CN115304678A - 基于dc细胞的双功能纳米抗体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开基于DC细胞的双功能纳米抗体及其构建方法和应用，所述双功能纳米抗体是以接头元件将基于DC细胞的目的蛋白特异性纳米抗体和编码粒径为150nm以下的病毒抗原特异性纳米抗体的基因连接后获得目的基因片段并重组表达获得的目的蛋白。本发明所采用的技术手段具备通用性，可以针对不同的病原筛选其特异性的纳米抗体，构建相应的猪DC靶向型双功能纳米抗体，即可扩展应用于其他猪用疫苗抗原，操作简单、高效、耗时短，且双功能纳米抗体在设计以及结构上较为明确，易于利用微生物基因工程***高效生产，制造成本低，具有较好的稳定性。双功能纳米抗体与抗原经孵育后即可使用，简单易行，更加贴近兽医临床实际，便于推广普及。

Description

基于DC细胞的双功能纳米抗体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于DC细胞的双功能纳米抗体及其构建方法和应用。
背景技术
树突状细胞(dendritic cell，DC)是机体内功能最强大的专职抗原提呈细胞，针对DC细胞实现 抗原的主动靶向输送对于提高抗原提呈效率和改善抗原免疫效力具有重要意义，是新型疫苗制剂研 制与应用领域的前沿热点。抗原的DC靶向主要是通过靶向DC细胞表面受体来实现的，外源性抗 原经抗体或天然配体靶向至DC细胞后，DC细胞对其进行摄取、加工处理，分别提呈至相应的效应 细胞，激活免疫反应。与非靶向抗原相比较，靶向抗原在提高抗原提呈效率以及减少抗原用量方面 都具有显著改善，在抗病毒感染和肿瘤治疗方面具有良好的应用价值，目前多个DC靶向人用疫苗 已进入临床试验阶段。而关于猪DC靶向研究、猪DC细胞表面受体种类、结构和功能研究较少。
CD205作为DC特异性的抗原提呈受体，属于C型凝集素受体(C-type lectinreceptors，CLRs) 中的巨噬细胞甘露糖受体家族，又称为DEC-205或Ly75，是目前在机体淋巴器官T细胞区域的DC 细胞中表达最广泛的唯一受体，在抗原提呈过程中发挥着重要作用。研究显示，与非靶向抗原相比 较，CD205靶向可以使OVA抗原提呈效率提高至少100倍，抗原用量减少近1000倍；通过将乙肝 病毒preS抗原靶向至CD205，可以在小鼠体内产生高效的IgG1和IgG2a抗体反应，对乙肝病毒感 染产生预防和治疗效果；在人黑色素瘤临床试验中发现，通过将NY-ESO-1抗原靶向至CD205，可 以产生高效的体液免疫反应和细胞免疫反应，部分患者病症表现稳定，并出现肿瘤衰退以及病灶缩 小。CD205已成为新型疫苗制剂研发与应用领域的重要靶点，CD205靶向人用疫苗也已进入临床试 验阶段。在兽医领域研究方面，CD205靶向日益受到关注。研究显示，通过将立克次氏体MSP1a 抗原靶向至牛CD205，可以显著提高IFN-γ水平和抗体水平；通过将禽流感病毒HA抗原靶向至鸡 CD205，在免后14天可以产生高效的抗体水平；通过将裂谷热病毒eGn抗原靶向至羊CD205，尽 管可以提高IFN-γ水平，但降低了抗体水平以及攻毒保护作用；通过将PRRSV的GP345M融合抗原靶向至猪CD205，尽管可以产生较好的IFN-γ水平和抗体水平，但不能产生攻毒保护作用，猪肺 部病变差异不显著；CD205靶向FMDV、PEDV、CSFV研究则未见报道。综上所述，现有研究报道 中由于物种、靶向抗原的不同，产生的免疫效果也不尽相同；且靶向提呈作用机制尚不清楚，靶向 抗原的设计也存在不足。现有研究报道中多使用蛋白质抗原作为靶向抗原，蛋白质抗原由于抗原表 位有限，往往不能产生较为理想的免疫效果。因此，如何设计更加有效的靶向抗原对于改善DC靶 向免疫效力将发挥重要作用。抗原的DC靶向主要是利用DC表面受体相应的特异性单克隆抗体或 单链抗体，通过化学偶联或基因融合表达的方法与抗原进行组装，该过程较为繁琐，易影响抗原结 构。因此，探索新的抗原组装策略对于改善DC靶向免疫效力具有重要意义。
纳米抗体作为目前已知的具有完整功能的最小抗原结合片段，与单克隆抗体和单链抗体相比， 具有相对分子质量小(约15KDa)、免疫原性低、稳定性高、易于利用微生物基因工程***高效生 产等特点。纳米抗体在DC靶向方面的研究也表现出了较好的应用前景，研究表明，通过制备针对 MHCII、CD11b和CD36的特异性纳米抗体，分别利用GFP、酵母泛素、OVA和流感病毒HA进行 DC靶向研究，均可以产生较好的免疫反应，在小鼠体内可以产生针对流感病毒的攻毒保护作用；通 过制备小鼠CD206特异性纳米抗体，可以实现纳米凝胶和报告基因的靶向提呈。截止到目前为止， 在猪DC或CD205靶向研究方面，仍然以单克隆抗体和单链抗体为主，猪DC或CD205特异性纳米 抗体未见报道，关于猪DC细胞靶向型双功能纳米抗体及猪CD205靶向型双功能纳米抗体均未见报 道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了可用于抗原靶向猪DC细胞的双功能纳米抗体。 本发明采用一种新的技术思路，利用抗原与纳米抗体之间的特异性结合以及双功能纳米抗体的桥连 作用实现抗原的DC靶向，该方法既可以避免化学偶联和基因融合表达方法对抗原结构的影响，又 可以采用完整的病原粒子替代常规的蛋白质抗原，充分利用完整的病原粒子的天然抗原表位，易于 在临床实际中开展应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的双功能纳米抗体的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的双功能纳米抗体的应用。
技术方案：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了基于DC细胞的双功能纳米抗体， 所述双功能纳米抗体是以接头元件将基于DC细胞的目的蛋白特异性纳米抗体的基因和编码粒径为 150nm以下的病毒抗原特异性纳米抗体的基因连接后获得目的基因片段并重组表达获得的目的蛋 白。
其中，所述基于DC细胞的目的蛋白特异性纳米抗体包括编码DC细胞特异性的纳米抗体或编 码DC细胞抗原提呈受体特异性的纳米抗体。
其中，所述猪DC细胞的目的蛋白特异性纳米抗体和粒径在150nm以内的猪病毒抗原特异性纳 米抗体是利用噬菌体展示技术分别筛选获得。
进一步地，所述猪病毒抗原粒径为17nm～130nm。进一步地，所述猪病毒抗原粒径为20nm～60nm。 进一步地，所述猪病毒抗原粒径为20nm～50nm。进一步地，所述猪病毒抗原粒径为17nm、20nm、 25nm、50nm、60nm或130nm中的一种或几种。
其中，所述猪病毒抗原包括猪圆环病毒抗原(Porcine Circovirus，PCV，病毒粒子直径约为17nm)、 猪细小病毒抗原(Porcine Parvovirus，PPV，病毒粒子直径约为20nm)、猪***病毒抗原(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV，病毒粒子直径约为25nm)、猪瘟病毒抗原(Classical Swine Fever Virus， CSFV，病毒粒子直径约为50nm)、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV，病毒粒子直径约为60nm)或猪流行性腹泻病毒抗原(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV，病毒粒子直径约为130nm)中的一种或几种。
本发明内容还包括所述的基于DC细胞的双功能纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)使用新鲜诱导分化的DC细胞免疫骆驼或羊驼，经过多次免疫后，利用分子生物学原理提取 其外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库；
2)将新鲜诱导分化的DC细胞作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛选， 获得1个猪DC特异性纳米抗体；
3)使用所述的病毒免疫骆驼或羊驼，经过多次免疫后，利用分子生物学原理提取其外周血淋巴 细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库；
4)将所述的病毒作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛选，获得1个所述 的病毒特异性纳米抗体；
5)将猪DC特异性纳米抗体的基因序列和所述的病毒特异性纳米抗体的基因序列连接后获得目 的基因片段并重组表达获得的目的蛋白：利用猪DC特异性纳米抗体和该病原特异性纳米抗体的基 因序列经重叠延伸PCR方法构建双功能纳米抗体表达体系，表达产物经纯化后，与该病原抗原孵育， 对猪进行免疫，采集免后血清、***等样品，对抗体、细胞因子进行检测，用于免疫效力评价。
本发明内容还包括靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体，所述靶向猪DC细胞的 猪O型FMDV的双功能纳米抗体是以接头元件将编码DC特异性的纳米抗体的基因和编码猪O型 FMDV特异性的纳米抗体的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的蛋白。
其中，所述猪DC特异性的纳米抗体Nb131的氨基酸序列为SEQ ID NO.：5所示，所述猪O型 FMDV特异性的纳米抗体Nb104的氨基酸序列为SEQ ID NO.：6所示。
其中，所述编码猪DC特异性的纳米抗体Nb131的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.：1所示，所 述编码猪O型FMDV特异性的纳米抗体Nb104的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.：2所示。
其中，所述接头元件包括但不仅限于接头元件(G4S)4，还可以包括常见的(G4S)n，n＝1～6， 还有驼源抗体IgG2c的铰链区、人抗体IgA的铰链区等，所述接头元件为接头元件(G4S)4，所述 接头元件(G4S)4的核苷酸序列如SEQ ID NO.：3所示，接头元件(G4S)4的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7 所示。
其中，所述靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体Nb131-104的氨基酸序列如SEQ ID NO.：8所示。
其中，猪DC特异性的纳米抗体Nb131与猪DC细胞的平衡解离常数(KD)为3.43×10-9，猪O 型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104与猪O型FMDV抗原的平衡解离常数(KD)为6.82×10-10， 猪DC/FMDV双功能纳米抗体Nb131-104与猪DC细胞的平衡解离常数(KD)分别为6.02×10-8，猪 DC/FMDV双功能纳米抗体Nb131-104与猪O型FMDV抗原的平衡解离常数(KD)为2.41×10-9。
本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体 Nb131-104，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。
本发明内容还包括所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体的构建方法，所述构 建方法包括如下步骤：将编码靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体Nb131-104的基因 ***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白， 裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb131-104。
本发明内容还包括靶向猪DC细胞的猪CSFV的双功能纳米抗体，所述靶向猪DC细胞的猪CSFV 的双功能纳米抗体是以接头元件将编码DC特异性的纳米抗体的基因和编码猪CSFV特异性的纳米 抗体的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的蛋白。
其中，所述猪DC特异性的纳米抗体Nb131的氨基酸序列为SEQ ID NO.：5所示，所述猪CSFV 特异性的纳米抗体Nb62的氨基酸序列为SEQ ID NO.：20所示。
其中，所述编码猪DC特异性的纳米抗体Nb131的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.：1所示，所 述编码猪CSFV特异性的纳米抗体Nb62的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.：18所示。
其中，所述接头元件包括但不仅限于接头元件(G4S)4，还可以包括常见的(G4S)n，n＝1～6， 还有驼源抗体IgG2c的铰链区、人抗体IgA的铰链区等，所述接头元件为接头元件(G4S)4，所述 接头元件(G4S)4的核苷酸序列如SEQ ID NO.：3所示，接头元件(G4S)4的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7 所示。
其中，所述靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体Nb131-62的氨基酸序列如SEQID NO.：21 所示。
其中，猪DC特异性的纳米抗体Nbl31与猪DC细胞的平衡解离常数(KD)为3.43×10-9，猪 CSFV抗原特异性纳米抗体Nb62与猪CSFV抗原的平衡解离常数(KD)为1.55×10-10，猪DC/CSFV 双功能纳米抗体Nb131-62与猪DC细胞的平衡解离常数(KD)分别为0.77×10-9，猪DC/CSFV双功 能纳米抗体Nb131-62与猪CSFV抗原的平衡解离常数(KD)为3.49×10-9。
本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体 Nb131-62，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：19所示。
本发明内容还包括所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体的构建方法，所述构建方 法包括如下步骤：将编码靶向猪DC细胞的猪CSFV的双功能纳米抗体Nb131-62的基因***pMECS 载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后 纯化获得双功能纳米抗体Nb131-62。
为了通过抗原的猪CD205靶向提呈进而改善抗原的免疫效力，本发明以猪CD205目的蛋白为 靶点，筛选猪CD205特异性纳米抗体，开展抗原的靶向提呈与免疫效力评价。
本发明内容还包括靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，所述双功能纳米抗体以接头元件 将编码CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193和编码猪PEDV抗原特异性纳米抗体Nb2的基因连 接后获得目的基因片段进一步重组表达获得目的蛋白。
其中，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的核苷酸序列如SEQ ID NO.：9所示，所 述猪PEDV抗原特异性纳米抗体Nb2的核苷酸序列如SEQ ID NO.：13所示。
其中，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的氨基酸序列如SEQ ID NO.：11所示，猪 PEDV抗原特异性纳米抗体Nb2的氨基酸序列如SEQ ID NO.：14所示。
其中，所述接头元件包括但不仅限于接头元件(G4S)4，还可以包括常见的(G4S)n，n＝1～6， 还有驼源抗体IgG2c的铰链区、人抗体IgA的铰链区等，所述接头元件为接头元件(G4S)4，所述 接头元件(G4S)4的核苷酸序列如SEQ ID NO.：3所示，接头元件(G4S)4的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7 所示。
其中，所述靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体Nb193-2的氨基酸序列如SEQ IDNO.：16 所示。其中，所述的猪CD205特异性纳米抗体Nb193与猪CD205目的蛋白的平衡解离常数(KD) 为1.04×10-9，猪PEDV特异性纳米抗体Nb2与猪PEDV抗原的平衡解离常数(KD)为1.03×10-8， 所述的猪CD205/PEDV双功能纳米抗体Nb193-2与猪CD205目的蛋白的平衡解离常数(KD)为 1.52×10-8，所述的猪CD205/PEDV双功能纳米抗体Nb193-2与猪PEDV抗原的平衡解离常数(KD) 为1.01×10-8。
本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体 Nb193-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：15所示。
本发明内容还包括所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体的制备方法，包括以下步骤： 将双功能纳米抗体Nb193-2的编码基因***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获 得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb193-2。
本发明内容还包括靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，所述靶向猪CD205的猪O 型FMDV双功能纳米抗体以接头元件将编码CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的基因和编码 O型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的 蛋白。
其中，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的核苷酸序列如SEQ ID NO.：9所示，猪 O型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104的核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。
其中，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的氨基酸序列如SEQ ID NO.：11所示，猪 O型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示。
其中，所述接头元件包括但不仅限于接头元件(G4S)4，还可以包括常见的(G4S)n，n＝1～6， 还有驼源抗体IgG2c的铰链区、人抗体IgA的铰链区等，所述接头元件(G4S)4，的核苷酸序列如 SEQ ID NO.：3所示，接头元件(G4S)4，的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7所示。
其中，所述靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体Nb193-104的氨基酸序列如SEQ ID NO.：12所示。其中，所述的猪CD205特异性纳米抗体Nb193与猪CD205目的蛋白的平衡解离常数 (KD)为1.04×10-9，猪O型FMDV特异性纳米抗体Nb104与猪O型FMDV抗原的平衡解离常数 (KD)为6.82×10-10，所述的猪CD205/FMDV双功能纳米抗体Nb193-104与猪CD205目的蛋白的平 衡解离常数(KD)为0.75×10-8、、所述的猪CD205/FMDV双功能纳米抗体Nb193-104与猪O型FMDV 抗原的平衡解离常数(KD)为1.44×10-8。
本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体 Nb193-104，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：10所示。
本发明内容还包括所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体的制备方法，包括以 下步骤：将双功能纳米抗体Nb193-104的编码基因***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受 态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb193-104。
本发明内容还包括所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体、所述的靶向猪 DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体、所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体、所述的靶 向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体、所述的核酸或基因在制备猪用疫苗中的应用。
本发明所述载体包括但不仅限于pMECS载体，其他载体，如pHEN1、pHEN4、pComb3XSS、 pCANTAB5e、pPIC9K、pYES2等，还有病毒载体，如杆状病毒、慢病毒载体、腺病毒载体、AAV 病毒载体、逆转录病毒等，以及转座子和其他基因转移***，根据后续的表达以及作用方式，可以 选择很多种载体形式。
本发明所述细胞包括但不仅限于大肠杆菌WK6感受态细胞，其他宿主细胞如原核细胞中的大肠 杆菌TOP10、BL21、XL1-blue等，还有真核细胞CHO、293等，其他宿主还有酿酒酵母BY4743细 胞和毕赤酵母GS115细胞，以及SF9昆虫细胞等。
本发明提供的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体具体通过以下技术方案实现：
1)使用新鲜诱导分化的猪BMDC细胞免疫新疆双峰驼，经过6次免疫后，利用分子生物学原 理提取其外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基 因文库；
2)将新鲜诱导分化的猪BMDC细胞作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和 筛选，获得1个介导抗原高效内吞的猪DC特异性纳米抗体，命名为Nb131；
3)使用O型FMDV灭活病毒免疫新疆双峰驼，经过6次免疫后，利用分子生物学原理提取其 外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库；
4)将O型FMDV作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛选，获得1个O 型FMDV特异性纳米抗体，命名为Nb104；
5)利用猪DC特异性纳米抗体Nb131和O型FMDV特异性纳米抗体Nb104的基因序列利用重 叠延伸PCR方法构建双功能纳米抗体表达体系(Nb131-104)，表达产物经纯化后，与猪O型FMDV 抗原孵育，对猪进行免疫，采集免后血清、***等样品，对抗体、细胞因子进行检测，用于免疫 效力评价。
本发明提供的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体通过以下技术方案实现：
1)使用新鲜诱导分化的猪BMDC细胞免疫新疆双峰驼，经过6次免疫后，利用分子生物学原 理提取其外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基 因文库；
2)将新鲜诱导分化的猪BMDC细胞作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和 筛选，获得1个介导抗原高效内吞的猪DC特异性纳米抗体，命名为Nb131；
3)使用猪瘟耐热保护剂活疫苗免疫新疆双峰驼，经过6次免疫后，利用分子生物学原理提取 其外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库；
4)将猪瘟病毒灭活抗原作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛选，获得1 个CSFV特异性纳米抗体，命名为Nb62；
5)利用猪DC特异性纳米抗体Nb131和CSFV特异性纳米抗体Nb62的基因序列利用重叠延伸 PCR方法构建双功能纳米抗体表达体系(Nb131-62)，表达产物经纯化后，与猪CSFV抗原孵育， 对猪进行免疫，采集免后血清、***等样品，对抗体、细胞因子进行检测，用于免疫效力评价。
本发明提供的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体按照以下技术方案实现：
S1)利用PCR技术扩增猪CD205分子的CysR-FN II截短基因序列，采用pET-32a表达载体构 建猪CD205分子重组表达载体，进行原核***可溶性表达及蛋白纯化。
S2)使用纯化后的猪CD205目的蛋白免疫新疆双峰驼，经过5-7次免疫后提取其外周血淋巴细 胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库。
S3)将纯化后的猪CD205目的蛋白作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛 选，获得1个高亲和力的猪CD205特异性纳米抗体，命名为Nb193。
S4)使用猪PEDV抗原免疫新疆双峰驼，经过5-7次免疫后提取其外周血淋巴细胞cDNA，并 扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库。
S5)将猪PEDV抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛选，获得1个高亲和力 的猪PEDV特异性纳米抗体，命名为Nb2。
S6)利用猪CD205特异性纳米抗体Nb193和猪PEDV特异性纳米抗体Nb2的基因序列经重叠 延伸PCR方法构建双功能纳米抗体表达体系(Nb193-2)，表达产物经纯化后，与猪PEDV抗原孵 育，对猪进行免疫，采集免后血清、***等样品，对抗体、细胞因子进行检测，用于免疫效力评 价。
本发明提供的一种靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体通过以下技术方案实现：
1)利用PCR技术扩增猪CD205分子的CysR-FN II截短基因序列，采用pET-32a表达载体构建 猪CD205分子重组表达载体，进行原核***可溶性表达及蛋白纯化。
2)使用纯化后的猪CD205目的蛋白免疫新疆双峰驼，经过5-7次免疫后提取其外周血淋巴细 胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库。
3)将纯化后的猪CD205目的蛋白作为抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛 选，获得1个高亲和力的猪CD205特异性纳米抗体，命名为Nb193。
4)使用猪O型FMDV抗原免疫新疆双峰驼，经过5-7次免疫后提取其外周血淋巴细胞cDNA， 并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库。
5)将猪O型FMDV抗原进行包被，利用噬菌体展示技术进行3-5轮亲和筛选，获得1个高亲 和力的猪O型FMDV特异性纳米抗体，命名为Nb104。
6)利用猪CD205特异性纳米抗体Nb193和猪O型FMDV特异性纳米抗体Nb104的基因序列 经重叠延伸PCR方法构建双功能纳米抗体表达体系(Nb193-104)，表达产物经纯化后，与猪O型 FMDV抗原孵育，对猪进行免疫，采集免后血清、***等样品，对抗体、细胞因子进行检测，用 于免疫效力评价。
本发明的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体可以同时与猪DC细胞、猪O型口蹄 疫抗原特异性结合的双功能纳米抗体，在改善猪O型FMDV抗原免疫效力中开展的应用，可以提高 猪O型FMDV抗原免后IgG和IgG1抗体效价，延长免后IgG抗体持续期，提高CD4+T细胞和CD8+T 细胞占比，促进IFN-γ、IL-2、IL-4分泌。
本发明的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体可以同时与猪DC细胞、猪CSFV抗原特 异性结合的双功能纳米抗体，在改善猪CSFV抗原免疫效力中开展的应用，可以提高猪CSFV抗原 免后的抗体阻断率，促进淋巴细胞增殖以及IFN-γ、IL-2、IL-4、IL10分泌，诱导高效的细胞免疫应 答。
本发明的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体利用一种可以同时与猪CD205目的蛋白、 猪PEDV抗原特异性结合的双功能纳米抗体在改善猪PEDV抗原免疫效力中开展的应用，可以提高 猪PEDV抗原免后IgG、IgG1、IgG2a以及粘膜IgA抗体效价，促进淋巴细胞增殖以及IFN-γ、IL-4、 IL-6分泌，诱导高效的细胞免疫应答。
本发明的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体利用一种可以同时与猪CD205目的蛋 白、猪O型FMDV抗原特异性结合的双功能纳米抗体在改善猪O型FMDV抗原免疫效力中开展的 应用，可以提高猪O型FMDV抗原免后IgG、IgG1、IgG2a抗体效价，促进淋巴细胞增殖以及IFN-γ、 IL-2、IL-4分泌，诱导高效的细胞免疫应答。
本发明所述双功能纳米抗体可以直接与抗原进行孵育组装，该方法既可以采用全病毒替代蛋白 质抗原，充分利用全病毒的天然抗原表位，又可以避免化学偶联和基因融合表达方法对抗原结构的 影响。而粒径作为病原微生物最基本的属性之一，可以通过影响抗原与免疫细胞的相互作用以及抗 原向***的迁移效率等方面，进而影响免疫效果。细胞对抗原的摄取途径可分为受体介导的内吞 作用、吞噬作用和巨胞饮作用等途径，不同粒径的抗原会以不同的途径被不同的抗原提呈细胞摄取。 一般情况下，20-200nm的抗原主要以受体介导的内吞作用被细胞摄取，而大于500nm的抗原则主要 以巨胞饮和吞噬作用被细胞摄取。本发明也通过多个实施例验证了，对于粒径为150nm以下的病毒 均可以实现DC靶向，而针对粒径为150nm以下的其他病毒，仅需更换相应的纳米抗体进而构建对 应的猪DC靶向或CD205靶向双功能纳米抗体，即可推广应用于其他猪用疫苗抗原，具有很强的通 用性。
现有研究通常采用化学偶联或基因融合表达的方法将DC特异性单克隆抗体或单链抗体与抗原 进行组装，但该过程较为繁琐，易影响抗原结构，且蛋白质抗原由于抗原表位有限，往往不能产生 理想的免疫效果。本发明采用一种新的技术思路，利用抗原与纳米抗体之间的特异性结合以及双功 能纳米抗体的桥连作用实现抗原的DC靶向，该方法既可以避免对抗原结构的影响，又可以采用全 病毒替代蛋白质抗原，充分利用全病毒的天然抗原表位，易于在临床实际中开展应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明所提供的可用于抗原靶向猪DC细 胞或猪CD205的双功能纳米抗体，是国内外首次提出的以双功能纳米抗体为技术手段，以猪DC细 胞或猪CD205分子为靶点探索大幅度改善猪用疫苗抗原免疫效力的新途径，本发明有助于设计针对 猪DC细胞的新型、高效、主动靶向抗原输送***。本发明采用双功能纳米抗体作为技术纽带，直 接与抗原进行孵育组装，即可实现抗原的DC或CD205靶向，该方法既可以采用完整病原粒子替代 传统的蛋白质抗原，充分利用完整病原粒子的天然抗原表位，又可以避免常规的化学偶联和基因融 合表达方法对抗原结构的影响。此外，本发明具备通用性，可以针对在本发明特定的粒径范围内的 不同的病原筛选其特异性的纳米抗体，构建相应的猪DC靶向型双功能纳米抗体，即可扩展应用于 其他猪用疫苗抗原，操作简单、高效、耗时短，且双功能纳米抗体在设计以及结构上较为明确，易 于利用微生物基因工程***高效生产，制造成本低，具有较好的稳定性。双功能纳米抗体与抗原经 孵育后即可使用，简单易行，更加贴近兽医临床实际，便于推广普及。
附图说明
图1为激光共聚焦显微镜观察猪BMDC细胞免疫荧光图。分别利用PE anti-porcineCD11c、FITC anti-porcine CD11b和DAPI对细胞进行染色并观察细胞形态。
图2为VHH基因PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNA marker，泳道1和2为VHH基因片段扩增产物。
图3为噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体基 因文库单克隆，M：DL2000bp DNA marker。
图4为间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示 OD450数值，猪DC破碎产物表示样品孔，猪骨髓祖细胞破碎产物表示阴性孔，Control表示空白孔。
图5为纯化后的纳米抗体的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。左图中泳道1-6为随 机挑选的纯化后的纳米抗体SDS-PAGE鉴定结果；M：protein standards；右图中泳道1-6为随机挑选 的纯化后的纳米抗体Western Blot鉴定结果；M：protein standards。
图6为VHH基因PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNA marker，泳道1-5为VHH基因片段扩增产物。
图7为噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体基 因文库单克隆，M：DL2000bp DNA marker。
图8为间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示 OD450数值，O型FMDV表示样品孔，BHK-21表示阴性孔，Control表示空白孔。
图9为间接ELISA方法检测纳米抗体的特异性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示 OD450数值，A型FMDV和Asial型FMDV表示样品孔，Control表示空白孔。
图10为纯化后的纳米抗体的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。左图中泳道1-5为随 机挑选的纯化后的纳米抗体SDS-PAGE鉴定结果；M：protein standards；右图中泳道1-5为随机挑选 的纯化后的纳米抗体Western Blot鉴定结果；M：protein standards。
图11为双功能纳米抗体基因片段SOE-PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNAmarker，另一 泳道为双功能纳米抗体基因片段扩增产物。
图12为纯化后的双功能纳米抗体Nb131-104的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。上 图中泳道1、2为纯化后的双功能纳米抗体Nb131-104的SDS-PAGE鉴定结果；下图中泳道1、2为 纯化后的双功能纳米抗体Nb131-104的Western Blot鉴定结果；M：proteinstandards。
图13为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb131-104与猪BMDC的结合能力。上方的4 组图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光 共聚焦显微镜观察结果。分别利用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb131-104和DAPI对细胞进行染 色并观察细胞形态。
图14为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb131-104的FMDV抗原递送能力。上方的4 组图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光 共聚焦显微镜观察结果。分别利用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb131-104和DAPI对细胞进行染 色并观察细胞形态。
图15为ELISA检测免后血清中特异性抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行抗体检测。
图16为ELISA检测免后血清中IgG1抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血进 行抗体检测。
图17为ELISA检测免后血清中IgG2a抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行抗体检测。
图18为ELISA检测免后抗体持续期，分别于免后14天、28天、42天、56天采血进行抗体检 测。
图19为ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平；
图20为VHH基因PCR扩增结果。其中M为DL2000 DNA marker，泳道1为VHH基因片段扩增产物。
图21为噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体 基因文库单克隆，M为DL2000 DNA marker。
图22为间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表 示OD450数值，猪瘟病毒抗原表示样品孔，PK-15表示阴性孔，Control表示空白孔。
图23为间接ELISA方法检测纳米抗体的特异性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示 OD450数值，O-FMDV、PCV2、PRRSV、PRV、PEDV表示样品孔，Control表示空白孔；
图24为纯化后的纳米抗体的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1-3为随机挑选 的纯化后的纳米抗体，M为protein standards；
图25为双功能纳米抗体基因片段SOE-PCR扩增结果。其中M为DL10000 DNAmarker，泳道 1为双功能纳米抗体基因片段扩增产物；
图26为纯化后的双功能纳米抗体Nb131-62的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳 道1为纯化后的双功能纳米抗体Nb131-62，M为protein standards；
图27为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb131-62与猪BMDC的结合能力。上方的4组 图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光共 聚焦显微镜观察结果。分别使用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb131-62和DAPI对细胞进行染色 并观察细胞形态；
图28为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb131-62的FMDV抗原递送能力。上方的4组 图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光共 聚焦显微镜观察结果。分别利用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb131-62和DAPI对细胞进行染色 并观察细胞形态；
图29为ELISA检测免后血清中特异性抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行检测；
图30为ELISA检测免后血清中IFN-γ分泌水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行检测；
图31为ELISA检测免后血清中IL-2分泌水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血进 行检测
图32为ELISA检测免后血清中IL-4分泌水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血进 行检测
图33为ELISA检测免后血清中IL-10分泌水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行检测。
图34为MTT法检测淋巴细胞增殖水平。
图35为猪CD205分子CysR-FN II截短基因PCR扩增结果。其中M为DL2000 DNAmarker， 泳道1为猪CD205分子CysR-FN II截短基因片段扩增产物。
图36为纯化后的猪CD205目的蛋白的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。其中泳道1 为纯化后的猪CD205目的蛋白，M为protein standards。
图37为VHH基因PCR扩增结果。其中M为DL2000 DNA marker，泳道1和2为VHH基因片段扩增产物。
图38为噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体 基因文库单克隆，M为DL2000 DNA marker。
图39为间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表 示OD450数值，猪CD205目的蛋白表示样品孔，相同条件下制备的其他任一不相关蛋白表示阴性 孔，Control表示空白孔。
图40为纯化后的纳米抗体的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1、2为随机挑 选的纯化后的纳米抗体，M为protein standards。
图41为VHH基因PCR扩增结果。其中M为DL2000 DNA marker，泳道1-3为VHH基因片段 扩增产物。
图42为噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体 基因文库单克隆，M为DL2000 DNA marker。
图43为间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表 示OD450数值，PEDV表示样品孔，ST表示阴性孔，Control表示空白孔。
图44为间接ELISA方法检测纳米抗体的特异性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示 OD450数值，O-FMDV、PCV2、PRRSV、PRV表示样品孔，Control表示空白孔。
图45为纯化后的纳米抗体的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1、2为随机挑 选的纯化后的纳米抗体，M为protein standards。
图46为双功能纳米抗体基因片段SOE-PCR扩增结果。其中M为DL10000 DNAmarker，泳道 1为双功能纳米抗体基因片段扩增产物。
图47为纯化后的双功能纳米抗体Nb193-2的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道 1为纯化后的双功能纳米抗体Nb193-2，M为protein standards。
图48为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb193-2与猪BMDC的结合能力。上方的4组 图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光共 聚焦显微镜观察结果。分别使用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb193-2和DAPI对细胞进行染色并 观察细胞形态。
图49为ELISA检测免后28天血清中特异性抗体水平。
图50为ELISA检测免后28天血清中IgG1抗体水平。
图51为ELISA检测免后28天血清中IgG2a抗体水平。
图52为ELISA检测免后28天粘膜IgA抗体水平。
图53为MTT法检测淋巴细胞增殖水平。
图54为ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-6分泌水平。
图55为双功能纳米抗体基因片段SOE-PCR扩增结果。其中M为DL10000 DNAmarker，泳道 1为双功能纳米抗体基因片段扩增产物；
图56为纯化后的双功能纳米抗体Nb193-104的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳 道1为纯化后的双功能纳米抗体Nb193-104，M为protein standards；
图57为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb193-104与猪BMDC的结合能力。上方的4 组图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光 共聚焦显微镜观察结果。分别使用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb193-104和DAPI对细胞进行染 色并观察细胞形态；
图58为激光共聚焦显微镜观察双功能纳米抗体Nb193-104的FMDV抗原递送能力。上方的4 组图为加入双功能纳米抗体的试验组激光共聚焦显微镜观察结果，下方的4组图为空白对照组激光 共聚焦显微镜观察结果。分别利用AF647 anti-porcine CD1、FITCNb193-104和DAPI对细胞进行染 色并观察细胞形态。
图59为ELISA检测免后血清中特异性抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行抗体检测；
图60为ELISA检测免后血清中IgG1抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血进 行抗体检测；
图61为ELISA检测免后血清中IgG2a抗体水平，分别于免后14天、28天、42天、56天采血 进行抗体检测；
图62为ELISA检测免后抗体持续期，分别于免后14天、28天、42天、56天采血进行抗体检 测；
图63为MTT法检测淋巴细胞增殖水平；
图64为ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用 于限制本发明范围。
实施例1针对猪BMDC细胞纳米抗体文库的构建
1、猪BMDC细胞的诱导分化
收集新鲜的猪骨髓祖细胞(4×106cells/mL)，使用猪重组GM-CSF(20ng/mL，购自上海优宁维 公司)和猪重组IL-4(10ng/mL，购自上海优宁维公司)对其进行诱导分化，连续培养7天后，收 集猪骨髓源树突状细胞(BMDC)并种植于细胞培养皿中(2×106cells/mL)，并用4％多聚甲醛室温 固定10min，PBS清洗3遍后置于含0.1％Triton的PBS中37℃处理5min，用PBS清洗3遍后置 于封闭液中37℃封闭1h，用PE标记anti-porcine CD11c荧光抗体(1：1000稀释，购自上海优宁维 公司)4℃孵育30min，PBS洗涤细胞三遍，使用FITC标记anti-porcine CD11b荧光抗体(1∶1000 稀释，购自上海优宁维公司)4℃孵育30min，PBS洗涤细胞三遍，使用DAPI(工作液，购自上海 碧云天公司)染色10min，PBS洗涤细胞三遍后置于激光共聚焦显微镜下进行观察，如图1所示， 获得了较为丰富的猪BMDC细胞。
2、RNA的提取与cDNA的合成
经反复多次的诱导分化，将足量的猪BMDC细胞(约1×1010cells)进行超声破碎，12000g离心 10min后弃上清，使用生理盐水重悬沉淀，获得猪BMDC细胞破碎产物，将1mg猪BMDC细胞破 碎产物与弗氏完全佐剂等体积混合，对一只新疆双峰驼进行免疫；1周之后，将1mg猪BMDC细胞 破碎产物与弗氏不完全佐剂等体积混合，免疫该双峰驼，每周一次，共免疫6次，刺激机体产生针 对猪BMDC细胞的特异性抗体；免疫结束后，抽取100mL骆驼外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞的 总RNA，按照反转录试剂盒(购自TAKARA公司)说明操作，合成cDNA。
3、引物的设计与合成
根据参考文献(Beta-lactamase inhibitors derived from single-domainantibody fragments elicited in the camelidae，Conrath Katja et.al，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45，2807-2812.)设 计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物C1F、C1R、VHHF和VHHR。 各引物的具体序列如表1。
表1.PCR扩增引物
引物 序列(5’-3’)
C1F GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
C1R GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
V<sub>HH</sub>F GATGTGCAG<u>CTGCAG</u>GAGTCTGGRGGAGG(下划线为Pst I酶切位点)
V<sub>HH</sub>R CTAGT<u>GCGGCCGC</u>TGAGGAGACGGTGACCTGGGT(下划线为Not I酶切位点)
注：表1中的简并碱基R＝A或G。
4、VHH片段的扩增
利用前面合成的骆驼cDNA为模板，PCR扩增VHH片段。首先，以cDNA为模板，利用C1F和C1R为上下游引物，扩增获得大小约为750bp的基因片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s， 59℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，回收大小约为750bp的基因片 段。然后，以该大小约为750bp的基因片段为模板，利用VHHF和VHHR为上下游引物，扩增VHH 片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图2所示， 可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司) 对目的条带进行纯化和回收。
5、噬菌体展示基因文库的构建
纯化回收的VHH基因片段采用Pst I和Not I酶切后，连入pMECS载体(购自Novagen公司)。 将连接产物转化至E.coli TG1感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃培养1h，将菌液离心浓缩 后涂在含有氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃过夜生长之后随机挑选24个单克隆菌落，利用VHHF 和VHHR为上下游引物进行菌落PCR鉴定。结果如图3，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，所有单 克隆菌落均含有大小约为350bp的目的片段，说明该文库的***率达到了100％。将上述平板中的菌 落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为猪BMDC 细胞纳米抗体噬菌体展示文库。
实施例2针对猪BMDC细胞纳米抗体的筛选过程
1、噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的实施例1所制备的噬菌体展示文库，接种至500mL 2×TY培养基中， 37℃、摇床转速为200rpm条件下培养3-5h后，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公 司)，37℃孵育1h，随后37℃、摇床转速为200rpm条件下培养过夜。次日，加入80g的PEG6000 (购自上海生工公司)沉淀噬菌体，该沉淀即为扩增后的噬菌体展示文库。将扩增后的噬菌体展示 文库重悬于5mL 0.1M PBS缓冲液中，得到其悬液。
2、亲和筛选
将10μg实施例1制备的猪BMDC细胞破碎产物加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2) 中，混合均匀，取100μL加入96孔酶标板的每孔中，在4℃包被过夜，设立猪骨髓祖细胞破碎产物 作为对照；次日，每孔加入1％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；然后，每孔加入100μL扩增后的 噬菌体展示文库悬液，室温作用1h，用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，洗掉不结合的 噬菌体，随后用100μL浓度为100mM的三乙胺(购自上海生工公司)溶液将与猪BMDC细胞破 碎产物特异性结合的噬菌体洗脱下，并感染5倍体积(约500μL)处于对数生长期(OD600为0.8) 的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)侵染 TG1细胞，离心取上清液，即得第一轮筛选到的噬菌体，用于下一轮的筛选。相同筛选过程共进行 3轮。每一轮筛选获得的噬菌体各取10μL涂于LB固体培养基上，均在37℃过夜培养，用于观察亲 和筛选富集过程。如表2所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要 多。
表2.噬菌体文库3轮亲和筛选富集过程
亲和筛选轮次 投入噬菌体文库量(pfu/mL) 回收噬菌体文库量(pfu/mL)
第一轮亲和筛选 1.12×10<sup>7</sup> 8.71×10<sup>3</sup>
第二轮亲和筛选 1.04×10<sup>7</sup> 6.25×10<sup>4</sup>
第三轮亲和筛选 1.16×10<sup>7</sup> 3.04×10<sup>5</sup>
实施例3酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1、纳米抗体的表达
从实施例2中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选200个单菌落分别接种于96孔板 (添加有含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基)的各孔中，并设置一个仅加入了TB培养基的空白 对照，在37℃、摇床转速为200rpm条件下培养至对数生长期，各孔均加入终浓度为1mM的IPTG， 在28℃、摇床转速为200rpm条件下过夜培养。次日，利用超声破碎法裂解各菌，离心后取裂解液， 分别获得各重组菌表达的针对猪BMDC细胞破碎产物的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～200。
2、间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应鉴定编号1～200的各纳米抗体与猪BMDC细胞破碎产物的结合活性。将 10μg实施例1制备的猪BMDC细胞破碎产物加入到10mL浓度为100mM的NaHCO3溶液(pH8.2) 中，混合均匀，取100μL加入到96孔酶标板的每个样品孔中，在4℃包被过夜，对照孔中以猪骨髓 祖细胞破碎产物替代猪BMDC细胞破碎产物进行包被；次日，弃掉板内液体，利用含有0.05％ Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入5％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；利用含有 0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，将100μL各纳米抗体依次加入ELISA板的各孔中，室温下 孵育1 h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的纳米抗体，加入100μL经1∶2000 稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，利用 含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1∶2000稀释后的HRP labeled goat anti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，利 用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液(购自上海生 工公司)，37℃孵育15min，每孔各加2M的硫酸溶液50μL终止反应，使用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光值OD450。当样品孔OD450值大于对照孔OD450值2.5倍以上时，判为阳性克隆孔。 结果如图4所示，共有17个纳米抗体可与猪BMDC细胞破碎产物发生特异性的结合反应(为筛选 到高亲和力的纳米抗体，仅选取OD450值大于2.0的纳米抗体)。
实施例4表面等离子共振法(SPR)筛选针对猪BMDC的高亲和力纳米抗体
1、针对猪BMDC的纳米抗体的表达及纯化
分别抽提实施例3所获得的针对猪BMDC的表达阳性纳米抗体的重组菌质粒，42℃分别转化到 大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃、摇床转速为200rpm的条件下培养1h， 离心浓缩菌液，并将其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时；挑 选单个菌落，分别获得针对猪BMDC的表达纳米抗体的重组菌A1-A17。
将重组菌A1-A17分别接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃摇床中培养至OD 600达0.6～0.9，取1mL菌液转接至500mL TB培养液中，在37℃摇床中培养，当OD600值达到0. 6～0.9时，加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃摇床中培养12～16小时诱导重组菌表达目的蛋白， 离心收集菌体沉淀，利用超声破碎获得纳米抗体粗提液，采用镍柱(购自GEHealthcare公司)亲和 层析法纯化纳米抗体。随机取纯化后的纳米抗体(编号分别为18、29、37、47、60、64)进行SDS -PAGE电泳和Western blot鉴定。从图5可以看到纳米抗体在大约16kD处均有明显条带，与目的 片段预期大小相一致，纯度达90％以上。
2、SPR法鉴定针对猪BMDC的纳米抗体的亲和力
分别使用BiacoreTM X100蛋白互作仪(购自GE Healthcare公司)鉴定所获得的17个针对猪B MDC的纳米抗体与猪BMDC细胞破碎产物的亲和力。首先使用偶联试剂N-ethyl-N’-(dimethylamino propyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide(购自Sigma公司)将实施例1制备的1mg猪BMDC细 胞破碎产物偶联至CM5芯片上，利用生理盐水将纯化后的纳米抗体(编号如表3所示)从100nM 进行梯度稀释(分别为100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM)，并分别与偶联至CM 5芯片上的破碎产物进行结合，结合时间180s，使用乙醇胺进行封闭，利用HBS-EP缓冲液(10m M N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-2-ethanesulfonic acid(HEPES)，pH 7.5，150mM NaCl，3.5m M EDTA，and 0.005％(v/v)Surfactant P20)进行洗涤去除未结合的物质，流速为30μL/min，使用 10mM glycine/HCl(pH 2.5)进行重生。检测结果经Biacore 2.0.1软件进行分析，结合速率常数(k a)、解离速率常数(kd)以及平衡解离常数(KD)如表3所示。编号为131的纳米抗体KD值达3. 43×10-9，为本发明筛选获得的亲和力最高的针对猪BMDC的纳米抗体，后续研究均围绕该纳米抗体Nb131开展。
表3.各纳米抗体与猪BMDC细胞破碎产物结合的动力学参数
纳米抗体编号 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
18 3.16×10<sup>4</sup> 4.10×10<sup>-4</sup> 1.29×10<sup>-8</sup>
29 1.17×10<sup>4</sup> 3.97×10<sup>-4</sup> 3.39×10<sup>-8</sup>
37 4.11×10<sup>4</sup> 3.03×10<sup>-4</sup> 0.73×10<sup>-8</sup>
39 8.85×10<sup>4</sup> 1.52×10<sup>-4</sup> 0.17×10<sup>-8</sup>
47 2.15×10<sup>5</sup> 9.65×10<sup>-4</sup> 4.48×10<sup>-9</sup>
60 1.91×10<sup>4</sup> 5.05×10<sup>-4</sup> 2.64×10<sup>-8</sup>
64 5.18×10<sup>4</sup> 1.79×10<sup>-4</sup> 0.35×10<sup>-8</sup>
96 8.09×10<sup>4</sup> 4.93×10<sup>-4</sup> 0.61×10<sup>-8</sup>
108 7.17×10<sup>4</sup> 3.18×10<sup>-4</sup> 0.44×10<sup>-8</sup>
128 2.10×10<sup>4</sup> 4.76×10<sup>-4</sup> 2.26×10<sup>-8</sup>
131 0.89×10<sup>5</sup> 3.05×10<sup>-4</sup> 3.43×10<sup>-9</sup>
147 6.71×10<sup>4</sup> 7.32×10<sup>-4</sup> 1.09×10<sup>-8</sup>
162 5.45×10<sup>4</sup> 8.23×10<sup>-4</sup> 1.51×10<sup>-8</sup>
169 3.10×10<sup>4</sup> 2.98×10<sup>-4</sup> 0.96×10<sup>-8</sup>
173 9.12×10<sup>4</sup> 1.76×10<sup>-4</sup> 0.19×10<sup>-8</sup>
181 4.46×10<sup>4</sup> 8.81×10<sup>-4</sup> 1.97×10<sup>-8</sup>
194 2.01×10<sup>4</sup> 5.24×10<sup>-4</sup> 2.61×10<sup>-8</sup>
注：表3中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
抽提纳米抗体Nb131的重组菌质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得其核苷酸序列和氨基 酸序列，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：5所示。
实施例5针对O型***病毒纳米抗体文库的构建
1、RNA的提取与cDNA的合成
将1mg O型***灭活病毒(中农威特生物科技股份有限公司惠赠)与弗氏完全佐剂等体积混 合，对一只新疆双峰驼进行免疫；1周之后，按照实施例1标题2所述方法免疫双峰驼以及合成cDNA。
2、引物的设计与合成
根据实施例1标题3设计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物 C1F、C1R、VHHF和VHHR。各引物的具体序列如上述表1。
3、VHH片段的扩增
利用本实施例标题1中合成的骆驼cDNA为模板，按照实施例1标题4所述方法对VHH片段 进行扩增及鉴定。结果如图6所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝 胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)说明书进行操作，对目的条带进行纯化和回收。
4、噬菌体展示基因文库的构建
纯化回收的VHH基因片段按照实施例1标题5所述方法构建噬菌体展示基因文库并鉴定，结果 如图7，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，所有单克隆菌落均含有大小约为350bp的目的片段，说 明该文库的***率达到了100％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为30％ 的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为O型***病毒噬菌体展示文库。
实施例6针对O型***病毒纳米抗体的筛选过程
1、噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的实施例5制备的O型***病毒噬菌体展示文库，按照实施例2标题 1所述方法进行扩增，将扩增后的噬菌体文库重悬于5mL 0.1M PBS中，得到其悬液。
2、亲和筛选
将10μg O型***灭活病毒加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，按照实施 例2标题2所述方法进行亲和筛选及鉴定，设立BHK-21细胞破碎产物(本实验室保存)作为对照， 结果如表4所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。
表4.噬菌体文库3轮亲和筛选富集过程
亲和筛选轮次 投入噬菌体文库量(pfu/mL) 回收噬菌体文库量(pfu/mL)
第一轮亲和筛选 1.01×10<sup>7</sup> 3.96×10<sup>3</sup>
第二轮亲和筛选 1.12×10<sup>7</sup> 2.58×10<sup>4</sup>
第三轮亲和筛选 1.07×10<sup>7</sup> 1.49×10<sup>5</sup>
实施例7酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1、针对O型***病毒的纳米抗体的表达
从实施例6中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选200个单菌落按照实施例3标题1 所述方法，分别制备各重组菌表达的针对O型***病毒的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～ 200。
2、间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应鉴定各纳米抗体与O型***病毒的结合活性。将10μgO型***灭活 病毒加入到10mL 100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，按照实施例3标题2所述方法进行鉴定， 设立BHK-21细胞破碎产物作为对照。结果如图8所示，共有29个纳米抗体可与O型***病毒发 生特异性的结合反应(为筛选到高亲和力的纳米抗体，仅选取OD450值大于2.0的纳米抗体)。
3、特异性的鉴定
按照本实施例中标题2所述间接ELISA检测方法，分别检测各纳米抗体与A型、Asia1型口蹄 疫病毒之间的交叉反应性，利用酶标仪测定相应OD450，不同之处在于ELISA板的包被抗原采用A 型、Asia1型***病毒替代O型***病毒。结果如图9所示，本发明所获得的纳米抗体中，有8 个纳米抗体对A型***病毒存在交叉反应性，9个纳米抗体对Asia1型***病毒存在交叉反应 性，3个纳米抗体对A型、Asia1型***病毒均存在交叉反应性，其余15个纳米抗体对A型、Asia1 型***病毒交叉反应性极低，说明本发明获得了针对O型***病毒的特异性纳米抗体，同时， 部分纳米抗体与A型、Asia1型***病毒存在交叉反应性。
实施例8表面等离子共振法(SPR)筛选针对O型***病毒的高亲和力纳米抗体
1、纳米抗体的表达及纯化
分别抽提实施例7所获得的针对O型***病毒的特异性纳米抗体重组菌质粒，按照实施例4 标题1所述方法制备15个表达针对O型***病毒纳米抗体的重组菌B1～B15，并进行诱导表达及 蛋白纯化。随机取纯化后的纳米抗体(编号分别为26、43、45、82、88)进行SDS-PAGE电泳和 Western blot鉴定。从图10可以看到纳米抗体在大约16kD处均有明显条带，与目的片段预期大小 相一致，纯度达90％以上。
2、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定所获得的15个纳米抗体与O型***灭活病毒的亲和 力。结果如表5所示。编号为104的纳米抗体KD值达6.82×10-10，为本发明筛选获得的亲和力最高 的纳米抗体Nb104，后续研究均围绕该纳米抗体开展。
表5.各纳米抗体与O型***病毒结合的动力学参数
纳米抗体编号 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-</sup>1) K<sub>D</sub>(M)
26 5.16×10<sup>5</sup> 9.10×10<sup>-4</sup> 1.76×10<sup>-9</sup>
43 2.57×10<sup>5</sup> 2.03×10<sup>-4</sup> 7.89×10<sup>-8</sup>
45 6.31×10<sup>5</sup> 3.93×10<sup>-4</sup> 6.22×10<sup>-8</sup>
82 4.47×10<sup>5</sup> 8.25×10<sup>-4</sup> 1.84×10<sup>-9</sup>
88 1.52×10<sup>5</sup> 6.59×10<sup>-4</sup> 4.33×10<sup>-9</sup>
104 1.41×10<sup>5</sup> 9.61×10-<sup>5</sup> 6.82×10<sup>-10</sup>
109 8.15×10<sup>5</sup> 7.91×10<sup>-4</sup> 9.71×10<sup>-8</sup>
119 3.09×10<sup>5</sup> 3.90×10<sup>-4</sup> 1.26×10<sup>-9</sup>
131 9.14×10<sup>5</sup> 6.82×10<sup>-4</sup> 7.46×10<sup>-8</sup>
146 7.02×10<sup>5</sup> 6.47×10<sup>-4</sup> 9.21×10<sup>-8</sup>
163 5.89×10<sup>5</sup> 3.31×10<sup>-4</sup> 5.62×10<sup>-8</sup>
168 6.16×10<sup>5</sup> 2.92×10<sup>-4</sup> 4.74×10<sup>-8</sup>
184 1.63×10<sup>5</sup> 2.31×10<sup>-4</sup> 1.41×10<sup>-9</sup>
186 2.14×10<sup>5</sup> 1.85×10<sup>-4</sup> 8.64×10<sup>-8</sup>
197 1.92×10<sup>5</sup> 1.17×10<sup>-4</sup> 6.09×10<sup>-8</sup>
注：表5中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
抽提纳米抗体Nb104的重组菌质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得其基因序列和氨基酸 序列，其基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：6所示。
实施例9双功能纳米抗体Nb131-104的串联表达及纯化
1、双功能纳米抗体基因片段的构建
分别抽提表达猪DC特异性纳米抗体Nb131和表达猪O型***病毒特异性纳米抗体Nb104的 重组菌质粒，分别利用表6所示的引物NbF、NbLR和NbLF、NbR进行扩增，获得猪DC特异性的 纳米抗体Nb131和猪O型***病毒特异性的纳米抗体Nb104的基因片段，并进行纯化回收。利用 纯化回收的纳米抗体基因片段为模板，以(G4S)4序列为接头元件linker，通过重叠延伸拼接(Splicing by Overlap Extension，SOE)PCR方法构建双功能纳米抗体片段Nb131-104，反应分两步进行：
第一步反应是在不加引物的条件下进行，反应条件为：95℃3min；95℃30s，62℃30s，72℃ 2min，共8个循环；72℃10min；
第二步反应只需要在原始PCR管内加入引物NbF和NbR即可，反应条件为：95℃3min；95℃ 30s，55℃30s，72℃2min，共25个循环；72℃10min；
反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图11所示， 可见大约900bp的基因片段，与预期片段大小相一致，随后***pMECS载体(购自Novagen公司) 的Pst I和Xba I酶切位点之间，于42℃转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)， 37℃、摇床转速为200rpm的条件下培养1h，离心浓缩菌液，并将其涂布在含有100μg/mL氨苄青 霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时；挑选单个菌落，得到表达双功能纳米抗体的重组菌。各 引物的具体序列如表6：
表6.SOE-PCR扩增引物
Figure BDA0003625252430000151
2、双功能纳米抗体基因序列的鉴定
抽提表达双功能纳米抗体Nb131-104重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得接头 元件(G4S)4和双功能纳米抗体Nb131-104的核苷酸序列以及氨基酸序列。接头元件(G4S)4和双 功能纳米抗体Nb131-104的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.：3和SEQ IDNO.：4所示，接头元件(G4S) 4和双功能纳米抗体Nb131-104的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.：7和SEQ ID NO.：8所示。
3、双功能纳米抗体的表达与纯化鉴定
按照实施例4标题1所述方法，利用重组菌诱导表达制备双功能纳米抗体Nb131-104，并进行 蛋白纯化及鉴定。从图12可以看到双功能纳米抗体Nb131-104在大约35kD处均有明显条带，与目 的片段预期大小相一致，纯度达90％以上。
实施例10表面等离子共振法(SPR)鉴定双功能纳米抗体Nb131-104的亲和力
1、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定双功能纳米抗体Nb131-104与猪BMDC细胞破碎产物以 及O型***病毒的亲和力。结果如表7所示。双功能纳米抗体Nb131-104与猪BMDC细胞破碎 产物、O型***病毒的平衡解离常数(KD)分别为6.02×10-8、2.41×10-9。
表7.双功能纳米抗体Nb131-104与抗原结合的动力学参数
抗原 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
猪BMDC细胞破碎产物 2.37×10<sup>4</sup> 1.42×10<sup>-3</sup> 6.02×10<sup>-8</sup>
O型***病毒 1.93×10<sup>5</sup> 4.65×10<sup>-4</sup> 2.41×10<sup>-9</sup>
注：表7中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
实施例11激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb131-104的抗原提呈作用
1、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb131-104与猪BMDC的结合能力
将实施例9制备的双功能纳米抗体Nb131-104进行柱层析去除内毒素，并使用内毒素检测试剂 盒(购自Pyrosate公司，0.25EU/mL)检测其内毒素含量，确保内毒素水平小于0.05EU，并使用 FITC荧光染料(购自上海优宁维公司)对其进行标记，超滤(4000g，20min)除去未标记上的多 余染料。按照实施例1所述方法诱导分化新鲜的猪BMDC细胞，使用预先用FITC荧光染料标记的 双功能纳米抗体Nb131-104(5μg/mL)与猪BMDC细胞(1×106cells/mL)4℃孵育30min，收集细 胞，并用4％多聚甲醛室温固定10min，PBS清洗三遍后置于含0.1％Triton的PBS中37℃处理5min， 用PBS清洗三遍后置于封闭液中37℃封闭1h，PBS洗涤细胞三遍，使用AF647标记的抗猪CD1 抗体(1∶1000稀释，购自上海优宁维公司)4℃孵育30min，PBS洗涤细胞三遍，使用DAPI(工作 液，购自碧云天公司)染色10min，PBS洗涤细胞三遍后置于激光共聚焦显微镜下进行观察。结果 如图13所示，加入双功能纳米抗体Nb131-104的猪BMDC细胞试验组绿色荧光强度高于对照组， 表明双功能纳米抗体Nb131-104可以和猪BMDC细胞发生特异性结合。
2、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb131-104的FMDV抗原递送能力
运用蔗糖密度梯度离心技术对O型FMDV灭活抗原进行纯化，并利用SDS-PAGE和Western Blotting方法对纯化产物进行鉴定。按照实施例1所述方法诱导分化新鲜的猪BMDC细胞，使用FITC 荧光染料(购自上海优宁维公司)标记的双功能纳米抗体Nb131-104(5μg/mL)与纯化后的FMDV 灭活抗原(5μg/mL)4℃孵育30min后，再与猪BMDC细胞(1×106cells/mL)4℃孵育30min，收 集细胞，按照本实施例标题1所述方法进行鉴定。结果如图14所示，加入双功能纳米抗体Nb131-104 的猪BMDC细胞试验组绿色荧光强度高于对照组，表明FMDV抗原经过双功能纳米抗体Nb131-104 递送至猪BMDC细胞。
实施例12双功能纳米抗体Nb131-104提呈FMDV抗原的免疫效力评价
1、免疫试验
将实施例9制备的双功能纳米抗体Nb131-104(5μg/mL)与纯化后的FMDV灭活抗原(5μg/mL) 4℃孵育60min后，辅以206免疫佐剂，对猪进行免疫实验，每只猪颈部肌肉免疫2mL，并于不同 的时间节点(14d、28d、42d、56d)进行采血取样，同时设置双功能纳米抗体Nb131-104配伍PBS 对照组、非DC靶向纳米抗体配伍FMDV对照组、非DC靶向纳米抗体配伍PBS对照组、FMDV对 照组和PBS空白对照组，每组5只猪。
FMD液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性，与攻毒保护 具有很好的相关性，现已被大量应用于FMD免疫抗体水平的检测中，FAO和OIE推荐使用液相阻 断ELISA方法来对FMD免疫效果进行评价，故本研究使用液相阻断ELISA方法来对FMD免疫效 果进行评价。
2、免疫效力评价
利用FMD液相阻断ELISA抗体检测试剂盒检测免后血清中特异性抗体水平、抗体亚型(IgG1 和IgG2a)及免疫持续期，检测步骤均按照试剂盒说明书进行操作。检测结果如图15所示，双功能 纳米抗体Nb131-104配伍FMDV试验组的免后抗体效价均明显高于其他试验组和对照组，表明双功 能纳米抗体对FMDV抗原免后抗体产生具有促进作用；抗体亚型检测结果表明(如图16，图17所 示)，双功能纳米抗体Nb131-104配伍FMDV试验组的免后IgG1抗体效价均明显高于其他试验组和 对照组，IgG2a抗体效价与其他FMDV试验组差异不显著，表明双功能纳米抗体Nb131-104可以显 著提升FMDV抗原免后IgG1抗体水平，对IgG2a抗体水平的提升作用与其他试验组差异不显著； 免疫持续期检测结果显示(如图18所示)，双功能纳米抗体Nb131-104配伍FMDV试验组的抗体水 平可持续至免后56天，且抗体效价均明显高于其他试验组和对照组，表明双功能纳米抗体Nb131-104 不仅可以显著提升FMDV抗原免后抗体水平，而且免后56天血清中的抗体仍可以维持在一个较高 的水平，表明双功能纳米抗体对FMDV抗原免后所引起的体液免疫反应具有显著的促进作用。
于注射位点附近活体采集免疫后猪的新鲜***，制备***单细胞悬液，向细胞悬液中加入 淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心(3000g，20min)，吸取淋巴细胞(离心后从上到下一共分为 四层，吸取第二层)，用含血清的细胞培养基洗涤3次后接种至96孔板中(1×106cells/mL)；对分离 的淋巴细胞分别用抗CD4和CD8的荧光抗体进行染色，利用FACSAria流式细胞仪检测增殖结果， 用CellQuest软件获取数据。在前散射光(FSC)与对侧散射光(SSC)的二维散点图中划出淋巴细 胞区P1，在P1区内计数10000个细胞，利用多参数流式细胞术分析淋巴细胞的种类。使用CellQuest 软件分析CD4+T细胞和CD8+T细胞占所选定P1细胞区内细胞总数的百分比，各组细胞数及百分比 见表8，由表8可知，Nb131-104+O-FMDV试验组CD4+T细胞与CD8+T细胞数均有明显的升高， 与其余试验组和对照组相比有非常明显的差异，说明双功能纳米抗体对于FMDV抗原免疫后引起的 细胞免疫反应具有促进作用。
表8.各试验组脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞数及百分比
Figure BDA0003625252430000161
Figure BDA0003625252430000171
将上述新鲜分离的淋巴细胞(2×106cells/mL)接种至24孔板中，用纯化后的FMDV灭活抗原 (5μg/mL)体外刺激淋巴细胞，置于细胞培养箱中(37℃，含5％CO2)共同作用120min，收集部 分细胞样品并离心取上清液，按照ELISA试剂盒(购自上海优宁维公司)说明对上清液中IFN-γ、 IL-2、IL-4的浓度进行检测，结果如图19所示，Nb131-104+O-FMDV试验组IFN-γ、IL-2、IL-4分 泌水平均显著高于其余试验组和对照组，进一步说明双功能纳米抗体Nb131-104可以显著提高 FMDV抗原免疫后所引起的细胞免疫反应。
实施例13针对猪瘟病毒纳米抗体文库的构建
1、RNA的提取与cDNA的合成
利用一头份的猪瘟耐热保护剂活疫苗(南京天邦生物制品有限公司惠赠)对一只新疆双峰驼进 行免疫；1周之后，按照实施例1标题2所述方法免疫双峰驼以及合成cDNA。
2、引物的设计与合成
根据实施例1标题3设计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物 C1F、C1R、VHHF和VHHR。各引物的具体序列如上述表1。
3、VHH片段的扩增
利用本实施例标题1中合成的骆驼cDNA为模板，按照实施例1标题4所述方法对VHH片段 进行扩增及鉴定。结果如图20所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝 胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)说明书进行操作，对目的条带进行纯化和回收。
4、噬菌体展示基因文库的构建
纯化回收的VHH基因片段按照实施例1标题5所述方法构建噬菌体展示基因文库并鉴定，结果 如图21，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，所有单克隆菌落均含有大小约为350bp的目的片段， 说明该文库的***率达到了100％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为 30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为猪瘟病毒噬菌体展示文库。
实施例14针对猪瘟病毒纳米抗体的筛选过程
1、噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的实施例13所制备的猪瘟病毒噬菌体展示文库，按照实施例2标题1所 述方法进行扩增，将扩增后的噬菌体文库重悬于5mL 0.1MPBS中，得到其悬液。
2、亲和筛选
将10μg猪瘟病毒灭活抗原(本实验室保存)加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2) 中，按照实施例2标题2所述方法进行亲和筛选及鉴定，设立PK-15细胞破碎产物(本实验室保存) 作为对照，结果如表9所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。
表9.噬菌体文库3轮亲和筛选富集过程
亲和筛选轮次 投入噬菌体文库量(pfu/mL) 回收噬菌体文库量(pfu/mL)
第一轮亲和筛选 1.38×10<sup>7</sup> 3.41×10<sup>3</sup>
第二轮亲和筛选 1.21×10<sup>7</sup> 1.51×10<sup>4</sup>
第三轮亲和筛选 1.25×10<sup>7</sup> 1.67×10<sup>5</sup>
实施例15酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1、针对猪瘟病毒的纳米抗体的表达
从实施例14中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选200个单菌落按照实施例3标题 1所述方法，分别制备各重组菌表达的针对猪瘟病毒的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～200。
2、间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应鉴定各纳米抗体与猪瘟病毒的结合活性。将10μg猪瘟病毒加入到10mL 100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，按照实施例3标题2所述方法进行鉴定，设立PK-15细胞破 碎产物作为对照。结果如图22所示，共有19个纳米抗体可与猪瘟病毒发生特异性的结合反应(为 筛选到高亲和力的纳米抗体，仅选取OD450值大于2.0的纳米抗体)。
3、特异性的鉴定
按照本实施例中标题2所述间接ELISA检测方法，分别检测各纳米抗体与O-FMDV、PCV2、 PRRSV、PRV、PEDV之间的交叉反应性，利用酶标仪测定相应OD450，不同之处在于ELISA板的 包被抗原采用O-FMDV、PCV2、PRRSV、PRV、PEDV替代猪瘟病毒。结果如图23所示，本发明所获得的纳米抗体对O-FMDV、PCV2、PRRSV、PRV、PEDV交叉反应性极低，说明本发明获得了针对猪PEDV的特异性纳米抗体。
实施例16表面等离子共振法(SPR)筛选针对猪瘟病毒的高亲和力纳米抗体
1、纳米抗体的表达及纯化
分别抽提实施例15所获得的针对猪瘟病毒的特异性纳米抗体重组菌的质粒，按照实施例4标题 1所述方法制备19个表达针对猪瘟病毒纳米抗体的重组菌B1～B19，并进行诱导表达及蛋白纯化。 随机取纯化后的纳米抗体(编号分别为26、43、45、82、88)进行SDS-PAGE电泳和Western blot 鉴定。从图24可以看到纳米抗体在大约16kD处均有明显条带，与目的片段预期大小相一致，纯度 达90％以上。
2、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定所获得的19个纳米抗体与猪瘟病毒的亲和力。结果如表 10所示。编号为62的纳米抗体KD值达6.82×10-10，为本发明筛选获得的亲和力最高的纳米抗体Nb62， 后续研究均围绕该纳米抗体开展。
表10.各纳米抗体与猪瘟病毒结合的动力学参数
Figure BDA0003625252430000181
Figure BDA0003625252430000191
注：表10中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
抽提纳米抗体Nb62的重组菌质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得其基因序列和氨基酸 序列，其基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：14所示。
实施例17双功能纳米抗体Nb131-62的串联表达及纯化
1、双功能纳米抗体基因片段的构建
分别抽提表达猪DC细胞特异性纳米抗体Nb131和表达猪瘟病毒特异性纳米抗体Nb62的重组 菌质粒，按照实施例9标题1所述方法构建双功能纳米抗体片段Nb131-62，如图25所示，可见大 约900bp的基因片段，与预期片段大小相一致，随后***pMECS载体(购自Novagen公司)的Pst I和Xba I酶切位点之间，得到表达双功能纳米抗体的重组菌。
2、双功能纳米抗体基因序列的鉴定
抽提表达双功能纳米抗体Nb131-62重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得接头元 件(G4S)4和双功能纳米抗体Nb131-62的基因序列以及氨基酸序列。接头元件(G4S)4和双功能 纳米抗体Nb131-62的基因序列分别如SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：19所示，接头元件(G4S)4和 双功能纳米抗体Nb131-62的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：7和SEQID NO.：21所示。
3、双功能纳米抗体的表达与纯化鉴定
按照实施例4标题1所述方法，利用重组菌诱导表达制备双功能纳米抗体Nb131-62，并进行蛋 白纯化及鉴定。从图26可以看到双功能纳米抗体Nb131-62在大约35kD处均有明显条带，与目的 片段预期大小相一致，纯度达90％以上。
实施例18表面等离子共振法(SPR)鉴定双功能纳米抗体Nb131-62的亲和力
1、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定双功能纳米抗体Nb131-62与猪BMDC细胞破碎产物以 及猪瘟病毒的亲和力。结果如表11所示。双功能纳米抗体Nb131-62与猪BMDC细胞破碎产物、猪 瘟病毒的平衡解离常数(KD)分别为0.77×10-9、3.49×10-9。
表11.双功能纳米抗体Nb131-62与抗原结合的动力学参数
抗原 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
猪BMDC细胞破碎产物 3.85×10<sup>4</sup> 2.97×10<sup>-4</sup> 0.77×10<sup>-9</sup>
猪瘟病毒 1.61×10<sup>5</sup> 5.63×10<sup>-4</sup> 3.49×10<sup>-9</sup>
注：表11中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
实施例19激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb131-62的抗原提呈作用
1、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb131-62与猪BMDC的结合能力
将实施例17制备的双功能纳米抗体Nb131-62进行柱层析去除内毒素，确保内毒素水平小于0.05 EU，并使用FITC荧光染料(购自上海优宁维公司)对其进行标记。按照实施例1所述方法诱导分 化新鲜的猪BMDC细胞，使用FITC荧光染料标记的双功能纳米抗体Nb131-62(5μg/mL)与猪BMDC 细胞(1×106cells/mL)4℃孵育30min，收集细胞，按照实施例11标题1所述方法进行鉴定。结果 如图27所示，加入双功能纳米抗体Nb131-62的猪BMDC细胞试验组绿色荧光强度高于对照组，表 明双功能纳米抗体Nb131-62可以和猪BMDC细胞发生特异性结合。
2、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb131-62的猪瘟病毒抗原递送能力
运用蔗糖密度梯度离心技术对猪瘟病毒抗原进行纯化，并利用SDS-PAGE和Western Blotting方 法对纯化产物进行鉴定。按照实施例1所述方法诱导分化新鲜的猪BMDC细胞，使用FITC荧光染 料标记的双功能纳米抗体(5μg/mL)与纯化后的猪瘟病毒抗原(5μg/mL)4℃孵育30min后，再 与猪BMDC细胞(1×106cells/mL)4℃孵育30min，收集细胞，按照实施例11标题1所述方法进行 鉴定。结果如图28所示，加入双功能纳米抗体Nb131-62的猪BMDC细胞试验组绿色荧光强度高于 对照组，表明猪瘟病毒抗原经过双功能纳米抗体Nb131-62递送至猪BMDC细胞。
实施例20双功能纳米抗体Nb131-62提呈猪瘟病毒抗原的免疫效力评价
1、免疫试验
将实施例17所制备的双功能纳米抗体Nb131-62(5μg/mL)与纯化后的猪瘟病毒抗原(5μg/mL) 4℃孵育60min后，辅以206免疫佐剂，对猪进行免疫实验，每只猪耳根后肌肉免疫2mL，并于不 同的时间节点(14d、28d、42d、56d)进行采血取样，同时设置双功能纳米抗体配伍PBS对照组、 非DC靶向纳米抗体配伍猪瘟病毒对照组、非DC靶向纳米抗体配伍PBS对照组、猪瘟病毒对照组 和PBS空白对照组，每组5只猪。
2、免疫效力评价
利用CSFV-ELISA抗体检测试剂盒(购自美国IDEXX公司)检测免后血清中特异性抗体水平， 检测步骤按照试剂盒说明书进行操作，并按照试剂盒提供的公式计算抗体阻断率，检测结果如图29 所示，双功能纳米抗体Nb131-62配伍猪瘟病毒试验组的免后抗体效价均明显高于其他试验组和对照 组，表明双功能纳米抗体对猪瘟病毒抗原免后抗体产生具有促进作用。
利用ELISA试剂盒(购自苏州卡尔文公司)检测上述免后血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的 分泌水平，检测步骤按照试剂盒说明书进行操作，检测结果如图30～图33所示，双功能纳米抗体 Nb131-62+猪瘟病毒试验组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10分泌水平均显著高于其余试验组和对照组，进 一步说明双功能纳米抗体可以显著提高猪瘟病毒抗原免疫后所引起的细胞免疫反应。
无菌采集免疫后猪的前腔静脉抗凝血，按照淋巴细胞分离液说明书进行淋巴细胞的分离，向前 腔静脉抗凝血中加入淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心(3000g，20min)，吸取淋巴细胞(离心 后从上到下一共分为四层，吸取第二层)，用含血清的细胞培养基洗涤3次后接种至96孔板中(1×106 cells/mL)；分别用纯化后的猪瘟病毒抗原(5μg/mL)、LPS刺激细胞，置于细胞培养箱中(37℃， 含5％CO2)继续培养48h；每孔分别加入MTT(5mg/mL)后继续培养4h，离心收集细胞样品，加 入DMSO并混匀至晶体溶解，将细胞板置于酶标仪中读取结果。结果如图34所示，与对照组相比， Nb131-62+猪瘟病毒试验组可以显著提高淋巴细胞的增殖水平，诱导更好的细胞免疫水平。
实施例21猪CD205分子目的蛋白的制备
1、引物的设计与合成
根据NCBI已公布的猪CD205分子的基因序列(登录号为GQ420669.1)，设计用于扩增猪CD205 分子CysR-FNII截短基因(参见SEQ ID NO.：17，600bp)的PCR引物F1和R1。各引物的具体序 列如表12。
表12.PCR扩增引物
引物 序列(5’-3’)
F1 <u>GGATCC</u>GAGCTCTAAATGATCACACCACTGAACGAC(下划线为BamH I酶切位点)
R1 <u>TTCGAA</u>CTCGAGTGAAATATAAGCTTCTTTCCAAGAA(下划线为HindIII酶切位点)
2、猪CD205分子CysR-FN II截短基因的扩增
无菌条件下获取猪脾脏组织，提取脾脏组织的总RNA，按照反转录试剂盒(购自TAKARA公 司)说明操作，合成cDNA，利用本实施例标题1所设计的引物F1和R1，进行PCR扩增，获得大 小约为600bp的基因片段。PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，59℃1min，72℃1min， 共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯 下观察目的条带，如图35所示，可见大约600bp的猪CD205分子CysR-FNII截短基因片段，与预 期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)对目的条带进行纯化和回收。
3、猪CD205分子目的蛋白的诱导表达与纯化鉴定
将纯化回收的猪CD205分子CysR-FN II基因片段采用BamH I和Hind Ⅲ酶切后，连入pET-32a 载体(购自Novagen公司)。将连接产物转化至E.coli BL21感受态细胞(购自Novagen公司)中， 37℃培养1h，将菌液离心浓缩后涂在含有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基上，37℃培养12～16小 时；挑选单个菌落，获得表达猪CD205目的蛋白的重组菌1。
按照实施例4标题1所述方法，利用重组菌1诱导表达制备猪CD205目的蛋白，并进行蛋白纯 化与鉴定。从图36可以看到猪CD205目的蛋白在大约23kD处均有明显条带，与目的片段预期大 小相一致，纯度达90％以上。
实施例22针对猪CD205分子纳米抗体文库的构建
1、RNA的提取与cDNA的合成
取实施例13所制备的猪CD205目的蛋白1mg与弗氏完全佐剂等体积混合，对一只新疆双峰驼 进行免疫；1周之后，按照实施例1标题2所述方法免疫双峰驼以及合成cDNA。
2、引物的设计与合成
根据实施例1标题3设计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物 C1F、C1R、VHHF和VHHR。各引物的具体序列如上述表1。
3、VHH片段的扩增
利用本实施例标题1中合成的骆驼cDNA为模板，按照实施例1标题4所述方法对VHH片段 进行扩增及鉴定。结果如图37所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝 胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)对目的条带进行纯化和回收。
4、噬菌体展示基因文库的构建
纯化回收的VHH基因片段按照实施例1标题5所述方法构建噬菌体展示基因文库并鉴定，结果 如图38，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，所有单克隆菌落均含有大小约为350bp的目的片段， 说明该文库的***率达到了100％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为 30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为猪CD205分子纳米抗体噬菌体展示文库。
实施例23针对猪CD205分子纳米抗体的筛选过程
1、噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的实施例22所制备的噬菌体展示文库，按照实施例2标题1所述方法进 行扩增。将扩增后的噬菌体展示文库重悬于5mL 0.1M PBS缓冲液中，得到其悬液。
2、亲和筛选
将10μg实施例21所制备的猪CD205目的蛋白加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2) 中，按照实施例2标题2所述方法进行亲和筛选及鉴定，设立相同条件下制备的其他任一不相关蛋 白抗原作为对照，结果如表13所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一 轮要多。
表13.噬菌体文库3轮亲和筛选富集过程
亲和筛选轮次 投入噬菌体文库量(pfu/mL) 回收噬菌体文库量(pfu/mL)
第一轮亲和筛选 1.1×10<sup>7</sup> 5.3×10<sup>3</sup>
第二轮亲和筛选 1.4×10<sup>7</sup> 2.2×10<sup>4</sup>
第三轮亲和筛选 1.2×10<sup>7</sup> 1.6×10<sup>5</sup>
实施例24酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1、纳米抗体的表达
从实施例23中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选200个单菌落按照实施例3标题 1所述方法，分别制备各重组菌表达的针对CD205目的蛋白的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～ 200。
2、间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应鉴定编号1～200的各纳米抗体与猪CD205目的蛋白的结合活性。将10μg 实施例21所制备的猪CD205目的蛋白加入到10mL浓度为100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中， 按照实施例3标题2所述方法进行鉴定，对照孔中以相同条件下制备的其他任一不相关蛋白替代猪 CD205目的蛋白进行包被。结果如图39所示，共有14个纳米抗体可与猪CD205目的蛋白发生特异 性的结合反应(为筛选到高亲和力的纳米抗体，仅选取OD450值大于2.0的纳米抗体)。
实施例25表面等离子共振法(SPR)筛选高亲和力纳米抗体
1、纳米抗体的表达及纯化
分别抽提实施例24所获得的表达纳米抗体的重组菌质粒，按照实施例4标题1所述方法制备表 达纳米抗体的重组菌A1-A14，并进行诱导表达及蛋白纯化。随机取纯化后的纳米抗体进行SDS-PA GE电泳和Western blot鉴定。从图40可以看到纳米抗体在大约16kD处均有明显条带，与目的片 段预期大小相一致，纯度达90％以上。
2、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定各纳米抗体的与猪CD205目的蛋白的亲和力。结果如表 14所示。编号为193的纳米抗体KD值达1.04×10-9，为本发明筛选获得的亲和力最高的纳米抗体， 后续研究均围绕该纳米抗体开展。
表14.各纳米抗体与猪CD205目的蛋白结合的动力学参数
纳米抗体编号 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
3 2.18×10<sup>4</sup> 1.71×10<sup>-4</sup> 0.78×10<sup>-8</sup>
21 1.29×10<sup>4</sup> 2.39×10<sup>-4</sup> 1.85×10<sup>-8</sup>
25 3.14×10<sup>4</sup> 1.38×10<sup>-4</sup> 0.43×10<sup>-8</sup>
46 2.16×10<sup>4</sup> 1.26×10<sup>-4</sup> 0.58×10<sup>-8</sup>
68 6.91×10<sup>5</sup> 3.45×10<sup>-4</sup> 0.49×10<sup>-9</sup>
87 1.17×10<sup>4</sup> 3.12×10<sup>-4</sup> 2.66×10<sup>-8</sup>
89 4.16×10<sup>4</sup> 5.10×10<sup>-4</sup> 1.23×10<sup>-8</sup>
131 1.47×10<sup>5</sup> 1.97×10<sup>-4</sup> 1.34×10<sup>-9</sup>
153 4.31×10<sup>4</sup> 3.83×10<sup>-4</sup> 8.89×10<sup>-9</sup>
169 2.85×10<sup>4</sup> 9.52×10<sup>-4</sup> 3.34×10<sup>-8</sup>
170 4.25×10<sup>4</sup> 2.23×10<sup>-4</sup> 0.52×10<sup>-8</sup>
174 2.02×10<sup>4</sup> 1.98×10<sup>-4</sup> 0.98×10<sup>-8</sup>
181 2.52×10<sup>4</sup> 8.65×10<sup>-4</sup> 3.43×10<sup>-9</sup>
193 1.99×10<sup>5</sup> 2.07×10<sup>-4</sup> 1.04×10<sup>-9</sup>
注：表14中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
抽提纳米抗体193的重组菌质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得其基因序列和氨基酸序 列，其基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：9和SEQ ID NO.：11所示。
实施例26针对猪PEDV抗原纳米抗体文库的构建
1、RNA的提取与cDNA的合成
将1mg猪PEDV抗原(本实验室增殖保存)与弗氏完全佐剂等体积混合，对一只新疆双峰驼 进行免疫；1周之后，按照实施例1标题2所述方法免疫双峰驼以及合成cDNA。
2、引物的设计与合成
根据实施例1标题3设计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物 C1F、C1R、VHHF和VHHR。各引物的具体序列如上述表1。
3、VHH片段的扩增
利用本实施例标题1中合成的骆驼cDNA为模板，按照实施例1标题4所述方法对VHH片段 进行扩增及鉴定。结果如图41所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝 胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)说明书进行操作，对目的条带进行纯化和回收。
4、噬菌体展示基因文库的构建
纯化回收的VHH基因片段按照实施例1标题5所述方法构建噬菌体展示基因文库并鉴定，结果 如图42，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，所有单克隆菌落均含有大小约为350bp的目的片段， 说明该文库的***率达到了100％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为 30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为猪PEDV抗原噬菌体展示文库。
实施例27针对猪PEDV抗原纳米抗体的筛选过程
1、噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的实施例26所制备的噬菌体文库，按照实施例2标题1所述方法进行扩 增。将扩增后的噬菌体文库重悬于5mL 0.1M PBS中，得到其悬液。
2、亲和筛选
将10μg本实验室保藏的猪PEDV抗原加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，按照实施例2标题2所述方法进行亲和筛选，设立ST细胞破碎产物(本实验室增殖保存)作为对照， 结果如表15所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。
表15.噬菌体文库3轮亲和筛选富集过程
亲和筛选轮次 投入噬菌体文库量(pfu/mL) 回收噬菌体文库量(pfu/mL)
第一轮亲和筛选 1.2×10<sup>7</sup> 4.1×10<sup>3</sup>
第二轮亲和筛选 1.1×10<sup>7</sup> 1.8×10<sup>4</sup>
第三轮亲和筛选 1.1×1<sup>0</sup>7 2.4×10<sup>5</sup>
实施例28酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1、纳米抗体的表达
从实施例27中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选200个单菌落按照实施例3标题 1所述方法，分别制备各重组菌表达的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～200。
2、间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应鉴定各纳米抗体与猪PEDV抗原的结合活性。将10μg猪PEDV抗原加 入到10mL 100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，按照实施例3标题2所述方法进行鉴定，设立ST 细胞破碎产物作为对照。结果如图43所示，共有11个纳米抗体可与猪PEDV抗原发生特异性的结 合反应(为筛选到高亲和力的纳米抗体，仅选取OD450值大于2.0的纳米抗体)。
3、特异性的鉴定
按照本实施例中标题2所述间接ELISA检测方法，分别检测各纳米抗体与O型FMDV、PCV2、 PRRSV、PRV之间的交叉反应性，利用酶标仪测定相应OD450，不同之处在于ELISA板的包被抗原 采用O型FMDV、PCV2、PRRSV、PRV替代PEDV。结果如图44所示，本发明所获得的纳米抗体 对O型FMDV、PCV2、PRRSV、PRV交叉反应性极低，说明本发明获得了针对猪PEDV的特异性 纳米抗体。
实施例29表面等离子共振法(SPR)筛选高亲和力纳米抗体
1、纳米抗体的表达及纯化
分别抽提实施例28所获得的针对猪PEDV抗原的特异性纳米抗体重组菌的质粒，按照实施例4 标题1所述方法制备表达纳米抗体的重组菌B1-B11，并进行诱导表达及蛋白纯化。随机取纯化后的 纳米抗体进行SDS-PAGE电泳和Westernblot鉴定。从图45可以看到纳米抗体在大约16kD处均有 明显条带，与目的片段预期大小相一致，纯度达90％以上。
2、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定各纳米抗体与猪PEDV抗原的亲和力。结果如表16所示。 编号为2的纳米抗体KD值达1.03×10-8，为本发明筛选获得的亲和力最高的纳米抗体2，后续研究 均围绕该纳米抗体开展。
表16.各纳米抗体与猪PEDV抗原结合的动力学参数
纳米抗体编号 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
2 1.15×10<sup>4</sup> 1.19×10<sup>-4</sup> 1.03×10<sup>-8</sup>
16 1.25×10<sup>4</sup> 2.31×10<sup>-4</sup> 1.84×10<sup>-8</sup>
25 2.36×10<sup>4</sup> 4.79×10<sup>-4</sup> 2.02×10<sup>-8</sup>
37 3.73×10<sup>4</sup> 2.85×10<sup>-4</sup> 0.76×10<sup>-8</sup>
61 1.82×10<sup>4</sup> 2.19×10<sup>-4</sup> 1.2×10<sup>-8</sup>
67 3.42×10<sup>4</sup> 1.69×10<sup>-4</sup> 0.49×10<sup>-8</sup>
88 1.85×10<sup>4</sup> 5.79×10<sup>-4</sup> 3.12×10<sup>-8</sup>
122 4.39×10<sup>4</sup> 3.29×10<sup>-4</sup> 0.74×10<sup>-8</sup>
149 5.46×10<sup>4</sup> 1.72×10<sup>-4</sup> 0.31×10<sup>-8</sup>
170 3.71×10<sup>4</sup> 4.99×10<sup>-4</sup> 1.34×10<sup>-8</sup>
191 5.28×10<sup>4</sup> 7.11×10<sup>-4</sup> 1.35×10<sup>-8</sup>
注：表16中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
抽提纳米抗体2的重组菌质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得其基因序列和氨基酸序列， 其基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：14所示。
实施例30双功能纳米抗体Nb193-2的串联表达及纯化
1、双功能纳米抗体Nb193-2基因片段的构建
分别抽提表达猪CD205特异性纳米抗体193和表达猪PEDV抗原特异性纳米抗体2的重组菌质 粒，按照实施例9标题1所述方法构建双功能纳米抗体片段Nb193-2，如图46所示，可见大约900bp 的基因片段，与预期片段大小相一致，随后***pMECS载体(购自Novagen公司)的Pst I和Xba I 酶切位点之间，得到表达双功能纳米抗体的重组菌。
2、双功能纳米抗体基因序列的鉴定
抽提表达双功能纳米抗体Nb193-2重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得接头元 件(G4S)4，和双功能纳米抗体Nb193-2的基因序列以及氨基酸序列。接头元件(G4S)4，和双功 能纳米抗体Nb193-2的基因序列分别如SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：15所示，接头元件(G4S)4， 和双功能纳米抗体Nb193-2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：7和SEQID NO.：16所示。
3、双功能纳米抗体Nb193-2的表达与纯化鉴定
按照实施例4标题1所述方法，利用重组菌诱导表达制备双功能纳米抗体Nb193-2，并进行蛋 白纯化及鉴定。从图47可以看到双功能纳米抗体Nb193-2在大约35kD处均有明显条带，与目的片 段预期大小相一致，纯度达90％以上。
实施例31表面等离子共振法(SPR)鉴定双功能纳米抗体Nb193-2的亲和力
1、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定双功能纳米抗体Nb193-2与猪CD205目的蛋白以及猪 PEDV抗原的亲和力。结果如表17所示。双功能纳米抗体Nb193-2与猪CD205目的蛋白、猪PEDV 抗原的平衡解离常数(KD)分别为1.52×10-8、1.01×10-8。
表17.双功能纳米抗体Nb193-2与抗原结合的动力学参数
Figure BDA0003625252430000241
Figure BDA0003625252430000251
注：表17中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
实施例32激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb193-2的抗原提呈作用
1、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb193-2的PEDV抗原递送能力
将实施例30所制备的双功能纳米抗体Nb193-2进行柱层析去除内毒素，确保内毒素水平小于 0.05EU，并使用FITC荧光染料(购自上海优宁维公司)对其进行标记。运用蔗糖密度梯度离心技 术对猪PEDV抗原进行纯化，并利用SDS-PAGE和Western Blotting方法对纯化产物进行鉴定。按照 实施例1所述方法诱导分化新鲜的猪BMDC细胞，使用FITC荧光染料标记的双功能纳米抗体(5 μg/mL)与纯化后的PEDV抗原(5μg/mL)4℃孵育30min后，再与猪BMDC细胞(1×106cells/mL) 4℃孵育30min，收集细胞，按照实施例11标题1所述方法进行鉴定。结果如图48所示，加入双功 能纳米抗体Nb193-2的猪BMDC细胞试验组绿色荧光强度高于对照组，表明PEDV抗原经过双功能 纳米抗体Nb193-2递送至猪BMDC细胞。
实施例33双功能纳米抗体Nb193-2提呈PEDV抗原的免疫效力评价
1、免疫试验
将实施例30所制备的双功能纳米抗体Nb193-2(5μg/mL)与纯化后的PEDV抗原(5μg/mL) 4℃孵育60min后，辅以206免疫佐剂，对猪进行免疫实验，每只猪颈部肌肉免疫2mL，并于28d 进行采血取样，同时设置双功能纳米抗体配伍PBS对照组、非CD205靶向纳米抗体配伍PEDV对 照组、非CD205靶向纳米抗体配伍PBS对照组、PEDV对照组和PBS空白对照组，每组5只猪。
2、免疫效力评价
利用PEDV抗体检测试剂盒(购自武汉科前公司)检测免后血清中特异性抗体水平、抗体亚型 (IgG1和IgG2a)及IgA抗体水平，检测步骤均按照试剂盒说明书进行操作。抗体检测结果如图49 所示，双功能纳米抗体配伍PEDV试验组的免后28天抗体效价明显高于其他试验组和对照组，表明 双功能纳米抗体对PEDV抗原免后抗体产生具有促进作用；抗体亚型检测结果表明(如图50，51 所示)，双功能纳米抗体配伍PEDV试验组的免后28天IgG1和IgG2a抗体效价均明显高于其他试验 组和对照组，表明双功能纳米抗体可以显著提升PEDV抗原免后IgG1和IgG2a抗体水平；IgA检测 结果显示(如图52所示)，尽管各试验组和对照组的抗体水平较低，但双功能纳米抗体配伍PEDV 试验组的免后28天粘膜IgA抗体效价明显高于其他试验组和对照组，表明双功能纳米抗体可以显著 提升PEDV抗原免后粘膜IgA抗体水平。
于注射位点附近活体采集免疫后猪的新鲜***，制备***单细胞悬液，向细胞悬液中加入 淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心(3000g，20min)，吸取淋巴细胞(离心后从上到下一共分为 四层，吸取第二层)，用含血清的细胞培养基洗涤3次后接种至96孔板中(1×106cells/mL)；分别用 纯化后的PEDV抗原(5μg/mL)、LPS刺激细胞，置于细胞培养箱中(37℃，含5％CO2)继续培养 48h；每孔分别加入MTT(5mg/mL)后继续培养4h，离心收集细胞样品，加入DMSO并混匀至晶 体溶解，将细胞板置于酶标仪中读取结果。结果如图53所示，与对照组相比，Nb193-2+PEDV试验 组可以显著提高淋巴细胞的增殖水平，诱导更好的细胞免疫水平。
将上述新鲜制备的淋巴细胞(2×106cells/mL)接种至24孔板中，用纯化后的PEDV抗原(5μg/mL) 体外刺激淋巴细胞，置于细胞培养箱中(37℃，含5％CO2)共同作用120min，收集部分细胞样品 并离心取上清液，按照ELISA试剂盒(购自上海优宁维公司)说明对上清液中IFN-γ、IL-6、IL-4 的浓度进行检测，结果如图54所示，Nb193-2+PEDV试验组IFN-γ、IL-6、IL-4分泌水平均显著高 于其余试验组和对照组，进一步说明双功能纳米抗体可以显著提高PEDV抗原免疫后所引起的细胞 免疫反应。
实施例34双功能纳米抗体Nb193-104的串联表达及纯化
1、双功能纳米抗体基因片段的构建
分别抽提表达猪CD205特异性纳米抗体Nb193和表达猪O型***病毒特异性纳米抗体Nb104 的重组菌质粒，按照实施例9标题1所述方法构建双功能纳米抗体片段Nb193-104，如图55所示， 可见大约900bp的基因片段，与预期片段大小相一致，随后***pMECS载体(购自Novagen公司) 的Pst I和Xba I酶切位点之间，得到表达双功能纳米抗体的重组菌。
2、双功能纳米抗体基因序列的鉴定
抽提表达双功能纳米抗体Nb193-104重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得接头 元件(G4S)4，和双功能纳米抗体Nb193-104的基因序列以及氨基酸序列。接头元件(G4S)4，和 双功能纳米抗体Nb193-104的基因序列分别如SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：10所示，接头元件(G4S) 4，和双功能纳米抗体Nb193-104的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：12所示。
3、双功能纳米抗体的表达与纯化鉴定
按照实施例4标题1所述方法，利用重组菌诱导表达制备双功能纳米抗体Nb193-104，并进行 蛋白纯化及鉴定。从图56可以看到双功能纳米抗体Nb193-104在大约35kD处均有明显条带，与目 的片段预期大小相一致，纯度达90％以上。
实施例35表面等离子共振法(SPR)鉴定双功能纳米抗体Nb193-104的亲和力
1、SPR法鉴定纳米抗体的亲和力
按照实施例4标题2所述方法分别鉴定双功能纳米抗体Nb193-104与猪CD205目的蛋白以及O 型***病毒的亲和力。结果如表18所示。双功能纳米抗体Nb193-104与猪CD205目的蛋白、O 型***病毒的平衡解离常数(KD)分别为0.75×10-8、1.44×10-8。
表18.双功能纳米抗体Nb193-104与抗原结合的动力学参数
抗原 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
猪CD205目的蛋白 2.13×10<sup>4</sup> 1.59×10<sup>-4</sup> 0.75×10<sup>-8</sup>
O型***病毒 1.36×10<sup>4</sup> 1.96×10<sup>-4</sup> 1.44×10<sup>-8</sup>
注：表18中ka代表结合速率常数，kd代表解离速率常数，KD代表平衡解离常数。
实施例36激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb193-104的抗原提呈作用
1、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb193-104与猪BMDC的结合能力
将实施例34制备的双功能纳米抗体Nb193-104进行柱层析去除内毒素，确保内毒素水平小于 0.05EU，并使用FITC荧光染料(购自上海优宁维公司)对其进行标记。按照实施例1的方法诱导 分化新鲜的猪BMDC细胞，使用FITC荧光染料标记的双功能纳米抗体Nb193-104(5μg/mL)与猪 BMDC细胞(1×106cells/mL)4℃孵育30min，收集细胞，按照实施例11标题1所述方法进行鉴定。 结果如图57所示，加入双功能纳米抗体Nb193-104的猪BMDC细胞试验组绿色荧光强度高于对照 组，表明双功能纳米抗体Nb193-104可以和猪BMDC细胞发生特异性结合。
2、激光共聚焦显微镜技术鉴定双功能纳米抗体Nb193-104的FMDV抗原递送能力
运用蔗糖密度梯度离心技术对O型FMDV灭活抗原进行纯化，并利用SDS-PAGE和Western Blotting方法对纯化产物进行鉴定。按照本实施例标题1所述方法诱导分化新鲜的猪BMDC细胞， 使用FITC荧光染料标记的双功能纳米抗体(5μg/mL)与纯化后的O型FMDV灭活抗原(5μg/mL) 4℃孵育30min后，再与猪BMDC细胞(1×106cells/mL)4℃孵育30min，收集细胞，按照实施例 11标题1所述方法进行鉴定。结果如图58所示，加入双功能纳米抗体Nb193-104的猪BMDC细胞 试验组绿色荧光强度高于对照组，表明O型FMDV灭活抗原经过双功能纳米抗体Nb193-104递送至 猪BMDC细胞。
实施例37双功能纳米抗体Nb193-104提呈FMDV抗原的免疫效力评价
1、免疫试验
将实施例34所制备的双功能纳米抗体Nb193-104(5μg/mL)与纯化后的FMDV抗原(5μg/mL) 4℃孵育60min后，辅以206免疫佐剂，对猪进行免疫实验，每只猪颈部肌肉免疫2mL，并于不同 的时间节点(14d、28d、42d、56d)进行采血取样，同时设置双功能纳米抗体配伍PBS对照组、 非CD205靶向纳米抗体配伍FMDV对照组、非CD205靶向纳米抗体配伍PBS对照组、FMDV对照 组和PBS空白对照组，每组5只猪。
FMD液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性，与攻毒保护 具有很好的相关性，现已被大量应用于FMD免疫抗体水平的检测中，FAO和OIE推荐使用液相阻 断ELISA方法来对FMD免疫效果进行评价，故本研究使用液相阻断ELISA方法来对FMD免疫效 果进行评价。
2、免疫效力评价
利用FMD液相阻断ELISA抗体检测试剂盒检测免后血清中特异性抗体水平、抗体亚型(IgG1 和IgG2a)及免疫持续期，检测步骤均按照试剂盒说明书进行操作。检测结果如图59所示，双功能 纳米抗体Nb193-104配伍FMDV试验组的免后抗体效价均明显高于其他试验组和对照组，表明双功 能纳米抗体对FMDV抗原免后抗体产生具有促进作用；抗体亚型检测结果表明(如图60，61所示)， 双功能纳米抗体Nb193-104配伍FMDV试验组的免后IgG1抗体效价均明显高于其他试验组和对照 组，IgG2a抗体效价与其他FMDV试验组差异不显著，表明双功能纳米抗体Nb193-104可以显著提 升FMDV抗原免后IgG1抗体水平，对IgG2a抗体水平的提升作用与其他试验组差异不显著；免疫 持续期检测结果显示(如图62所示)，双功能纳米抗体Nb193-104配伍FMDV试验组的抗体水平可 持续至免后56天，且抗体效价均明显高于其他试验组和对照组，表明双功能纳米抗体Nb193-104不 仅可以显著提升FMDV抗原免后抗体水平，而且免后56天血清中的抗体仍可以维持在一个较高的 水平，表明双功能纳米抗体对FMDV抗原免后所引起的体液免疫反应具有显著的促进作用。
于注射位点附近活体采集免疫后猪的新鲜***，制备***单细胞悬液，向细胞悬液中加入 淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心(3000g，20min)，吸取淋巴细胞(离心后从上到下一共分为 四层，吸取第二层)，用含血清的细胞培养基洗涤3次后接种至96孔板中(1×106cells/mL)；分别用 纯化后的FMDV抗原(5μg/mL)、LPS刺激细胞，置于细胞培养箱中(37℃，含5％CO2)继续培 养48h；每孔分别加入MTT(5mg/mL)后继续培养4h，离心收集细胞样品，加入DMSO并混匀至 晶体溶解，将细胞板置于酶标仪中读取结果。结果如图63所示，与对照组相比，Nb193-104+FMDV 试验组可以显著提高淋巴细胞的增殖水平，诱导更好的细胞免疫水平。
将上述新鲜制备的淋巴细胞(2×106cells/mL)接种至24孔板中，用纯化后的FMDV抗原(5 μg/mL)体外刺激淋巴细胞，置于细胞培养箱中(37℃，含5％CO2)共同作用120min，收集部分 细胞样品并离心取上清液，按照ELISA试剂盒(购自上海优宁维公司)说明对上清液中IFN-γ、IL-2、 IL-4的浓度进行检测，结果如图64所示，Nb193-104+FMDV试验组IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平均 显著高于其余试验组和对照组，进一步说明双功能纳米抗体可以显著提高FMDV抗原免疫后所引起 的细胞免疫反应。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员会 容易意识到，本发明可容易改造而获得本文所述的那些目的和优点以及隐含在本文中的那些目的和 优点。在本文中以当前优选实施方式的代表形式描述的方法、变体和组合物是示例性的，并不意在 限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可对它们做出改变或将其用于其他用途，但这都包 括在本申请所附权利要求书定义的本发明的范围内。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 基于DC细胞的双功能纳米抗体及其构建方法和应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> 猪DC特异性的纳米抗体(Nb131)
<400> 1
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctgaaag gacttataat agcatgtact gcatggcctg gttccgccag 120
gctccaggga aggagcgcga ggcggtcgca gttattgata gcgctggtag cacaacttac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cgctctgtat 240
ctccaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc gcagggaaaa 300
attgtagtgg cggttacggg tatcccgccc cccctaattc cttcggccta taactacgtt 360
ggcctgggga cccaggtcac cgtctcctca gcggccgcat ac 402
<210> 2
<211> 375
<212> DNA
<213> 猪DC特异性的纳米抗体(Nb104)
<400> 2
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggata cacctactgt aggtacgaca tgagctggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgagtt cgtctcagtt attgatagtg atggtagcac aagctacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaaca ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcaac agatcagtgc 300
cccctggtgg tagctggtgc cccaggttac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tcagcggccg catac 375
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 接头元件(（G4S）4)
<400> 3
ggcggcggcg gctcaggtgg tggtggatcc ggaggaggag gctccggcgg cggcggctca 60
<210> 4
<211> 837
<212> DNA
<213> 纳米抗体(Nb131-104)
<400> 4
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctgaaag gacttataat agcatgtact gcatggcctg gttccgccag 120
gctccaggga aggagcgcga ggcggtcgca gttattgata gcgctggtag cacaacttac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cgctctgtat 240
ctccaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc gcagggaaaa 300
attgtagtgg cggttacggg tatcccgccc cccctaattc cttcggccta taactacgtt 360
ggcctgggga cccaggtcac cgtctcctca gcggccgcat acggcggcgg cggctcaggt 420
ggtggtggat ccggaggagg aggctccggc ggcggcggct cacaggtgca gctgcaggag 480
tctggaggag gctcggtgca ggctggaggg tctctgagac tctcctgtgt agcctctgga 540
tacacctact gtaggtacga catgagctgg taccgccagg ctccagggaa ggagcgcgag 600
ttcgtctcag ttattgatag tgatggtagc acaagctacg cagactccgt gaagggccga 660
ttcaccatct cccaagacaa caccaagaac acggtgtatc tgcaaatgaa cagcctgaaa 720
cctgaggaca ctgccatgta ctactgtgca acagatcagt gccccctggt ggtagctggt 780
gccccaggtt actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcagcggc cgcatac 837
<210> 5
<211> 134
<212> PRT
<213> 猪DC特异性的纳米抗体(Nb131 )
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Asn Ser Met
20 25 30
Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala
35 40 45
Val Ala Val Ile Asp Ser Ala Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gln Gly Lys Ile Val Val Ala Val Thr Gly Ile Pro Pro Pro Leu
100 105 110
Ile Pro Ser Ala Tyr Asn Tyr Val Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
130
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> 猪DC特异性的纳米抗体(Nb131 )
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Val Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Asp Gln Cys Pro Leu Val Val Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
115 120 125
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 接头元件(（G4S）4)
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 8
<211> 279
<212> PRT
<213> 纳米抗体(Nb131-104)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Asn Ser Met
20 25 30
Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala
35 40 45
Val Ala Val Ile Asp Ser Ala Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gln Gly Lys Ile Val Val Ala Val Thr Gly Ile Pro Pro Pro Leu
100 105 110
Ile Pro Ser Ala Tyr Asn Tyr Val Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Arg Tyr Asp Met Ser Trp Tyr Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Val Ile Asp Ser Asp
195 200 205
Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Gln Cys Pro Leu
245 250 255
Val Val Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
275
<210> 9
<211> 402
<212> DNA
<213> 猪CD205特异性纳米抗体(Nb193)
<400> 9
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcaga ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacat cctctggatt cacctacagt ggcaagtgca tgtcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgcggc ggtcgcaact atttccacga ctagtactac aacatactat 180
gccgacgacg tcaagggccg attcactatc tcccaagacg tcgccaagcg cacggtatat 240
ctgcaaatga acgccctgaa acctgacgac actgccatgt atttctgtgc ggcagccggt 300
cccacgagtc cgcacggggg tatgtggtgc gtaaattatt tggctgactt tggttactgg 360
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca gcggccgcat ac 402
<210> 10
<211> 837
<212> DNA
<213> 纳米抗体(Nb193-104)
<400> 10
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcaga ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacat cctctggatt cacctacagt ggcaagtgca tgtcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgcggc ggtcgcaact atttccacga ctagtactac aacatactat 180
gccgacgacg tcaagggccg attcactatc tcccaagacg tcgccaagcg cacggtatat 240
ctgcaaatga acgccctgaa acctgacgac actgccatgt atttctgtgc ggcagccggt 300
cccacgagtc cgcacggggg tatgtggtgc gtaaattatt tggctgactt tggttactgg 360
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca gcggccgcat acggcggcgg cggctcaggt 420
ggtggtggat ccggaggagg aggctccggc ggcggcggct cacaggtgca gctgcaggag 480
tctggaggag gctcggtgca ggctggaggg tctctgagac tctcctgtgt agcctctgga 540
tacacctact gtaggtacga catgagctgg taccgccagg ctccagggaa ggagcgcgag 600
ttcgtctcag ttattgatag tgatggtagc acaagctacg cagactccgt gaagggccga 660
ttcaccatct cccaagacaa caccaagaac acggtgtatc tgcaaatgaa cagcctgaaa 720
cctgaggaca ctgccatgta ctactgtgca acagatcagt gccccctggt ggtagctggt 780
gccccaggtt actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcagcggc cgcatac 837
<210> 11
<211> 134
<212> PRT
<213> 猪CD205特异性纳米抗体(Nb193)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Lys
20 25 30
Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Ala Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Val Ala Lys Arg Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Pro Thr Ser Pro His Gly Gly Met Trp Cys Val Asn
100 105 110
Tyr Leu Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
130
<210> 12
<211> 279
<212> PRT
<213> 纳米抗体(Nb193-104)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Lys
20 25 30
Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Ala Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Val Ala Lys Arg Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Pro Thr Ser Pro His Gly Gly Met Trp Cys Val Asn
100 105 110
Tyr Leu Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Arg Tyr Asp Met Ser Trp Tyr Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Val Ile Asp Ser Asp
195 200 205
Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Gln Cys Pro Leu
245 250 255
Val Val Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
275
<210> 13
<211> 384
<212> DNA
<213> 猪PEDV抗原特异性纳米抗体(Nb2)
<400> 13
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggaggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cagcgatagt agctactgca taggttggtt ccgccagcgt 120
ccagggaagc cgcgcgaggg ggttgcggtc atcgatagtg atggtagcac aatctacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaaca ccaagaatac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgactcc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc agattctcgc 300
attgtttgta gttggctgtc aacgggggac tttggttcct ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct cagcggccgc atac 384
<210> 14
<211> 128
<212> PRT
<213> 猪PEDV抗原特异性纳米抗体(Nb2)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Ile Gly Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Pro Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ser Arg Ile Val Cys Ser Trp Leu Ser Thr Gly Asp Phe Gly
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
115 120 125
<210> 15
<211> 846
<212> DNA
<213> 纳米抗体(Nb193-2)
<400> 15
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcaga ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacat cctctggatt cacctacagt ggcaagtgca tgtcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgcggc ggtcgcaact atttccacga ctagtactac aacatactat 180
gccgacgacg tcaagggccg attcactatc tcccaagacg tcgccaagcg cacggtatat 240
ctgcaaatga acgccctgaa acctgacgac actgccatgt atttctgtgc ggcagccggt 300
cccacgagtc cgcacggggg tatgtggtgc gtaaattatt tggctgactt tggttactgg 360
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca gcggccgcat acggcggcgg cggctcaggt 420
ggtggtggat ccggaggagg aggctccggc ggcggcggct cacaggtgca gctgcaggag 480
tctggaggag gctcggtgca ggctggaggc tctctgagac tctcctgtgc agcctctgga 540
tacagcgata gtagctactg cataggttgg ttccgccagc gtccagggaa gccgcgcgag 600
ggggttgcgg tcatcgatag tgatggtagc acaatctacg cagactccgt gaagggccga 660
ttcaccatct cccaagacaa caccaagaat actctgtatc tgcaaatgaa cagcctgact 720
cctgaggaca ctgccatgta ctactgtgcg gcagattctc gcattgtttg tagttggctg 780
tcaacggggg actttggttc ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctcagcggcc 840
gcatac 846
<210> 16
<211> 282
<212> PRT
<213> 纳米抗体(Nb193-2)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Lys
20 25 30
Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Ala Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Val Ala Lys Arg Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Pro Thr Ser Pro His Gly Gly Met Trp Cys Val Asn
100 105 110
Tyr Leu Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Ser Ser Tyr Cys Ile Gly Trp Phe Arg
180 185 190
Gln Arg Pro Gly Lys Pro Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Asp Ser Asp
195 200 205
Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Arg Ile Val
245 250 255
Cys Ser Trp Leu Ser Thr Gly Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
275 280
<210> 17
<211> 600
<212> DNA
<213> 猪CD205分子 (CysR-FNⅡ)
<400> 17
atcacaccac tgaacgactg gatagtggca aaggactgtg acaaaaccaa ggacatgttt 60
tggaagtggg tatctcagca tcgactcttt catttgcaat cccagaagtg ccttggccta 120
gacataacca aacccacgga ttccttaaga atgttcagct gtgactccga tgccatgctg 180
tggtggaaat gtgaggacca ctctctgtat ggagctgccc agtacaggtt ggctctgaag 240
ggtggacacg ccatagcaag taccaattca tctgacgtct ggaagaaagg aggctcagag 300
gaaagcctct gtgcccagcc ctaccatgag atctatacca gagatgggaa ttccaatggg 360
agaccttgtg aatttccatt cttagttaac ggaacttggc atcacgagtg tatgcgtgat 420
ggagatcaca atgggctgtg gtgtgcaacc accttcaact atgaatatga gggaaagtgg 480
ggcatctgct tacaaccaga aaatggctgt gaagataatt gggaaaagaa tgagcagact 540
ggaggttgct accaatttaa tagtcaggca gctctttctt ggaaagaagc ttatatttca 600
<210> 18
<211> 444
<212> DNA
<213> 猪CSFV抗原特异性纳米抗体(Nb62)
<400> 18
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcaga ctggagggtc tctgagactc 60
ccgaaccctg tacatttcct ccggacggct ggattcacct acagtggcaa gtgcatgtcc 120
tggttcaggg cccgccaggc tccagggaag gagcgcgcgc cgaagcggtc gcaactattt 180
ccacgactag tactacaaca tactatgggc cgacgacggg caatcaaggg ccgattcact 240
atctcccaag acgtcgccgg accaagcgca cggtatatct gcaaatgcgc cctgaaaccc 300
gacactgcca tgtattccgg gaagcgctct gtgcggcagc cggtcccacg agtccgcacg 360
ggggtatgtg gtgcgcggaa attatttggc tttggttact ggggccaggg gacccaggtc 420
accgtctcct cagcggccgc atac 444
<210> 19
<211> 906
<212> DNA
<213> 纳米抗体(Nb131-62)
<400> 19
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctgaaag gacttataat agcatgtact gcatggcctg gttccgccag 120
gctccaggga aggagcgcga ggcggtcgca gttattgata gcgctggtag cacaacttac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cgctctgtat 240
ctccaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc gcagggaaaa 300
attgtagtgg cggttacggg tatcccgccc cccctaattc cttcggccta taactacgtt 360
ggcctgggga cccaggtcac cgtctcctca gcggccgcat acggcggcgg cggctcaggt 420
ggtggtggat ccggaggagg aggctccggc ggcggcggct cacaggtgca gctgcaggag 480
tctgggggag gctcggtgca gactggaggg tctctgagac tcccgaaccc tgtacatttc 540
ctccggacgg ctggattcac ctacagtggc aagtgcatgt cctggttcag ggcccgccag 600
gctccaggga aggagcgcgc gccgaagcgg tcgcaactat ttccacgact agtactacaa 660
catactatgg gccgacgacg ggcaatcaag ggccgattca ctatctccca agacgtcgcc 720
ggaccaagcg cacggtatat ctgcaaatgc gccctgaaac ccgacactgc catgtattcc 780
gggaagcgct ctgtgcggca gccggtccca cgagtccgca cgggggtatg tggtgcgcgg 840
aaattatttg gctttggtta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctcagcggcc 900
gcatac 906
<210> 20
<211> 148
<212> PRT
<213> 猪CSFV抗原特异性纳米抗体(Nb62)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Pro Asn Pro Val His Phe Leu Arg Thr Ala Gly Phe
20 25 30
Thr Tyr Ser Gly Lys Cys Met Ser Trp Phe Arg Ala Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Glu Arg Ala Pro Lys Arg Ser Gln Leu Phe Pro Arg Leu Val
50 55 60
Leu Gln His Thr Met Gly Arg Arg Arg Ala Ile Lys Gly Arg Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Gln Asp Val Ala Gly Pro Ser Ala Arg Tyr Ile Cys Lys Cys
85 90 95
Ala Leu Lys Pro Asp Thr Ala Met Tyr Ser Gly Lys Arg Ser Val Arg
100 105 110
Gln Pro Val Pro Arg Val Arg Thr Gly Val Cys Gly Ala Arg Lys Leu
115 120 125
Phe Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ala Ala Tyr
145
<210> 21
<211> 302
<212> PRT
<213> 纳米抗体(Nb131-62)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Arg Thr Tyr Asn Ser Met
20 25 30
Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala
35 40 45
Val Ala Val Ile Asp Ser Ala Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gln Gly Lys Ile Val Val Ala Val Thr Gly Ile Pro Pro Pro Leu
100 105 110
Ile Pro Ser Ala Tyr Asn Tyr Val Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Pro Asn
165 170 175
Pro Val His Phe Leu Arg Thr Ala Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Lys Cys
180 185 190
Met Ser Trp Phe Arg Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Pro
195 200 205
Lys Arg Ser Gln Leu Phe Pro Arg Leu Val Leu Gln His Thr Met Gly
210 215 220
Arg Arg Arg Ala Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Val Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ser Ala Arg Tyr Ile Cys Lys Cys Ala Leu Lys Pro Asp Thr
245 250 255
Ala Met Tyr Ser Gly Lys Arg Ser Val Arg Gln Pro Val Pro Arg Val
260 265 270
Arg Thr Gly Val Cys Gly Ala Arg Lys Leu Phe Gly Phe Gly Tyr Trp
275 280 285
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr
290 295 300

Claims (33)

1.基于DC细胞的双功能纳米抗体，其特征在于，所述双功能纳米抗体是以接头元件将基于DC细胞的目的蛋白特异性纳米抗体的基因和编码粒径为150nm以下的病毒抗原特异性纳米抗体的基因连接后获得目的基因片段并重组表达获得的目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的基于DC细胞的双功能纳米抗体，其特征在于，所述基于DC细胞的目的蛋白特异性纳米抗体包括编码DC细胞特异性的纳米抗体或编码DC细胞抗原提呈受体特异性的纳米抗体。
3.根据权利要求1所述的基于DC细胞的双功能纳米抗体，其特征在于，所述病毒抗原包括猪圆环病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪***病毒抗原、猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原或猪流行性腹泻病毒抗原中的一种或几种。
4.权利要求1所述的基于DC细胞的双功能纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）使用新鲜诱导分化的DC细胞免疫骆驼或羊驼，经过多次免疫后，提取其外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库；
2）将新鲜诱导分化的DC细胞作为抗原进行包被，进行3-5轮亲和筛选，获得DC特异性纳米抗体；
3）使用粒径为150nm以下的病毒免疫骆驼或羊驼，经过多次免疫后，提取其外周血淋巴细胞cDNA，并扩增其抗体重链可变区基因文库，构建噬菌体展示纳米抗体基因文库；
4）将粒径为150nm以下的病毒作为抗原进行包被，进行3-5轮亲和筛选，获得所述的病毒特异性纳米抗体；
5）将DC特异性纳米抗体的基因序列和所述的病毒病原特异性纳米抗体的基因序列连接后获得目的基因片段并重组表达获得的目的蛋白。
5.靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体是以接头元件将编码猪DC特异性的纳米抗体Nb131的基因和编码猪O型FMDV特异性的纳米抗体Nb104的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪DC特异性的纳米抗体Nb131的氨基酸序列为SEQ ID NO.:5所示，所述猪O型FMDV特异性的纳米抗体Nb104的氨基酸序列为SEQ ID NO.:6所示。
7.根据权利要求5所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体，其特征在于，所述编码猪DC特异性的纳米抗体Nb131的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.:1所示，所述编码猪O型FMDV特异性的纳米抗体Nb104的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.:2所示。
8.根据权利要求5所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述接头元件为接头元件（G4S）4，所述接头元件（G4S）4的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，接头元件（G4S）4的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
9.根据权利要求5所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。
10.核酸或基因，其编码权利要求5所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
11.权利要求1~9任一项所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：将编码靶向猪DC细胞的猪O型FMDV双功能纳米抗体Nb131-104的基因***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb131-104。
12.靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体以接头元件将编码CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的基因和编码O型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的蛋白。
13.根据权利要求12所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示，所述猪O型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
14.根据权利要求12所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示，所述猪O型FMDV抗原特异性纳米抗体Nb104的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
15.根据权利要求12所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述接头元件为接头元件（G4S）4，所述接头元件（G4S）4的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，接头元件（G4S）4的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
16.根据权利要求12所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示。
17.核酸或基因，其编码权利要求16所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:10所示。
18.权利要求12~16任一项所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将双功能纳米抗体Nb193-104的编码基因***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb193-104。
19.靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体以接头元件将编码CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193和编码猪PEDV抗原特异性纳米抗体Nb2的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的蛋白。
20.根据权利要求19所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示，所述猪PEDV抗原特异性纳米抗体Nb2的核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示。
21.根据权利要求19所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪CD205目的蛋白特异性纳米抗体Nb193的氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示，猪PEDV抗原特异性纳米抗体Nb2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:14所示。
22.根据权利要求19所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述接头元件为接头元件（G4S）4，所述接头元件（G4S）4的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，接头元件（G4S）4的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
23.根据权利要求19所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。
24.核酸或基因，其编码权利要求19所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:15所示。
25.权利要求19~23任一项所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将双功能纳米抗体Nb193-2的编码基因***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb193-2。
26.靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体以接头元件将编码猪DC细胞特异性纳米抗体Nb131和编码猪CSFV抗原特异性纳米抗体Nb62的基因连接后获得目的基因片段进一步重组表达获得的目的蛋白。
27.根据权利要求26所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪DC细胞特异性纳米抗体Nb131的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，所述猪CSFV抗原特异性纳米抗体Nb62的核苷酸序列如SEQ ID NO.:18所示。
28.根据权利要求26所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体，其特征在于，所述猪DC细胞特异性纳米抗体Nb131的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示，猪CSFV抗原特异性纳米抗体Nb62的氨基酸序列如SEQ ID NO.:20所示。
29.根据权利要求26所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体，其特征在于，所述接头元件为接头元件（G4S）4，所述接头元件（G4S）4的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，接头元件（G4S）4的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
30.根据权利要求26所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体，其特征在于，所述靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:21所示。
31.核酸或基因，其编码权利要求26所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:19所示。
32.权利要求26~30任一项所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将双功能纳米抗体Nb131-62的编码基因***pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌；诱导重组菌表达目的蛋白，裂解重组菌后纯化获得双功能纳米抗体Nb131-62。
33.权利要求1~9任一项所述的靶向猪DC细胞的猪O型FMDV的双功能纳米抗体、权利要求12~16任一项所述的靶向猪CD205的猪O型FMDV双功能纳米抗体、权利要求19~23任一项所述的靶向猪CD205的猪PEDV双功能纳米抗体、权利要求26~30任一项所述的靶向猪DC细胞的猪CSFV双功能纳米抗体、权利要求10、17、24或31所述的核酸或基因在制备猪用疫苗中的应用。
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