CN115305212B - 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明提供的一株枯草芽孢杆菌G‑2(Bacillussubtilis)，保藏编号为CGMCCNo.21707。本发明提供的枯草芽孢杆菌G‑2具有良好的降解木质纤维素的作用。实施例的结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌G‑2在10℃、pH3.5的条件下可以生长；在20℃、pH4.0的条件下生长良好，纤维素酶活力达到80U/mL；在35℃、pH4.0的条件下纤维素酶活力达到最高，可达128U/mL。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
木质纤维素是植物细胞壁中的主要结构组成成分，由木质素、纤维素和半纤维素三者相互嵌合，以共价键结合构成空间网状结构。由于木质纤维素自身分子量大、结构复杂、性质稳定，在自然条件下极难被分解。在我国农业生产中各种富含木质纤维素的农作物秸秆、经济作物与药用植物废弃物资源丰富，产量巨大。然而长期以来，受生活方式、加工技术及其本身饲用性差等因素的影响，大量的农作物秸秆、药用植物废弃物被丢弃或焚烧，没有得到合理开发利用。因此，开展木质纤维素的综合利用研究对于节约资源、保护环境、增加农民收入、促进农业的可持续发展都具有重要的现实意义。
常见的纤维降解方法有机械降解、酸降解、碱降解、热降解、氧化降解、电化学降解和生物降解。相对于其它方法而言，生物降解法利用微生物产生的纤维素酶催化纤维素降解，是一种温和、快速并且环境友好的方法。目前生物降解法的研究热点集中在获得具有良好降解木质纤维素的菌株方面。
目前生物降解法中常用菌株为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌在生长过程中，能够分泌木质纤维素酶，但现有研究表明，枯草芽孢杆菌产木质纤维素酶活较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌具有良好的降解木质纤维素的作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌G-2(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCCNo.21707。
本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2的培养方法，包括如下步骤：将上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2接种至发酵培养基，得到枯草芽孢杆菌G-2菌液；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～13.0g/L葡萄糖，0.8～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.03～0.06g/LMgSO4和4.0～7.0g/LCaCO3；所述发酵培养基的pH为3.5～6.0。
优选的，所述发酵培养的条件为：温度15～40℃，时间24～72h，转速150～200rpm。
优选的，所述枯草芽孢杆菌G-2以种子液的形式接种至发酵培养基；所述种子液的接种量为4％～10％。
优选的，所述种子液的培养方法为：将枯草芽孢杆菌G-2接种至种子培养基进行种子培养，得到种子液；
所述种子培养基包括如下质量浓度的组分：9.0～12.0g/L蛋白胨，2.0～3.0g/L牛肉膏和4.0～5.0g/L氯化钠；所述种子培养基的pH为3.5～6.0。
优选的，所述种子培养的条件为：温度15～40℃，时间12～36h，转速150～200rpm。
本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2在木质纤维素降解中的应用。
本发明提供了一种木质纤维素降解菌剂，采用上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2制备。
优选的，所述枯草芽孢杆菌G-2的浓度为1×108～3×108CFU/g。
有益效果：
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌G-2(Bacillussubtilis)，保藏编号为CGMCCNo.21707。本发明提供的枯草芽孢杆菌G-2具有良好的降解木质纤维素的作用。实施例的结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌G-2在10℃、pH3.5的条件下可以生长；在20℃、pH4.0的条件下生长良好，纤维素酶活力达到80U/mL；在35℃、pH4.0的条件下纤维素酶活力达到最高，可达128U/mL。
生物保藏说明
枯草芽孢杆菌G-2，拉丁文为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.21707，保藏日期2021年01月25日，保藏地址北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌G-2在刚果红平板初筛结果图；
图2为枯草芽孢杆菌G-2在刚果红平板复筛结果图；
图3为枯草芽孢杆菌G-2在苯胺蓝平板的水解圈试验结果图；
图4为枯草芽孢杆菌G-2***发育树的结果。
具体实施方式
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌G-2(Bacillussubtilis)，保藏编号为CGMCCNo.21707。本发明的枯草芽孢杆菌G-2是从白星花金龟的粪便中分离得到。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-2的菌落外形不规则，乳白色，不透明，有较小褶皱，中间微有褶皱凸起。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-2革兰氏染色为紫色，是革兰氏阳性菌；芽孢染色显示有芽孢；厌氧生长-；V-P反应+；硝酸盐还原+；淀粉水解+；明胶液化+；利用丙酸盐-；D-甘露醇+；D-木糖+；L-***糖+。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-2在10℃、pH3.5的条件下就可以生长；在20℃、pH4.0的条件下生长良好，纤维素酶活力达到80U/mL；在35℃、pH4.0的条件下纤维素酶活力达到最高，可达128U/mL。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-2的16S rDNA基因序列全长为1500bp，具体序列为SEQ ID No.1。通过使用Blast进行比对，根据GenBank提供的最高相似性序列构建***发育树，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2的培养方法，包括如下步骤：将上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2接种至发酵培养基，得到枯草芽孢杆菌G-2菌液；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～13.0g/L葡萄糖，0.8～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.03～0.06g/LMgSO4和4.0～7.0g/LCaCO3；所述发酵培养基的pH为3.5～6.0。
本发明所述枯草芽孢杆菌G-2优选以种子液的形式接种至发酵培养基。在本发明中，所述种子液的培养方法优选为：将枯草芽孢杆菌G-2接种至种子培养基进行种子培养，得到种子液。在本发明中，所述种子培养基优选包括如下质量浓度的组分：9.0～12.0g/L蛋白胨，2.0～3.0g/L牛肉膏和4.0～5.0g/L氯化钠；进一步优选包括10g/L蛋白胨，3.0g/L牛肉膏和5.0g/L氯化钠。本发明种子培养基为枯草芽孢杆菌G-2提供了合适的碳源、氮源和无机盐等，为枯草芽孢杆菌G-2生长提供了良好的条件。在本发明中，所述种子培养基的pH优选为3.6～6.0；进一步优选为4.0～5.0；更进一步优选为4.0。在本发明中，所述种子培养的温度优选为15～40℃；进一步优选为35～37℃；更进一步优选为35℃或者37℃。在本发明中，所述种子培养的时间优选为12～36h；更进一步优选为16～20h；更进一步优选为16h。在本发明中，所述种子发酵的转速优选为150～200rpm；进一步优选为180～200rpm；更进一步优选为180rpm。
得到种子液后，本发明优选将种子液接种到发酵培养基进行发酵培养。在本发明中，所述种子液的接种量优选为4％～10％；进一步优选为6％～8％；更进一步优选为6％。在本发明中，所述发酵培养基优选包括如下质量浓度的组分：8.0～13.0g/L葡萄糖，0.8～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.03～0.06g/LMgSO4和4.0～7.0g/LCaCO3；进一步优选包括如下质量浓度的组分：10g/L葡萄糖，1.5g/L酵母膏，0.5g/L蛋白胨，0.05g/LMgSO4和6.0g/LCaCO3。本发明的发酵培养基为枯草芽孢杆菌G-2提供了合适的碳源、氮源和无机盐等，使枯草芽孢杆菌G-2生长最佳。在本发明中，所述发酵培养基的pH优选为3.5～6.0；进一步优选为3.5～5.0；更进一步优选为4.0。本发明发酵培养基特定的pH范围是枯草芽孢杆菌G-2的最佳生长pH范围，利于枯草芽孢杆菌G-2扩大生长。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为15～40℃；进一步优选为20～37℃；更进一步优选为35℃。在本发明中，所述发酵培养的时间优选为24～72h；更进一步优选为36～48h；更进一步优选为48h。在本发明中，所述种子发酵的转速优选为150～200rpm；进一步优选为180～200rpm；更进一步优选为180rpm。本发明特定的发酵条件有利于发酵进行，使枯草芽孢杆菌G-2产纤维素酶的能力最强，降解木质纤维素的活力最大。本发明提供的枯草芽孢杆菌G-2的培养方法简单、易操作，可实现枯草芽孢杆菌G-2的大规模生产。
本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2在木质纤维素降解中的应用。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-2具有良好的降解木质纤维素的能力，纤维素酶活最高可达128U/mL，可将枯草芽孢杆菌G-2用于木质纤维素的降解，对于木质纤维素的综合利用具有重要意义。
本发明提供了一种木质纤维素降解菌剂，采用上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-2制备。在本发明中，所述木质纤维素降解菌剂中枯草芽孢杆菌G-2的浓度优选为1×108～3×108CFU/g；进一步优选为1×108～2×108CFU/g；更进一步优选为2×108CFU/g。本发明提供的木质纤维素降解菌剂具有良好的降解木质纤维素的能力，且温和、快速、无污染。
实施例1
枯草芽孢杆菌G-2的分离和鉴定
本发明的枯草芽孢杆菌G-2是从白星花金龟的粪便中分离得到。本发明采用在刚果红平板上用十字划线法进行初筛。刚果红培养基的制备方法：羧甲基纤维素钠4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO31.0 g，(NH4)2SO42.0 g，琼脂20.0g，刚果红0.2g，蒸馏水溶解至1000mL。刚果红平板是在培养基中加入刚果红，刚果红能够与大分子多糖结合，纤维素是一种大分子多糖，所以在有纤维素的平板上添加刚果红能够有颜色，当菌生长产生纤维素酶，分解培养基中的纤维素为小分子糖，便出现透明圈。图1为枯草芽孢杆菌G-2在刚果红平板初筛结果图(十字划线法)。
采用刚果红平板和苯胺蓝平板进行复筛。苯胺蓝培养基的制备方法为：酵母粉10.0g，葡萄糖20.0g，苯胺蓝0.1g，琼脂20.0g，蒸馏水溶解至1000mL。苯胺蓝平板与刚果红平板原理相似，苯胺蓝平板也用于产木质素降解酶类菌株的筛选中。
图2为枯草芽孢杆菌G-2在刚果红平板的水解圈试验结果图(平板扩散法)；图3为枯草芽孢杆菌G-2在苯胺蓝平板的水解圈试验结果图(平板扩散法)。枯草芽孢杆菌G-2的透明圈直径测定结果见表1。
表1枯草芽孢杆菌G-2的透明圈直径测定结果
将本发明的枯草芽孢杆菌G-2菌株在NA培养基上生长，其中，NA培养基的制备方法为：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0～20.0g，蒸馏水溶解至1000mL，调节pH7.2～7.4。得到的菌落外形不规则，乳白色，不透明，有较小褶皱，中间微有褶皱凸起；革兰氏染色为紫色，是革兰氏阳性菌；芽孢染色显示有芽孢；厌氧生长-；V-P反应+；硝酸盐还原+；淀粉水解+；明胶液化+；利用丙酸盐-；D-甘露醇+；D-木糖+；L-***糖+。
使用基因组提取试剂盒提取该菌株基因组DNA，并利用PCR技术测定16SrDNA基因序列全长为1500bp，具体序列为SEQ ID No.1，具体序列如下：
ACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACGCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTT。
通过使用Blast进行比对，根据GenBank提供的最高相似性序列构建***发育树，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，***发育树的结果如图4。
实施例2
培养温度对枯草芽孢杆菌G-2培养的影响
将枯草芽孢杆菌G-2接种于种子培养基中，37℃摇床180rpm震荡培养16h制成种子液。其中，种子培养基由如下质量浓度的组分组成：10g/L蛋白胨，3.0g/L牛肉膏和5.0g/L氯化钠，pH为7.2～7.4。
将种子液以6.0％的接种量接入到发酵培养基中，其中，发酵培养基由如下质量浓度的组分组成：10g/L葡萄糖，1.5g/L酵母膏，0.5g/L蛋白胨，0.05g/LMgSO4和6.0g/LCaCO3，pH为7.2～7.4。调节发酵温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，每个处理2个重复，培养48h后，观察菌的生长情况，并测定发酵液离心上清液的纤维素酶活力。检测结果见表2，其中，“-”不生长，“w”微弱生长，“+”生长，“++”生长较好，“+++”生长良好。
表2本发明菌株在不同温度条件下的生长特性
由表2的结果可知，本发明的菌株在25～40℃的条件下均生长良好，且能在15～20℃的低温下生长，具有低温耐受性。在10～35℃时，本发明的枯草芽孢杆菌G-2所产纤维素酶活随着温度的升高纤维素酶活力逐渐升高，在35℃后纤维素酶活达到最高，为128.0U/mL左右，随后纤维素酶活呈现降低趋势。本发明的枯草芽孢杆菌G-2在20℃的时候酶活力仍然在80U/mL以上。
实施例3
发酵培养基的pH对枯草芽孢杆菌G-2培养的影响
枯草芽孢杆菌G-2的种子液的培养方法同实施例2。
将种子液以6.0％的接种量接入到pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的发酵培养基中，其中，发酵培养基的组分及浓度同实施例2的发酵培养基。每个处理2个重复，置于37℃条件下培养48h，观察菌的生长情况，并测定发酵液离心上清液的纤维素酶活力。检测结果见表3，其中，“-”不生长，“w”微弱生长，“+”生长，“++”生长较好，“+++”生长良好。
表3本发明菌株在不同温度条件下的生长特性
由表3的结果可知，本发明的菌株在pH 3.5～6.0之间均可以生长，但在pH3.5条件下生长微弱，在pH 4.0～4.5时生长较好。
本发明提供的枯草芽孢杆菌G-2具有良好的降解木质纤维素的作用，在10℃、pH3.5的条件下可以生长；在20℃、pH4.0的条件下生长良好，纤维素酶活力达到80U/mL；在35℃、pH4.0的条件下纤维素酶活力达到最高，可达128U/mL。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围内。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca 120
gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc 180
ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 240
atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt 300
gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg 420
acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 480
tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 540
gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc 600
ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg 720
ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc 780
tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc 840
acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt 900
gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta 960
ccgtcaaggt accgccctat tcgaacggta cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg 1020
atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa 1080
gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga 1140
tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgttg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc 1200
taatgcgccg cgggtccatc tgtaagtggt agccgaagcc accttttatg tttgaaccat 1260
gcggttcaaa caaccatccg gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag 1320
gcaggttacc cacgtgttac tcacgcgtcc gccgctaaca tcagggagca agctcccatc 1380
tgtccgctcg actt 1394
Claims (6)
1.枯草芽孢杆菌G-2(Bacillussubtilis)菌液在木质纤维素降解中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌G-2的保藏编号为CGMCCNo.21707；
所述枯草芽孢杆菌G-2菌液的制备方法包括：将所述的枯草芽孢杆菌G-2接种至发酵培养基，得到所述枯草芽孢杆菌G-2菌液；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～13.0g/L葡萄糖，0.8～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.03～0.06g/LMgSO4和4.0～7.0g/LCaCO3；所述发酵培养基的pH为6.0；
所述发酵培养的条件为：温度37℃，时间48h，转速150～200rpm。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌G-2以种子液的形式接种至发酵培养基；所述种子液的接种量为4％～10％。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述种子液的培养方法为：将枯草芽孢杆菌G-2接种至种子培养基进行种子培养，得到种子液；
所述种子培养基包括如下质量浓度的组分：9.0～12.0g/L蛋白胨，2.0～3.0g/L牛肉膏和4.0～5.0g/L氯化钠；所述种子培养基的pH为3.5～6.0。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子培养的条件为：温度15～40℃，时间12～36h，转速150～200rpm。
5.一种木质纤维素降解菌剂，其特征在于，采用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-2制备；
所述制备的方法包括将所述的枯草芽孢杆菌G-2接种至发酵培养基，得到枯草芽孢杆菌G-2菌液；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～13.0g/L葡萄糖，0.8～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.03～0.06g/LMgSO4和4.0～7.0g/LCaCO3；所述发酵培养基的pH为6.0；
所述发酵培养的条件为：温度37℃，时间48h，转速150～200rpm。
6.根据权利要求5所述的木质纤维素降解菌剂，其特征在于，所述木质纤维素降解菌剂中枯草芽孢杆菌G-2的浓度为1×108～3×108CFU/g。
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