CN115322921A - 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115322921A CN115322921A CN202210699669.9A CN202210699669A CN115322921A CN 115322921 A CN115322921 A CN 115322921A CN 202210699669 A CN202210699669 A CN 202210699669A CN 115322921 A CN115322921 A CN 115322921A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- fermentation
- cow
- pathogenic bacteria
- cow dung
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 72
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title claims abstract description 32
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 claims abstract description 22
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 38
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 38
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 21
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 19
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 abstract description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 44
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 6
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006158 Baird–Parker agar Substances 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K1/00—Housing animals; Equipment therefor
- A01K1/015—Floor coverings, e.g. bedding-down sheets ; Stable floors
- A01K1/0152—Litter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K1/00—Housing animals; Equipment therefor
- A01K1/015—Floor coverings, e.g. bedding-down sheets ; Stable floors
- A01K1/0152—Litter
- A01K1/0155—Litter comprising organic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及粪污处理技术领域，具体涉及一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的芽孢杆菌可在牛粪中快速增殖，并对奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有拮抗作用，且具有较好的纤维素、蛋白质、淀粉分解能力，所述的芽孢杆菌可作为抑制菌及菌剂应用于牛粪再生垫料的生产和使用过程中。
Description
技术领域
本发明涉及粪污处理领域，尤其是涉及一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用。
背景技术
牛粪再生垫料是以牛粪为原料，通过好氧发酵等技术手段生产的一种牛床垫料，已经成为牛粪资源化利用的一种重要技术手段。相较传统垫料，牛粪再生垫料具有原料获取便利且廉价的先天优势，但与沙子等无机垫料相比，牛粪本身就携带许多致病菌，且作为有机物更容易造成微生物的繁殖，因此杀菌是生产牛粪再生垫料过程中必不可少的步骤。
而在实际生产过程中，奶牛***炎致病菌并不能被彻底杀灭，且在牛粪再生垫料使用过程中，奶牛场为了节约成本，垫料不能做到每天更换，这个过程中通过牛体、空气流动等进入垫料的致病微生物会逐渐随着积累和繁殖而增多，包括链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等奶牛***炎致病菌。奶牛***炎会导致牛奶产量下降、品质降低、奶牛死亡和淘汰，被认为是奶制品行业成本最高的疾病之一。因此，一种适用于牛粪再生垫料生产和使用过程中抑制奶牛***炎致病菌的微生物菌剂是目前市场需要的。
发明内容
本发明的目的是提供一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用。
第一方面，本发明提供一株芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC NO.24847。
本发明从牛粪中，筛选出对奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌圈最大的菌株，进行16s rRNA测序，并建立***发育树，由16s rRNA测序结果及***发育树结果和形态学分析，确定抑菌圈最大的菌株为芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌DN-2。
本发明所提供的芽孢杆菌DN-2已在2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，分类命名：芽孢杆菌Bacillus sp.，保藏编号为CGMCCNO.24847。
第二方面，本发明提供一种菌剂，含有上述芽孢杆菌。
第三方面，本发明提供一种发酵方法，以上述的芽孢杆菌作为发酵菌，以纤维素、蛋白质或淀粉作为碳源进行发酵。
第四方面，本发明提供一种芽孢杆菌发酵液或发酵上清液，所述芽孢杆菌发酵液由上述发酵方法发酵得到；所述芽孢杆菌发酵上清液，由芽孢杆菌发酵液经离心、过滤后得到。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述芽孢杆菌或上述菌剂或上述发酵方法或上述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在抑制奶牛***炎致病菌中的应用。
在本发明所提供的应用中，所述奶牛***炎致病菌包括奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
在本发明所提供的应用中，所述芽孢杆菌或所述菌剂或所述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在环境温度为25-35℃时，抑制奶牛***炎致病菌最佳。
在本发明所提供的应用中，芽孢杆菌发酵上清液对奶牛源无乳链球菌的抑菌圈直径为15.7mm以上。
本发明还请求保护，上述芽孢杆菌或上述菌剂或上述发酵方法或上述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在制备和使用牛粪再生垫料中的应用。
第五方面，本发明提供一种牛粪再生垫料，可抑制牛粪垫料中***炎致病菌的增加；所述牛粪再生垫料含有上述芽孢杆菌或上述菌剂或上述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供的芽孢杆菌DN-2是从牛粪中分离得到的，芽孢杆菌DN-2的发酵液在一次处理中，能够同时对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均起到抑制作用；芽孢杆菌DN-2的发酵液经离心后的上清液，也能实现对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。其中，芽孢杆菌发酵上清液对奶牛源无乳链球菌的抑菌圈直径为 15.7mm以上。
附图说明
图1为本发明提供的芽孢杆菌DN-2的***发育树。
图2为本发明提供的芽孢杆菌DN-2的菌落形态。
图3为本发明提供的芽孢杆菌DN-2的显微镜检形态。
图4为本发明提供的芽孢杆菌DN-2对纤维素、蛋白质、淀粉分解能力的照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发实施例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1芽孢杆菌DN-2的筛选过程
本实施例提供芽孢杆菌DN-2的筛选过程和所用培养基。
其中，所用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基的配方为：CMC-Na 15.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，琼脂14.0g，去离子水1000mL，pH值自然，加热融化后，121℃灭菌20min，待冷却至50℃倒平板。0.9％NaCl溶液：NaCl 9.0g，去离子水1000mL， 121℃灭菌20min。
LB肉汤培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaCl 10.0g，1000mL去离子水，溶解后121℃灭菌20min。
LB琼脂培养基的配方为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0 g，琼脂15.0g，1000mL去离子水，溶解后121℃灭菌15min，待其冷却至50℃到平板。
筛选步骤，具体如下：
(1)取50g牛粪置于锥形瓶中，封口膜封口后放入恒温箱55℃富集5d。
(2)取5g富集后的牛粪置于锥形瓶中，加入45g的0.9％NaCl 溶液，充分震荡，取1mL上清液用0.9％NaCl溶液稀释成10-2～10-5浓度梯度，取100μL不同浓度梯度的稀释液涂布于CMC-Na培养基。在生化培养箱中倒置培养24h后，选取不同形态的单一菌落进行数次划线分离，直至纯化成单一菌株。
(3)将待测菌株接种在LB平板上培养24h进行活化，然后用接种环挑取待测菌株接种于LB液体培养基，置于恒温震荡培养箱 37℃、150r/min培养至对数生长期，进行抑菌试验。
(4)将待测菌株接种在LB平板上培养24h进行活化，然后用接种环挑取待测菌株接种于LB液体培养基，置于恒温震荡培养箱 37℃、150r/min培养24h，将发酵液在4℃，4000r/min离心12min，将离心后的上清液用22μm的水系滤膜过滤2次，进行抑菌试验。
(5)取100μL稀释至107cfu/mL的致病菌菌液涂布在LB平板上，待菌液晾干后用直径6mm的打孔器在平板上打4个孔，其中1 个孔内注入30μL的LB液体培养基作为对照组，其余3个孔内注入 30μL步骤(3)的待测菌液或步骤(4)的上清液，在超净工作台内放置至菌液扩散完毕，将平板置于37℃条件下培养24h，测量待测菌株中，抑菌效果最好的菌株的抑菌圈，见表1。
表1抑菌效果最好的菌株的抑菌圈
| 无乳链球菌/mm | 金黄色葡萄球菌/mm | 大肠杆菌/mm | |
| 菌液抑菌圈直径 | 11.64±0.14 | 13.23±0.01 | 8.46±0.09 |
| 上清液抑菌圈直径 | 15.70±0.51 | 10.85±0.84 | - |
对抑菌圈最大的菌株，进行16s rRNA测序，并建立***发育树，***发育树见图1。由16s rRNA测序结果及***发育树结果和形态学分析，确定抑菌圈最大的菌株为芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌DN-2。芽孢杆菌DN-2的菌落形态及显微镜镜检形态，见图2和图3。
实施例2芽孢杆菌DN-2具有多种物质分解能力
本实施例提供芽孢杆菌DN-2的多种物质分解能力测试，测试所用培养基及步骤如下。
所用的蛋白质培养基配方为：牛肉膏3g，酪蛋白10g，NaCl 5 g，K2HPO4 2g，溴百里香酚蓝0.05g，琼脂粉15g，去离子水1000mL， pH值为7.3～7.5，121℃灭菌20min，待冷却至50℃倒平板。
刚果红染色液配方为：刚果红1g，去离子水1000mL。脱色液： NaCl 58.5g，去离子水1000mL。
所用的淀粉培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，NaCl 5.0g，可溶性淀粉30.0g，琼脂15.0g，pH 7.8。
测试方法的步骤如下：
将实施例1筛选出芽孢杆菌DN-2接种于LB平板上，37℃活化 24h，用接种环挑取接种于LB液体培养基，37℃条件下150r/min培养3h至浑浊，然后用0.9％的NaCl溶液以10倍为梯度进行稀释，取10-4～10-6的稀释液100μL涂布于CMC-Na平板、蛋白质培养基平板或淀粉培养基平板上，37℃培养48h。
在具有蛋白质分解能力或淀粉分解能力的细菌菌落周围会形成明显的透明圈，用游标卡尺测量菌落直径和透明圈直径并记录，结果见表2。
纤维素分解能力的测定方法为：选取形成清晰单菌落的平板注入 10mL刚果红染液，静置15min倒掉染液，再注入10mL脱色液，静置15min倒掉脱色液。用游标卡尺测量菌落直径d和透明圈直径D 并记录透明圈的大小见图4，一般用D/d判断纤维素分解能力，结果见表2。
表2芽孢杆菌DN-2的多种物质分解能力
| 营养源种类 | 菌落直径d/mm | 分解圈直径D/mm | D/d |
| 纤维素 | 8.53±0.53 | 18.24±0.32 | 2.14 |
| 蛋白质 | 11.17±0.33 | 23.11±0.79 | 2.07 |
| 淀粉 | 10.75±0.25 | 15.82±1.11 | 1.47 |
实施例3芽孢杆菌DN-2的最适抑菌温度
本实施例提供芽孢杆菌DN-2的最适抑菌温度，具体探究步骤如下：
取100μL稀释至107cfu/mL的芽孢杆菌DN-2菌液涂布在LB平板上，待菌液晾干后用直径6mm的打孔器在平板上打5个孔，其中1个孔内注入30μL的LB液体培养基作为对照组，其余4个孔内注入待测菌菌液，在超净工作台内放置至菌液扩散完毕，将平板置分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下培养24h，测量抑菌圈，见表 3。
需要说明的是，由于在温度为20℃、40℃、45℃时，不是无乳链球菌的适宜生长温度，无乳链球菌出现生长过慢或者停止生长或被杀死的现象，导致无乳链球菌的抑菌圈不能读数。
表3芽孢杆菌DN-2的最适抑菌温度
| 温度/℃ | 金黄色葡萄球菌/mm | 大肠杆菌/mm | 无乳链球菌/mm |
| 20 | 12.35 | 9.72 | - |
| 25 | 13.82 | 10.06 | 15.90 |
| 30 | 13.39 | 9.63 | 15.08 |
| 35 | 12.29 | 8.42 | 11.53 |
| 40 | 11.30 | 7.15 | - |
| 45 | 8.34 | - | - |
实施例4芽孢杆菌DN-2与致病菌于液体共培养
本实施例提供芽孢杆菌于LB肉汤培养基中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、DN-2在LB营养琼脂培养基进行活化，然后分别接种于LB肉汤培养基，37℃、160rpm 进行培养，约3h培养至浑浊，将4种菌在4℃、4000rpm条件下离心6 min，并用LB肉汤培养基进行重悬，该重悬过程进行2次，其中3种致病菌用LB肉汤培养基稀释至107cfu/g备用。
进行致病菌和目标菌混合培养的试验，实验组为1支50mL离心管中添加2.5mL的LB肉汤培养基，25μL金黄色葡萄球菌菌液、25μL 大肠杆菌菌液、25μL无乳链球菌菌液，2.5mL的DN-2菌液。其对照组为1支50mL离心管中添加5mL的LB肉汤培养基，25μL金黄色葡萄球菌菌液、25μL大肠杆菌菌液、25μL无乳链球菌菌液，培养3～5h，当菌液浑浊停止。每个处理组设置三个平行。取待测样品适量，用0.9％ NaCl溶液进行10倍为梯度的稀释，选择合适梯度的菌液100μL分别涂布于麦康凯琼脂培养基(大肠杆菌呈桃红色菌落)、改良爱德华培养基(链球菌呈蓝绿色菌落)、Baird-Parker琼脂培养基(金黄色葡萄球菌呈黑色菌落)，37℃倒置培养18～24h，选取菌落数适合的平板进行计数，并计算致病菌数量，见表4。
表4 LB肉汤培养基中芽孢杆菌对致病菌的抑制率
| 无乳链球菌 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | |
| 抑制率 | 99％以上 | 85％以上 | - |
实施例5芽孢杆菌DN-2用于牛粪生产牛粪再生垫料
本实施例提供芽孢杆菌在牛粪中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、DN-2在LB营养琼脂培养基进行活化，然后分别接种于LB肉汤培养基，37℃、160rpm 进行培养，约3h培养至浑浊，将4种菌分别在4℃、4000rpm条件下离心6min，并用0.9％NaCl溶液进行重悬，该重悬过程进行2次，其中致病菌用0.9％NaCl溶液稀释至103cfu/g备用，将DN-2再次进行离心，弃上清液将20mL的菌液浓缩至3mL。将20g牛粪装入锥形瓶于121℃灭菌20min，放凉后加入3mL浓缩后的DN-2菌液，三种致病菌分别添加0.2mL，对照组将DN-2菌液换成0.9％NaCl溶液，其他条件保持不变，每个处理设置3个平行，培养3d。取待测样品适量，用0.9％NaCl 溶液进行10倍为梯度的稀释，选择合适梯度的菌液100μL分别涂布于麦康凯琼脂培养基(大肠杆菌呈桃红色菌落)、改良爱德华培养基(链球菌呈蓝绿色菌落)、Baird-Parker琼脂培养基(金黄色葡萄球菌呈黑色菌落)，37℃倒置培养18～24h，选取菌落数适合的平板进行计数，并计算致病菌数量，牛粪中芽孢杆菌对致病菌的抑制率见表5。
表5芽孢杆菌对牛粪中致病菌的抑制率
| 无乳链球菌 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | |
| 抑制率 | 80％以上 | 95％以上 | - |
实施例6芽孢杆菌DN-2用于牛粪，生产牛粪再生垫料
本实施例提供芽孢杆菌在牛粪中的抑菌能力，具体探究步骤如下：
将400g鲜牛粪放入有效容积1L容器中，将芽孢杆菌DN-2与解淀粉芽孢杆菌(保藏编号为：CGMCC NO.24846)进行复配，实验组按照3％V/W的接种量接入对数生长期的微生物菌液，对照组按照3％ V/W加入无菌水，具体试验方案见表6，30℃恒温培养，第0，4，8d 取样检测其三种致病菌数量，并基于第0天计算致病菌残留率，结果如表7、表8和表9所示。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌已在2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens.，保藏编号为CGMCC NO.24846。
表6接种物及体积
| 组别 | 接种物 | 体积 |
| 对照组 | 无菌水 | 12mL |
| 试验组 | DN-2、解淀粉芽孢杆菌 | 各6mL |
表7金黄色葡萄球菌残留率
| 时间/d | 对照组 | 试验组 |
| 0 | 100.00％ | 100.00％ |
| 4 | 57.61％ | 42.59％ |
| 8 | 17.17％ | 5.89％ |
表8大肠杆菌残留率
| 时间/d | 对照组 | 试验组 |
| 0 | 100.00％ | 100.00％ |
| 4 | 8.00％ | 4.89％ |
| 8 | 0.60％ | 0.39％ |
表9无乳链球菌残留率
| 时间/d | 对照组 | 试验组 |
| 0 | 100.00％ | 100.00％ |
| 4 | 15.25％ | 17.45％ |
| 8 | 28.16％ | 18.73％ |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一株芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.24847，可在牛粪环境中快速增殖。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述芽孢杆菌。
3.一种发酵方法，其特征在于，以权利要求1所述的芽孢杆菌作为发酵菌，以纤维素、蛋白质或淀粉作为碳源进行发酵。
4.一种芽孢杆菌发酵液或发酵上清液，其特征在于，所述芽孢杆菌发酵液由权利要求3所述发酵方法发酵得到；所述芽孢杆菌发酵上清液，由芽孢杆菌发酵液经离心、过滤后得到。
5.权利要求1所述芽孢杆菌或权利要求2所述菌剂或权利要求3所述发酵方法或权利要求4所述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在抑制奶牛***炎致病菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述奶牛***炎致病菌包括奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌或所述菌剂或所述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在环境温度为25-35℃时，具备抑制奶牛***炎致病菌的作用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，芽孢杆菌发酵上清液对奶牛源无乳链球菌的抑菌圈直径为15.7mm以上。
9.权利要求1所述芽孢杆菌或权利要求2所述菌剂或权利要求3所述发酵方法或权利要求4所述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在制备或使用牛粪再生垫料中的应用。
10.一种牛粪再生垫料，其特征在于，可抑制牛粪垫料中***炎致病菌的增加；所述牛粪再生垫料含有权利要求1所述芽孢杆菌或权利要求2所述菌剂或权利要求4所述芽孢杆菌发酵液或发酵上清液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210699669.9A CN115322921B (zh) | 2022-06-20 | 2022-06-20 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210699669.9A CN115322921B (zh) | 2022-06-20 | 2022-06-20 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115322921A true CN115322921A (zh) | 2022-11-11 |
| CN115322921B CN115322921B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=83915972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210699669.9A Active CN115322921B (zh) | 2022-06-20 | 2022-06-20 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115322921B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115181690A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-10-14 | 中国农业大学 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555613A (zh) * | 2013-10-15 | 2014-02-05 | 广西科技大学 | 一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN108085265A (zh) * | 2016-11-22 | 2018-05-29 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料 |
| CN108676756A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-10-19 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用 |
| CN110699300A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-01-17 | 江苏省苏微微生物研究有限公司 | 一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用 |
| CN111004741A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-04-14 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 一株深海来源的弯曲芽孢杆菌r29-2、微生态制剂及其应用 |
| CN115181690A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-10-14 | 中国农业大学 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
-
2022
- 2022-06-20 CN CN202210699669.9A patent/CN115322921B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555613A (zh) * | 2013-10-15 | 2014-02-05 | 广西科技大学 | 一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN108085265A (zh) * | 2016-11-22 | 2018-05-29 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料 |
| CN108676756A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-10-19 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用 |
| CN110699300A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-01-17 | 江苏省苏微微生物研究有限公司 | 一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用 |
| CN111004741A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-04-14 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 一株深海来源的弯曲芽孢杆菌r29-2、微生态制剂及其应用 |
| CN115181690A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-10-14 | 中国农业大学 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115181690A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-10-14 | 中国农业大学 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
| CN115181690B (zh) * | 2022-06-20 | 2024-04-12 | 中国农业大学 | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115322921B (zh) | 2024-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104946574B (zh) | 一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C | |
| CN107541477B (zh) | 一种利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法 | |
| CN109536406A (zh) | 弱后酸化的嗜热链球菌jmcc16、分离纯化方法及应用 | |
| CN112501090A (zh) | 一株地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| CN115322921B (zh) | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN115181690B (zh) | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108865938B (zh) | 一种高产芽孢的嗜热脂肪芽孢杆菌 | |
| CN117070428B (zh) | 枯草芽孢杆菌bs-22株在改善养殖环境中的应用 | |
| CN110862953B (zh) | 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备和萌发方法及其应用 | |
| CN116751701B (zh) | 一株解磷菌及其应用 | |
| CN113862169A (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在羽毛降解中的应用 | |
| CN116042483B (zh) | 一株具有产γ-氨基丁酸的乳酸肠球菌FSUH-1及其应用 | |
| CN113061550B (zh) | 一株乳杆菌新菌株z6及其在食品中的应用 | |
| CN114891705A (zh) | 一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌及其培养方法与应用 | |
| KR102201035B1 (ko) | 난배양성 미생물의 분리 및 배양 방법 | |
| CN108865937B (zh) | 一种利用嗜热脂肪芽孢杆菌突变菌生产芽孢的方法 | |
| CN113862179A (zh) | 一种沼泽红假单胞菌及其制备5-ala的用途和方法 | |
| CN117106676B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在饲料生产中的应用 | |
| CN116925934B (zh) | 一株降解臭气物质正丁酸的菌株及其应用 | |
| NL2032659B1 (en) | Method for detecting Cronobacter in infant formula milk powder | |
| CN116925944B (zh) | 一株降解粪臭素的菌株及其应用 | |
| CN117467583B (zh) | 一株喹诺酮类抗生素降解菌、菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN109652332B (zh) | 一种可提高水虻虫卵孵化效率的菌剂及应用 | |
| WO2023040761A1 (zh) | 一种难培养微生物新物种的分离培养方法 | |
| Dega et al. | Growth of Salmonella typhimurium in skim milk concentrates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |