本申请要求于2020年4月2日提交至中国专利局、申请号为202010254388.3、发明名称为“全人源抗人CD22的嵌合抗原受体及其应用”的中国专利申请的优先权。
发明内容
在一方面,本文提供了抗CD22抗体分子,其包括轻链可变区和重链可变区,其中所述重链可变区包括选自如下任一组的互补决定区:
具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:5所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:6所示序列的HCDR3;
具有SEQ ID NO:10所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:12所示序列的HCDR3;
具有SEQ ID NO:16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:17所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:18所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQID NO:24所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述抗CD22抗体分子为IgG形式,与CD22的结合具有不大于2nM的KD值;或者所述抗CD22抗体分子为Fab形式,与CD22的结合具有不大于20nM的KD值。
在一些实施方案中,所述抗CD22抗体分子为全人源抗体分子。
另一方面,本文提供了抗CD22抗体分子,其包括轻链可变区和重链可变区,其中所述轻链可变区包括选自如下任一组的互补决定区:
具有SEQ ID NO:1所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:2所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:3所示序列的LCDR3;
具有SEQ ID NO:7所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:8所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:9所示序列的LCDR3;
具有SEQ ID NO:13所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:14所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:15所示序列的LCDR3;以及
所述重链可变区包括选自如下任一组的互补决定区:
具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:5所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:6所示序列的HCDR3;
具有SEQ ID NO:10所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:12所示序列的HCDR3;
具有SEQ ID NO:16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:17所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:18所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:1所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:2所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:3所示序列的LCDR3,所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:5所示序列的HCDR2和具有SEQ IDNO:6所示序列的HCDR3;
所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:7所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:8所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:9所示序列的LCDR3,所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:10所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:12所示序列的HCDR3;或者
所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:13所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:14所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:15所示序列的LCDR3,所述重链可变区包括具有SEQ IDNO:16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:17所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:18所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQID NO:23所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQID NO:24所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:19所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:20所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列;所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:21所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:22所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列;或者所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:23所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:24所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述抗CD22抗体分子为scFv形式,并包括与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述抗CD22抗体分子为IgG形式,与CD22的结合具有不大于2nM的KD值;或者所述抗CD22抗体分子为Fab形式,与CD22的结合具有不大于20nM的KD值。
在一些实施方案中,所述抗CD22抗体分子为全人源抗体分子。
另一方面,本文提供了靶向CD22的嵌合抗原受体,其包括结合CD22的抗原结合结构域,所述抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区,其中所述轻链可变区包括选自如下任一组的互补决定区:
具有SEQ ID NO:1所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:2所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:3所示序列的LCDR3;
具有SEQ ID NO:7所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:8所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:9所示序列的LCDR3;
具有SEQ ID NO:13所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:14所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:15所示序列的LCDR3;以及
所述重链可变区包括选自如下任一组的互补决定区:
具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:5所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:6所示序列的HCDR3;
具有SEQ ID NO:10所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:12所示序列的HCDR3;
具有SEQ ID NO:16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:17所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:18所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:1所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:2所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:3所示序列的LCDR3,所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:5所示序列的HCDR2和具有SEQ IDNO:6所示序列的HCDR3;
所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:7所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:8所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:9所示序列的LCDR3,所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:10所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:12所示序列的HCDR3;或者
所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:13所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:14所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:15所示序列的LCDR3,所述重链可变区包括具有SEQ IDNO:16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:17所示序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:18所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQID NO:23所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQID NO:24所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:19所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:20所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列;所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:21所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:22所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列;或者所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:23所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列,所述重链可变区包括与SEQ ID NO:24所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述抗原结合结构域为scFv形式。
在一些实施方案中,所述抗原结合结构域包括与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述嵌合抗原受体还包括CD3z胞内信号域和4-1BB共刺激信号域。
在一些实施方案中,所述嵌合抗原受体从N末端到C末端依次包括CD8α信号肽,所述抗原结合结构域,CD8α铰链区,跨膜区,4-1BB共刺激信号域,和CD3z胞内信号域。
在一些实施方案中,所述嵌合抗原受体包括与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQID NO:37所示序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述嵌合抗原受体在C末端还包括自裂解多肽T2A和tEGFR序列。
另一方面,本文提供了核酸分子,其编码上述抗体分子或上述嵌合抗原受体。
在一些实施方案中,所述核酸分子包括如SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ IDNO:40所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中,所述核酸分子包括SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或SEQ IDNO:45所示的核苷酸序列。
另一方面,本文提供了包括上述核酸分子的表达载体。
另一方面,本文提供了表达上述嵌合抗原受体的免疫细胞。
在一些实施方案中,所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。
另一方面,本文提供了药物组合物,其包括上述抗体分子、上述嵌合抗原受体或上述免疫细胞以及药学上可接受的载体。
另一方面,本文提供了上述抗体分子、上述嵌合抗原受体、上述核酸分子、上述表达载体,或上述免疫细胞在制备治疗CD22相关疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中,所述CD22相关疾病为B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
另一方面,本文提供了在患者中治疗CD22相关疾病的方法,其包括向所述患者给予治疗有效量的上述抗体分子、上述免疫细胞或上述药物组合物。
在一些实施方案中,所述CD22相关疾病为B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
具体实施方式
除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
“抗体”指由浆细胞(效应B细胞)分泌、被机体免疫***用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。经典抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异,将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。在可变区中,某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(骨架区,FR)更易变化,称为高变区(HVR),高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补,故又称为互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。重链和轻链均具有三个互补决定区,分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。在一些情形下,抗体也可以用来指代具有抗原结合能力的抗体片段,例如scFv、Fab、F(ab’)2等。
“单链抗体(single chain fragment variable,scFv)”,是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠,来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段,因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
“嵌合抗原受体(CAR)”,也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体,为一种工程化的膜蛋白受体分子,其可将期望的特异性赋予免疫效应细胞,例如与特定肿瘤抗原结合的能力。嵌合抗原受体通常由胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域构成。在一些情形下,抗原结合结构域为一段scFv序列,负责识别和结合特定的抗原。胞内信号结构域通常包括免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM),例如来源于CD3z分子的信号传导结构域,负责激活免疫效应细胞,产生杀伤作用。另外,嵌合抗原受体还可在氨基端包括负责新生蛋白在细胞内定位的信号肽,以及在抗原结合结构域和跨膜结构域之间包括铰链区。除了信号传导结构域,胞内信号结构域还可包括来源于例如4-1BB或CD28分子的共刺激结构域。在本文描述CAR结构时,可采用缩写“bbz”表示包括4-1BB和CD3z的胞内信号结构域,例如,将包括抗体克隆80(作为抗原结合结构域)以及4-1BB和CD3z(作为胞内信号结构域)的CAR分子简写为“clone80-bbz”。
“CAR-T细胞”指表达CAR的T细胞,通常采用编码CAR的表达载体转导T细胞获得。常用的表达载体为病毒载体,例如慢病毒表达载体。经嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)不受主要组织相容性复合体的限制,具有特异性靶向杀伤活性和持久扩增的能力。除T细胞外,也可以用编码CAR的表达载体转化诸如NK细胞的其他淋巴细胞,获得表达该CAR的靶向杀伤性细胞。
“CD22”为Siglec家族凝集素,在膜外部分包括7个IgG样结构域,分子量约135kD。人CD22及其变体可以在UniProt中以登记号P20273获得。作为跨膜糖蛋白,其在前B细胞(pre-B cell)阶段开始在B细胞表面上表达,存在于成熟B细胞上,而在浆细胞上消失。美国国家癌症研究所报道了一种靶向CD22的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的I期临床结果,证实CD22 CAR-T安全有效,可使部分患者缓解[2]。因此,CD22蛋白是一个理想的B细胞肿瘤靶点。
“m971分子”为采用CD22-Fc融合蛋白从人Fab噬菌体库淘选的抗CD22抗体,其结合CD22分子的近膜段表位[3]。利用源于该m971的scFv构建的CAR在临床前模型中显示出较好的抗白血病活性[4]。在本文的一些实施例中,以m971 scFv(氨基酸序列SEQ ID NO:28)构建的CAR作为参比对象来评估本文提供的CAR的一些生物学活性。
“KD”为平衡解离常数,可用于衡量抗体和其抗原之间的结合亲和力强弱。KD值越小,表明亲和力越强。
提及氨基酸或核苷酸序列时,术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量,一般以百分比表示。通常,在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前,先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置,两序列中的氨基酸残基或碱基相同,则认为两序列在该位置一致或匹配;两序列中的氨基酸残基或碱基不同,则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中,用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中,还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的,可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到),通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。
在一些实施方案中,本发明提供的抗CD22抗体分子的轻链可变区包括与SEQ IDNO:19所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列,重链可变区包括与SEQ ID NO:20所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的抗CD22抗体分子的轻链可变区包括与SEQ IDNO:21所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列,重链可变区包括与SEQ ID NO:22所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的抗CD22抗体分子的轻链可变区包括与SEQ IDNO:23所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列,重链可变区包括与SEQ ID NO:24所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的CAR中所述抗原结合结构域包括与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的CAR包括与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQID NO:37所示序列有至少90%序列一致性(例如,至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性)的氨基酸序列。
本领域技术人员可以理解的是,在本文提供的具体序列基础上,可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原CD22的结合能力或生物学活性,从而获得本发明提供的抗CD22抗体分子或靶向CD22的嵌合抗原受体的相应变体,这些变体也应包括在本发明的范围内。
本领域技术人员还可以理解的是,在本文提供的具体重链可变区序列基础上,可以通过以CD22作为抗原筛选抗体轻链库(如人源噬菌体轻链库),从而获得与所述重链可变区匹配并维持CD22结合能力的轻链可变区。以此方式可获得的抗CD22抗体分子以及利用该抗CD22抗体分子构建的靶向CD22的CAR也包括在本发明的范围内。
提及药物组合物,所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质,这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应,同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。
“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明双特异性抗体的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如,典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg活性成分。
采用本发明筛选的抗CD22抗体分子制备的CAR-T细胞在体外和体内均对表达CD22的靶细胞有更佳的杀伤活性,有望用于一些淋巴瘤及白血病的治疗。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
实施例1抗CD22抗体分子的制备及分析
通过酵母表面展示技术筛选针对CD22的全人源抗体。将已构建的scFv酵母展示文库,用生物素化的CD22-llama-Fc或者CD22-his蛋白进行多轮的流式分选,共获得了129个针对CD22的全人源抗体克隆。对它们进行测序并将它们用于随后的体外和体内筛选。
将所制备的抗体分别制备为IgG和Fab形式,检测它们与人CD22的结合能力(ForteBio),部分结果显示在表1和表2中。
表1 IgG形式的抗体与人CD22的结合检测结果
克隆编号 |
IgG KD(M)Avid |
kon(1/Ms) |
koff(1/s) |
Response(nm) |
17 |
1.6E-09 |
1.3E+05 |
2.0E-04 |
0.62 |
28 |
9.7E-10 |
2.1E+05 |
2.0E-04 |
0.81 |
80 |
8.2E-10 |
2.4E+05 |
2.0E-04 |
0.93 |
表2 Fab形式的抗体与人CD22的结合检测结果
克隆编号 |
Fab KD(M)Monovalent |
kon(1/Ms) |
koff(1/s) |
Response(nm) |
17 |
8.1E-09 |
2.1E+05 |
1.7E-03 |
0.19 |
28 |
9.4E-10 |
2.8E+05 |
2.7E-04 |
0.25 |
80 |
1.3E-08 |
3.6E+05 |
4.6E-03 |
0.24 |
通过表位分箱(epitope binning)分析,将所有129个抗体分为7个Bins。其中,Bin3为m971竞争组。Bin 4和5的抗原结合位点为CD22胞外靠近膜的区域。我们选取了所有Bin 3、4、和5的抗体,以及4个其余Bins的抗体,总计62个抗体序列,用于后续的报告基因法初筛。其中,克隆80、28与m971结合相近的抗原表位,都属于Bin3。克隆17结合抗原表位与m971不同,属于Bin 4。
实施例2 CD22 CAR质粒载体构建
首先,人工合成核苷酸序列(序列为SEQ ID NO:42),该序列中包含KOZAK(碱基1-9)、CD8a信号肽(碱基10-72,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:30)、ccdB筛选基因(碱基73-428)、CD8a铰链区及跨膜区(碱基429-677,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:31)、4-1BB共刺激因子(碱基678-803,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:32)、CD3z胞内信号传导结构域(碱基804-1139,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:33)、T2A剪切肽(碱基1140-1202,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:29)、tEGFR(碱基1203-2276,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:34)。通过PCR拼接方法,将上述合成序列***到慢病毒载体PLVX-EF1alpha-IRES-Puro质粒(Clontech,Cat.No.631988)的多克隆位点,获得如图1所示的PXL0662质粒。
然后,分别合成编码scFv的核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQID NO:40,SEQ ID NO:41等核苷酸序列),通过PXL0662质粒中两个II型内切酶位点BsmBI(2339和2701位点)将这些scFv的核苷酸序列分别***到PXL0662中,获得编码CD22 CAR的各质粒载体。
实施例3 CD22 CAR报告基因法初筛
工作原理
CAR-T细胞的激活是通过CAR分子胞内区中CD3z和共刺激因子来实现的,其中CD3z可以激活细胞中NFAT信号通路,这是CAR-T细胞激活的一个必要条件。因此,可以通过NFAT报告基因方法,筛选出具有激活NFAT信号通路功能的CAR分子[5]。
初筛过程中,采用整合了NFAT-RE-ffLuc报告基因的Jurkat细胞作为报告细胞(如图2所示,细胞命名为JLuc307)。CAR分子通过质粒电转的方式瞬时表达在报告细胞的表面。当表达CAR分子的报告细胞和靶细胞共孵育后,靶细胞表面抗原可以特异性激活CAR分子,进而激活报告基因(ffLuc,萤火虫荧光素酶)的表达。然后,通过检测荧光素酶的活性,可以评价CAR分子激活NFAT信号通路的能力。该报告基因法所使用的质粒还包括编码截短的EGFR(tEGFR)的序列,在tEGFR表达于细胞表面时,可用于标记成功表达了CAR的细胞。此外,由于不同CAR分子在电转时的效率不同,因此可以通过与CAR分子共混的内参质粒(CMV-hRLuc,海肾荧光素酶)来标定电转效率。
操作步骤
1)将待测CAR质粒和内参质粒按照固定比例混合后,用电转方法转染报告细胞;
2)转染后48h,取部分细胞,用PE-anti human EGFR抗体染色进行流式检测,用于评估CAR质粒的瞬时表达情况;
3)转染后72h,将报告细胞和靶细胞按照1∶1的比例混合后,分别铺入U底96孔板中孵育24h;其中每孔中加入3x104个报告细胞,每种靶细胞设置3个复孔;
4)孵育完成后,在4℃,1000g下离心5min,移除培养上清后,每孔加入100μL裂解液裂解细胞,从中取20μL细胞裂解液用于双荧光素酶活性检测。
筛选标准
CD22阳性靶细胞可以有效激活NFAT-RE-ffLuc报告基因,产生荧光信号。无靶细胞刺激或者CD22阴性靶细胞刺激下,本底产生(tonic effects)或者非特异激活产生的荧光信号低。
结果
初筛共分成6个批次进行,每批检测均含有PXL0589(m971-bbz-T2A-tEGFR,clone0-2)质粒作为阳性对照,pGL4.75质粒(编号PXL0337)作为阴性对照(mock)。
由于62个待测抗体的koff值都不相同,并且部分抗体与CD22抗原结合后解离速度很快,因此CAR分子在报告细胞JLuc307上的瞬时表达情况,通过EGFR抗体间接进行表征。流式检测结果显示,除clone 4外,其余61个待测CAR分子均可在JLuc307细胞上瞬时表达。代表性流式检测图显示在图3中。
报告基因法初筛过程中,选用了Raji、REH、JVM2、K562和CD22 K/O Raji(clone3D11或3E09,为我们制备的CD22敲除/敲减Raji细胞)等细胞作为靶细胞。在初筛前,我们分别使用APC mouse anti-human CD22抗体(clone S-HCL-1)或者FITC mouse anti-humanCD22抗体(clone HIB22),通过流式检测对靶细胞表面CD22抗原的表达情况进行检测。结果如图4所示,其中Raji细胞为CD22高表达;3E09、REH、JVM2细胞为CD22中等表达;K562和3D11细胞为CD22阴性细胞。
通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒,可以分别得到萤火虫荧光素酶(ffLuc)和海肾荧光素酶(RLuc)两组荧光读数;其中,海肾荧光素酶读书作为内参,用来消除细胞数量或者转染效率的差异。因此,每种CAR样品受靶细胞激活产生的NFAT-RE-ffLuc转录调控水平,可以用ffLuc/RLuc比值(RLU)来表征。以第一批检测为例,结果如图5所示。其中,clone0-2为对照CAR样品(m971),当其受到阳性靶细胞Raji、3E09、JVM2刺激可以激活NFAT,并且信号强度与靶细胞上抗原表达密度正相关;当其受阴性靶细胞3D11、K562刺激或者没有靶细胞刺激情况下,不会激活NFAT产生荧光信号。对比clone 0-2结果,Clone 28、36、和80是能够特异识别CD22靶细胞并且激活NFAT信号通路的克隆,其余克隆被淘汰。
通过报告基因法的筛选,从62个克隆中总计筛选出10个克隆进行下一步的功能评价。具体步骤包括制备慢病度载体、CAR-T细胞制备、CAR-T细胞体外功能评价等。
实施例4.慢病度载体的制备
对于实施例3中获得的10个克隆,对应的慢病度载体制备过程如下。
复苏HEK293T细胞,在含有10%FBS的DMEM培养基中培养。经过2~3代细胞扩增培养后,按照6x 104个/cm2的密度接种到十层细胞工厂中。在细胞接种3天后,进行质粒转染。质粒转染液用Opti-MEM配制,质粒终浓度为10μg/mL,其中包含CAR载体质粒(T)、psPAX2质粒(P)和pMD2.G质粒(E),三者比例为T∶P∶E=5∶3∶2。此外,质粒转染液还加入终浓度为30μg/mL的PEI,充分混匀,并在室温孵育30min后使用。每个细胞工厂用100mL质粒转染液进行转染。
72小时后,收取上清液至离心管中,3000g 4℃离心10min,离心后上清液用0.45μm的滤器过滤。将过滤后的上清液在27000g 4℃离心4小时。离心后弃去上清,用4℃预冷的PBS重悬病毒。对重悬后的病毒进行分装,并放在-80℃保存备用。
实施例5.CAR-T细胞的制备
本实施例采用健康供者细胞来制备CAR-T,并用于评价实施例3中获得的10个克隆的功能。CAR-T的制备过程示例如下。
第1天,采集约80mL健康供者的外周血,使用Ficoll分离得到PBMC,进一步使用CD3MicroBeads分选获得T细胞。分选后的T细胞使用CD3/CD28 Dynabeads进行活化。活化约24小时后(第2天),分别加入实施例4中制备的慢病毒转导(MOI=3),转导时T细胞密度约为1.5×106个细胞/mL。在第3天时,对转导后的T细胞进行一次换液。之后,维持细胞密度在(0.6~2.0)×106个细胞/mL之间进行培养。
细胞培养至第6或7天时,使用流式细胞术检测细胞表面CAR分子、tEGFR分子以及CD8的表达情况。这里以来自供者SXW的外周血制备的CAR-T细胞为例说明。在细胞培养第6天时,每个样品分别取出约5×105个细胞,500g离心去除培养基。然后,用PBS+1%HSA溶液清洗细胞两遍后,再用50μLPBS+1%HSA溶液重悬细胞,并在每个样品中分别加入2μL CD22-FITC蛋白(Acro Biosystem,Cat.No.SI2-HF2H6)、2μL APC anti-human CD8抗体(BD,Cat.No.555369)和2μL PE anti-human EGFR抗体(BioLegend,Cat.No.352904),混匀后4℃避光孵育20min。孵育完成后,用PBS+1%HSA溶液再次清洗细胞两遍,然后用200μL PBS+1%HSA溶液重悬细胞后,上机检测。部分检测结果如图6和表3所示,除了对照T细胞外,所有样品均可以同时表达EGFR和CAR分子,并且CAR分子可以正常和CD22蛋白结合,CAR阳性率(CAR%)在34.6~53.3%之间,CD8阳性细胞群上可以正常表达CAR分子。
表3供者SXW细胞制备的CAR-T样品的流式检测数据。
实施例6.CAR-T细胞体外功能评价
实施例5中制备的CAR-T细胞,培养至第8-12天之间时,采用CD107a脱颗粒实验(CD107a degranulation assay)和体外细胞杀伤实验(in-vitro cytotoxicity assay)两种方法,对其进行体外功能评价。其工作原理和筛选标准如下。
6.1 CD107a脱粒试验
工作原理
CD107a是细胞内微囊泡的标志物,当负载有颗粒酶的微囊泡与细胞膜融合后,细胞膜上的CD107a会增加,当用莫能酶素(monesin,购自BioLegend)阻断其回收时,可以定量反映微囊泡释放的强度[6]。因此,在CAR-T细胞受靶细胞表面抗原刺激发生脱颗粒效应时,可以通过流式检测CAR-T细胞表面CD107a的阳性率,来判断CAR-T细胞的激活情况。
操作步骤
1)CD22阳性和阴性靶细胞分别在室温、300g下离心5min;弃上清后,用T细胞培养基重悬为2x105个细胞/mL;
2)根据待测CAR-T细胞的CAR阳性率和E∶T值(通常采用0.3∶1),将CAR-T细胞重悬到合适密度,并加入monensin和PE/Cy7 mouse anti-human CD107a抗体;
3)在U底96孔板中,分别加入100μL/孔待测CAR-T细胞和100μL/孔靶细胞,混合均匀,然后放入培养箱中(37℃,5%CO2)孵育3h;
4)孵育完成后,在4℃,600g下离心5min后弃上清,用200μL/孔DPBS+1%HSA洗细胞2次;
5)用20μL/孔DPBS+1%HSA重悬细胞,并加入APC mouse anti-human CD8抗体和Alexa Fluor 488 anti-human EGFR抗体(或者FITC-CD22蛋白),混匀细胞后在冰上避光孵育20min;
6)孵育完成后,用200μL/孔DPBS+1%HSA洗细胞3次,然后用200μL/孔DPBS+1%HSA重悬细胞,进行流式检测。
筛选标准
CD22阳性靶细胞可以有效激活CAR-T细胞(CD8+/CAR+细胞群中,CD107a阳性比例高)。无靶细胞刺激或者CD22阴性靶细胞刺激下,CD8+/CAR+细胞群中,CD107a阳性比例低。
结果
供者SXW的CAR-T样品在day 8时进行CD107a脱粒试验。CD107a脱粒试验中使用的CD22阳性靶细胞有Raji、NALM6、REH、和JVM2,阴性靶细胞有Jurkat、U266、HEK293、Karpas-299、K562和3D11,其中3D11为制备的CD22敲除/敲减Raji细胞。CD107a脱粒试验数据分析示例如图7所示,首先在SSC vs FSC散点图(图7a)中,选取活细胞群。然后在活细胞群的FSC-Hvs FSC-A散点图(图7b)中,选取单分散细胞。然后在单分散细胞群的SSC vs APC-CD8散点图(图7c)中,选取CD8阳性细胞。最后在CD8阳性细胞的PECy7-CD107a vs AF488-EGFR散点图(图7d)中,分析EGFR阳性细胞群中CD107a的阳性比率。通过图7d中Q2/(Q2+Q3)的比例计算CD107a阳性率,计算结果如表4所示。此外,由于T细胞中没有EGFR,其CD107a阳性率通过图7d中Q1/(Q1+Q2)计算。
在阳性靶细胞刺激下,所有克隆的CAR-T细胞均会发生脱颗粒效应。其中,clone80、clone 28、clone 36和clone 17的脱颗粒效应和对照CAR(m971-bbz)相近。但是,在CD22阴性靶细胞刺激下,clone 36发生明显脱颗粒效应,因此clone 36可能存在非特异性激活问题,被淘汰。
此外,肿瘤细胞表面CD22抗原的表达量下调,是造成CD22 CAR-T细胞治疗后复发的其中一个主要原因[8]。因此,我们希望获得能够识别并杀伤CD22低表达的肿瘤细胞的CAR分子。由于3D11为CD22敲除/敲减Raji细胞,clone 80、clone 28、clone 17和m971在3D11刺激下,均有少量脱颗粒效应,效应的强弱预示克隆对低密度靶点的识别能力。因此,Clone 80可能具有较好的低密度靶点识别能力。
表4供者SXW的CAR-T样品在不同靶细胞刺激下,CD8+/CAR+细胞群中CD107a阳性率。
6.2体外细胞杀伤实验
工作原理
在CAR-T细胞的抗原特异性杀伤能力评价中,采用NALM6-ffLuc作为CD22阳性靶细胞,K562-ffLuc或者Jurkat-ffLuc细胞作为CD22阴性靶细胞。这些靶细胞为经慢病度转导方式而获得的稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的细胞系。
在体外细胞杀伤实验中,将CAR-T细胞和靶细胞分别按照不同效靶比(E:T)进行共孵育培养。当靶细胞被CAR-T细胞杀伤时,荧光素酶会被释放并且很快失活(萤火虫荧光素酶半衰期约0.5h[7])。如果靶细胞没有被CAR-T细胞杀伤或者抑制,随着靶细胞的扩增和荧光素酶的持续表达,将会产生更多的荧光素酶。因此,可以通过荧光素酶的活性来检测CAR-T对靶细胞的杀伤情况。
操作步骤
1)将NALM6-ffLuc和K562-ffLuc细胞,分别在室温、300g下离心5min,弃上清,然后用T细胞完全培养基重悬为2x105个细胞/mL;在底透96孔板中分别加入100μL/孔靶细胞;
2)根据待测CAR-T细胞的CAR阳性率和E∶T值(通常采用2∶1,1∶1,0.5∶1),分别在96孔板中加入100μL/孔CAR-T细胞,并和靶细胞混匀后,放入培养箱中(3℃,5%C02)孵育24h;
3)孵育完成后,在室温、800g下离心5min后,收集100μL/孔上清作为细胞因子检测用留样(-80℃保存);
4)留样后剩余细胞用荧光素酶检测试剂盒检测每孔中的荧光素酶活性。
筛选标准
CAR-T细胞可有效杀伤CD22阳性靶细胞,对CD22阴性靶细胞无非特异性杀伤。
结果
供者SXW的CAR-T样品在day 8时进行体外细胞杀伤实验。实验中使用NALM6-ffLuc和REH-ffLuc两种CD22阳性靶细胞,以及K562-ffLuc一种CD22阴性靶细胞。
结果如表5和图8a所示,在效靶比(E∶T)为1∶1或2∶1时,所有CAR-T样品均可以杀伤CD22阳性靶细胞NALM6-ffLuc。其中,m971、clone 80和clone 17表现出较强的杀伤能力。对照T细胞样品,未出现明显的非特异杀伤问题。
如表6和图8b所示,所有CAR-T样品在E∶T值为2∶1时,均可杀伤CD22阳性靶细胞REH-ffLuc。其中,m971、clone 80和clone 17表现出较强的杀伤能力。在E∶T值为1∶1时,m971、clone 80、clone 36和clone 17依然有一定的杀伤能力。但是,在E∶T值为0.5∶1,所有样品均无法有效杀伤靶细胞REH-ffLuc。对照T细胞样品均未出现非特异杀伤,并且靶细胞REH-ffLuc出现快速扩增。
如表7和图8c所示,所有CAR-T/T样品均不杀伤CD22阴性靶细胞K562-ffLuc,并且由于MLR效应,K562-ffLuc出现快速扩增现象。
表5供者SXW的CAR-T样品和靶细胞NALM6-ffLuc共孵育17h后,检测体外细胞杀伤效率。其中,负值代表靶细胞扩增。
表6供者SXW的CAR-T样品和靶细胞REH-ffLuc共孵育17h后,检测体外细胞杀伤效率。其中,负值代表靶细胞扩增。
表7供者SXW的CAR-T样品和靶细胞K562-ffLuc共孵育17h后,检测体外细胞杀伤效率。其中,负值代表靶细胞扩增。
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综合实施例3(报告基因法初筛)和实施例6(CAR-T细胞体外功能评价)的结果,表明利用Clone 80、clone 28和clone17产生的CAR-T细胞表现出良好的体外细胞功能。
实施例7.荷瘤动物模型体内肿瘤抑制实验
工作原理
以特异性表达CD22的人急性淋巴细胞白血病细胞Nalm6细胞荷瘤免疫缺陷小鼠NPG为实验***,评价实施例5中的方法制备CAR-T细胞样品,评价clone 80、clone 28和clone 17在动物体内的药效。
NPG小鼠与NOD/SCID小鼠相比,敲除了IL-2受体的gamma链,IL-2受体是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同受体亚基,该基因被敲除后能进一步降低小鼠的免疫机能,尤其是NK细胞的活力几乎完全丧失。因此NPG小鼠是更适合于细胞或组织移植的受体。
Nalm6为稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的细胞系。通过尾静脉注射小鼠体内,Nalm6细胞会发生增殖,通过腹腔注射D-荧光素钾,于异氟烷麻醉下以Bruker小动物成像仪拍摄化学发光信号。如果靶细胞没有被CAR-T细胞杀伤或者抑制,随着靶细胞的扩增和荧光素酶的持续表达,会检测到更多的发光信号;通过靶细胞成像位置,也可观测靶细胞特异性聚集部位。因此,可以通过发光信号强弱来检测CAR-T在动物体内对靶细胞的杀伤情况。
操作步骤
1)按照实施例5中的方法分别制备包括clone 80、clone 28和clone 17的CAR-T细胞样品;
2)选用免疫缺陷鼠NPG,雌性,4-5周龄,体重20±3g;取对数生长期的NALM6-LUC细胞尾静脉注射接种于NPG小鼠体内,接种量为1×106个/只。在肿瘤细胞接种2天后通过尾静脉注射给予不同剂量的供试品,分组方案如表8所示;
3)给药后第3、7、12、18和28天,通过腹腔注射D-荧光素钾,于异氟烷麻醉下以Bruker小动物成像仪拍摄化学发光信号,通过肿瘤成像检测肿瘤生长抑制情况;
4)给药后第3、7、14、17、21、和28天,以异氟烷麻醉后,待角膜反射消失,眶静脉取血0.1mL,EDTA-2K抗凝保存;测CAR拷贝数。
表8动物模型实验的分组方案
动物实验结果
1)小鼠成像结果
如图9所示,溶媒对照组和MockT对照肿瘤细胞正常生长,模型成功;D20后溶媒对照组小鼠因肿瘤超负荷出现死亡,MockT组小鼠死亡前出现GvHD现象;给药组小鼠临床指标均无异常;Clone80低剂量和高剂量组、Clone28组和Clone17组均观测到抑制肿瘤生长的现象;各组在第12天开始出现CR,CR均维持至观察末期D28;Clone80不同剂量药效出现明显差异,药效与剂量正相关;Clone28组在D28出现3/6CR;Clone17组部分小鼠在D28出现肿瘤细胞扩增现象。
2)肿瘤细胞荧光信号
测定的荧光信号强度显示于下表9中。
表9小鼠肿瘤细胞成像荧光信号
将上表中数据进行作图,结果如图10所示。溶媒对照组和Mock-T组,肿瘤信号随时间逐渐增强,两组间无明显差异;Clone80低剂量和高剂量组、Clone28组和Clone17组均观测到肿瘤信号减弱;Clone80组不同剂量组肿瘤信号有明显差异,相同时间点,高剂量信号比低剂量明显降低;Clone28组肿瘤信号一直处于较低水平;Clone17组肿瘤信号在D18后出现逐渐上升。
综上所述,Clone 80组、Clone 28组和Clone 17组在Nalm6荷瘤小鼠模型中均观测到明显药效,其中Clone 80组和Clone 28组抑瘤现象优于Clone17组。
本文中提到的一些氨基酸或核酸序列如下:
SEQ ID NO:1(克隆17 LCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:2(克隆17 LCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:3(克隆17 LCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:4(克隆17 HCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:5(克隆17 HCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:6(克隆17 HCDR3氨基酸序列)
/>
SEQ ID NO:7(克隆28 LCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:8(克隆28 LCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:9(克隆28 LCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:10(克隆28 HCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:11(克隆28 HCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:12(克隆28 HCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:13(克隆80 LCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:14(克隆80 LCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:15(克隆80 LCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:16(克隆80 HCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:17(克隆80 HCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:18(克隆80 HCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:19(克隆17 VL氨基酸序列)
SEQ ID NO:20(克隆17 VH氨基酸序列)
SEQ ID NO:21(克隆28 VL氨基酸序列)
SEQ ID NO:22(克隆28 VH氨基酸序列)
SEQ ID NO::23(克隆80 VL氨基酸序列)
SEQ ID NO:24(克隆80 VH氨基酸序列)
SEQ ID NO:25(克隆17 scFv氨基酸序列)
SEQ ID NO:26(克隆28 scFv氨基酸序列)
SEQ ID NO:27(克隆80 scFv氨基酸序列)
SEQ ID NO:28(M971 scFv氨基酸序列)
SEQ ID NO:29(T2A氨基酸序列)
SEQ ID NO:30(CD8α信号肽氨基酸序列)
/>
SEQ ID NO:31(CD8α铰链区和跨膜区氨基酸序列)
SEQ ID NO:32(4-1BB共刺激信号域氨基酸序列)
SEQ ID NO:33(CD3z胞内信号域氨基酸序列)
SEQ ID NO:34(tEGFR氨基酸序列)
SEQ ID NO:35(克隆17 CAR氨基酸序列)
SEQ ID NO:36(克隆28 CAR氨基酸序列)
SEQ ID NO:37(克隆80 CAR氨基酸序列)
SEQ ID NO:38(克隆17 scFv核苷酸序列)
SEQ ID NO:39(克隆28 scFv核苷酸序列)
SEQ ID NO:40(克隆80 scFv核苷酸序列)
SEQ ID NO:41(M971 scFv核苷酸序列)
SEQ ID NO:42(PXL0662中CAR部分核苷酸序列)
/>
SEQ ID NO:43(克隆17 CAR核苷酸序列)
/>
SEQ ID NO:44(克隆28 CAR核苷酸序列)
/>
/>
SEQ ID NO:45(克隆80 CAR核苷酸序列)
/>
参考文献:
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