。在96孔板中，细胞培养到细胞密度达到80％时，将各组阳离子脂质体核酸药物组合物制剂加入培养基中，在37℃、4％CO2的细胞培养箱中孵育培养24h，然后吸弃旧培养基，换上新鲜培养基继续培养24h。采用溶解缓冲液处理细胞，用荧光素酶测试试剂盒，在底物发光化学检测仪上测定荧光强度，另设空白对照往培养的细胞中加入相同剂量的裸露的siRNA。由于转录进入细胞的siRNA能抑制荧光素酶基因Fluc mRNA的表达，以未处理细胞为阴性对照组，设阴性对照组中的靶基因的表达(即荧光强度)指定为100％，结果显示，空白对照组的荧光强度为78％，阳性对照组1荧光强度为65％，阳性对照组2的荧光强度为43％，实验组1的荧光强度为33％，实验组2的荧光强度为35％，实验组3的荧光强度为25％。与空白对照组相比，阳性对照组1、阳性对照组2、实验组1、实验组2、实验组3均有较好的荧光素酶基因抑制效果，说明了脂质体能提高核酸药物的转运率；与阳性对照组1相比，阳性对照组2、实验组1、实验组2和实验组3的均有较好的荧光素酶基因抑制效果，说明了含有阳离子脂质的阳离子脂质体能提高核酸药物的转运率；与阳性对照组2相比，本发明的实验组1和实验组2均有较好的荧光素酶基因抑制效果，说明了本发明的阳离子脂质与现有的阳离子脂质相比，能提高脂质体的核酸转运率；与实验组1相比，实验组3有较好的荧光素酶基因抑制效果，即有很好的基因沉默效果，说明了本发明的聚乙二醇化脂质及本发明的阳离子脂质制备的阳离子脂质体能进一步提高基因的转染率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，对此应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (19)

1.一种聚乙二醇化脂质，其结构如下所示：
Figure FDA0004052214140000011
其中，n1为20-250的整数。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化脂质，其特征在于，所述n1为45。
3.一种阳离子脂质体，其特征在于，含有权利要求1所述的聚乙二醇化脂质、中性脂质、类固醇脂质和阳离子脂质；所述阳离子脂质的结构如通式(2-2)、或式(2-3)或式(2-4)所示：
Figure FDA0004052214140000012
其中，N为氮支化中心；
L3为连接键；
B1、B2各自独立地为亚戊基、亚己基、亚庚基中任一种；
R1、R2各自独立地为十一烷基、
Figure FDA0004052214140000013
Figure FDA0004052214140000014
中任一种；
R3为H；
A为-CH2CH2O-；
n为2或3。
4.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述中性脂质为磷脂。
5.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述B1、B2为亚己基。
6.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述R1、R2各自独立地为
Figure FDA0004052214140000015
7.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述R1、R2为
Figure FDA0004052214140000021
8.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质的结构选自以下结构中任一种：
Figure FDA0004052214140000022
Figure FDA0004052214140000031
Figure FDA0004052214140000041
Figure FDA0004052214140000051
9.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述中性脂质选自1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺中任一种及其组合物。
10.根据权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述类固醇脂质选自胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中任一种及其混合物。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的阳离子脂质体，其特征在于，包含20-80％的阳离子脂质、5-15％的中性脂质、25-55％的类固醇脂质和0.5-10％的聚乙二醇化脂质，所述百分比为各脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比。
12.根据权利要求3-10中任一项所述的阳离子脂质体，其特征在于，
所述阳离子脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为30-65％；
或所述中性脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为7.5-13％；
或所述类固醇脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为35-50％；
或所述聚乙二醇化脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为1-3％。
13.根据权利要求3-10中任一项所述的阳离子脂质体，其特征在于，
所述阳离子脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％中任一种；
或所述中性脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为8％、9％、10％、11％、12％中任一种；
或所述类固醇脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％中任一种；
或所述聚乙二醇化脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％中任一种。
14.一种阳离子脂质体核酸药物组合物，其特征在于，含有权利要求3-10中任一项所述的阳离子脂质体和核酸药物。
15.根据权利要求14所述的阳离子脂质体核酸药物组合物，其特征在于，所述核酸类药物选自DNA、反义核酸、质粒、mRNA、干扰核酸、适体、miRNA、核酶和siRNA中任一种。
16.根据权利要求15所述的阳离子脂质体核酸药物组合物，其特征在于，所述核酸类药物选自DNA、mRNA、miRNA和siRNA中任一种。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的阳离子脂质体核酸药物组合物，其特征在于，所述药物组合物作为药物使用，选自以下任一种药物：治疗癌症的药物、抗感染剂、抗生素剂、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗。
18.一种阳离子脂质体核酸药物组合物制剂，其特征在于，含有权利要求17所述的脂质体核酸药物组合物和药学上可接受的稀释剂或赋形剂。
19.根据权利要求18所述的阳离子脂质体核酸药物组合物制剂，其特征在于，所述稀释剂或赋形剂为去离子水、磷酸盐缓冲液和生理盐水中任一种。
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