CN115327013A - 一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法 - Google Patents
一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，将石斛样品粉末与C18粉末置于研具中共研磨得到均匀混合粉末，用甲醇洗脱后离心，取上清液通过HPLC‑IM‑Q‑TOF‑MS结合代谢组学和化学计量学进行统计分析。本发明在以往常见一维质谱图的基础上增加了新的维度，提出并建立了基于保留时间和漂移时间的二维点状图，该方法使得在保留时间维度上不能成功分离的化合物有了进一步分离的可能性，特别是对于同分异体的分离有明显的帮助。此外，本发明提出将淌度质谱数据与代谢组学和化学计量学相结合，用于植物种属的鉴别。
Description
技术领域
本发明属于植物中化合物以及植物种属的鉴别领域，具体涉及一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，是一种基于保留时间和漂移时间的二维点状谱图，将高效液相色谱与淌度质谱联用所得到的二维淌度质谱图与植物中化合物和植物种属鉴别巧妙结合起来，在常见一维的基础上增加了一个新的维度，实现快速有效直观的鉴别植物中的化合物并用于植物种属分析。
背景技术
代谢组学是一种能够全面、***地定性、定量分析生物***小分子代谢物的重要分析方法。基于代谢组学的研究通常需要化学计量学工具，该工具可以有效处理指纹图谱分析获得的高维复杂数据，便于观察差异。常见的多元数据分析包括主成分分析(PCA)、聚类分析(CA)和偏最小二乘判别分析(PLSDA)等。PCA和CA是进一步分类方法之前的步骤，是一种降维数据分析方法，可以识别，反映样本之间的差异；在此基础上，利用PLSDA对未知样本进行识别和聚类预测以达到鉴别样品种属的目的。因此，将植物代谢组学与多元统计分析技术相结合，不仅可以直观地分析植物样品之间的差异，还可以发现潜在的差异代谢物。总之，化学计量学辅助非靶向植物代谢组学已被认为是评估植物真伪，鉴别食物品种和核实食品地域认证的一种可行方法。
近十年来，各种分析方法结合非靶向代谢组学被用于探究代谢化合物与外界因素的关系。例如，核磁共振、近红外光谱和其他一些基于质谱的平台已经被使用。与其他联合技术相比，基于液相色谱四极杆飞行时间质谱的代谢组学分析是代谢组学研究中最重要的方法，具有明显的优势，包括更高的分辨率、灵敏度、通量和峰重现性。然而，据我们所知，基于液相色谱离子淌度四极杆飞行时间质谱(HPLC-IM-Q-TOF-MS)的非靶向代谢组学研究鲜有报道。
离子淌度质谱(IM-MS)技术出现于20世纪90年代初，是一种很有前景的基于离子质量、电荷、大小和形状的检测技术，可以为更精确的分离提供额外的维度。在IM-MS中，由于离子与漂移气体的相互作用，在电场的影响下，不同的离子以不同的速度通过漂移管中的缓冲气体，这导致每种离子对应不同的迁移率和漂移时间。此外，通过IM-MS可以计算离子的碰撞截面，这是一个独立于共提取基质、化合物浓度和测量方法的尺寸参数，因此可以作为一个额外的验证参数，已被证明特别有利于同分异构体分子的分离和鉴定。鉴于上述IM-MS的独特性质，除了Q-TOF-MS可以提供的保留时间、质荷比和响应值外，还可以提供额外的CCS值和目标化合物的漂移时间。基于离子的保留时间和漂移时间，可以在一定程度上形成与质谱成像类似的二维离子点状质谱图，这在以往文献中没有提及。与传统的质谱成像需要特殊的质谱离子扫描技术和专业的图像处理软件相比，该成像技术更加方便高效。IM-MS技术最初应用于分析原子团簇、生物分子等大型复杂离子。近年来，随着IM-MS技术的发展，其分析物已扩展到小分子，如废水中的污染物，药物滥用，生物聚糖和脂类。然而，目前还没有报道提出基于HPLC-IM-Q-TOF-MS二维点状图在植物化合物和植物种属鉴别方面的应用。
石斛是一种多年生植物，是兰科植物的重要属。它在许多国家传播，主要分布在热带和亚热带地区，在中国分布更广。石斛属植物共有76种，比如金钗石斛、铁皮石斛、霍山石斛、黄草石斛、流苏石斛、梳唇石斛等。石斛中的活性成分主要有香豆素、酚类、酸类、生物碱、多糖和联苯，这使得石斛具有无与伦比的药用价值。现代药理学研究证实其具有抗肿瘤、抗诱变作用、免疫增强、延长生命、保护胃溃疡等功能。然而，目前市场上石斛茶品种繁多，其有效成分差异较大，导致石斛商品价格差异较大。因此，有必要对石斛的主要活性成分和种类进行鉴定。石斛的特征代谢物受植物来源的生物合成途径、地理气候和品种等多种因素的影响，可作为区分不同物种的依据。然而，以往对石斛的研究主要集中在利用液相色谱或质谱对特定成分进行定性和定量分析，还缺乏***分析石斛代谢物与石斛种类之间关系的研究，这将有助于石斛种类的科学鉴定。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出了一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法。本发明在以往常见一维质谱图的基础上增加了新的维度，提出并建立了基于保留时间和漂移时间的二维点状图。该方法使得在保留时间维度上不能成功分离的化合物有了进一步分离的可能性，特别是对于同分异体的分离有明显的帮助。此外，本发明提出将淌度质谱数据与代谢组学和化学计量学相结合，用于植物种属的鉴别。
本发明采用如下技术方案：
步骤(1)：将适量石斛样品粉末与C18粉末置于研具中共研磨一段时间后得到均匀的混合粉末。
步骤(2)：将研磨所得粉末转移至固相萃取柱，上下用筛板压实，再将固相萃取柱固定于固相萃取仪上，加入一定量的甲醇，在气泵的作用下进行洗脱。
步骤(3)：收集所得洗脱液并离心。
步骤(4)：取离心后所得的上清液通过HPLC联合IM-Q-TOFMS测定石斛中的化合物，同时得到化合物在保留时间和漂移时间两个维度上的点状谱图；
步骤(5)：将所得HPLC-IM-Q-TOF-MS数据结合代谢组学和化学计量学进行统计分析。
作为优选，步骤(1)所述石斛样品粉末与C18粉末的质量比为1:1。
作为优选，步骤(1)所述共研磨的时间为2min。
作为优选，步骤(1)所述混合粉末与步骤(2)所述甲醇的质量体积比为100mg：0.2mL。
作为优选，步骤(3)离心参数为15000rpm下离心5min。
作为优选，步骤(4)所述HPLC采用的色谱柱是AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm。
作为优选，步骤(4)所述流动相中采用体积含量为0.1％的甲酸水溶液作为流动相A，甲醇作为流动相B；洗脱梯度为:0-3min，体积含量为10-30％流动相B，其余为流动相A；3-10min，体积含量为30-45％流动相B，其余为流动相A；10-17min，体积含量为45-65％流动相B，其余为流动相A；17-20min，体积含量为65-85％流动相B，其余为流动相A；20-23min，体积含量为85-100％流动相B，其余为流动相A。
本发明的优点在于：
(1)提出了一种基于HPLC-IM-Q-TOF-MS的二维点状质谱图，具有快速、有效、直观的特点，能够应用于植物中化合物的分离与鉴别。
(2)提出将淌度质谱数据与代谢组学和化学计量学相结合，能够应用于植物种属的鉴别。
(3)该方法与传统的分离鉴别方法相比，在以往常见一维质谱图的基础上增加了新的维度，提出并建立了基于保留时间和漂移时间的二维点状谱图，使得在保留时间维度上不能成功分离的化合物有了进一步分离的可能性，特别是对于同分异体的分离有明显的帮助；将高效液相色谱与淌度质谱联用所得到的二维淌度质谱图与植物中化合物和植物种属鉴别巧妙结合起来，实现了快速、有效、直观地鉴别植物中的化合物并用于植物种属分析。
附图说明
图1为本发明的整体流程图。
图2为不同色谱柱对色谱图的影响的对比图。
图3为不同流动相对色谱图的影响的对比图。
图4为HPLC-IM-Q-TOF-MS分析所得的九种不同品种石斛的二维点状图。图中A：金钗石斛，B：黄草石斛，C：虎牙石斛，D：霍山石斛，E：流苏石斛，F：铁皮石斛，G：珍虫石斛，H：紫皮石斛，I：鲜石斛。
图5为IM-MS数据结合PCA所得的三维图。图中a：流苏石斛，b：鲜石斛，c中含有：铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛、珍虫石斛、紫皮石斛，d：虎牙石斛，e:黄草石斛。
图6为偏最小二乘法(PLSDA)模型与测试样品之间的差异。图中A：黄草石斛；B：流苏石斛。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
本发明的具体实施方案如下：
选取金钗石斛，黄草石斛，霍山石斛，虎牙石斛，流苏石斛，铁皮石斛，珍虫石斛，紫皮石斛，鲜石斛共九种石斛样品粉末。称取其中任意一石斛样品粉末50mg，C18粉末50mg，将两种粉末置于玛瑙研钵中共研磨2min，得到均匀粉末，转移至1mL固相萃取小柱中，上下用筛板压实。将固相萃取小柱固定于固相萃取仪上，取200μL的甲醇，在气泵的作用下对样品基质进行洗脱。用1mL离心管收集洗脱液，将离心管置于离心机中，15000rpm下离心5min，取上层清液装入进样小瓶进行HPLC-IM-Q-TOF-MS分析，其中色谱柱选用Agilent SB-C181.8μm,4.6×50mm，洗脱液选用0.1％甲酸水溶液和甲醇。剩余八种石斛样品重复进行上述样品前处理操作步骤。将所得IM-MS数据与中药数据库、参考文献相匹配进行鉴别和数据分析。为验证该发明的有效性和实用性，采用单因素试验对工艺过程中相关因素进行优化。该过程如图1所示。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1考察色谱柱对分离效果的影响
1.1取适量标准品(芦丁，异槲皮苷，丁香酸，木犀草素，对羟基肉桂酸，香草酸，异夏佛塔苷，夏佛塔苷，芹菜苷，牡荆素葡萄糖苷，槲皮苷，柚皮素，阿魏酸，牡荆素鼠李糖苷，佛莱心苷，异佛莱心苷，柚皮苷，对羟基苯甲酸，芹菜素-7-O-葡萄糖苷，牡荆素，红景天苷，鸟苷，丹皮酚原苷，山药素，尿苷，滨蒿内酯，小檗碱，石斛碱，石斛酚，豆甾醇，毛兰素，腺苷，谷甾醇，5-羟基糠醛)，加适量体积的甲醇，配置成浓度为1000μg/mL的标准溶液。
1.2取上述所有标准溶液和甲醇稀释成浓度为20μg/mL的混合标准溶液。
1.3将混合标准溶液转移至离心管，将离心管置于离心机，15000rpm下离心5min。
1.4取上层清液装入进样小瓶，用HPLC-IM-Q-TOF-MS分析结果。
1.5HPLC-IM-Q-TOF-MS分析过程中替换使用四种不同的色谱柱：
A：AgilentBonusRPRRHD1.8μm,2.1×50mm；
B：Agilentporoshell120EC-C82.7μm,2.1×100mm；
C：AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm；
D：EclipseXDB-C182.1μm,2.1×100mm。
其余HPLC条件保持一致，为：
柱温：25℃；流动相为甲醇(B)和0.1％的甲酸水溶液(A)，洗脱梯度为:0-3min，10-30％B；3-10min，30-45％B；10-17min，45-65％B；17-20min，65-85％B；20-23min，85-100％B；此处百分含量为体积含量。流速为0.4mL/min，进样量为2μL。
质谱条件为：
负离子模式；喷雾器电压：35psi；鞘气温度：275℃；鞘气流速：12L/min；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；毛细管电压：3500V；碎裂电压：175V。
对HPLC质谱分离的优化从选择合适的色谱柱入手，色谱柱包含柱相、柱长、孔径和粒度等重要参数。在这项研究中，在负离子模式下分析了不同的色谱柱对分离效果的影响如图2所示。可以看出在峰的数量、分离时间和大多数目标化合物的响应方面，图C(AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm)的分离效果最好。这可能是该色谱柱采用直径为1.8μm的固定相颗粒，碳负载高，提高了分离效率，可以在短时间内实现高分辨率分离。相比之下，图A的峰形和分离性能上都相对较差。在ZorbaxBonusRP柱中，极性酰胺基团嵌入在键合相中，与标准反相柱相比，这大大增加了极性化合物的保留，导致色谱峰的拓宽。此外，本实验中酸性目标化合物较多，固定相中氨基的引入可能导致它们与酸性化合物之间的二次滞留，导致化合物峰形拖尾。因此实验选择AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm作为优选色谱柱。
实施例2考察流动相对分离效果的影响
2.1称取适量标准品(芦丁，异槲皮苷，丁香酸，木犀草素，对羟基肉桂酸，香草酸，异夏佛塔苷，夏佛塔苷，芹菜苷，牡荆素葡萄糖苷，槲皮苷，柚皮素，阿魏酸，牡荆素鼠李糖苷，佛莱心苷，异佛莱心苷，柚皮苷，对羟基苯甲酸，芹菜素-7-O-葡萄糖苷，牡荆素，红景天苷，鸟苷，丹皮酚原苷，山药素，尿苷，滨蒿内酯，小檗碱，石斛碱，石斛酚，豆甾醇，毛兰素，腺苷，谷甾醇，5-羟基糠醛)，溶解于适量体积的甲醇，配置成浓度为1000μg/mL的标准溶液。
2.2取上述所有标准溶液和甲醇稀释成浓度为20μg/mL的混合标准溶液。
2.3将混合标准溶液转移至离心管，将离心管置于离心机，15000rpm下离心5min。
2.4取上层清液装入进样小瓶，用HPLC-IM-Q-TOF-MS分析结果。
2.5HPLC-IM-Q-TOF-MS分析过程中替换使用四种不同的流动相，分别标记为A：纯水和甲醇；B：0.05％甲酸水溶液和甲醇；C：0.1％甲酸水溶液和甲醇；D：0.15％甲酸水溶液和甲醇。
其余HPLC条件保持一致，为：
柱温：25℃；色谱柱：AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm；洗脱梯度为:0-3min，10-30％B；3-10min，30-45％B；10-17min，45-65％B；17-20min，65-85％B；20-23min，85-100％B；此处百分含量为体积含量。流速为0.4mL/min，进样量为2μL。
质谱条件为：
负离子模式；喷雾器电压：35psi；鞘气温度：275℃；鞘气流速：12L/min；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；毛细管电压：3500V；碎裂电压：175V。
流动相组成、极性和浓度是影响目标化合物洗脱的重要因素。因此，对不同的流动相组成进行了研究。在此步骤中，用最优色谱柱筛选最佳流动相。首先，选择纯水与乙腈或纯水与甲醇作为流动相，结果表明，纯水与甲醇的流动相分离效果较好。产生这种现象的原因可能是本研究涉及的化合物种类较多。与乙腈相比，甲醇可以溶解更多种类的化合物，整体峰形更好。因此，在进一步的实验中选择甲醇作为有机相。随后，在甲酸体积分数为0％-1.5％的条件下，研究pH对分离的影响，如图3所示。以纯水溶液为流动相时，峰强度普遍较高，但是峰的数量很少，相应的峰的形状和对称性不理想，有明显的展宽。产生这一现象的原因可能是，以纯水作为流动相A，目标化合物不能充分电离。当甲酸体积分数从0％增加到0.1％时，峰形逐渐改善，峰数增加。但甲酸浓度从0.1％增加到0.15％时，部分峰强度明显降低，总离子色谱中几乎没有明显的峰。原因可能是在较高的酸浓度下，一些目标化合物电离被抑制，导致化合物响应显著降低。因此，选择0.1％甲酸水溶液和甲醇作为流动相进行进一步实验。
实施例3.考察各种石斛中所含化合物情况
3.1选取金钗石斛，黄草石斛，霍山石斛，虎牙石斛，流苏石斛，铁皮石斛，珍虫石斛，紫皮石斛，鲜石斛共九种石斛样品粉末。
3.2称取其中任意一石斛样品粉末50mg，C18粉末50mg，将两种粉末置于玛瑙研钵中共研磨2min，得到均匀粉末。
3.3将混合粉末转移至1mL固相萃取小柱中，上下用筛板压实。
3.4将固相萃取小柱固定于固相萃取仪上。
3.5取200μL的甲醇，在气泵的作用下对样品基质进行洗脱。
3.6用1mL离心管收集洗脱液。
3.7将离心管置于离心机，15000rpm下离心5min。
3.8取上层清液装入进样小瓶，进行HPLC-IM-Q-TOF-MS分析。
3.9剩余八种石斛样品重复进行3.2至3.8所述操作步骤。
3.10将所得IM-MS数据与中药数据库，参考文献相匹配。
HPLC色谱条件
柱温：25℃；色谱柱：AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm；流动相为甲醇(B)和0.1％的甲酸水(A)，洗脱梯度为:0-3min，10-30％B；3-10min，30-45％B；10-17min，45-65％B；17-20min，65-85％B；20-23min，85-100％B；此处百分含量为体积含量。流速为0.4mL/min，进样量为2μL。
质谱条件为：
负离子模式；喷雾器电压：35psi；鞘气温度：275℃；鞘气流速：12L/min；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；毛细管电压：3500V；碎裂电压：175V。
在本实验中，不同品种的石斛经过HPLC-IM-Q-TOF-MS得到对应的二维淌度质谱点状图。这些图从两个维度描述了目标化合物的信息，纵坐标提供了分析物的漂移时间，横坐标为分析物的保留时间。图中的每一个点代表一种化合物，点的大小代表分析物的检测强度。从图4可以看出，总体而言，图4I(新鲜石斛)的点数最多，表示新鲜石斛所含的化合物信息最多。相比之下，图4A(金钗石斛)中的点较少，这意味着其中化合物信息少于其他石斛品种。另外，为了进一步鉴别石斛中可能含有的成分，根据标准品以及相关文献信息建立了关于石斛所含化合物的数据库。将所得谱图经MassHunterProfinder软件处理后与中药数据库和新建的数据库相匹配，得到了石斛中可能存在的103种的化合物，对应的化合物名称，分子式，保留时间，漂移时间，碰撞截面积(CCS)等参数如表1所示。
实施例4.考察不同石斛品种的聚类关系
4.1选取金钗石斛，黄草石斛，霍山石斛，虎牙石斛，流苏石斛，铁皮石斛，珍虫石斛，紫皮石斛，鲜石斛九种石斛样品粉末共74批样品。
4.2称取任意1批石斛样品粉末50mg，C18粉末50mg，将两种粉末置于玛瑙研钵中共研磨2min，得到均匀粉末。
4.3将混合粉末转移至1mL固相萃取小柱中，上下用筛板压实。
4.4将固相萃取小柱固定于固相萃取仪上。
4.5取200μL的甲醇，在气泵的作用下对样品基质进行洗脱。
4.6用1mL离心管收集洗脱液。
4.7将离心管置于离心机，15000rpm下离心5min。
4.8取上层清液，装入进样小瓶，进行HPLC-IM-Q-TOF-MS分析。
4.9剩余所有石斛样品重复进行4.2至4.8所述操作步骤。
4.10将所得IM-MS数据结合化学计量学进行统计分析。
HPLC色谱条件
柱温：25℃；色谱柱：AgilentSB-C181.8μm,4.6×50mm；流动相为甲醇(B)和0.1％的甲酸水(A)，洗脱梯度为:0-3min，10-30％B；3-10min，30-45％B；10-17min，45-65％B；17-20min，65-85％B；20-23min，85-100％B。流速为0.4mL/min，进样量为2μL。
质谱条件为：
负离子模式；喷雾器电压：35psi；鞘气温度：275℃；鞘气流速：12L/min；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；毛细管电压：3500V；碎裂电压：175V。
主成分分析(PCA)是一种统计方法，旨在从多变量数据中删除一些与主题信息有一定重叠的变量，筛选出较少的新变量，但仍能反映原变量所反映的信息。这是一种对多变量数据进行降维的过程，用图形来描述较少的变量，以达到可视化的目的。为了进一步了解石斛属品种(金钗石斛，黄草石斛，虎牙石斛，霍山石斛，流苏石斛，铁皮石斛，珍虫石斛，紫皮石斛，鲜石斛)的分散聚集信息，本研究对获得的74份负离子模式下的淌度质谱数据进行预处理后，导入软件进行PCA分析，所得的PCA三维图分析结果如图5所示。每一个单独的点代表一个石斛样本，点颜色相同，代表它们属于同一类。点之间的距离代表了每个样本之间的差异程度，距离越近意味着样本中含有的化合物成分信息越相近。图5可以看出，在负离子模式下的PCA得分图中，三个主成分PC1，PC2，PC3的累计贡献率为79.98％。基于图中点的分布可以发现，在负离子模式下流苏石斛、黄草石斛、虎牙石斛和鲜石斛之间存在明显的差异。对比之下，铁皮石斛、紫皮石斛、金钗石斛、珍虫石斛、和霍山石斛则相对聚集在一起，意味着它们含有的化合物信息相近。
为了进一步的证明该统计分析对石斛品种的潜在鉴别能力，建立了偏最小二乘法判别分析(PLSDA)模型。该模型在数据前处理的基础上建立起来，具有对未知样本的鉴别能力。本实验中将额外的黄草石斛和流苏石斛作为测试样本带入建立的PLSDA模型中，如图6所示，这两个样本(黑点)都落在了对应的分组区域，证明了该方法在一定程度上为石斛种属的鉴别提供了参考。
Claims (6)
1.一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将适量石斛样品粉末与C18粉末置于研具中共研磨一段时间后得到均匀的混合粉末；
步骤(2)：将研磨所得混合粉末转移至固相萃取柱，上下用筛板压实，再将固相萃取柱固定于固相萃取仪上，加入一定量的甲醇，在气泵的作用下进行洗脱；
步骤(3)：收集所得洗脱液并离心；
步骤(4)：取离心后所得的上清液通过HPLC联合IM-Q-TOF MS测定石斛中的化合物，同时得到化合物在保留时间和漂移时间两个维度上的点状谱图；
步骤(5)：将所得HPLC-IM-Q-TOF-MS数据结合代谢组学和化学计量学进行统计分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，其特征在于步骤(1)所述石斛样品粉末与C18粉末的质量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，其特征在于步骤(1)所述共研磨的时间为2min。
4.根据权利要求1所述的一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，其特征在于步骤(1)所述混合粉末与步骤(2)所述甲醇的质量体积比为100mg：0.2mL。
5.根据权利要求1所述的一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，其特征在于步骤(4)所述HPLC使用的色谱柱为Agilent SB-C181.8μm,4.6×50mm。
6.根据权利要求1所述的一种基于二维离子淌度质谱图的中药石斛种属鉴别方法，其特征在于步骤(4)所述HPLC使用的流动相采用体积含量为0.1％的甲酸水溶液作为流动相A，甲醇作为流动相B；洗脱梯度为:0-3min，体积含量为10-30％流动相B，其余为流动相A；3-10min，体积含量为30-45％流动相B，其余为流动相A；10-17min，体积含量为45-65％流动相B，其余为流动相A；17-20min，体积含量为65-85％流动相B，其余为流动相A；20-23min，体积含量为85-100％流动相B，其余为流动相A。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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