CN115297868B - 用于编码核糖核酸的器官保护性表达和调节的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括具有至少一个开放阅读框(ORF)的m RNA构建体的组合物，其中所述ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS包括至少第一、第二和第三微RNA(miRNA)靶序列，并且其中至少第一、第二和第三miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交。所提供的组合物和分子在例如癌症治疗、免疫治疗和疫苗中具有医药价值。

Description

用于编码核糖核酸的器官保护性表达和调节的组合物及方法
相关申请
本申请要求于2020年2月21日提交的序列号为62/979619的美国临时专利申请、以及于2020年7月31日提交的序列号为63/059458的美国临时专利申请的优先权，并通过引用将它们的内容整体并入本文。
技术领域
本发明涉及信使核糖核酸(mRNA)递送技术，和在多种治疗性、诊断性和预防性适应症中使用这些mRNA递送技术的方法。这样的递送***可用作独立干预，或与其他治疗组分组合。
背景技术
在特定靶组织或器官中诱导特定基因产物(如多肽)表达的能力是经常需要的。在许多情况下，一个目标组织或器官包括不止一种类型的细胞，在这种情况下，它通常还被要求在不同类型的细胞中以不同的程度表达基因产物，即在目标组织的不同类型细胞之间提供基因产物的差异表达。例如，在基因治疗中，突变的和/或无功能的基因可以通过完整的拷贝替换到靶细胞中，其有助于尽量减少邻近细胞、组织和器官中靶蛋白的产生。同样，疫苗抗原的基因产物，如COVID-19的刺突蛋白，优选在免疫***的树突状细胞内或周围表达，以确保最大的应答。
基因疗法通常依赖于病毒载体以将编码多核苷酸引入到靶细胞中，但存在不使用病毒而将多核苷酸递送到细胞的其它技术。病毒的优点包括转染速率可能相对较高，以及通过控制病毒进入靶细胞的结合蛋白将病毒靶向特定细胞类型的能力。相比之下，将编码多核苷酸引入到细胞中的非病毒方法可能存在低转染速率的问题，以及针对特定器官和细胞类型的靶向表达的选择限制。然而，病毒干预本身存在毒性和炎症的风险，而且对引入因子的表达持续时间和表达程度的控制力有限。
基于生物途径的肿瘤疗法具有优于传统化学治疗剂的优点，因为其可采用许多不同机制来更精确地靶向和消灭癌症，例如经由直接细胞溶解、细胞毒素免疫效应机制和血管收缩等。因此，基于这类途径的潜在疗法的临床研究数量已显著增加。然而，归因于治疗活性的不同范围，临床前研究和临床研究是复杂的，因为治疗潜力可能受多个参数影响，因此，很难确定治疗失败的原因或可能增强治疗活性的方法。维持中靶活性、肿瘤特异性和减少副作用也是这类实验和强大疗法的主要挑战。
基于病毒的治疗已经成为解决疾病治疗许多方面问题的一种有前景的方法。溶瘤病毒和以灭活或减毒病毒为基础的癌症疫苗对难治性癌症具有相当大的潜力。然而，***毒的有效性往往受到人体自身免疫反应的限制，从而限制了全身性给药的应用。因此，提供新的组合物和方法来改进和扩大目前可用的病毒疗法的范围将是有益的。
WO-2017/132552-A1描述了含有微RNA结合位点的工程化基因组的重组溶瘤病毒。
US-2013/156849-A1涉及表达哺乳动物细胞或组织中目标多肽的方法，所述方法包括将所述哺乳动物细胞或组织与包括编码目标多肽的经修饰mRNA的制剂接触。WO-2016/011306-A2描述了包括至少一种可以含有微RNA结合位点的末端修饰的核酸的设计、制备、生产和/或制剂。前述现有技术并未解决如何确保用治疗剂或因子治疗共同治疗的受试者体内单个或多个器官类型的有效保护问题。
WO 2019/051100 A1和WO 2019/158955 A1描述了在一个或多个靶器官内表达一个或多个多肽的mRNA序列的递送的组合物和方法，包括miRNA结合位点序列，所述miRNA结合位点序列允许编码序列在一个或多个靶器官内的至少第一和第二类型细胞中的差异表达。
亟需进一步改进和优化调节特定器官和/或组织中多核苷酸序列(如mRNA)表达的方法和组合物。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种mRNA构建体，包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS包括至少第一、第二和第三微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少第一、第二和第三微RNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交。
本发明的第二方面提供了一种药物组合物，包括：
i、一种mRNA构建体，包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS包括至少第一、第二和第三微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少第一、第二和第三微RNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交；和
ii、体内递送组合物；
其中所述mRNA构建体包括在递送组合物中或吸附到递送组合物上。
本发明的第三方面提供了一种mRNA构建体，包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且所述OPS包括至少第一和至少第二微RNA(miRNA)靶序列，至少第一和第二miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交。
本发明的第四方面提供了一种药物组合物，包括：
a、至少一种mRNA构建体，包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且所述OPS包括至少第一和第二微RNA(miRNA)靶序列，并且至少第一和第二miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交；和
b、体内递送组合物；
其中mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，包括：
a、至少一种mRNA构建体，包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且所述OPS包括至少第一和第二微RNA(miRNA)靶序列，并且至少第一和第二miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交；和
b、体内递送组合物；
其中mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上。
第六方面提供了包括至少一个开放阅读框(ORF)的mRNA，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，并且所述OPS包括：
a、至少第一OPS，其中所述第一OPS包括作为第一miRNA的靶点的序列，并且所述第一OPS被优化为与第一器官细胞内的第一miRNA杂交，并具有基本完美的匹配；
b、至少第二OPS，其中所述第二OPS包括作为第二miRNA的靶点的序列，并且所述第二OPS被优化为与第二器官细胞内的第二miRNA杂交，并具有基本完美的匹配；和
c、至少第三OPS，其中第三OPS包括作为第三miRNA的靶点的序列，并且所述第三OPS被优化为与第三器官细胞内的第三miRNA杂交，并具有基本完美的匹配；
其中，第一、第二和第三器官保护序列在OPS中连续排列，并且第一、第二和第三器官的细胞是未患病细胞。
本发明的第七方面提供了一种药物组合物，包括：
i、至少一个如本文所述的mRNA；和
ii、体内递送组合物；
其中mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上。
本发明的第八方面提供了一种疫苗组合物，包括：
至少第一mRNA构建体，包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，且所述OPS包括至少第一和第二微RNA(miRNA)靶序列，并且至少第一和第二miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交；和
体内递送组合物；
其中mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上。
本发明的第九方面提供了一种疫苗组合物，包括：
一种疫苗构建体，至少包括第一mRNA，所述第一mRNA至少具有第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码选自细菌蛋白和/或病毒蛋白的抗原，并且第一ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且所述OPS包括至少第一和第二微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少第一和第二miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交；
一种辅助构建体，包括至少第二mRNA，所述第二mRNA包括至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码选自IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF的促炎性细胞因子，所述第二ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个保护多个器官的OPS，并且所述OPS包括至少第三和第四miRNA靶序列，并且其中所述至少第三和第四miRNA靶序列中的每一个被优化为与相应的miRNA序列杂交；
和
体内递送组合物；
其中所述疫苗构建体和辅助构建体包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上。或者，所述疫苗构建体和辅助构建体可包含在或吸附到共同给药或顺序给药的不同递送组合物中。
本发明在本文所述的各种实施方案和实施例中进一步说明，如技术人员所理解的，其特征可以进一步组合以形成其他实施方案。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个实施方案包括OPS的mRNA构建体的示意图(即非等比例)。
图2示出了用于确定报告基因mCherry表达的方案的示意图。将本文所述组合物施用于不同类型细胞后，通过荧光显微镜(Texas Red和DAPI filter)进行mCherry信号分析，细胞核用Hoechst 33342染色。
图3示出了遵循上述方案的三种类型肝细胞中的mCherry信号，并表明与用对照mCherry mRNA转染的人肝癌细胞(Hep3B)或正常小鼠肝细胞(AML12)相比，用mCherry-3MOP或mCherry-5MOP mRNA转染正常小鼠和人肝细胞时，细胞信号显著降低。这些图像是用Texas Red和DAPI filter获得的图像的叠加，示出了mCherry的荧光信号和细胞核染色。
图4示出了使用Cytation仪(Biotek)转染细胞中的mCherry荧光定量。
图5A示出了以本文所述组合物转染的正常人肾细胞中的mCherry信号，示出了经mCherry-3MOP处理后细胞中的信号降低，表明了mCherry翻译的减少。图像是用Texas Red和DAPI filter cube获得的图像的叠加，示出了mCherry的荧光信号和细胞核染色。
图5B示出了使用Cytation仪(Biotek)转染后正常人肾细胞中的mCherry荧光定量。
图6a-f示出了用本文所述的包含与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染后的肝细胞中mCherry信号的比较，并表明MOP序列抑制AML12小鼠肝细胞中的表达，但不抑制肝癌细胞(Hep3B)中的表达。对于每组图片，顶部的图片是用Texas Red和DAPI filter cubes采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Red filter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未转染mRNA的对照Hep3B细胞(肝癌)，底部图片显示无mCherry信号；(b)用无MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(c)用含有MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(d)未用mRNA转染的对照AML12细胞(正常肝脏)中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(e)用无MOP序列的mRNA转染的AML12细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(f)用含有MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图7a-f示出了用本文所述的包含与Let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染后的肝细胞中的mCherry信号的比较，并表明了所述MOP序列可以抑制AML12小鼠肝细胞中的表达，但不抑制肝癌细胞(Hep3B)中的表达。对于每组图片，顶部的图片是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Red filter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未转染mRNA的对照Hep3B细胞(肝癌)，底部图片显示无mCherry信号；(b)用无MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(c)用含有MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(d)未转染mRNA的对照AML12细胞(正常肝脏)中的细胞核染色和mCherry信号，底部图片显示无mCherry信号，(e)用无MOP序列的mRNA转染的AML12细胞中的细胞核染色和mCherry信号，(f)用含有MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图8a-b示出了本文所述的包含与复制一次(1*)、两次(2*)或四次(4*)的miRNA-122结合的完美匹配的多重MOP序列的组合物的转染后肝细胞中mCherry信号的比较，并表明了其在抑制AML12正常肝细胞(a)中mCherry表达方面存在剂量依赖性，但在Hep3B癌细胞中明显不同(b)。对于(a)和(b)中的每一个，顶部的图片都是用Texas Red和DAPI filtercube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用TexasRed filter cube采集的图像，只示出了mCherry荧光。未注射mRNA，以及不含MOP序列的mRNA的对照也被用于测定mCherry。
图9a-d示出了用本文所述的包含与miRNA122结合的不完全匹配的双(2*)MOP序列的组合物转染后AML12小鼠肝细胞中的mCherry信号的比较。对于(a)、(b)、(c)和(d)中的每一个，顶部图片均是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Red filter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未经mRNA转染的对照AML12细胞(正常肝脏)中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(b)用不含MOP序列的mRNA转染的AML12细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(c)用含有2*不完全匹配的miRNA122 MOP序列的mRNA转染后AML12细胞中的细胞核染色和mCherry信号，底部图片显示mCherry在AML12细胞中的表达是可检测的；(d)用含有2*完全匹配的miRNA-122MOP结合序列(优化)的mRNA转染后AML12细胞中的细胞核染色和mCherry信号，底部图片显示在AML12细胞中几乎不存在可检测的mCherry的表达。
图10a-f示出了用本文所述的包含与Let7b,miRNA-126,and miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染后的肾细胞中mCherry信号的比较，并表明了所述MOP序列抑制人肾细胞(HREC)中mCherry的表达，但不抑制癌细胞(786-0)中mCherry的表达。对于(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的每一个，顶部图片均是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Redfilter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未经mRNA转染的对照786-0人肾细胞腺癌细胞中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(b)经不含MOP序列的mRNA转染后786-0细胞的细胞核染色和mCherry信号；(c)经含MOP序列的mRNA转染后786-0细胞的细胞核染色和mCherry信号，这显示了表达证据；(d)未经mRNA转染的对照hREC细胞(正常混合肾上皮细胞)中的细胞核染色，底部图片无mCherry信号；(e)经不含MOP序列的mRNA转染后hREC细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(f)经含有MOP序列的mRNA转染后hREC细胞中的细胞核染色和mCherry信号，所述mCherry信号仅显示几乎无表达。
图11a-f示出了用本文所述的包含与miRNA-122,miRNA-192,and miRNA-30a结合并完美匹配的MOP序列的组合物转染后肾细胞中mCherry信号的比较，并表明了所述MOP序列抑制人肾细胞(hREC)中mCherry的表达，但不抑制癌细胞(786-0)中mCherry的表达。对于(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中的每一个，顶部图片均是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Redfilter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未经mRNA转染的对照786-0人肾细胞腺癌细胞中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(b)经不含MOP序列的mRNA转染后786-0细胞的细胞核染色和mCherry信号；(c)经含有MOP序列的mRNA转染后786-0细胞的细胞核染色和mCherry信号，这显示了表达证据；(d)未经mRNA转染的对照hREC细胞(正常混合肾上皮细胞)中的细胞核染色，底部图片上无mCherry信号；(e)经不含MOP序列的mRNA转染后hREC细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(f)经含有MOP序列的mRNA转染后hREC细胞中的细胞核染色和mCherry信号，所述mCherry信号仅显示几乎无表达。
图12a-b示出了根据一个实施方案的实验结果，用本文所述的组合物转染人PBMC细胞，所述组合物包括(a)在三个剂量水平下表达的人IL-12的mRNA，在转染以下mRNA 6小时后记录IL-12的表达：NC(无ATG密码子的来自单链的非编码人重组IL-12)、hdcIL-12(来自分离的IL122A和IL12b mRNA的1:1混合物的人重组人IL-12)、hscIL-12(来自单链的人重组IL-12)和hscIL-12-MOP(来自单链的人重组IL-12)，这是一种表达包含与miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的mRNA的单链重组IL-12；(b)在三个剂量水平上表达人GM-CSF的mRNA，在转染以下mRNA 6小时后记录GM-CSF的表达：NC(非编码GM-CSF mRNA–无ATG密码子)、hGM-CSF和hGM-CSF-MOP，这是一种表达包含与miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的mRNA的hGM-CSF。
图13a-f显示了本文所述的包含与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30A结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染后结肠上皮细胞中mCherry信号的比较，并表明了所述MOP序列抑制结肠上皮细胞中的表达，但不抑制结肠癌细胞(HCT-116)中的表达。对于每组图片，顶部图片是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Red filter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未经mRNA转染的对照结肠上皮细胞，底部图片显示无mCherry信号；(b)经不含MOP序列的mRNA转染后结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(c)经含有MOP序列的mRNA转染后结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(d)未经mRNA转染的对照HCT-116细胞(结肠癌)中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(e)经不含MOP序列的mRNA转染后HCT-116细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(f)经含有MOP序列的mRNA转染后HCT-116细胞中的细胞核染色和mCherry信号。
图14a-f示出了用本文所述的包含与miRNA-Let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染后结肠上皮细胞中mCherry信号的比较，并表明了所述MOP序列通过抑制正常结肠细胞和结肠癌细胞中的表达提供器官保护，这归因于其存在miRNA-Let7b结合位点。对于每组图片，顶部图片是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Redfilter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未经mRNA转染的对照结肠上皮细胞，底部图片显示无mCherry信号；(b)经不含MOP序列的mRNA转染后结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(c)经含有MOP序列的mRNA转染后结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(d)未经mRNA转染的对照HCT-116细胞(结肠癌)中的细胞核染色，底部图片上显示无mCherry信号；(e)经不含MOP序列的mRNA转染后HCT-116细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(f)经含有MOP序列的mRNA转染后HCT-116细胞中的细胞核染色和mCherry信号。
图15a-c示出了用本文所述的包含与miRNA-let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染后正常健康肺细胞(BEAS-2B)中的mCherry信号，并表明所述MOP序列通过抑制健康肺细胞中的表达来保护肺，这归因于其存在miRNA-let7b结合位点。对于每组图片，顶部图片是用Texas Red和DAPI filter cube采集的图像的叠加，其示出了细胞核染色和mCherry荧光。底部的图片示出了用Texas Red filter cube采集的图像，其只示出了mCherry荧光。(a)顶部图片示出了未经mRNA转染的对照细胞，底部图片显示无mCherry信号；(b)经不含MOP序列的mRNA转染后细胞的细胞核染色和mCherry信号；(c)经含有MOP序列的mRNA转染后细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图16a-b示出了小鼠体内生物分布实验的结果，表明(a)在用本发明所述的组合物转染后3.5小时(T3.5h)后，在包括含有MOP的构建体(第2组和第3组)和不含MOP的构建体(对照组，第1组)在内的所有组中通过全身成像均可观察到高水平的荧光素酶的表达；但在24小时后(T24小时)，含有MOP的组合物中观察到荧光素酶的表达显著下降。在(b)中，与第1组(无MOP对照)相比，第2组和第3组(含MOP构建体)24小时后离体器官成像显示肝、肺、脾和肾中的荧光素酶表达降低。
具体实施方式
除非另有说明，本发明的实践使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、化学方法等常规技术，这些常规技术属于本领域普通技术人员的能力范围。这些技术也在被文献中说明，例如M.R.Green,J.Sambrook,2012,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第四版,Books 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Ausubel,F.M.等人(CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Online ISSN:1934-3647)；B.Roe,J.Crabtree,和A.Kahn,1996,DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O'D.McGee,1990,In Situ Hybridisation:Principles and Practice,Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods ofEnzymology:DNA StructurePart A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,AcademicPress；Synthetic Biology,Part A,Methods in Enzymology,Edited by Chris Voigt,497卷，2-662页(2011)；Synthetic Biology,Part B,Computer Aided Design and DNAAssembly,Methods in Enzymology,Edited by Christopher Voigt，498卷,2-500页(2011)；RNA Interference,Methods in Enzymology,David R.Engelke和John J.Rossi,392卷,1-454页(2005)。这些一般文本中的每一篇都以参考文献的形式被纳入本文。
在阐述本发明之前，提供了一些有助于理解本发明的定义。此处引用的所有参考文献均通过引用整体并入。除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
如本文所使用，术语“包含”是指必须包括任何所列举的要素，并且还可能任选地包括其它要素。“基本上由...组成”是指必须包括任何所列举的要素，将实质上影响所列举要素的基本和新颖特征的要素排除在外，其它要素可能任选地包含在内。“由……组成”是指除所列要素外的所有要素。由这些术语中的每一个所限定的实施方案都在本发明的范围内。
术语“分离的”在应用于多核苷酸序列时，表示该序列已从其天然来源的生物体中移出，从而，不需要额外的或多余的编码或调控序列。分离的序列适合用于重组DNA过程和基因工程蛋白合成***。所述分离的序列包括cDNA、mRNA和基因组克隆。所述分离的序列可以仅限于蛋白质编码序列，也可以包括5'和3'调控序列，如启动子和转录终止子，或未翻译序列(UTR)。在进一步阐述本发明之前，提供了一些有助于理解本发明的定义。
“多核苷酸”是一个单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3'和5'末端通过磷酸二酯键连接。多核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基组成。多核苷酸包括DNA和RNA，可以在体外合成或从天然来源分离。多核苷酸的大小通常以双链多核苷酸的碱基对(bp)的数目表示，或者如果是单链多核苷酸，则以核苷酸(nt)的数目表示。1000bp或nt等于1千碱基(kb)。长度小于40个核苷酸的多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”。本文中使用的术语“核酸序列”是单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3'和5'端通过磷酸二酯键连接。多核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基组成。核酸序列可以包括DNA和RNA，可以在体外合成或从天然来源分离。在本发明的具体实施方案中，所述核酸序列包括信使RNA(mRNA)。
核酸还可以包括修饰的DNA或RNA，例如甲基化的DNA或RNA，或经过翻译后修饰的RNA，例如用7-甲基鸟苷在5'加帽，3'加工(如切割和多聚腺苷酸化反应)，以及剪接。核酸还可以包括合成核酸(XNA)，如己糖醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。
根据本发明，本文所述的核酸序列的同源性不限于简单的100％序列一致性。在这方面，与两个序列相关的术语“基本相似”是指序列至少具有70％、80％、90％、95％或100％的相似性。同样，与两个序列相关的术语“基本互补”一词意味着序列完全互补，或者至少70％、80％、90％、95％或99％的碱基互补。也就是说，待杂交的序列的碱基之间可能发生错配，这可能发生在至少1％、5％、10％、20％或最多30％的碱基之间。然而，在某些情况下，可能需要区分两个可以相互杂交但包括某些错配的序列——“不精确匹配”、“不完全匹配”或“不精确互补”——和两个可以相互杂交而不存在任何错配的序列——“精确匹配”、“完美匹配”或“精确互补”。此外，还考虑了可能的错配程度。
如本文所用，术语“器官保护序列”(“OPS”)是指由天然或合成来源的多种microRNA(miRNA)靶序列和任选地一个或多个辅助序列组成的序列。其中OPS向多个器官提供保护，可称为多器官保护(MOP)序列。术语“靶序列”是指包括在mRNA序列中的序列，例如在非翻译区(UTR)中的序列，所述在UTR中的序列被特定的miRNA靶向绑定。通过核酸杂交的方式在miRNA和相应靶序列中的互补碱基对之间进行结合。结合作用可以被优化，使得特定miRNA和靶序列之间不存在错配，或者错配仅限于靶序列长度上的单个碱基对错配。在本发明的一个实施方案中，单个碱基错配仅限于靶序列的5′或3′端。优化的序列也可以描述为与靶向miRNA完美匹配，并且可能与野生型结合序列存在两个或多个碱基对的区别。包括两个以上天然发生的错配的野生型序列被认为是未完全匹配或与相应的miRNA序列不完全匹配。
术语“可操作地连接”在应用于核酸序列时，例如在表达构建体中，表示所述序列以它们协同工作的方式排列，以实现其预期目的。例如，在DNA载体中，启动子序列允许启动转录，所述转录通过连接的编码序列进行，直至终止序列。在RNA序列的情况下，一个或多个非翻译区(UTR)可以相对于被称为开放阅读框(ORF)的连接多肽编码序列排列。本文所公开的给定mRNA可以包括一个以上的ORF，即所谓的多顺反子RNA。UTR可以位于可操作地连接的编码序列ORF的5’或3’端。UTR可以包括在自然界中发现的mRNA序列中通常发现的序列，例如，任意一个或多个：Kozak共有序列、起始密码子、顺式作用调节元件、聚-A尾、内部核糖体进入位点(IRES)、调节mRNA寿命的结构、指导mRNA定位的序列等。mRNA可以包括相同或不同的多个UTR。一个或多个UTR可以包括OPS或位于OPS的近端或附近。
本发明的术语“表达多肽”是指产生本文所述的多核苷酸序列所编码的多肽。通常，这涉及通过将序列递送到细胞中的核糖体机制翻译提供的mRNA序列(即ORF)。
本文使用的术语“疾病”，如“患病细胞”和/或“患病组织”，是指显示异常、不健康或疾病病理学的组织和器官(或其部分)以及细胞。例如，患病细胞可以被病毒、细菌、朊病毒或真核寄生虫感染；可以包括致病突变；和/或可以是癌症的、癌前的、肿瘤的(tumoral)或肿瘤性的(neoplastic)。与其他正常或所谓的健康细胞相比，患病细胞可以包括改变的细胞内miRNA环境。在某些情况下，患病细胞可以是病理正常的，但包括改变的细胞内miRNA环境，代表疾病的前体状态。患病组织可以包括由另一器官或器官***的患病细胞浸润的健康组织。例如，许多炎症性疾病包括健康器官被T细胞和中性粒细胞等免疫细胞浸润的病理特点。例如，受狭窄性病变或肝硬化病变的器官和组织可包括健康细胞和邻近的患病细胞。
本文使用的术语“癌症”是指组织中的肿瘤，包括恶性肿瘤，可以是起源于特定组织的原发性癌症，也可以是通过从其他地方转移而扩散的继发性癌症。术语癌症、肿瘤和恶性肿瘤在这里互换使用。癌症可以破坏位于肿瘤内或具有肿瘤相关特性的组织或细胞。肿瘤通常具有区别于正常组织和正常细胞的特征。这些特征包括但不限于：间变性程度、形态改变、形状不规则、细胞粘附性降低、转移的能力和增加的细胞增殖。与“癌症”相关且通常与“癌症”同义的术语包括肉瘤、癌、恶性肿瘤、上皮瘤、白血病、淋巴瘤、转化和肿瘤等。如本文所用，术语“癌症”包括癌前病变和/或癌前肿瘤，以及恶性肿瘤。
本文使用的术语“健康”，如“健康细胞”和/或“健康组织”表示本身没有患病和/或接近通常正常功能表型的组织和器官(或其部分)及细胞。可以理解，在本发明的上下文中，术语“健康”是相对的，例如，受肿瘤影响的组织中的非肿瘤细胞很可能在绝对意义上不是完全健康的。因此，“非健康细胞”是指本身不是肿瘤、癌或癌前的细胞，但可以是肝硬化、发炎、感染或其他疾病的细胞。同样，“健康或非健康组织”是指不存在肿瘤(tumor)、肿瘤的(neoplastic)、癌的或癌前细胞，或上述其他疾病的组织或其部分；而不管整体健康状况如何。例如，在包括癌组织和纤维化组织的器官中，与癌组织相比，纤维化组织中的细胞可以被认为是相对“健康”的。用于近似“健康”细胞正常功能表型的模型可能包括在细胞功能和基因表达方面与起始细胞相近的永生化细胞系。
在一个可替代实施方案中，通过量化miRNA的表达来确定细胞、细胞类型、组织和/或器官的健康状况。在某些类型疾病中，如癌症，特定miRNA种的表达受到影响，与未受影响的细胞相比，miRNA的表达可能上调或下调。miRNA转录组的这种差异可用于识别相关的健康状况，和/或对健康细胞、细胞类型、组织和/或器官的向疾病状态的进展进行跟踪。所述疾病状态可以包括转化为肿瘤细胞的不同阶段。在本发明的实施方案中，利用包含在给定器官或器官***的细胞类型的miRNA转录组的差异性变化来控制不同细胞类型中的蛋白质表达。
如本文所用，术语“器官”是“器官***”的同义词，是指组织和/或细胞类型的组合，所述组织和/或细胞类型可以在受试者的体内被分隔，以提供生物功能，如生理、解剖学、稳态或内分泌功能。适当地，器官或器官***可以是指血管化的内部器官，如肝脏或胰腺。通常，器官包括至少两种组织类型和/或显示器官表型特征的多种细胞类型。组织或组织***可以合作，但不能被正式视为一个器官。例如，血液通常被视为一种组织，甚至是液体组织，但根据所使用的定义，从严格意义上讲，血液不被视为器官。然而，在某些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于包括血液、造血和淋巴组织在内的器官、组织和组织***，并呈现保护作用。
本文所用术语“***毒”是指能够感染和杀死癌细胞的病毒，有时通过直接病毒溶解(溶瘤)和/或包括通过刺激宿主抗肿瘤反应间接杀死。溶瘤病毒的特征通常是与健康细胞相比，患病细胞(包括癌症细胞)的活性增强。***毒也可以包括在疫苗配方中有用的减毒或改性病毒。
表1***毒和其亚型的实例
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在本发明的实施方案中，病毒可以选自从巴尔的摩病毒分类法(Baltimore D(1971)."Expression of animal virus genomes".Bacteriol Rev.35(3):235–41)中组I–VII中任一病毒。在本发明的具体实施方案中，合适的病毒可以选自：巴尔的摩组I，其特征在于具有双链DNA病毒基因组；组II，其特征在于具有阳性单链DNA基因组；组III，其特征在于具有双链RNA病毒基因组；组IV，其特征在于具有单链阳性RNA基因组；组V，具有单链阴性RNA基因组。
本文所用术语“毒力基因”或“毒力因子”是指有助于***毒(如溶瘤病毒)在其感染的细胞中复制或溶解其感染的细胞的基因或基因产品。术语“复制因子”在本文用作同义术语。毒力因子通常是由病毒基因组编码的病毒基因。毒力因子可能参与细胞内免疫***抑制和逃避、病毒基因组复制、病毒传播或传递、结构外壳蛋白的产生或组装、潜在状态下病毒的激活、病毒潜伏期的预防以及宿主细胞过程的接管等功能。一些毒力因子具有细胞或其他等效物，如果病毒基因组中没有这些基因，可以补偿这些基因的功能。一些病毒可以用外源毒性基因修饰，从而提高它们复制、溶解细胞和传播的能力。
术语“病毒进入受体”或“病毒融合受体”是指存在于靶细胞表面的细胞表面蛋白或其他标记物或抗原，病毒在进入所述细胞之前可能与之结合，作为病毒生命周期“进入”阶段的一部分。众所周知，病毒基因组必须进入靶细胞进行感染和复制。病毒与靶细胞之间的结合被认为是由于病毒进入受体与病毒衣壳或病毒包膜上的病毒蛋白之间的相互作用(取决于病毒类型)。随后的进入可以通过膜融合(在有病毒包膜的病毒中)、内吞作用和/或仅通过注射病毒基因组来介导。病毒进入受体可以是天然的(存在于现有生物体中)，也可以被修饰、合成和/或工程化作为病毒蛋白的结合靶点。与病毒进入受体结合的病毒蛋白也可以是天然的(存在于现有病毒中)，也可以被修饰、合成和/或工程化以与天然或修饰/合成或工程化的病毒进入受体结合。
在本发明的具体实施方案中，所述mRNA序列通过一个或多个优先在肿瘤中增强病毒毒力的蛋白质或多肽的差异表达来增强或维持共同施用的病毒在器官内的肿瘤中的溶瘤能力。以这种方式，所述mRNA可以编码一个或多个因子，通过增加复制和/或增加病毒溶瘤活性和/或增加病毒后代和/或增强适应性抗肿瘤免疫应答来增强溶瘤病毒的生物活性。在本发明的进一步实施方案中，所述组合物可以编码控制宿主免疫细胞与肿瘤内溶瘤病毒之间的相互作用的蛋白质或多肽。然而，在进一步的实施方案中，本发明所述的组合物可以用于生产蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽可以调节溶瘤病毒或其他***毒活性的差异模式；以及表达免疫共刺激分子，所述免疫共刺激分子通过本发明的病毒体、外源性或递送粒子施用。
本文所用的术语“多肽”是由肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然产生的还是通过合成手段在体外产生的。长度小于约12个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”，长度在约12到约30个氨基酸残基之间的多肽可以被称为“寡肽”。本文所用的术语“多肽”是指天然存在的多肽、前体形式或前蛋白的产物。多肽也可以经历成熟或翻译后修饰过程，这些过程可以包括但不限于糖基化、蛋白水解溶解、脂质化、信号肽溶解、前体肽溶解、磷酸化等。所述术语“蛋白质”是指包含一个或多个多肽链的大分子。
本文所用的术语“基因产物”是指由至少一个编码序列或开放阅读框(ORF)编码的肽或多肽，所述编码序列或开放阅读框(ORF)包含在本文所述的本发明的mRNA构建体中。可以使用多顺反子mRNA构建体，产生由位于同一多核链上的多个ORF编码的多个基因产物。应当理解的是，多个ORF可能导致原位产生各种产物，例如蛋白质、肽或多肽，这些产物可以在功能上协同，或可以形成具有不同生物活性和潜在治疗作用的复合物和/或多聚体蛋白质。
所述mRNA编码的基因产物通常是肽、多肽或蛋白质。当特定的蛋白质由一个以上的亚基组成时，mRNA可以编码一个或多个ORF中的一个或多个亚基。在可选地实施方案中，第一mRNA可以编码第一亚基，而第二个共同施用的mRNA可以编码第二亚基，在原位翻译时，使得多亚基蛋白质基因产物组装。
将mRNA直接递送到细胞中，可以直接和可控地将目标基因产物(如多肽和/或蛋白质)翻译到细胞中。具体而言，mRNA的提供不仅允许使用细胞表达调节机制，如miRNA介导的控制(如下文具体实施方案所述)，而且还表示产物的有限和可耗尽的供应，而不是靶细胞转录组的潜在永久性变化，而靶细胞转录组可以由游离基因或基因组***的DNA载体提供。
在本发明的实施方案中，提供了一种mRNA序列，包括用于编码至少一种多肽的序列，所述多肽与一个或多个可以赋予组织特异性和核酸序列整体稳定性的非翻译区(UTR)有效结合。“组织特异性”是指mRNA编码的蛋白质产物的翻译根据UTR的存在而受到调控。调控可以包括允许、减少甚至阻断mRNA向蛋白质的可检测翻译。所述UTR可以直接与顺式mRNA相连，即在同一个多核苷酸链上。在可选地实施方案中，提供了用于编码基因产物的第一序列和与第一序列的一部分杂交的第二序列，所述第二序列包括一个或多个赋予整个核酸序列组织特异性的UTR。在后一种实施方案中，所述UTR与反式编码基因产物的序列可操作地连接。
根据本发明的具体实施方案，提供了一种mRNA，其包括按需要可操作地连接到其上的此类相关核酸序列，以预防或减少未病变肝组织中(例如健康肝细胞中)的基因产物的表达。所述mRNA在之后指代“编码mRNA”。因此，提供的这种编码mRNA的构建体或转录本，包括核糖体募集和组织和/或器官特定表达(通常，但不完全位于ORF的3’端)所需的5’cap和UTR，以及分别定义一个或多个ORF的起始和终止密码子。当所述构建体被引入未患病肝、肺、胰腺、乳腺、脑/CNS、肾脏、脾脏、肌肉、皮肤和/或结肠胃消化道时，基因产物的表达被阻止或减少。相比之下，上述器官内的肿瘤细胞或其他患病细胞通常不符合正常的未患病细胞表达模式，具有显著不同的miRNA转录组。所述mRNA编码的多肽被特异性地翻译到这些异常细胞中，但在相邻健康或未患病细胞中不翻译或翻译程度较低。可以通过本文所述的特定递送平台或以本领域已知的任何合适的方法将所述mRNA构建体递送至器官。可以通过微RNA调节机制(例如下文更详细地描述的机制)介导细胞类型特定表达。
本文所定义的“治疗组分”或“治疗剂”是指当作为治疗干预的一部分施用于个体人类或其他动物时，有助于对该个体人类或其他动物产生治疗效果的分子、物质、细胞或生物体。所述治疗效果可能由治疗组分本身或治疗干预的其他组分引起。治疗组分可以是编码核酸组分，尤其是mRNA。编码核酸组分可以编码治疗性增强因子，如下所述。治疗组分还可以包括药物，任选地包括化疗药物，例如小分子或单克隆抗体(或其片段)。在某些实施方案中，治疗组分可以包括细胞，例如重组修饰的免疫效应因子细胞-例如CAR T细胞。在本发明的其他实施方案中，所述治疗剂包括***毒，例如溶瘤病毒或病毒载体。
所述术语“治疗效果”一词是指由药物或治疗活性剂引起的动物受试者(通常是人类)的局部或全身作用，所述药物或治疗活性剂包括施用于受试者的物质、分子、组合物、细胞或生物体。所述术语“治疗干预”是指施用这些物质、分子、组合物、细胞或生物体。因此，所述术语是指旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或促进动物或人类受试者所需的身心发展和状况的任何药剂。“有效治疗量”一词是指以适用于任何治疗的合理效益/风险比下产生预期局部或全身作用的药剂量。在某些实施方式中，药剂的有效治疗量取决于其治疗指数、溶解度等。例如，本发明的某些治疗剂可以以产生适用于该治疗的合理效益/风险比的充足量给药。在癌症治疗的特定背景下，“治疗效果”可以通过多种方式表现出来，包括但不限于实体瘤体积减少、癌细胞数量减少、观察到的转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低、肿瘤细胞标志物表达减少，和/或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。在治疗病毒、细菌或寄生虫感染的具体情况下，例如通过疫苗预防，可以通过对病原体攻击的全部或部分抗性、受试者或动物中存在针对病原体的循环抗体或其他已知的疫苗有效性措施来表示“治疗效果”。
在一种实施方案中，接受治疗的受试者是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、灵长类动物、非人类哺乳动物、家畜或牲畜，如狗、猫、兔子、牛、马、绵羊、山羊等)，并且适合人类。在另一种实施方案中，受试者是患癌的动物模型。例如，所述动物模型可以是人源性癌症，适当地肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、脑癌、肾癌、肌肉瘤、皮肤癌和/或结肠-胃肠道癌的原位异种移植动物模型。
在本发明方法的具体实施方案中，所述受试者尚未进行治疗，例如***毒治疗、化疗、放射治疗、靶向治疗、疫苗接种和/或抗免疫检查点治疗。在另一种实施方案中，所述受试者接受了治疗，例如上述治疗。
在进一步的实施方案中，所述受试者接受了切除癌或癌前组织的手术。在其他实施方案中，癌组织没有被切除，例如，癌组织可能位于身体的一个不可手术的区域，例如，如果接受手术干预，可能危及受试者生命的组织或器官，或者手术程序将导致永久伤害甚至致死的高风险的区域。
在某些实施方案中，所提供的编码mRNA构建体可以编码“治疗增强因子”。根据本发明，治疗增强因子是可以增强或促进另一种共同施用的治疗剂对给定细胞(靶细胞是合适的)执行治疗效果的能力的基因产物或多肽。当引入靶细胞或在其附近时，治疗增强因子的表达可以与共同施用的治疗剂协同，从而激活或增强所述药剂的治疗活性。在某些实施方案中，所述治疗增强因子可以增强共同施用的溶瘤病毒溶解癌细胞的能力。在本发明的其他实施方案中，所述治疗增强因子可以影响肿瘤微环境的改变，以协助或募集受试者自身的免疫应答。在后一种实施方案中，所述肿瘤微环境的改变可能有助于溶瘤病毒、CAR-T或其他基于治疗的过继细胞、或免疫检查点抑制剂(如单克隆抗体或等效的PD-1/PD-L1)的共同施用。在某些实施方案中，所述治疗增强因子可以使前药转化为活性形式。在其他实施方案中，所述治疗增强因子可以作为共同或顺序施用疫苗的佐剂。可选地，所述治疗增强因子可作为共同或顺序施用的减毒或修饰的病毒佐剂，例如疫苗制剂中使用的修饰的腺病毒。
根据本发明的具体实施方案，可以将多种治疗增强因子组合成组合物。在这些实施方案中，每种治疗增强因子的编码序列可以存在于单独的mRNA分子中。在某些实施方案中，一种以上治疗增强因子的序列可以存在于相同mRNA分子上。在这种情况下，多顺反子mRNA分子进一步包括所有编码序列的表达所需的序列，例如内部核糖体进入位点(IRES)。
在将多个不同的mRNA分子包含于一个或多个递送***的实施方案中，设想每个递送***——例如粒子、脂质体、病毒载体***——可以包括一种或多种mRNA分子作为“有效负载”；也就是说，并非每一个特定的实施方案中递送的有效负载都必需包括所述实施方案中提供的所有mRNA分子。以这种方式，还可以使用本文所述的靶向药剂，将不同的递送***及其相关序列直接递送到不同的靶细胞。
本发明的某些实施方案的mRNA构建体可以从例如DNA质粒的多核苷酸表达构建体合成。该表达构建体可以包括启动转录所必需的任何启动子序列和相应的终止序列，以使mRNA构建体的转录发生。这种多核苷酸表达构建体被认为涵盖于本发明的实施方案。
由mRNA编码的基因产物可以是适合产生治疗效果的任何类型。在癌症治疗的情况下，mRNA编码的基因产物可以适当地包括由癌症细胞表达时引起的基因或有助于癌细胞破坏的基因。
本发明的构建体可以提供肿瘤抑制基因，例如p53。p53在包括细胞凋亡和基因组稳定性在内的细胞过程中起作用。它参与了响应基因组损伤的DNA修复过程的活化，并能抑制细胞生长和繁殖。
细胞死亡可以通过许多机制发生，包括程序性细胞死亡或凋亡，这些机制描述了由内在因素介导的控制细胞死亡的过程，这些因素被检测为指示细胞应激。这些术语还包括由外源信号介导的细胞死亡，例如免疫***中的细胞接收到的信号，例如细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞。由于导致细胞凋亡的途径往往被癌细胞抑制以避免细胞死亡，因此这些途径是癌症治疗的一个有前景的靶点。
促进细胞死亡的基因，例如通过凋亡，即所谓的***基因，当其表达时导致细胞激活凋亡过程，也可以由本发明的组合物和构建体提供。癌细胞往往具有这些凋亡相关基因的突变和/或无功能变种，因此不能响应外部信号进行凋亡。***基因治疗也可以指引入允许无毒化合物或前药转化为致死性药物的基因(Duarte等人，Cancer Letters,2012；324(2):160-170)。根据本发明的实施方案，所述基因产物可以选择性地导入患病细胞，例如肿瘤细胞，标记它们，并通过诱导凋亡或递送其他无毒化合物或前药进行破坏。
在本发明的特定实施方案中，所述mRNA可以编码检查点抑制剂，例如抑制剂PD-1受体(CD279)或其配体PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)。一些癌细胞含有大量的PD-L1，这有助于它们逃避T细胞介导的免疫攻击。因此，mRNA可以编码一种蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽与靶器官内患病细胞或肿瘤细胞的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2轴结合或以其他方式干扰其功能。适配蛋白质或多肽可以包括与PD-1受体、PD-L1、PD-L2或配体和受体复合物结合的抗体，其可以为单克隆或多克隆，或其抗原结合片段，或其他抗原结合微蛋白。这种效应也可以通过使用细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)途径的蛋白质或多肽抑制剂，另一种所谓的免疫检查点来观察。已知抑制两种途径中的任何一种或两种途径全部抑制均会导致肿瘤微环境中的免疫应答发生变化，从而对患者的健康有积极效益。此外，通过调节受试者的免疫应答，本发明的组合物可在与其他抗癌治疗方法(例如放射治疗或化疗)联合治疗中显示特殊用途。FDA批准的抗PD-1途径抑制剂包括帕博丽珠单抗和纳武单抗。已知的抗PD-L1抑制剂包括MPDL-3280A、BMS-936559和阿替丽珠单抗。抗CTLA-4治疗抑制剂包括伊匹单抗和替西木单抗。本发明的组合物可以用于通过利用这些细胞的差异miRNA环境，选择性地将所述程序性细胞死亡途径抑制剂或其功能模拟物递送至受试者的靶器官内的患病细胞。可选地，本发明的组合物可以与检查点抑制剂或其他相关抗癌疗法结合使用，以递送可以激活免疫细胞(如IL-12)的蛋白质。
白细胞介素12(IL-12)是一种对包括T细胞和NK细胞在内的免疫细胞具有免疫刺激作用的细胞因子。IL-12是一种由吞噬细胞和抗原呈递细胞特异性产生的异二聚体细胞因子，可增强抗肿瘤免疫应答。IL12的强效免疫刺激特性的一个后果是，全身给药会产生严重的副作用，限制其在患者中的临床应用。工程化NK92在肿瘤部位表达IL-12可以提高嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的抗肿瘤活性(Luo等人，Front Oncol.(2019)Dec 19；9:1448)。据信，IL-12诱导的IFNγ在肿瘤中的积累也促进了CAR-T或其他宿主免疫细胞(例如NK细胞)渗透进入肿瘤，从而增强了治疗效果(Chinnasamy D.等人，Clin Cancer Res2012:18；Chmielewski M.等人，Cancer Res 2011；71；Kerkar SP.等人，J Clin Invest2011；121；Jackson HJ.等人，Nat Rev Clin Oncol 2016；13)。在本发明的实施方案中，本发明的组合物包括mRNA，所述mRNA包括编码功能性IL-12或其类似物或衍生物的ORF中的至少一个。由于野生型IL-12由35kDa IL-12a和40kDa IL-12b亚单位的杂二聚体组成，所述ORF可以包括其中一个亚单位，并与编码其他亚单位的另一个mRNA共同给药，从而使功能性IL-12在细胞中组装。可选地，功能性IL-12可以是修饰后的单链IL-12的形式，包括单个ORF(例如，见SEQ ID No:63)的两个亚单位。
在本发明的一些实施方案中，所述编码mRNA与CAR-T或其他过继细胞治疗结合递送，以提供编码mRNA的瞬时表达。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是一种免疫细胞，通常是T淋巴细胞，经过修饰以表达针对特定细胞类型的受体，所述特定细胞类型包括癌细胞。这种过继性免疫治疗涉及将体外产生的自体抗原特异性T细胞转移到患者身上。“自体”是指T细胞是患者的T细胞。用于过继免疫治疗的T细胞可以通过抗原特异性T细胞的扩增或通过基因工程重新定向T细胞来产生(Park等人，Trends Biotechnol.2011；29(11):550-7)。通过***工程化嵌合抗原受体(CAR)成功地产生了具有新的或改进的特异性的修饰后T细胞。
FDA批准的CAR-T细胞治疗的一个示例是替沙仑赛(Tisagenlecleucel)(品牌名称Kymriah)，这是一种自体免疫细胞治疗，涉及使用患者的T细胞，所述T细胞被基因工程化以高水平表达CD19糖蛋白的嵌合受体。CD19在B细胞表面有特异性和一致性表达，包括大多数淋巴瘤、白血病以及健康的B细胞(Vairy等人，Drug Des Devel Ther.2018；12:3885-98)。
在一些实施方案中，所述工程化T细胞包括特定类别的T细胞，例如γ-δT细胞，这是一种T细胞亚型，可选择性地靶向肿瘤细胞，而不影响健康细胞。CAR已经成功地允许T细胞针对各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原进行重定向(Jena，Dotti等人，见上文)。在某些实施方案中，所述工程化T细胞至少包括自体T细胞群，其中，CAR-T细胞被工程化用于消除内源性α-βT细胞受体(TCR)的表达，以防止移植物抗宿主反应，而不影响CAR依赖性效应或功能。在某些实施方案中，所述工程化T细胞至少包括异体T细胞群。在某些实施方案中，所述工程T细胞至少包括自体T细胞群和异体T细胞群。
在一些实施方案中，T细胞活化导致免疫细胞激活，T细胞释放炎症细胞因子以促进炎症和/或免疫应答。在某些实施方案中，T细胞活化导致细胞毒性活性，T细胞释放细胞毒素以促进癌细胞死亡。在某些实施方案中，T细胞活化导致增殖，T细胞释放白细胞介素以促进细胞发育和***。在某些实施方案中，T细胞活化导致免疫细胞激活、细胞毒性活性和/或增殖中至少两种的组合。
本发明实施方案提供的mRNA组合物有助于提高CAR T细胞的安全性和有效性。例如，由本文描述的mRNA编码的多肽可以用于将特定免疫细胞或诸如CAR T细胞等免疫细胞的修饰亚群募集到肿瘤微环境中。
在一些实施方案中，所述编码mRNA用于提供一个“CAR T靶点”，作为CAR T细胞表达的受体结合的靶点。由于CAR T细胞可以被工程化为向特定靶点表达特定受体，因此也可以使用根据本发明的组合物来诱导这些靶点在靶细胞类型中的表达。由于本发明的实施方案所允许的差异表达，该方法可以允许CAR T细胞仅选择性地靶向那些所提供的mRNA发生表达的细胞，从而减少脱靶效应。
通过这种方法，可以诱导通常不由该细胞类型表达的CAR T受体靶点在靶细胞中的表达，从而使CAR T细胞仅靶向那些成功表达由本发明所述mRNA编码的多肽的细胞。可以选择在受试者体内天然存在的细胞中罕见或缺失的CAR T靶点。例如，当对人类受试者治疗时，从未在人类细胞上发现的天然CAR T靶点，可以完全阻止CAR T细胞靶向那些不表达所提供的mRNA的受试者细胞。
在一些实施方案中，可以修饰、合成和/或工程化所述CAR T靶点，以便被所提供的CAR T细胞有效靶向。类似地，CAR T细胞本身也可以或者可选地可以被设计，以使被其工程化表达的受体被修饰、合成和/或工程化，从而防止其与细胞靶点结合，而不是与本发明实施方案的mRNA编码的靶点结合。以这种方式，还可以设计、修饰或合成在自然界中不存在的CAR T受体和CAR T靶点的独特配对，以防止CAR T细胞影响除表达本发明上述mRNA的细胞以外的任何细胞。
在一些实施方案中，所述编码的mRNA被用来将CAR T细胞吸引到受试者的特定部位。在某些实施方案中，所述编码的mRNA被用来克服免疫细胞向肿瘤微环境的不充分迁移。在对特定趋化因子的应答中，不同的免疫细胞亚群迁移到肿瘤微环境中，并以时空方式调节肿瘤免疫反应。在某些实施方案中，所述编码的mRNA被用来增强CAR T细胞的活化。此外，趋化因子可以直接靶向肿瘤微环境中的非免疫细胞，包括肿瘤细胞和血管内皮细胞，并已被证明可以调节肿瘤细胞增殖、肿瘤样干细胞特性、肿瘤侵袭和转移。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞或树突状细胞，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述编码的mRNA可以用来克服CAR T细胞向肿瘤微环境的不充分迁移，并阻止非靶向CAR T活化。在某些实施方案中，所述mRNA被递送到肿瘤微环境中，所述编码mRNA编码基因产物，所述基因产物吸引或以其他方式募集CAR T细胞到肿瘤微环境中。在某些实施方案中，所述编码mRNA表达趋化因子。通过非限制性示例，一种或多种编码mRNA可以编码一种或多种吸引T细胞的趋化因子，例如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL22、CCL28、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、XCL1及它们的任何组合。在需要反转效应的情况下，例如在自身免疫性疾病中，所述编码mRNA可以表达上述因子的阻断剂、拮抗剂和/或抑制剂。
在一些实施方案中，所述编码mRNA在肿瘤微环境中瞬时表达。在某些实施方案中，所述编码mRNA编码参与调节肿瘤应答中免疫细胞存活、增殖和/或分化的细胞因子或其他基因产物，例如活化的T细胞和NK细胞。通过非限制性示例，所述编码mRNA可以编码细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-33、IL-35、TGF-β、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ及它们的任何组合。同样，在需要反转效应的情况下，如在自身免疫性疾病中，所述编码的mRNA可以表达上述因子的阻断剂、拮抗剂和/或抑制剂。
在一些实施方案中，如本文所述的mRNA递送***将编码基因编辑剂的mRNA递送给靶细胞群。在一些实施方案中，所述mRNA编码基因位点的序列特异性核酸酶，其靶向基因位点并破坏靶细胞群中一个或多个内源性基因产物的表达。在一些实施方案中，所述mRNA编码靶向T细胞受体(TCR)相关基因位点的序列特异性核酸酶，从而破坏TCR中一个或多个结构域的表达。
在一些实施方案中，所述mRNA递送***可用于将编码一个或多个可以程序工程化T细胞的试剂的mRNA递送至所需表型。在一些实施方案中，所述mRNA可以用于诱导具有所需T细胞表型特征的标记物和转录模式。在一些实施方案中，所述mRNA可以用于促进CD26L+中央记忆T细胞(Tcm)的发育，这些细胞已被证明可以提高CAR T细胞的治疗疗效。(Moffett等人，Nature Commun.2017；8(1):389)。
在一些实施方案中，所述mRNA递送***可以用于递送编码血管内皮生长因子(VEGF)成员的mRNA。这种信号蛋白家族是一种促进血管形成的血管生成因子，被用来修复梗死后受损的心肌细胞。
MicroRNA(miRNA)是一类非编码RNA，每种约含有20-25个核苷酸，其中一些被认为参与了基因表达的转录后调控，其通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)的互补靶序列结合使之沉默。这些互补的miRNA靶序列在这里也被称为miRNA结合位点或miRNA结合位点序列。某些miRNA的表达具有高度的组织特异性；例如，miR-122及其变体在肝脏中含量丰富，在其他组织中很少表达(Lagos-Quintana等人，Current Biology.2002；12:735-739)。
因此，miRNA***提供了一个强大的平台，通过这个平台，导入细胞的核酸可以在靶组织的选定细胞类型中沉默，并在其他细胞中表达。通过将靶序列导入特定的给定miRNA形成mRNA构建体，并将mRNA构建体导入靶细胞，特别是在UTR中，某些导入基因的表达可以在某些细胞类型中减少或实质上消除，而在其他细胞类型中仍然存在(Brown andNaldini,Nat Rev Genet.2009；10(8):578–585)。
根据本发明的具体实施方案，设想多个这种miRNA靶序列包含于器官保护序列中，然后将其包含在mRNA构建体中。如果存在多个miRNA靶序列，则所述多个可以包括例如大于2个、大于3个、通常大于4个miRNA靶序列。这些miRNA靶序列可以在mRNA构建体中指定的UTR内顺序排列串联或在预定位置排列。多个miRNA靶序列可以与辅助序列分离，所述辅助序列用于支持或促进整个器官保护序列的功能。例如，适当的辅助序列可以由接头(linker)或间隔(spacer)序列组成，所述linker或spacer序列可以是随机的，或者可以包括特定序列，例如“uuuaaa”，尽管也可以使用其他spacer序列。spacer的长度是可变的，并且可以包括spacer序列的重复，例如，spacer“uuuaaa”可以在每个spacer到待连接的靶序列之间重复一次(即“uuuaaa”)、两次(即“uuuaaauuuaaa”–SEQ ID NO:1)、三次、四次、五次，或六次。在一些实施方案中，结合位点序列之间可能不存在spacer序列。
尽管miRNA-122在健康的未患病肝组织中广泛存在，但在大多数肝癌和患病细胞中都会减少(Braconi等人，Semin Oncol.2011；38(6):752-763,Brown and Naldini,NatRev Genet.2009；10(8):578-585)。通过上述方法，我们发现当靶组织为肝脏时，导入的mRNA序列可以通过将miRNA-122靶序列(例如SEQ ID NO:1)包含在其3’UTR中促进其在癌细胞中的翻译，并在转染的健康细胞中减少或实质上消除其翻译。
同样的，通过使用其他miRNA靶序列，这种mRNA也可以在其他器官的癌细胞和健康细胞之间进行差异翻译。合适的候选物包括(但不限于)以下靶位点：miRNA-1、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、miRNA-Let7、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-143,miRNA-145、miRNA-148、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215和miRNA-30a、b、c。表2示出了已经证实差异表达的miRNA序列的进一步(非限制)示例。
miRNA-1、miR-133a和miR-206被描述为肌肉和/或心肌特异性miRNA的示例(Sempere等人，Genome Biology.2004；5:R13；Ludwig et al.Nucleic AcidsResearch.2016；44(8):3865-3877)。miRNA-1也被证明在疾病中是失调的，例如，在梗死的心脏组织中检测到miRNA-1的下调(Bostjancic E等人，Cardiology.2010；115(3)：163-169)，而在横纹肌肉瘤细胞系中也检测到miRNA-1的急剧减少(Rao,Prakash K等人，FASEBJ.2010；24(9):3427-3437)。当肌肉内施用本发明的组合物，可以特别考虑应用miRNA-1、miR-133a和miR-206，以便在需要时减少其在局部正常心肌细胞中的表达。
miRNA-125在多种实体瘤中下调，如肝细胞癌(Coppola等人，Oncotarget 2017；8)；乳腺癌(Mattie等人，Mol Cancer 2006；5)、肺癌(Wang等人，FEBS J 2009)、卵巢癌(Lee等人，Oncotarget 2016；7)、胃癌(Xu等人，Mol Med Rep 2014；10)、结肠癌(Tong等人，Biomed Pharmacother 2015；75)和***(Fan等人，Oncotarget 2015；6)；神经母细胞瘤、髓母细胞瘤(Ferretti等，Int J Cancer 2009；124)、胶质母细胞瘤(Cortez等，GenesChromosomes Cancer 2010；49)和视网膜母细胞瘤(Zhang等，Cell signal 2016；28)。
与未患病脑细胞(如神经元)相比，胶质母细胞瘤多形性细胞(Zhang H等人，JMiol Med 2009；87；Shi等人，Brain Res 2008；1236)中几种miRNA类别也差异表达，miRNA-124a是失调最严重的细胞之一(Karsy等人，Gene Cancer 2012；3；Riddick等人，Nat RevNeurol 2011；7；Gaur等人，Cancer Res 2007；67；Silber等人，BMC Med 2008；6)。
在肺癌中，最近的Meta分析证实了非小细胞肺癌中Let-7(以及miRNA-148a和miRNA-148b)的下调(Lamichhane等人，Disease Markers 2018)。
同样，与健康胰腺细胞相比，胰腺癌细胞中发现miRNA-375表达下调(Shiduo等人，Biomedical Reports 2013；1)。在胰腺中，miRNA-375的表达在正常胰腺细胞中高，但在患病组织和/或癌组织中显著降低(Song，Zhou等人，2013)。这种表达已被证明与癌症分期有关，随着晚期癌症的发展，这种表达进一步降低。miRNA-375被认为通过靶向3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)mRNA，而影响PI 3-激酶/PKB级联反应，参与调节葡萄糖诱导的胰腺β细胞生物响应(El Ouamari等人，Diabetes 57:2708–2717,2008)。这种假定的作用模式涉及miRNA-375的抗增殖作用，这可能解释了miRNA-375在癌细胞中的下调。
在所导入的多核苷酸的疾病特异性表达的情况下，在特定疾病中被破坏的任何miRNA序列的靶序列，即与未患病细胞相比，在疾病细胞(如肿瘤细胞)中被上调或下调的任何miRNA序列，被认为适用于本发明。表2进一步讨论了可用于本发明实施方案的在肿瘤中相对于健康组织差异调节的肿瘤miRNA的非限制性示例。然而，应当理解的是，本发明不仅限于在给定的器官或器官***中第一细胞类型相对于第二细胞类型中给定的miRNA或一类miRNA进行下调的情况。相反，只需要在第一和第二细胞类型之间存在调节性miRNA的差异表达模式，例如器官或器官***中的miRNA。可以使用本文所述的组合物和方法来实现miRNA的差异表达，以使蛋白质产物在这些细胞中进行相应的差异翻译。
已发现健康和癌症细胞之间类似差异miRNA表达证据的癌症示例包括乳腺癌(Nygaard等人，BMC Med Genomics,2009Jun 9；2:35)、卵巢癌(Wyman等人，PloS One,2009；4(4):e5311)、***癌(Watahiki等人，PLoS One，2011；6(9):e24950)和***(Lui等人，Cancer Research,2007Jul 1；67(13):6031-43)。WO 2017/132552 A1描述了多种miRNA在不同癌细胞中具有不同表达水平。在皮肤中，还观察到健康组织和邻近黑色素瘤细胞之间miRNA的差异表达。
表2
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使用溶瘤病毒或CAR T等免疫疗法治疗患者可能会因为产生脱靶效应而具有安全性问题。即使通过提供编码mRNA序列来表达某些多肽，也可能对某些器官产生负面影响。因此，保护健康组织，如肝、脑、***、肺、胰腺、结肠/胃肠道、皮肤、肌肉和肾，是成功用于临床的关键。例如，在特定组织中高表达的特定miRNA的靶序列可以用于保护健康细胞，例如miR-1、miR-133a和/或miR-206，以保护健康肌肉和/或心肌组织。因此，可能需要使用与疾病和健康细胞中差异表达无关的miRNA靶序列。例如，miRNA-142和miRNA-145在胰腺组织中有表达，而miR-9在这些组织中的高表达可以用于脑和肺保护。
如果要保护多个组织，则使用多个miRNA靶序列的组合。例如，miR-122、miR-203a、miR-1和miR-30a的靶序列一起用于保护肝、皮肤、肌肉和肾组织的细胞。
因此，本发明的组合物可以代表用于增强和促进迄今为止的“实验性”细胞或病毒疗法的成功采用的有利技术平台。
从本公开中可以明显看出，本发明被预期涉及治疗、递送平台(例如不同的纳米粒子组合物)、治疗剂(例如药物、CAR T细胞或病毒)、编码多肽和靶细胞、组织或器官的许多可能组合。每个或全部所有这些可能性都对mRNA序列提供的编码多肽的最佳表达有影响。
研究发现，优化miRNA靶序列的一个或多个特征可以在促进差异表达和保护健康器官方面发挥特别有效的作用。同样，可以根据具体情况控制这些特征来增加或减少特定器官、组织或细胞类型中产生的差异表达。在某些情况下，在不同的细胞类型中需要不同的表达水平，其目的是通过改变本文所述的一个或多个特征来修饰靶序列，以实现这种结果。此外，可以修饰miRNA靶位点序列，使其受同一组织或不同组织中多个miRNA的调控。
序列匹配：靶序列与互补miRNA序列精确匹配的程度(即miRNA序列与结合位点序列错配的数量)已被证明会影响最终表达沉默的有效性。例如，已经显示出精确或完美的匹配，导致具有miRNA结合位点序列的序列更快地降解(Brown and Naldini，NAT RevGenet.2009；10(8)：578-585。因此，如果某一特定细胞类型需要某一特定多肽产物的完全或接近完全沉默，则可能希望选择一个具有与此细胞类型相关的miRNA序列的精确匹配或最多不超过一个碱基对错配的miRNA靶序列。同样，如果在特定细胞类型中需要减少但不使表达缺失，则可以选择具有增加的错配数量的miRNA结合位点序列来实现。本文所述的几个miRNA序列的示例，包括具有最终加工成熟体5P或3P miRNA的茎环前体miRNA序列，与前述加下划线的miRNA中成熟miRNA形成的双重(duplex)序列，以及成熟miRNA序列和duplex序列形成的序列本身，如表3所示。在细胞中表达显著的成熟miRNA(可以是5P和3P链中的一个或两个)被标记为(*)。表4示出了在前体miRNA中形成双重序列的初始、不完全匹配的靶序列，然后是成熟的miRNA序列和修饰后的互补靶序列的开发，所述修饰后的互补靶序列旨在与过度表达的成熟miRNA序列完美匹配。常规5'至3'方向中修饰的靶序列以粗体显示。
表3.通过测试5P与3P成熟体结合序列以优化miRNA靶序列(来自RNA-Seq数据库的*过表达成熟miRNA，http://www.mirbase.org)。
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表4.通过修饰核苷酸序列来优化miRNA靶序列，以获得与miRNA的完美匹配(来自RNA-Seq数据库的*过表达成熟miRNA http://www.mirbase.org)。
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众所周知，可以发现miRNA序列的变体和其多态性，miRNA家族也存在类似的特性。在本发明中，期望在适当的情况下可以使用特定miRNA序列和相关结合位点的所有合适的变体和家族成员。另一方面，显然密切相关的miRNA序列可以具有不同的表达谱(Sun等人，World J Gastroenterol.,2017Nov 28)，因此在某些情况下，有必要参考文献确定特定的替代是否合适。例如，let-7是一个具有许多相关变体的大家族的一员，这些变体可以被表示为let-7a到let-7k等等。如上所述，这些变体和多态性在允许miRNA介导的沉默方面的有效性可能有所不同，因此可以进行特定的选择，以允许在特定细胞类型中达到所需的沉默水平。
mRNA构建体中存在多个miRNA靶序列，能够提高所提供多肽或多肽们的差异表达的疗效。在不受理论束缚的情况下，人们认为随着靶点数量的增加，miRNA抑制翻译的可能性增加。多个miRNA靶点可以包括基本相同的靶序列的多个拷贝，从而引入冗余。可选地或另外地，多个靶序列可以包括基本不同的序列，从而使mRNA构建体能够被多个类别miRNA靶向。以这种方式，从上述器官及其相关的特异性miRNA表达的讨论中可以看出，所提供的mRNA构建体的差异表达可以在多个细胞类型和/或多个器官中实现。两种方法被认为在同一序列或多个序列中都是可能的。还设想了一种中间方法，其中包括靶点，这些靶点旨在靶向同一miRNA序列，但存在差异，以便将同一家族的不同miRNA变体结合起来，例如Let7。
与使用多个靶位点相关的一些优点包括提高由本发明的mRNA序列提供的多肽在单个器官内的差异表达效果。使用不同的结合位点序列，或适用于多个组织或器官类型的序列，可以在多个组织或器官的不同细胞类型中实现差异表达。使用根据本发明的组合物全身给药可能是可取的，并且对于避免在一个以上的器官中产生脱靶效应是必需的。
即使在局部或靶向给药的情况下，所提供的mRNA构建体也有可能在器官、组织和/或细胞中相遇或积聚，这种相遇或积聚是不期望的。特别是，由于这些器官的生理功能，肝和脾组织可能积累给药组合物。在这些情况下，为了避免脱靶效应，所提供的构建体包含可以降低在这些组织中表达的miRNA靶序列是有利的。相反，在一些器官、组织和/或细胞类型中促进表达而在其他器官、组织和/或细胞类型中不促进可能是可取的，这可以通过相应地miRNA靶序列选择来实现。
miRNA靶位点的特定组合可能与靶器官的特定组合有关，这可能在不同的情况下特别有效。例如，施用的组合物可在肝和脾脏中积累，因此使用与这些器官相关的miRNA靶序列可对可能与组合物接触的健康细胞提供定向保护。例如，结合位点序列可以为miRNA-122和miRNA-142中的每一个或肝和脾相关miRNA序列的任何其他组合提供一个或多个靶点，例如表2中为这些器官列出的miRNA的任意组合。此类组合可以包括，例如，选自miRNA-122、miRNA-125和miRNA-199(肝)的至少一个靶点的至少一个拷贝；选自miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215和miRNA-30a、b、c(肾)中的至少一个结合位点序列的至少一个拷贝；和miRNA-142(脾)结合位点的至少一个拷贝。
这种方法对于递送某些种类的纳米粒子尤其有利。例如，基于脂质体的纳米粒子可能会在肝、肾和脾中积聚。其他纳米粒子类型或可选的给药方法可以在不同的器官或组织中积累，或者组合物的靶向性可能导致特定器官或组织特别需要调控表达。例如，肌肉内给药可能导致肌肉组织中的积累，皮下给药可能导致皮肤组织中的积累，对这些细胞类型有保护作用。因此，可以选择包括miRNA结合位点序列的通用的、可能更长序列，这些序列提供广泛的保护，防止在多个器官中意外表达，或者选择特定的miRNA结合位点序列，以便在特定情况下允许在一个或多个器官中进行特定保护，这可能允许短序列和/或包括重复的结合位点序列(见下文)。以这种方式，可以在递送模式方面优化递送的mRNA序列(反之亦然)。
在某些情况下，用于器官保护序列的miRNA靶序列可能与待治疗的组织或器官无关，也可能不会被设计为导致所述组织和器官中健康和疾病细胞之间的差异表达。相反，可以选择miRNA结合序列来防止非治疗器官中的脱靶效应。例如，根据本发明的组合物和方法可以被设计以用于治疗皮肤，例如用于治疗黑色素瘤。所述组合物应用于皮肤可以是局部的，也可以是肿瘤内的(IT)，例如通过直接注射到肿瘤中或通过血液供应直接进入肿瘤。然而，在这种情况下，所述组合物可以通过血流、淋巴***吸收，或通过这些手段或其他方式接触和/或积聚在皮肤以外的器官中，例如肝、肾和/或脾。在这种情况下，可以选择miRNA靶序列来适应不期望的生物分布，并阻止所述编码的mRNA在这些非靶器官中的表达。例如，可以选择使用与肝、肾和脾相关的miRNA靶序列，从而阻止miRNA在这些器官内的健康细胞中表达。可以被允许的miRNA靶序列的潜在组合示例如上所述。
人们还设想，由于miRNA介导的沉默的发生不需要在结合位点序列和miRNA序列之间进行完美匹配，而且由于一些miRNA序列(特别是存在于相似细胞类型中的序列)具有相当大的相似性，因此序列可以被设计，以提供不止一个miRNA序列的靶点。例如，miR-122和miR-199具有相似的结合位点序列，并且可以通过例如稍微修饰miR-122结合位点序列来设计对两个miRNA互补的序列，并将其作为miRNA靶序列。以这种方式，miR-122和miR-199都可以与这种序列结合，增加miRNA的降解。类似地，let-7miRNA的靶序列可以作为let-7家族其他成员的靶序列。不同miRNA的结合位点序列可以与任何合适的比对技术比对，并对共享核苷酸进行比较，其中可以设计包括共享核苷酸的结合位点序列。
在本发明的特定实施方案中，在mRNA中特定靶序列的重复次数可能影响由结合位点序列介导的沉默的有效性。例如，miRNA靶点的重复次数的增加可以增加相关miRNA与之结合的可能性，从而增加翻译发生前抑制或降解的可能性。因此，如果在特定细胞类型中需要更完整的miRNA介导的沉默，则可以使用这些细胞中表达的miRNA的适当靶序列的更多重复。同样，减少但不是缺失的表达可以通过包含较少的结合位点序列，采用或不采用本文讨论的任何其他方法来实现。因此，可以在mRNA中提供相同的结合位点序列一次、两次、三次、四次、五次或更多次，并且可以单独提供或与其他miRNA的靶点序列组合提供。
根据某些实施方案，所述mRNA序列中包含的miRNA靶位点的顺序可能会影响器官的保护效力。例如，miRNA-122、let 7b、miRNA-375、miRNA-192、miRNA-142(存在于肝、肺、***、胰腺、肾和脾细胞中)的靶序列可按此顺序或以许多其他排列呈现，例如：
miRNA-122–miRNA-375–let 7–miRNA-192–miRNA-142；
miRNA-122–miRNA-375–let 7–miRNA-142–miRNA-192；或
miRNA-122-let 7–miRNA-375–miRNA-142–miRNA-192。
作为另一个示例，miRNA-122、let 7a、miRNA-142、miRNA-30a、miRNA-143(存在于肝、肺/结肠、脾/造血细胞、肾和结肠细胞中)的靶序列可以以这种顺序或许多其他排列呈现，例如：
miRNA-122-LET7A-miRNA-142-miRNA-30a-miRNA-143；
miRNA-122-miRNA-142-LET7A-miRNA-143-miRNA-30a；或
miRNA-122-miRNA-30a-LET7A-miRNA-143-miRNA-142
在下文更详细描述的本发明的具体实施方案中，miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a(存在于肝、结肠和肾中)的靶序列可以以多种组合呈现，例如：
miRNA-122-miRNA-192-miRNA-30a；
miRNA-122-miRNA-30a-miRNA-192；或
miRNA-192-miRNA-122-miRNA-30a
在下文更详细描述的本发明的进一步实施方案中，Let7b、miRNA-126和miRNA-30a(存在于肝、结肠、脾、肺和肾中)的靶序列可以以多种组合呈现，例如：
Let7b–miRNA-126–miRNA-30a；
Let7b–miRNA-30a–miRNA-126；或
miRNA-126–Let7b–miRNA-30a
如本文所述，这些组合可用于保护被设计用于治疗某些癌症的组合物施用而受影响的组织。
作为进一步的示例，miRNA-122、miRNA-203a、miRNA-1、miRNA-30a(存在于肝、皮肤、肌肉/心肌和肾中)的靶序列可以以该顺序或以许多其他排列来呈现，例如：
miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a；
miRNA-122-miRNA-1-miRNA-203a-miRNA-30a；或
miRNA-122-miRNA-30a-miRNA-1-miRNA-203a
这种组合可以用于保护旨在诱导免疫应答的组合物的施用而受影响的组织，如下关于疫苗和类似方法部分所述。
因此，本发明允许选择与mRNA所递送的编码序列可调谐的不同途径，以及细胞类型。换言之，本发明允许的差异表达式是“可配置的”，以允许需要的任何水的表达或减少的表达。
例如，本发明的组合物可与溶瘤病毒结合使用，以靶向癌细胞引入毒性因子，增加这些细胞内的病毒活性和溶解，同时使用本发明可能提供的差异表达来阻止这些因子在健康细胞中的表达。在这种情况下，本发明所述的组合物和溶瘤病毒可以接触特定的细胞、器官和组织，这些细胞、器官和组织可以是相同的或不同的，例如，取决于每种组合物和病毒的性质、给药方式以及所用的任何靶向机制。可以理解，只有在组合物和病毒预期一致的健康细胞中，才有必要减少毒性因子的表达。本发明所述的mRNA到达并在其中表达，但溶瘤病毒无法到达的细胞、器官或组织可能不太需要减少表达。因此，可以使用上述一种或多种方法来选择和改变miRNA靶序列，以允许mRNA产物在靶癌细胞中充分表达，并在与组合物和病毒接触的健康细胞中，尽可能减少本发明所述的mRNA的表达，而对其他器官的miRNA序列不优先包括在内。
例如，用于治疗胶质母细胞瘤的oHSV可以与编码毒力因子并携带miR-124a靶序列的mRNA结合，以使毒力因子在健康脑中不表达，并且所述病毒只能在表达毒力因子的部位复制，即在脑肿瘤中。在另一个涉及oVV和肝的示例中，mRNA构建体会导致毒性因子的表达，但所述构建体携带miR-122或miR-199，因此所述蛋白在健康组织中不表达，仅将mRNA的作用限制在肿瘤细胞。
在另一个实施方案中，所递送的mRNA可能编码免疫刺激或抗免疫抑制蛋白，或者以另一种方式诱导免疫应答。在这种情况下，可能需要在靶患病细胞中最大限度地表达编码产物，也需要在靶器官周围健康组织中减少但仍存在表达。另一方面，可能需要完全避免在某些组织(如大脑或其他神经组织)中表达此类免疫刺激产物，和/或在组合物可能积聚的细胞、组织和器官中减少表达，以防止脱靶应答和可能的全身反应。因此，在一个示例中，所述miRNA靶序列可以通过上述一种或多种方法来确定，以允许其在靶患病细胞中完全表达，在靶器官的健康细胞中的表达部分减少，而在神经组织和积聚部位的表达完全减少。
在一些实施方案中，可以在单个组合物中提供多个不同的mRNA序列。这些不同的序列可以编码不同的多肽和/或不同的miRNA靶位点。以这种方式，单个组合物可以允许表达多种不同的多肽。通过在单独的mRNA序列中使用不同的miRNA靶序列组合，不同的细胞类型或靶器官可以根据所需的目的表达某些多肽或阻止某些多肽的表达。例如，如果肝和脑中的健康细胞必须受到多肽“A”的表达的保护，但其目的是在健康脑而不是肝中表达多肽“B”，则第一mRNA序列可以包括“A”的序列，其具有针对miRNA-122、miRNA-125a、miRNA-124a的靶位点，而第二mRNA序列可以包括“B”的序列，其具有miRNA-122和miRNA-125a的结合位点。
可以理解，本领域技术人员能够将miRNA靶位点、多肽序列和多个mRNA序列的组合进行设计，以实现在给定器官和细胞类型中表达的任何组合。上文和表2中讨论了与这些序列相关的相关器官和组织类型。图1示出了根据本发明的一些实施方案的mRNA构建体的示意图。ORF以起始密码子为先导，以终止密码子为终止，并且在3'UTR中存在一系列多达五个或更多个结合位点序列。如图1所示，定义OPS的miRNA靶点(BS1到BS5)可以用spacer分离，或者优选不使用spacer。所述ORF可以编码如本文所述的多肽。在任何一种实施方案中，均可预期终止密码子的可变性，则所述ORF和所述结合位点序列之间可能没有终止密码子。
本发明提供的mRNA序列的UTR可被选择与在靶器官内的一个细胞类型中表达的部分或全部UTR序列具有相似性，例如，大于90％的相似性。特定的细胞类型可以具有表达上调或下调的基因，所述UTR序列可以介导这种调节，例如通过促进相关mRNA序列的稳定性或降解来介导。
例如，与已知在癌症细胞中上调的基因相关的UTR可能具有一个或多个特征，例如miRNA结合位点序列，促进了所述UTR在这些癌症细胞中的稳定性和翻译。通过将类似序列整合到所提供的mRNA序列中，可以提高其在癌细胞的稳定性和翻译能力，但不能提高在非癌细胞或健康细胞中的稳定性和翻译能力。
本发明治疗的癌症可以是靶组织中的继发性癌症，即靶组织以外的癌症转移。例如，肝转移可能起源于食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、乳癌、肾癌、皮肤癌、胰腺癌或肺癌，可能是腺癌或其他类型的癌症。在这些情况下，可能需要选择替代的miRNA序列，以便在健康、非癌和/或癌细胞中提供差异表达。事实上，由于转移细胞的组织来源不同，在这种情况下，候选miRNA序列的选择可能会增加。
在某些情况下，可能存在一个以上的miRNA序列候选，所述miRNA序列在靶组织的不同细胞类型中表现出差异表达。在这种情况下，将多个miRNA靶序列包含在mRNA构建体中可能是有利的，并且这些序列可以是实质上不同的序列。然而，还设想多个miRNA靶序列的每一个可以是基本相同的序列。
联合疗法
***毒：溶瘤病毒
如上所述，溶瘤病毒治疗是使用***毒感染和杀死癌细胞的过程，有时通过直接病毒溶解，但也包括通过刺激宿主抗肿瘤应答间接杀死。虽然溶瘤病毒的特征通常是与健康细胞相比，在癌症细胞中的活性增加，但已记载了其损伤健康细胞引起脱靶效应(Russell等人，Nat.Biotechnol.2012；30(7)：658-670)。
为了提高安全性和降低脱靶效应，可以修饰或筛选溶瘤病毒以降低其毒性，例如通过缺失参与细胞内免疫***抑制和逃避、病毒基因组复制或转录以及宿主细胞过程接管等功能的毒性因子或基因。历史生产用于疫苗接种的安全形式的活病毒是病毒减毒的另一个来源。在其他情况下，人们发现特定的突变甚至额外的基因可以增强特定溶瘤病毒的溶瘤活性。常见于溶瘤病毒中添加、突变或缺失的毒性基因的非穷举示例见表5。
表5
以这种方式减毒或修饰溶瘤病毒可以在溶瘤病毒对癌细胞的选择性中起作用：由于致癌过程通常涉及对癌症和病毒感染起保护作用的基因的失活(例如通过调节细胞***或凋亡)，如前所述减毒的溶瘤病毒可以保留其在癌细胞中的毒力，因为这些细胞中缺乏通常的抗病毒基因。因此，在健康细胞中，所述减毒病毒不能抵抗正常的抗病毒反应，并且被消除，而在癌症细胞中，这种反应缺失，病毒可以溶解细胞。然而，这种方法很少完全有效，因为癌症细胞抗病毒反应的部分失活比完全缺乏抗病毒活性更为常见(Haralambieva等人，Mol.Ther.,2007；15(3):588-597)，这意味着溶瘤病毒在这些细胞的毒力仍然被降低，健康细胞的二次感染仍然可能发生。
同样，由于病毒通常利用宿主细胞的细胞机制来复制其基因组，但这种机制通常在不复制自身基因组的健康、静息、不能复制细胞中下调，因此许多病毒都有补偿宿主机制的基因。例如，核糖核苷酸还原酶是从核糖核苷酸生产脱氧核糖核苷酸所必需的；这些酶通常在静息的宿主细胞中被下调，一些病毒具有这种酶的基因，以获得脱氧核糖核苷酸的来源。由于复制癌细胞可以上调这些酶的表达上调，带有自身核糖核苷酸还原酶基因缺失的减毒溶瘤病毒仍然可以复制到癌细胞中。然而，由于上述类似的原因，这种方法在保护健康细胞免受感染或恢复癌细胞毒性方面可能并不完全有效。例如，并非肿瘤中的所有细胞都在任何给定的时间内复制，因此，在大多数癌症细胞中，可能无法获得足够的脱氧核糖核苷酸用于病毒复制。
在此之后，当将根据本发明所述的组合物或方法与溶瘤病毒治疗联合使用时，由本发明所述的构建体提供的治疗增强因子可以是提高溶瘤病毒在癌细胞中疗效的因子，例如，增强病毒的复制，或增强病毒溶解其驻留的细胞的能力。特别是，如果溶瘤病毒已被修饰以减弱其功能，例如通过缺失一个或多个用于毒性因子的基因，则治疗因子可以用基因产物的mRNA代替缺失的基因，所述基因产物是病毒基因产物的拷贝，或与缺失的基因具有大体上同源性的基因产物，或以其他方式补偿基因的缺失。在这种情况下，通过本发明可能在健康细胞和癌细胞中的差异表达，替代基因产物只能在癌细胞中表达以增强这些细胞中的病毒活性并溶解这些细胞，而不能在健康细胞中表达，其中所提供的mRNA的表达受到miRNA靶点的存在的抑制。
类似地，与健康细胞相比，编码增强细胞对溶瘤病毒耐药性因子的mRNA可以在健康细胞中优先表达，从而促进癌细胞的病毒活性。
这种方法的优点是，与以前使用溶瘤病毒的治疗方法不同，它不依赖于可以因致癌而失活的某些细胞抗病毒基因和过程，也不依赖于在某些癌细胞所激活而在其他癌细胞中未被激活的细胞复制过程。因此，允许从溶瘤病毒中缺失的毒性基因的范围更广。因此，可以对溶瘤病毒进行修饰，使其在健康细胞中完全缺乏复制能力，并且，在癌症细胞中，被缺失的毒力基因的功能被本发明的方法所替代，病毒可以恢复到完全的效力。因此，可以减少副作用，提高疗效。类似地，由于所提供的mRNA的差异表达依赖于癌细胞和健康细胞之间的miRNA表达差异，因此所有转染的癌细胞都可以恢复毒性，而不仅仅是那些在给药时正在复制的细胞。
在特定的实施方案中，溶瘤病毒是HSV-1，疱疹病毒家族的一部分。HSV的减毒版本可以被工程化或筛选为ICP6缺失，所述ICP6编码病毒核糖核苷酸还原酶(Aghi等人，Oncogene.2008；27(30):4249-4254)，和/或被工程化或筛选为US3缺失，所述US3编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并在病毒生命周期中发挥多种作用，包括阻断宿主细胞凋亡(Kasuya等人，Cancer Gene Therapy,2007；14(6):533-542)。
在另一种实施方案中，所述溶瘤病毒是痘疮病毒家族的一员。特别地，可以是痘苗(Vaccinia)病毒。痘苗病毒的减毒版本可以被工程化或筛选为缺失一个或多个核糖核苷酸还原酶亚基(RR1和RR2)和/或胸腺嘧啶激酶(TK)(Buller等人，Nature(London)1985；(317):813-815；Puhlmann M等人，Cancer Gene Ther 2000；7(1):66-73；Slabaugh MB等人，J Virol 1984；52(2):507-514)。
一种可用于溶瘤病毒的替代方法或另外的方法涉及提供病毒进入受体。为了使病毒完成生命周期，它们或至少它们的基因组必须进入宿主细胞。这种进入被认为需要将存在于病毒衣壳或病毒包膜(如有)上的一个或多个病毒蛋白结合到靶宿主细胞表面的一个或多个病毒进入受体上。随后病毒进入细胞，如通过膜融合、内吞或基因注射。病毒蛋白和病毒进入受体之间的结合只能使病毒接近细胞，和/或更直接地介导病毒进入。病毒进入受体通常用于表达它们的细胞，通常与细胞粘附有关。病毒上的病毒蛋白和其所连接的病毒进入受体通常控制它有能力感染的细胞。
在本文背景下，根据本发明的组合物可用于提供mRNA到靶细胞，使得这些细胞产生特定的病毒进入受体。然后所述细胞可以在细胞表面呈现这些病毒进入受体。这可以使病毒与这些受体结合，进入细胞，并在细胞内复制和/或溶解细胞。通过本发明所应用的差异表达，这些病毒进入受体的表达可限于特定细胞、组织和/或器官类型(例如特定组织内的患病细胞)，而其他细胞、组织和/或器官类型(例如健康细胞或脱靶器官)可以通过阻止它们表达病毒进入受体来被保护。
例如，单纯疱疹病毒(HSV)被认为是通过其病毒包膜糖蛋白C(gC)和糖蛋白B(gB)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的初始相互作用进入靶细胞(Agelidis和Shukla，FutureVirol.2015October 1；10(10):1145–1154.doi:10.2217/fvl.15.85)。随后，糖蛋白D(gD)与三个已知的主要病毒进入受体中的一个或多个结合，所述三个已知的主要病毒进入受体为疱疹病毒进入介质(HVEM)、3-O-硫酸乙酰硫酸肝素(3-OS HS)或Nectin-1(HSV-2也可以结合Nectin-2)。这种结合驱动包含其他糖蛋白gB、gH和gL在内的融合复合物的募集，最终使病毒包膜与细胞质膜融合。因此，在一些实施方案中，本发明所述的mRNA可以编码gD的病毒进入受体，例如选自HVEM或Nectin(如Nectin-1或Nectin-2)中的一个或多个。除通过含硫酸乙酰肝素的蛋白质外，还发现了与gB结合的受体，如成对免疫球蛋白样受体(PILRα)，一种在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上发现的抑制性受体，髓鞘相关糖蛋白(MAG)和非肌肉型肌球蛋白重链(NMHC)-IIA(Agelidis和Shukla)。因此，在一些实施方案中，本发明所述的mRNA可以编码gB的病毒进入受体，例如选自PILRα、NMHC-IIA和MAG中的一种或多种。
痘苗病毒是痘病毒的原型，它有两种主要的感染形式：成熟病毒(MV)，它有一个单一的膜，和胞外包膜病毒(EV)，它有一个额外的外膜，在融合前被破坏。疫苗MV可以在中性pH下进入细胞质膜或在低pH下通过内吞途径进入细胞，EV将其外膜覆盖在细胞表面，使MV样粒子在巨胞饮后与细胞质膜或内质膜融合。然后，MV疫苗通过四种病毒蛋白的相互作用与宿主细胞相连：病毒蛋白D8、A27和H3结合细胞氨基葡聚糖，如硫酸乙酰肝素和软骨素，病毒蛋白A26结合细胞表面细胞外基质蛋白层粘连蛋白(Moss，Viruses.2012；4(5):688-707；Chiu等人，JVirol.2007；81(5):2149-2157)。在一些实施方案中，本发明所述的mRNA可以编码细胞外层粘连蛋白以促进病毒附着。
通过该方法，可以诱导在该细胞类型不常表达或通常不过度表达的病毒进入受体在靶细胞中表达，从而仅允许感染成功表达由本发明所述mRNA编码的多肽的细胞。这可以降低病毒感染非靶细胞的风险。因此，为了感染细胞，可以选择所需病毒进入受体的病毒，所述病毒进入受体相对于受试者体内天然存在的健康细胞中的病毒进入受体较少或不存在。例如，当治疗人类时，病毒可能需要病毒进入受体，所述病毒进入受体从未在人类细胞上发现，因此可以完全阻止病毒进入不表达所提供的mRNA的细胞。
此外，所述编码的病毒进入受体可以被修饰、合成和/或工程化，以使其有效地与所提供病毒结合。类似地，病毒本身也可以或可选地被设计成以使与病毒进入受体结合的病毒蛋白被修饰、合成和/或工程化，以阻止其与除由本发明的mRNA编码的病毒进入受体以外的病毒进入受体结合。以这种方式，还可以设计、修饰或合成一对独特的在自然界中不存在的病毒蛋白和病毒进入受体，以阻止病毒感染除表达本发明mRNA的细胞以外的任何细胞。
在本发明的进一步实施方案中，如本文所定义的核酸构建体内的ORF可以编码降低宿主抗病毒应答的蛋白质。在治疗性溶瘤病毒被宿主免疫应答抑制或消除的情况下，这可能是有益的。在一个实施方案中，所述ORF表达B18R蛋白(保藏号YP 233081)。所述B18R基因是一种疫苗病毒基因，编码一种阻断干扰素α跨膜信号的I型干扰素结合蛋白。因此，B18R在患病细胞或癌细胞中表达，而在健康的原代细胞中不表达，可能有助于共同给药的溶瘤病毒的持续和复制。
细胞因子
本文所述的组合物和方法被认为可作用于诱导针对疾病或病原体感染的免疫应答。特别地，可以诱导针对癌细胞的免疫应答。癌变过程通常涉及癌细胞试图逃逸免疫***的方式，涉及到这些细胞产生和呈现的抗原的变化。
在一些实施方案中，本发明提供的mRNA包括至少一个多核苷酸，所述多核苷酸编码一种蛋白质，所述蛋白质是双特异性T细胞衔接器(BiTE)、抗免疫抑制蛋白或免疫原性抗原。本文使用的术语“抗免疫抑制蛋白”是一种抑制免疫抑制途径的蛋白质。
本发明包括提供编码抗免疫抑制蛋白的mRNA的组合物，所述抗免疫抑制蛋白是抗调节T细胞(TreG)蛋白或抗髓源性抑制细胞(MDSC)蛋白。在某些实施方案中，所述抗免疫抑制蛋白是VHH衍生的阻断剂或VHH衍生的BiTE。
本文所用术语“免疫原性抗原”是指增加炎症或免疫原性免疫应答的蛋白质。在特定实施方案中，抗免疫抑制和免疫原性抗原可诱导抗肿瘤免疫应答。这些蛋白质的示例包括与免疫检查点受体结合并抑制免疫检查点受体(如CTLA4、LAG3、PD1、PDL1等)的抗体或其抗原结合片段、促炎细胞因子(如IFNγ、IFNα、ΙFΝβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF等)、或结合并激活活化受体的蛋白质(例如FcγRI、Fcγlla、FcγlIIa、共刺激受体等)。在特定实施方案中，所述蛋白质选自EpCAM、IFΝβ、抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1、A2A、抗FGF2、抗FGFR/FGFR2b、抗SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、内皮素B受体、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(也称为SPEG4)、SMAD、STING、TGFβ、VEGF和VCAM1。
本发明包括组合物，所述组合物将编码功能性大分子的mRNA提供给基于细胞疗法的靶细胞群。在某些实施方案中，所述靶细胞群是一个基因工程化的T细胞群。在某些实施方案中，所述靶细胞群是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)群。
所述编码mRNA可以被用于将免疫细胞或免疫细胞群的组合吸引到受试者的特定部位。在某些实施方案中，所述编码的mRNA和所述递送粒子被用来吸引免疫细胞进入肿瘤微环境。在某些实施方案中，所述编码mRNA和递送粒子被用来克服免疫细胞向肿瘤微环境的不充分迁移。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞或树突状细胞，或其任何组合。在某些实施方案中，所述编码mRNA和递送粒子被用来吸引CAR T细胞进入肿瘤微环境。
所述编码mRNA可以用于克服CAR T细胞向肿瘤微环境的不充分迁移。在某些实施方案中，所述递送粒子特异性靶向肿瘤微环境，所述编码mRNA编码一种吸引或以其他方式募集CAR T细胞进入肿瘤微环境的基因产物。在某些实施方案中，所述编码mRNA表达趋化因子。通过非限制性示例，所述编码mRNA可以编码吸引T细胞的趋化因子，例如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL22、CCL28、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、XCL1以及其任何组合。在需要反转效应的情况下，如在自身免疫性疾病中，所述编码mRNA可以表达上述因素的阻断剂、拮抗剂和/或抑制剂。
所述编码mRNA可以被递送到肿瘤微环境中，并在肿瘤微环境中瞬时表达。在某些实施方案中，所述编码mRNA编码参与调节肿瘤应答中免疫细胞存活、增殖和/或分化的细胞因子或其他基因产物，例如活化的T细胞和NK细胞。通过非限制性示例，所述编码mRNA可以编码细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-17、IL-33、IL-35、TGF-β及其任何组合。同样，在需要逆转作用的情况下，例如在自身免疫性疾病中，所述编码mRNA可以表达上述因素的阻断剂、拮抗剂和/或抑制剂，例如TGF-β抑制剂。
所述提供mRNA的组合物可以被设计为靶向特定细胞亚型，并在与之结合时刺激受体介导的内吞作用，从而将它们携带的合成mRNA导入细胞，从而可以表达合成mRNA。由于不需要转基因的核运输和转录，这一过程既快又有效。
在某些实施方案中，所述编码mRNA可以编码与免疫细胞(如共刺激因子)或免疫途径相关的受体或其他细胞表面蛋白，或编码靶向这些受体的分子。例如，所述编码mRNA可以编码靶向选自以下细胞受体及其配体的分子：CD40、CD40L、CD160、2B4、Tim-3、GP-2、B7H3和B7H4。类似地，所述编码mRNA可以编码选自GM-CSF、TLR7和TLR9中的一个或多个树突状细胞活化剂。在一个实施方案中，所述编码mRNA编码一个或多个T细胞膜蛋白3抑制剂。在一个实施方案中，所述编码mRNA编码一种或多种NF-κB抑制剂。
Toll样受体(TLR)家族参与病原体识别和先天免疫激活。TLR8尤其可以识别单链RNA，因此通过激活转录因子NF-κB和抗病毒应答在ssRNA病毒的识别中发挥作用。因此，在需要抗病毒应答的情况下，编码TLR家族成员(例如TLR8)的编码mRNA的实施方案被考虑。
在某些实施方案中，所述mRNA递送***将编码基因编辑剂的编码mRNA递送至靶细胞群。在某些实施方案中，所述mRNA编码靶向基因位点的序列特异性核酸酶，并破坏靶细胞群中一个或多个内源性基因产物的表达。在某些实施方案中，所述mRNA编码靶向T细胞受体(TCR)相关基因位点的序列特异性核酸酶，从而破坏TCR中一个或多个结构域的表达。适当地，T细胞受体类型蛋白包括MHC I类相关蛋白(MR1)，如以下实施例中进一步描述。
在某些实施方案中，所述mRNA递送***可以用于递送编码一个或多个将T细胞工程化为所需表型的试剂的mRNA。在某些实施方案中，所述mRNA纳米粒子递送组合物可以用于诱导具有所需T细胞表型特征的标记物和转录模式。在某些实施方案中，所述mRNA纳米粒子递送组合物可以用于促进CD26L+中央记忆T细胞(TCM)的发育，这些细胞已被证明可以改善CAR T治疗(见例如，Moffett，Coon supra)。在某些实施方案中，组合物提供编码一个或多个转录因子的mRNA，以控制靶细胞群中的细胞分化。在某些实施方案中，所述转录因子是Foxo1，它控制CD8 T细胞的发育效应-记忆转换。
在一些实施方案中，所述mRNA递送组合物包括对T细胞标记物特异的表面锚定靶区，例如，在T细胞上发现的表面抗原。在某些实施方案中，所述表面锚定靶区对抗原具有特异性，所述抗原选择性地将纳米粒子结合到T细胞上，并引发受体诱导的内吞，以内化mRNA纳米粒子递送组合物。在某些实施方案中，所述表面锚定的靶区选择性地与CD3、CD8或其组合结合。在某些实施方案中，表面锚定靶区是或来自选择性地与CD3、CD8或其组合结合的抗体。
通过本发明，可以在不同的细胞类型中实现上述基因产物的差异表达，例如在健康细胞、未患病细胞、患病细胞和癌症细胞中。通过这种方法，可以触发靶向患病细胞的免疫应答，同时在未患病或健康细胞很少发生。
将编码核苷酸序列引入到靶细胞中通常需要使用递送剂或“体内递送组合物”将所需物质从细胞外空间转移到细胞内环境。通常，此类递送剂/组合物可以包括递送粒子。递送粒子可以被吞噬和/或与靶细胞融合。递送粒子可以通过封装或将其包含于基质或结构中来包含所需物质。
本发明所用术语“递送粒子”是指通过封装、保持在基质中、形成复合物或以其他方式包含治疗成分并将治疗组分(如编码核酸序列)递送到靶细胞的粒子。递送粒子可以是微米级的，但在特定实施方案中，通常可以是纳米级——即纳米粒子。纳米粒子的直径通常至少为50nm(纳米)，适当地至少约为100nm，通常最多为150nm、200nm，也任选地可达300nm。在本发明的一个实施方案中，纳米粒子的平均直径约为60nm。这些尺寸的一个优点是，这意味着粒子低于网状内皮***(单核吞噬细胞***)清除的阈值，即粒子足够小，不会被作为身体防御机制一部分的吞噬细胞破坏。这有助于本发明所述组合物在静脉递送途径的用途。
纳米粒子组成的替代方案包括聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、脂基粒子或磷脂基粒子，如脂质体或外泌体；基于蛋白质和/或糖蛋白(如胶原蛋白、白蛋白、明胶、弹性蛋白、麦胶蛋白、角蛋白、豆球蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、乳蛋白(如酪蛋白)等)的粒子(Lohcharoenkal等人，BioMed Research International；Volume 2014(2014))；胶体纳米粒子；以及基于金属或金属化合物的粒子，如金、银、铝、铜氧化物、金属有机环和笼(MOC)等。
特别地，已经研究了包括聚乙烯亚胺(PEI)的聚合物用于核酸的递送。由聚(β-氨基酯)(PBAE)组成的纳米粒子载体也被证明适用于核酸递送，特别是与聚乙二醇(PEG)组成的合剂(Kaczmarek JC等人，Angew Chem Int Ed Engl.2016；55(44):13808–13812)。树枝状体也被考虑使用。这些合剂的粒子被用来将mRNA递送到肺部。
基于多糖及其衍生物的粒子，如纤维素、几丁质、环糊精和壳聚糖也被考虑了。壳聚糖是一种通过甲壳素部分脱乙酰化获得的阳离子线性多糖，含有该物质的纳米粒子具有生物相容性、低毒性和小尺寸等有前景的药物递送特性(Felt等人，Drug Development andIndustrial Pharmacy,Volume 24,1998-Issue 11)。有人建议可以使用上述组分之间的组合。
递送粒子可以包括氨基乙醇脂质。这些化合物可用于形成粒子，包括纳米粒子、脂质体和胶束，这些粒子特别适合递送核酸。可以在实施例中找到用于生产包括根据本发明的一些实施方案的粒子的纳米制剂的示例。
递送粒子可以靶向所述靶组织的细胞。这种靶向可以通过递送粒子表面的靶向剂被介导，所述靶向剂可以是蛋白质、肽、碳水化合物、糖蛋白、脂质、小分子、核酸等。所述靶向剂可以用于靶向特定细胞或组织，或可以用于促进粒子的内吞或吞噬。靶向剂的示例包括但不限于抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白、人类免疫缺陷病毒(HIV)的gp120包膜蛋白、碳水化合物、受体配体、唾液酸、适配体等。
当向受试者施用时，治疗成分作为体内递送组合物的一部分适当地施用，并且可以进一步包括药学上可接受的载体，以制备药物组合物。可接受的药物载体可以是液体，如水和油(包括石油、动物油、植物油或合成的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。所述药物载体可以是盐水、***树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当向受试者施用时，药学上可接受的载体优选是无菌的。当静脉内施用本发明化合物时，水是适当的载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是注射用溶液。适当的药学载体还包括赋形剂，如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，药学组合物还可以含有少量的润湿剂、乳化剂或缓冲剂。
本发明的药物和药物组合物可以采用液体、溶液、悬浮液、凝胶、改性释放制剂(例如缓慢或持续释放)、乳液、胶囊(例如，含有液体或凝胶的胶囊)、脂质体、微粒、纳米粒子或本领域已知的任何其他合适的制剂的形式。适用的药学载体的其他示例参见Remington'sPharmaceutical Sciences,Alfonso R.Gennaro ed.,Mack Publishing Co.Easton,Pa.,第19版，1995，1447-1676页。
对于本文所述的任何化合物或组合物，可通过体外细胞培养试验初步确定有效治疗量。目标浓度是指能够实现本文所述方法的活性组分的浓度，如使用本文所述或本领域已知的方法测量的浓度。
如本领域公知，用于人类受试者的有效治疗量也可以从动物模型中确定。例如，针对人类的剂量可以被配制为达到在动物中被发现有效的浓度。如上文所述，可通过监测化合物的有效性并上调或下调剂量来调整人用剂量。在上述方法和其他方法的基础上，调整剂量以实现在人体中的最大疗效，完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
设想本发明的实施方案可以包括被配制为用于医药的组合物。因此，本发明的所述组合物可以悬浮在生物相容性溶液中，以形成可靶向患者或动物的细胞、组织或体内部位的组合物(即，所述组合物可以在体外、离体或体内使用)。适当地，所述生物相容性溶液可以是磷酸盐缓冲液或任何其他药上可接受的载剂溶液。一种或多种附加的药学上可接受的载体(例如稀释剂、佐剂、辅料或赋形剂)可与本发明药物组合物中的组合物结合。在E.W.Martin(Remington's Pharmaceutical Sciences中)描述了适当的药物载体。本发明的药物制剂和组合物的配方符合法定标准，可以经口、静脉内、局部、瘤内或皮下或通过其它常规途径施用。可以全身性或局部或鼻内或鞘内施用。具体而言，根据本发明的组合物可以静脉内、病变内、瘤内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内、动脉内和/或通过吸入进行施用。
还希望有这样的实施方案，其中将本发明的某些实施方案的组合物单独地或与可选地抗肿瘤或其它抗癌治疗组分联合给药。这些组分可以包括溶瘤病毒、小分子药物、化学治疗剂、放射治疗剂或生物试剂。组分可与本发明的组合物同时给药，并且可以包含于递送粒子内，或可在施用本发明的组合物之前或之后通过任何适合手段单独给药。
还预期本发明的一些实施方案的组合物可以在体外和/或离体使用的方法，例如在实验室环境中。体外方法的一个示例是，将包括如本文所述的mRNA序列的递送***的组合物施用至体外细胞靶点，并且在mRNA序列中包含的miRNA结合位点序列允许mRNA编码序列在体外细胞靶点内的不同细胞类型中的差异表达。类似地，设想了一种方法，其中组合物包括递送***和本文所述mRNA序列，可以施用于从动物中提取的靶体外样品，并且mRNA序列中包含的miRNA结合位点序列允许mRNA编码序列在靶样品中的不同细胞类型中的差异表达。
疫苗
mRNA构建体和组合物可以用于疫苗治疗，提高常规疫苗的疗效，和/或作为一种新的疫苗形式，用于对抗感染性病原体，例如病毒、细菌、真菌、原生动物和蠕虫(helminths)(蠕虫(worm))；或用于治疗癌症等疾病。
在某些实施方案中，所述编码mRNA可以编码期望产生免疫应答的抗原。如上文所述，这种抗原的递送可以用于诱导局部免疫应答，或用于激发对抗原本身的适应性免疫应答，即诱导对该抗原的免疫，类似于疫苗。在这种情况下，根据本发明的组合物可以与佐剂结合以促进产生免疫应答。适当地，一种或多种促炎细胞因子可以作为佐剂使用，例如：IFNγ、IFNα、ΙFΝβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。
预防传染病或病原体感染的预防性疫苗
例如，所述编码mRNA可以编码细菌、病毒或其他微生物蛋白，期望针对细菌、病毒或其他微生物蛋白全部或部分产生免疫应答。在某些情况下，只对细菌、病毒或其他微生物蛋白的一部分产生免疫，因此也考虑仅对这些部分进行编码。特别地，可以选择外部呈现的微生物蛋白质的部分作为免疫识别的潜在靶点。在某些实施方案中，所述编码mRNA可以编码一种或多种严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的病毒蛋白，即引发Covid-19大流行的病毒。这种病毒有四种结构蛋白，S(刺突蛋白)、E(包膜蛋白)、M(膜蛋白)和N(核 衣壳蛋白)。在某些实施方案中，所述编码mRNA编码SARS-CoV-2的全部或部分刺突蛋白。在某些实施方案中，所述mRNA编码S蛋白外域的预融合形式(氨基酸1至1208，在残基986和987具有脯氨酸取代；GenBank MN908947)。在某些实施方案中，所述mRNA编码刺突蛋白受体结合域或RBD(残基319至591；GenBank MN908947)。作为这种蛋白质的外部部分，它可能是免疫***可以识别的表位的位置。在一个特定的实施方案中，所述编码mRNA另外包括至少一个器官保护序列(OPS)，其中所述OPS至少包括第一、第二和第三微RNA(miRNA)靶序列。其中一个靶序列可包括能够与miRNA-1、miR-133a、miR-206、miRNA-122、miR-203a、miR-205、miR-200c、miR-30a和/或let7a/b中的一个或多个结合，或适当地与它们全部结合的序列。
可以理解的是，上述方法特别适合制备与典型的“类毒素”疫苗类似的疫苗治疗组合物，其中对细菌或其他生物体产生的灭活毒素诱导免疫应答，或诱导对靶微生物的片段的免疫应答的“亚单位”疫苗。
虽然本文所述的本发明的任何实施方案可以具有作为建议的靶组织的血液或其分支(例如造血细胞、淋巴细胞等)，但所述血液和其分支被认为可能特别适合于旨在诱导免疫应答的实施方案，其中针对通过所述编码mRNA编码的产物诱导免疫应答，和/或可选地提供疫苗治疗的实施方案。特别考虑外周血单个核细胞(PBMC)作为这种方法的靶点，合适地是抗原呈递细胞(APC)。
常规疫苗的功能，至少在一定程度上，通过向免疫***(外源抗原)提供病原特异性抗原，以便对其产生免疫反应，从而在下次遇到这种外源抗原时能够识别和快速对抗。所谓的抗原呈递细胞(APC)是这一过程的关键。虽然所有的核细胞都能向细胞毒性T细胞(CD8+)提供内源性抗原，但有些细胞是“专职”APC，包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，具有检测和呈现外源性抗原的能力。这些细胞内化和加工外源抗原，并将其或其片段(免疫显性表位)呈现于表面，与II型主要组织相容性复合物(MHC-II)以及常见的共刺激分子结合，形成增强的T细胞应答，如CD4+辅助T细胞，在启动B细胞驱动的抗体产生(适应性免疫)中起着重要作用。
先前的研究表明，编码流感蛋白的mRNA可以被导入脂质纳米粒子中，导致免疫细胞的募集，以及单核细胞和树突状细胞对mRNA的翻译(Liang等人，Efficient Targetingand Activation of Antigen-Presenting Cells In Vivo after Modified mRNAVaccine Administration in Rhesus Macaques.Mol Ther.2017)。因此，将专职APC(如单核细胞和树突状细胞)与本文所述的编码外源抗原或其表位的mRNA构建体或组合物转染，以允许抗原呈现，并诱导对该抗原的长期适应性免疫。然而，在专职APC中表达抗原不是必需的，其他组织表达抗原可以有效地诱导所需的免疫应答，因为所产生的抗原可以在产生后由专职APC以正常方式提取和处理。
另外或除此之之外，本文所述的mRNA构建体或组合物可以用于递送和表达与疫苗诱导免疫过程相关的产物，例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子或主要组织相容性复合物。如施用编码抗原和其他成分的mRNA，则这些mRNA可以作为分离的mRNA构建体来被配制，或者如上所述，在同一个多顺反子mRNA上一起配制。可以理解的是，这种编码与疫苗诱导免疫过程相关的此类产品的mRNA可以被用于任何类型的疫苗的组合，即与基于蛋白质的疫苗(类毒素、重组、结合疫苗)、基于mRNA和DNA的疫苗、活性减毒疫苗、灭活疫苗或基于重组载体的疫苗(如MVA或腺病毒平台)组合。
例如，巨噬细胞的活化需要T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)，以表达MHC-II。因此，用所述mRNA构建体和组合物转染诱导IFN-γ表达可以增强疫苗诱导免疫应答的诱导，无论是通过常规疫苗方法还是通过使用所述mRNA构建体和组合物的方法以诱导抗原表达。同样，也可以使用本文所述的mRNA构建体和组合物来诱导参与免疫原性过程(如TLR，适当地如上述TLR8)的细胞受体。
IL-12由树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和人B淋巴细胞响应抗原刺激应答而产生，并参与T细胞的刺激和生长。IL-12是一种促刺激和促炎性细胞因子，在辅助T细胞的Th1亚群的发育中起关键作用。IL-12最初被发现是因为它能够诱导干扰素-γ(IFN-γ)的产生、细胞增殖以及自然杀伤细胞和T细胞介导的细胞毒性。现已证实，IL-12在Th1应答的产生中也起着关键作用，导致IFN-γ和IL-2的产生。这些细胞因子可以促进细胞毒性T细胞应答和巨噬细胞活化。因此，在另一个实施方案中，可能需要施用使IL-12表达的mRNA构建体和/或组合物，以增强疫苗效力或增强疫苗诱导的免疫应答，无论是由常规疫苗方法还是使用本文所述的mRNA构建体和组合物的方法，以诱导外源抗原表达。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或CSF2；GenBank AAA52578)是一种由多种细胞类型产生的免疫调节剂，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和脂肪细胞。GM-CSF还调节抗原呈递细胞的功能，参与树突状细胞活化和促进单核吞噬细胞成熟。GM-CSF以前曾被用于疫苗中以刺激应答(Yu等人，Novel GM-CSF-basedvaccines:One small step in GM-CSF gene optimization,one giant leap for humanvaccines.Hum Vaccin Immunother.2016)。特别地，GM-CSF已被证明可以改善对细菌性疾病或感染的疫苗应答，包括但不限于预防白喉(Grasse M等人，GM-CSF improves theimmune response to the diphtheria-component in a multivalentvaccine.Vaccine.2018)和预防结核病(Wang等人，Enhanced immunogenicity of BCGvaccine by using a viral-based GM-CSF transgene adjuvantformulation.Vaccine.2002)。在病毒性疾病或病毒感染的疫苗方法中使用GM-CSF已经被发现提供了类似的改善作用，包括但不限于冠状病毒、流感病毒(Liu等人，Influenzavirus-like particles composed of conserved influenza proteins and GPI-anchored CCL28/GM-CSF fusion proteins enhance protective immunity againsthomologous and heterologous viruses.Int Immunopharmacol.2018)，以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(Yu等人，Construction and in vitro evaluation of a recombinantlive attenuated PRRSV expressing GM-CSF.Virol J.2014)。
因此，使用本文所述的mRNA构建体或组合物对GM-CSF进行编码的编码mRNA的引入可以被用于通过抗体和细胞免疫应答来增强疫苗的免疫原性。所以，这些方法可以被作为疫苗佐剂、增强剂或免疫增强剂以预防性和治疗性疫苗类型用于人类和其他受试者。其他CSF样蛋白，如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF1；GenBank BC021117)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF或CSF3；GenBank BC033245)也可以产生类似的效果。
可以使用本文所述的mRNA构建体或组合物诱导的与疫苗诱导免疫过程相关的产品的其他示例，包括核因子NF-κB通路的调节剂，这些调节剂参与了结核病疫苗(BCG)疫苗的疫苗应答的发展(Shey等人，Maturation of innate responses to mycobacteria overthe first nine months of life.J Immunol.2014)。
根据上述讨论的mRNA构建体和组合物可以包括本文所述的任何器官保护序列。然而，在特定实施方案中，所述器官保护序列被选择为保护肌肉、肝、肾和皮肤中的一个或多个(例如，使用miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a的靶序列)。在一些实施方案中，针对四种miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和miR-203a的靶序列都包括在器官保护序列中。这种组合被认为在保护肌肉组织(因为组合物可以在肌内给药)以及肝和胰腺组织方面有效。皮下或皮内给药也很常见，与皮肤相关的一个或多个miRNA靶序列(见表2)也可以被用于保护皮肤细胞。
人们还认为，避免在这些构建体和组合物中使用miRNA-142靶序列是有益的，因为这种miRNA在造血细胞和免疫细胞中大量存在，因此可导致预期介导疫苗介导的应答的细胞中的表达减少。
治疗性疫苗(或主动免疫疗法)
除了传统的预防性(preventive)或预防性(prophylactic)疫苗外，还有一个新的领域是治疗性疫苗，其目的是针对体内已经存在的靶点引起免疫应答，例如针对持续感染或癌症引起免疫应答。这已被证明更具挑战性，在这种情况下，免疫应答往往受到耐受机制的下调或抑制，所述耐受机制的作用是保护疾病免受正常免疫应答的影响(Melief等人，Therapeutic cancer vaccines JCI 2015)。
因此，在一个实施方案中，提供了如本文所述的mRNA构建体，编码肿瘤抗原，以在肿瘤细胞中进行翻译。如前所述，其目的是旨在诱导对癌细胞的免疫应答。通过根据本发明选择性地使用目前显而易见的器官保护序列，可以减少在靶肿瘤组织以外的细胞类型、组织和/或器官中的表达，无论是在相同或不同组织类型的肿瘤周围的组织中的健康细胞，还是在可能受给药使用或全身扩散影响的其他器官中。
这种给药可以与治疗性疫苗组合使用，以提高所引发的免疫应答，或者他们自身作为治疗性疫苗，因为所述免疫***对引入的增强剂作出反应，以便对肿瘤产生响应。
作为疫苗与***毒联合治疗癌症(作为基于病毒的免疫疗法的治疗性癌症疫苗)
癌症治疗疫苗，又称治疗性疫苗，是一种增强免疫***识别和破坏携带肿瘤特异性抗原(新抗原)的细胞的免疫疗法，所述肿瘤特异性抗原在健康细胞中没有被发现。例如，结直肠新抗原包括MUC1，常见于结直肠肿瘤细胞。其他新抗原可以对患者肿瘤具有特异性。在这种情况下，所述癌症治疗疫苗将是一种个性化的新抗原疫苗。癌症治疗疫苗被用于已经被诊断患有癌症的患者。这种疗法可以破坏癌细胞，阻止肿瘤生长和扩散，或者防止癌症在其他治疗结束后复发。癌症疫苗可以含有需要免疫应答的抗原，以及增强免疫应答的佐剂。
一种典型的癌症疫苗接种策略可以涉及选择一种适当的载体，将肿瘤相关的新抗原递送到免疫***的主要抗原呈递细胞，例如树突状细胞，这些细胞能够产生长期的抗肿瘤免疫应答。在某些实施方案中，腺病毒(Ad)载体由于其高效性和***突变的低风险性，可以作为递送新抗原基因的载体。腺病毒载体，如ChAdOx1或ChAdOx2载体，是很有前景的基因疫苗平台，因为它们能迅速诱导针对转基因产物和Ad衣壳蛋白的强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答。这一点在体内外通过感染肿瘤新抗原编码Ad载体的树突状细胞产生抗肿瘤T细胞应答被证明。因此，在一种实施方案中，本文所述mRNA构建体编码一种或多种免疫调节剂，所述免疫调节剂可以用于吸引和活化治疗性癌症疫苗产生的细胞应答。本文所述的适当免疫调节剂可以包括IL-12及其衍生物(例如单链形式)及其同系物。
与先前讨论的在预防/预防性(preventive/prophylactic)疫苗中的潜在作用类似，GM-CSF也被识别为治疗疫苗的潜在佐剂(Yan等人，Recent progress in GM-CSF-basedcancer immunotherapy.Immunotherapy.2017；Zhao等人，Revisiting GM-CSF as anadjuvant for therapeutic vaccines.Cell Mol Immunol.2018)。类似地，CD40配体(CD40L)作为基于病毒的疫苗的一部分被递送，用于增强抗原特异性抗癌免疫，已被证明可以改善免疫应答和诱导自然杀伤细胞(NK)活化和扩增(Medina-Echeverz等人，Synergistic cancer immunotherapy combines MVA-CD40L induced innate andadaptive immunity with tumor targeting antibodies.Nat Commun.2019)。因此，本文所述的mRNA构建体和组合物可以被用于诱导GM-CSF或CD40L的表达，以增强在应用癌症治疗疫苗之前、期间或之后的抗肿瘤免疫应答。
还可能需要诱导对患者特异性抗原的免疫应答，包括癌症细胞基因突变而产生的“新抗原”(Lichty等人，Going viral with cancer immunotherapy.Nat RevCancer.2014)。因此，在另一个实施方案中，本文所述的mRNA构建体和/或组合物，可以被设计为包含编码患者新抗原的mRNA。在相同或不同的mRNA构建体中，它们可以与编码用于免疫调节剂、免疫增强剂和其他效应子化合物的任何其他mRNA结合，如上文所述。这种方法旨在诱导肿瘤细胞产生效应增强的抗原蛋白，使免疫***能够更好地识别这些肿瘤细胞。这种对肿瘤细胞的细胞应答也可以通过进一步诱导癌症细胞表达免疫调节剂来增强。
因此，根据本发明的具体实施方案，提供了编码治疗增强因子(例如免疫刺激剂或免疫调节蛋白或多肽)的mRNA，用于与癌症免疫治疗(例如癌症疫苗)联合应用。所述癌症疫苗可以包括***毒(例如，见表5)，如修饰后的人类或灵长类腺病毒，可包含生物活性的IL-12和/或GM-CSF的免疫刺激剂或免疫调节蛋白或多肽。
在另一个实施方案中，本文提供了编码的NF-kB通路的调节剂和/或抑制剂的所述mRNA构建体和/或组合物，用于在肿瘤细胞中或由肿瘤细胞表达，如本文所讨论的。
本发明的组合物和方法由以下实施例来说明，但不限于以下实施例。
实施例
mRNA构建体
所有的mRNA构建体都是由TrilinkBiotechnologies(加利福尼亚州圣地亚哥)从通用的DNA序列中合成的。这些mRNA模拟完全加工、带帽和聚腺苷酸化的mRNA，且可以通过核糖体进行翻译。
制剂
将所有mRNA构建体配制成可电离脂质样物质C12-200、磷脂DOPE、胆固醇和脂质锚定聚乙二醇C14-PEG2000-DMPE混合物的多组分纳米粒子。这种特殊组合物和C12-200:mRNA的具体质量比(10:1)，且脂质样物质、磷脂、胆固醇和PEG的摩尔[％]组成被优化为体内高效转染(Kauffman K.J.，Nano Letter.2015，15，7300-7306)，并被称为DMPCTX-mRNA。为了制备该制剂，将脂质组分溶解在乙醇中，并以1:3的比例与mRNA在10mM柠檬酸缓冲液(pH 3)中使用T型接头混合装置稀释。在20kDa膜透析盒中，在室温下用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)透析4小时。必要时，使用Amicon超离心过滤装置(100kDa截留)浓缩制剂。随后，将制剂转移到一个新的试管中进行表征。根据制造商的说明书，使用核绿素RNA分析(RibogreenRNA assay，Invitrogen)来测量mRNA封装的有效性和浓度。采用动态光散射法(ZetasizerNano-ZS，Malvern)测量脂质纳米粒子的多分散指数(PDI)和粒径(Zave)。
如图2所示，制剂被用于在多孔板分析中转染细胞。将制剂适当稀释至约1.5pmol/孔DMPCTX-mRNA。分析的目的是通过mCherry荧光来检测mRNA的表达，用Hoechst 33342染液(NucBlue Liver ReadyProbes Reagent,Life Technologies)对细胞核染色并测定细胞密度。用荧光显微镜(来自BIOTEK的Cytation Systems或来自Thermofisher Scientific的EVOS FL Auto)在转染24小时后，对mCherry的荧光进行定量。
这些制剂也在体内动物研究中用于细胞转染。
细胞培养和转染
所有细胞在5％CO2条件下于37℃下生长，体外单次转染培养后的细胞(Hep3B、AML12、786-0、hREC、HCT-116)如下进行：转染前1天，将细胞接种在96孔组织培养微孔板中，完全培养基和细胞密度如表5所示。第二天，在200μL还原血清培养基(Opti-MEM培养基，Gibco)中，通过将mRNA-DMPCTx直接添加到孔中的培养基中，并根据需要与培养细胞轻轻混合，用1.5pmol的DMPCTx mRNA转染细胞。孵育4小时后，移除Opti-MEM培养基并用完全培养基替换。
表5：DMPCTx-mRNA体外转染的培养基和细胞密度
对于人正常肝细胞的转染(Sigma产品参考号MTOXH1000)，使用Sigma推荐的解冻、完全生长培养基，将细胞以250000个细胞/毫升的细胞密度接种在24孔胶原涂层平板中(参考MED-HHTM、MED-HHPM、MED-HHPMSP、MED-HHCM、MED-HHCMSP)。在含有5％FBS的培养基中进行mRNA-DMPCTx的转染。孵育4小时后，移除mRNA混合物，并将完全补充的培养基添加回孔中。
为了转染正常成人上皮结肠细胞(Cell Applications公司，参考732Cn-05a)，使用胃肠道上皮细胞解冻液和胃肠道上皮分化培养基(Cell Applications公司，参考716DC-50和716T-20)解冻、铺板和培养细胞。用胃肠道上皮细胞涂层溶液(Cell Applications公司，参考025-05)预处理96孔微孔板孔，每个孔接种60000个细胞。第二天，在200μl还原血清培养基(Opti-MEM培养基，Gibco)中，通过将mRNADMPCTx直接添加到孔中的培养基中，并根据需要与培养细胞进行轻轻混合，用1.5pmol的mRNA-DMPCTx转染细胞。培养4小时后，移除Opti-MEM培养基并用培养基替换。
转染正常人肺/支气管细胞(BAES-2B细胞，ATCC CRL-9609)时，用补充了BEGM支气管上皮细胞单细胞试剂盒(Lonza)的BEGM培养基(Lonza)培养细胞。将细胞以每毫升75000个细胞的密度接种在涂有I型胶原的微孔板中。第二天，通过将DMPCTx-mRNA直接添加到孔中的培养基中，并根据需要将培养细胞轻轻混合，用1.5pmol的DMPCTx-mRNA在200μl的还原血清培养基(Opti-MEM培养基，Gibco)中转染细胞。培养4小时后，移除Opti-MEM培养基并用培养基替换。
荧光显微镜检查
转染24小时后，使用Hoechst 33342染料(来自Invitrogen的NucBlueTM LiveReadyProbesTM试剂)对细胞核进行染色。用荧光显微镜(Biotek的多功能酶标仪或来自Thermofisher Scientific的FL成像***)检测活细胞的核染色和mCherry荧光。图像是用Texas Red和DAPI filter cube和20倍物镜获得的。
实施例1：未优化与优化的miRNA靶序列(不匹配与匹配)
为了研究本发明成功地用构建体mRNA转染靶细胞并随后驱动比未修饰的miRNA靶序列更好的蛋白差异表达的潜力，首次使用人癌细胞系和每个器官的正常原代细胞体外评估了经miRNA结合位点修饰的DMPCTx mRNA平台。纯化的mCherry mRNA可以用于追踪培养细胞的转染和翻译效率。
例如，miRNA-122是一种丰富的肝特异性miRNA，其在人原发性肝癌(HCC)和肝癌衍生细胞系(如Hep3B)中的表达显著降低。本实施例的研究目的是证明通过***优化的miRNA-122靶序列(例如变体2)来修饰mRNA序列的3'-非翻译区(UTR)可以导致外源mRNA在正常肝细胞中的翻译抑制作用更强，但在检测的HCC细胞系中没有。为此，对mCherry mRNA构建体进行了修饰，以在3'-UTR(变体1)中包含至少一个未经优化的miRNA-122靶序列，或至少一个优化的完美匹配靶序列(变体2)。将所述mRNA构建体转染小鼠AML12正常肝细胞，已知其表达高水平的miRNA-122，并用无miRNA靶序列的mRNA构建体作为阳性对照。用荧光显微镜(来自Thermofisher Scientific的EVOS FL Auto)检测单次转染mCherry mRNA 24小时后的mCherry荧光。可选地定量方法可以被用于验证递送构建体的表达，包括免疫印迹法(Western blot)或蛋白质组分析技术，如质谱法。
变体1[SEQ ID NO:4]：5’-AACGCCAUUAUCACACUAAAUA-3’(未匹配的miR-122靶序列)
变体2[SEQ ID NO:44]：5’-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3’(完美匹配的miR-122靶序列)
结果
如图9(b)所示，AML12细胞中无MOP的mCherry mRNA表达较强。当3'UTR中包含单个不完全匹配的miR-122靶序列(变体1)时，mCherry的表达仍然明显(见图9(c))。使用变体2进行完美匹配的效果明显，mCherry表达明显减少，见图9(d)右侧图片。
实施例2：比较miRNA靶序列重复数量的影响
为了研究本发明通过增加mRNA构建体中靶序列的数量来驱动更好差异表达的潜力，将mRNA修饰为3’-UTR中的包含1、2或4个优化的miRNA-122miRNA靶序列，并在体外评估和比较人Hep3B癌细胞系和相应的正常AML12原代细胞的翻译效率。不含miRNA靶序列的mCherry mRNA构建体被用作阳性对照。如图1所示，使用特定的核苷酸(如uuuaaa)将miR-122靶序列连接起来。通过荧光显微镜(来自Thermofisher Scientific的EVOS FL AuTo)检测对mCherry mRNA构建体进行单次转染24小时后mCherry荧光。可选地定量方法可用于验证递送构建体的表达，包括Western blot或蛋白质组分析技术，如质谱法。
结果
多重结合位点序列的结果如图8所示。在AML12正常肝细胞(a)中mCherry表达的抑制具有一定的剂量依赖性，结合位点序列的两次和四次重复显示mCherry的高水平抑制。然而，对Hep3B癌细胞(b)的影响并不明显，在这些细胞中，mCherry表达水平在miRNA结合位点重复一到两次时基本保持一致，而四倍多重序列的表达仅略有降低。
实施例3：与不含MOP的mCherry相比，评估多器官保护(MOP)序列对mCherry表达的影响
研究MOP序列减少或消除ORF在未患病细胞中翻译的潜力，这些未患病细胞来自选自以下一个或多个器官内的未患病细胞：肝、胰腺、脑和中枢神经***、肾、脾、肠道(包括食道、胃、肠、结肠和直肠)、肺、皮肤和***，mCherry mRNA被修饰为在3'-UTR中包含至少三条未优化的miRNA靶序列，其中第一、第二和第三miRNA靶序列彼此不同。在本实施例中，靶序列被优化为与miR-122、let7b和miR-192结合，并分别为肝、肺/***和肾中的未患病细胞提供多器官保护。在体外对人肿瘤细胞系和每个被保护的器官相应的正常原代细胞的翻译效率进行了评估和比较。不含miRNA靶序列的mCherry mRNA构建体被用作阳性对照。使用荧光成像***(来自BIOTEK的酶标仪)对mCherry mRNA构建体进行单次转染24小时后的mCherry荧光进行定量。靶序列使用特定的核苷酸(如uuuaaa)相连接。
实施例4：体外多器官保护方法构想的证明
为了研究本发明在多个不同的受体细胞类型中差异表达特定ORF的潜力，将mCherry mRNA如实施例3所述修饰，以在3'UTR中包含三个或五个miRNA靶序列。提供了针对miR-122、let7b和miR-192的第一mRNA序列靶序列mCherry-3mop)，针对miR-122、miR-124a、let7b、miR-375和miR-192的第二mRNA序列靶序列(mCherry-5mop)。使用无miRNA靶序列的对照mCherry mRNA序列。
制备的mRNA序列如上所述为纳米制剂。将制备的纳米粒子转染到对应于人正常肝细胞的细胞系(图2)(Sigma产品参考号MTOXH1000)；小鼠正常肝细胞(来自ATCC的AML12)和人肝癌细胞(来自于ATCC的Hep3B)。此外，用mCherry-3MOP mRNA和对照mCherry RNA转染与正常人肾细胞(来自ATCC的hREC)相对应的细胞系。将细胞接种在24孔板中。每孔转染0.5μgmRNA，转染24小时后用酶标仪5(Biotek)进行成像。
图3示出了三种肝细胞类型中的mCherry信号，并显示与转染人肝癌细胞(Hep3B)或对照mCherry mRNA转染正常细胞后的信号相比，用mCherry-3MOP或mCherry-5MOP mRNA转染正常小鼠和人肝细胞时的细胞信号显著减少。这表明，由于包含miRNA靶序列，正常细胞的mCherry翻译减少。图4示出了使用Biotek的Gen5成像软件量化转染细胞中的mCherry荧光。背景信号已被减除。值表示每个细胞荧光信号的平均值和标准偏差。与对照组相比，评估的mRNA在统计学上有显著差异，显示为*p<0.05，*p<0.005。结果表明，当使用3MOP或5MOP miRNA靶序列时，正常肝细胞(人和小鼠)的蛋白表达减少了约80％，而肿瘤细胞的蛋白表达减少较少。
图5A示出了转染的正常人肾细胞(hREC ATCC-PCS-400-012)中的mCherry信号。在mCherry-3MOP处理的细胞中可以看到信号的减少，表明mCherry翻译的减少。图5B使用Biotek的Gen5成像软件对这些进行了量化，该软件同样显示，用mCherry-3MOP转染正常肾细胞后，mCherry信号减少了约60％。在图5B中，背景信号已被减除，其值表示每个细胞的荧光信号的平均值和标准偏差。与对照组相比，评估mRNA的统计学上的显著性差异显示为*p<0.05。
图6示出了使用3MOP序列的替代结构的肝细胞实验的结果。在本实施例中，所述3MOP序列包括与miRNA122、miRNA192和miRNA30a完美匹配的miRNA结合位点。与图6(f)中在小鼠AML12肝细胞中没有明显的表达相比，图6(c)中在Hep3B癌细胞中可以清楚地看到mCherry的表达。
图7示出了另一个使用3MOP序列的替代结构的结果。在本施例中，3MOP序列包括与let7b、miRNA126和miRNA30a完美匹配的miRNA结合位点。同样，与图7(f)中的在小鼠AML12肝细胞中没有明显的表达可见相比，图7(c)中在Hep3B癌细胞中可以清楚地看到mCherry的表达。
图10示出了与图7实验中使用的3MOP序列相同的序列(miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a)对肾脏组织和器官特异性保护的效果。mCherry的表达在hREC人肾细胞中几乎完全被抑制(图10(f))，但在786-0肾腺癌细胞中未被抑制(图10(c))。在图11中，测试了替代的3MOP序列(miRNA122-miRNA192-miRNA30a)。图10和图11测试的MOP序列均包含与保护肾脏的miRNA 30a完美匹配的结合序列，然而，后者的3MOP进一步包含与提供假定的双层肾脏保护的完美匹配的miRNA-192的结合位点(见上文表2)。在图11中，mCherry的表达在hREC人肾细胞中不可见(图11(f))，但在786-0肾腺癌细胞中明显可见(图11(c))。
图13示出了与图11实验中使用的相同3MOP序列(miRNA122-miRNA192-miRNA30a)对结肠中的组织和器官的特异性保护作用。mCherry的表达在人类结肠上皮细胞中几乎完全被抑制(图13(c))，但在HCT-116细胞中未被抑制(图13(f))。在图14中，测试了替代的3MOP序列(miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a)。图14中测试的MOP序列包含与Let7b的完美匹配的结合序列，该序列广泛保护结肠组织。在图14中，mCherry在结肠上皮细胞(图14(c))和HCT-116细胞中的表达显著降低(图14(f))。
图15示出了使用包含miRNAlet7b、miRNA126和miRNA30a结合位点的MOP序列对肺的组织和器官特异性保护的效果。与上述其他试验类似，选择了支气管上皮细胞系代表最接近的健康非癌肺组织：BEAS-2B细胞系。BEAS-2B细胞通过感染复制缺陷型SV40/腺病毒12杂交体而永生化，这有助于改进操作和克隆。这些细胞被用来作为正常肺上皮功能的模型来研究鳞状上皮细胞的分化。在图15(c)中，与不含MOP相比，MOP序列的存在导致了非常高水平的mCherry表达抑制。
图7(f)、10(f)、14(c)和15(c)所示的结果表明，包含miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a MOP序列可以对健康肝、肾、结肠和肺提供来自相关ORF表达的有效保护。图6(f)、11(f)和13(c)的结果表明，包含miRNA122-miRNA192-miRNA30A结合序列的替代MOP对健康肝、肾和结肠组织提供了有效的保护。
本实施例表明，包含多个不同的miRNA靶序列的器官保护序列也可以驱动来自多个不同器官的细胞的差异表达，并可以在多个组织的正常细胞和肿瘤细胞中差异化。
实施例5：病毒进入受体ORF选择，粘连蛋白(Nectin)，以及OPS保护
本发明的目的是增加病毒进入受体在癌细胞表面的表达，以提高溶瘤病毒(例如溶瘤HSV(oHSV))对癌细胞的传染性。例如，编码HSV病毒进入受体Nectin-1的mRNA以不同浓度被转染到人或小鼠肿瘤细胞系中。用Western blot分析细胞溶解液中Nectin-1的表达。然后，对编码Nectin-1的mRNA进行修饰，以包含至少三个相似或不同的miRNA靶序列(如实施例4中所示)，并评估癌细胞系和至少一个器官的相应正常原代细胞中的mRNA表达差异，所述器官选自肝、胰腺、大脑和中枢神经***、肾、脾脏、肠道(包括食道、胃、肠、结肠和直肠)、肺、皮肤和***。Western blot分析表明，与癌细胞相比，Nectin-1蛋白在未患病细胞表面的表达减少。可选的量化方法可以被用于验证递送构建体的表达。
Nectin 1mRNA构建体
对于以下实施方案，使用Nectin 1蛋白编码序列的同种型1。所述mRNA含有3'UTR，所述3'UTR包含了完美匹配的MOP序列：MIR122-MIR192-MIR30A(122-192-30A)，分别允许肝、结肠和肾保护。替代MOP序列也可以被使用，例如miRlet7b-miR126-miR30a(let-7b-126-30a)或由这些或其他miRNA结合序列组成的不同组合。所述构建体是由TrilinkBiotechnologies(加利福尼亚州圣地亚哥)从生成的DNA序列中合成的。这些mRNA模拟完全加工、带帽和聚腺苷酸化的mRNA，且可通过核糖体进行翻译。不含MOP序列的相同的构建体被合成作为对照(例如，mRNA只表达Nectin 1，而不含MOP)。
体外Nectin 1转染
为了研究Nectin 1是否增加溶瘤性HSV(oHSV)的感染性，肝细胞因其已知的低Nectin 1表达水平而被使用。在体外转染Nectin 1构建体时，用DMPCTx-mRNANectin 1转染的人肝癌Hep3B细胞和正常人原代肝细胞的3'UTR中包含以下MOP序列：miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a的结合序列(Nectin-MOP)。Nectin-MOP构建体的转染导致Nectin-1蛋白在肝癌细胞中的高表达，而在健康肝细胞中由于miRNA122的结合序列保护而保持其低表达水平。
mRNAs的转染采用DMPCTx技术进行，转染前一天，细胞以60000个细胞/ml的密度单独接种到微孔板中。第二天，细胞用PBS溶剂对照(仅PBS)、Nectin 1-122-192-30a(Nectin-MOP)或不含MOP序列的Nectin 1(Nectin)转染。转染是通过将mRNA-DMPCTx直接添加到孔内的培养基中，并根据需要轻轻混合所培养细胞来完成的。
Nectin 1的免疫印迹和荧光检测
为控制Nectin 1的翻译，免疫印迹如下进行：去除培养基，用冷PBS冲洗细胞，用蛋白酶抑制剂(Sigma)混合物在RIPA(放射免疫沉淀分析)缓冲液(Boston Bioproducts)中溶解细胞粒子。将细胞组分从细胞质可溶性蛋白中分离出膜蛋白。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并通过电印记转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。用5％脱脂奶粉封闭TBS-Tween20(Boston Bioproducts)后，用抗Nectin 1或b-actin(对照)的一抗孵育膜，然后用二抗(如HRP(辣根过氧化物酶)-偶联抗体)孵育膜。然后分别使用ClarityTM Western ECLSubstrate(Bio Rad)和***(LI-COR)进行蛋白质检测。
为了控制Nectin 1在细胞表面的良好定位，免疫荧光如下进行：转染的细胞在盖玻片上生长(用0.2％明胶预孵育30分钟)，在PBS中冲洗，并在补充有10mM氧钒核糖核苷复合物(VRC)(新英格兰生物实验室)的0.5％CSK Triton的冰浴中预提取2分钟。然后将细胞在补充有10mM VRC的CSK中洗涤一次，并在冰浴中孵育2分钟，随后在室温下用4％多聚甲醛在PBS中固定10分钟。之后用PBS洗涤细胞两次，并在室温下在含RNase抑制剂(Roche)和1％牛血清白蛋白的PBS中封闭细胞20分钟。在含有1％牛血清白蛋白和RNase抑制剂(Roche)的PBS中，在室温下用1/500的抗Nectin 1(ab229464)的一抗孵育1小时。细胞在含有0.02％吐温-20(PBS-T)的PBS中洗涤三次。在室温下与荧光偶联的山羊抗兔二抗孵育30分钟后，将细胞在PBS-T中洗涤三次。然后用一滴含有4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield包埋载玻片。使用荧光显微镜(来自Thermofisher的EVOS FL Auto或Biotek的酶标仪)进行成像。
结果
DMPCTx mRNA Nectin-MOP构建体的转染将导致在Hep3B癌细胞中的表达，而健康肝细胞将因MOP序列而引起的mRNA翻译的保护。由于缺乏序列保护，转染不含MOP序列的mRNA构建体将在癌细胞和正常肝细胞中显示出Nectin 1蛋白的高表达。免疫印迹结果示出了在两种构建体转染的Hep3B细胞的蛋白溶解物中约57kDA的条带，对应于Nectin 1蛋白。虽然所述条带仅存在于由不含MOP序列的mRNA转染的健康肝细胞中，但免疫荧光实验示出，只有免疫印迹阳性的细胞显示在膜上正确定位的Nectin 1。
制备在mRNA转染后的不同间隔时间的蛋白质样品，以确定Nectin1何时在细胞膜中高表达。该信息将作为oHSV感染的参考点。
实施例6：评估Nectin-1是否增加感染性(与HSV共感染，体外)
本发明旨在提高肿瘤细胞的溶瘤病毒的传染性。编码病毒进入受体的mRNA与溶瘤病毒联合转染癌细胞。评估了增强的细胞致病作用，增加的病毒载量，增加的癌症细胞死亡。例如，编码HSV病毒进入受体Nectin-1的mRNA被修饰为包含至少三个相似或不同的miRNA靶序列，并在至少一个器官的癌细胞系和相应的正常细胞中评估mRNA表达差异，其中至少一个器官选自：肝、胰腺、大脑和中枢神经***、肾、脾、肠道(包括食道、胃、肠、结肠和直肠)、肺、皮肤和***。用修饰的Nectin-1mRNA构建体转染癌细胞及相应的正常细胞。随后使用溶瘤性HSV(oHSV)感染细胞，并评估癌症和正常细胞的细胞死亡增加情况。
oHSV感染的效率
本实施例用oHSV的溶瘤病毒MG18L菌株(Us3Δ，UL39(ICP6)
-，Lacz+)感染健康肝细胞和Hep3B细胞。在病毒感染之前，细胞被DMPCTx Nectin-MOP或不含MOP序列的Nectin 1感染或不感染。然后用连续稀释的oHSV感染细胞。如实施例5所述，也可以使用替代MOP序列，例如miRLet7b-miR126-miR30a(let-7b-126-30a)，或使用由这些或其他miRNA结合序列组成的不同组合。
Nectin 1被限制在上皮细胞的粘附连接处，不能完全接触到病毒(Yoon和Spear，2002)。钙的缺乏破坏了细胞连接，并诱导Nectin 1在整个细胞表面重新分布，从而增加了可能感染HSV的细胞比例(Yoon和Spear，2002年)。在这种情况下，钙的缺乏可以通过但不限于用BAPTA-Na4分子治疗来实现，所述BAPTA-Na4分子是钙螯合剂。采用BAPTA-Na4和Nectin-MOP对oHSV感染的Hep3B细胞进行联合治疗，评估钙螯合是否增加了Hep3B细胞的感染性。在oHSV感染前，将BAPTA-Na4加入细胞培养基。
在感染后的不同时间点，根据供应商的说明(细胞增殖试剂盒I，Sigma)，用MTT法测定转染细胞系的存活率。在550-600nm处用96孔板测量吸光度，以确定剂量效应曲线和50％有效剂量值(ED50)。
同时，在感染后的不同时间间隔，还应用与oHSV基因组互补的引物通过使用实时PCR分析来评估oHSV的复制，所述oHSV基因组包括但不限于编码糖蛋白D的US6基因(正向引物：CCCCGCTGGAACTACTATGA[SEQ ID NO:58]；反向引物：TCGGTGCTCCAGGATAAACT[SEQ IDNO:59])。根据制造商的说明，使用QIAamp DNA小型试剂盒(Qiagen)从细胞中分离基因组和病毒DNA。在QuantStudio 6Flex Rel-Time PCR仪(Applied Biosystems)上使用iQ SYBRGreen Supermix(Bio-Rad)进行实时PCR。采用ΔΔCt法计算相对oHSV检测水平。内参，如人类Gapdh基因(正向引物：CCCACACACATGCACTTACC[SEQ ID NO:60]；反向引物：CCCACCCCTTCTCTAAGTCC[SEQ ID NO:61])，用于将信号标准化。
由于所述MG18L菌株含有编码b-半乳糖苷酶的大肠杆菌LacZ基因，LacZ检测可作为感染的标志物，病毒粒子滴度通过使用单层Vero细胞的终点稀释法测定。Hep3B细胞感染实验后，病毒粒子在上清液中被回收。10μl的系列稀释液在37℃下与Vero细胞共孵育1-2h。然后冲洗细胞去除病毒接种物，在37℃下培养2-3天，直到溶菌斑形成。然后用2％多聚甲醛和0.2％戊二醛溶液固定细胞。用0.1％的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷)溶液对溶菌斑进行染色，并用倒置显微镜计数。
结果
经不含MOP序列的DMPCTx Nectin转染的Hep3B癌细胞和正常肝细胞都在细胞膜中高水平的表达Nectin 1，并且都对oHSV MG18L高度敏感，从而导致细胞死亡。实时PCR和病毒终点稀释法显示感染后病毒滴度增加，表明两种细胞类型的病毒复制增加。如果在病毒感染前未被Nectin 1mRNA转染，两种细胞类型对oHSV MG18L的敏感性都相对较低。转染了DMPCTx Nectin-MOP的健康肝细胞也会产生类似的结果，因为高水平的miRNA-122的存在，Nectin 1蛋白不会在这些细胞中表达，最终通过与MOP序列结合而抑制mRNA的翻译。由于肝细胞癌中miRNA-122的低表达，导致了Nectin-MOP转染的Hep3B肝癌细胞因为Nectin-1的高表达而表现出对MG18L感染的高易感性。
例7：评估Nectin-1是否增加体内HSV共感染的感染力
本实验描述了一种哺乳动物模型，以确定在保留健康肝组织的情况下，通过在肿瘤中表达Nectin-1是否可以增加人类肝癌对oHSV感染的易感性。
SCID小鼠Hep3B细胞的皮下异种移植
雌性CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl Fox Chase SCID小鼠被用于皮下异种移植。Hep3B细胞用PBS(MatrigelTM)以1:1重悬，然后注射到每只小鼠的右侧。通过观察和触诊，每周监测肿瘤生长两次。组间肿瘤大小充足且均匀者可用于进行治疗性试验。
Nectin 1的肿瘤内注射及翻译的Nectin1蛋白的检测
DMPCTx Nectin-MOP、Nectin或生理盐水在治疗期间多次注射到小鼠肿瘤内(IT)，与BATPA-Na4联用或不联用。如前述实施例5和6所述，可以使用替代MOP。在不同时间点处死小鼠，收集肿瘤并制备成FFPE块用于进一步分析。肝和其他未患病器官，如脾、肺和肾脏，也被收集并制备成FFPE块，以研究mRNA制剂的生物分布。然后进行免疫组化以评估Nectin-1在组织中的表达。
结果
IT注射DMPCTx Nectin-MOP可导致Hep3B肿瘤中Nectin 1的高水平表达，而在健康肝中的表达降低，在未患病器官(如肝、肾、肺、脾)中的表达降低。由于mRNA构建体的3’UTR中存在miRNA结合位点，因此在肿瘤细胞和未患病组织中可以实现Nectin 1的这种差异表达。然而，不含MOP的DMPCTx Nectin中缺乏这些miRNA结合位点，导致肝、肺、脾和肾等未患病器官表达Nectin 1。
oHSV感染的效率
在DMPCTx Nectin-MOP、Nectin或生理盐水处理之前、同时或之后，随机分组的小鼠被静脉注射MG18L或病毒缓冲液。BAPTA-Na4或生理盐水缓冲液可以在oHSV感染前、同时或感染后注入肿瘤内，以观察Nectin 1和BAPTA-Na4对病毒感染性的联合作用。每3或4天用卡尺测量肿瘤尺寸，观察联合治疗对肿瘤生长的影响。在感染后的不同时间点，处死小鼠的亚组。肿瘤和未患病组织(如肝、肾、肺、脾)被收集并制备成FFPE块进行免疫组化分析。用抗HSV糖蛋白D的抗体检测病毒定位，然后与适当的荧光偶联二级抗体孵育以检测病毒。
结果
与单独使用oHSV治疗的肿瘤相比，使用DMPCTx Nectin-MOP或Nectin预处理的Hep3B肿瘤预计更容易受到oHSV感染，其尺寸明显更小且糖蛋白D呈现高含量。BAPTA-4Na–Nectin 1的联合治疗能提高肿瘤对oHSV的敏感性。由于静脉注射oHSV，DMPCTx Nectin-MOP处理小鼠的健康肝、肾、肺和脾等未患病组织被保护而免受oHSV感染。不同的DMPCTx和oHSV给药方案以允许确定增加肿瘤细胞oHSV感染的最佳条件(例如，在oHSV给药前用DMPCTx预处理肿瘤，DMPCTx和oHSV联合给药，或在oHSV注射后用DMPCTx治疗)。
实施例8:编码递送至癌细胞的单态性MHC I类相关蛋白(MR1)表达的mRNA，以测定MR1限制性T淋巴细胞在癌细胞溶解中的增加
本发明的目的在于增强与识别癌细胞表面的MR1限制性T淋巴细胞相关的抗肿瘤作用。
例如，如前述实施例中所述，编码作为ORF的MR1的mRNA被修饰，以包含具有至少三个相似或不同miRNA靶序列的MOP，并评估至少一个器官中癌症细胞系和相应的正常原代细胞中mRNA的差异表达,所述器官选自肝、胰腺、大脑和中枢神经***、肾、脾、肠道(包括食道、胃、肠、结肠和直肠)、肺、皮肤和***。用修饰后的mR1 mRNA构建体转染癌细胞及相应的正常细胞。PBMC或T淋巴细胞随后被用于溶解优先表达MR1的癌细胞(例如，如Crowther等人，Nature Immunology,第21卷,178–185页，2020)。
MR1 mRNA构建体
在以下实验中，使用人类MR1mRNA的同种型1。mRNA含有3'UTR，所述3'UTR包含完美匹配的MOP序列(MR1-MOP)：miR122-miR375-miR30a(122-375-30a)，分别允许肝、胰腺和肾保护。替代MOP序列或由这些或其他miRNA结合序列组成的不同组合也可以使用。所述构建体是由Trilink Biotechnologies(加利福尼亚州圣地亚哥)从通用的DNA序列中合成的。这些mRNA模拟完全加工、带帽和聚腺苷酸化的mRNA，且可以通过核糖体进行翻译。不含MOP序列(MR1)的构建体被合成，作为肝、胰腺和肾无保护的阴性对照。
体外MR1转染
肝和胰腺癌细胞系被用来研究MR1是否增加与MR1-限制性T淋巴细胞识别肿瘤细胞表面的MR1相关的抗肿瘤作用，因为MR1在这些器官中似乎没有高表达(人类蛋白质图谱)。用于体外转染MR1构建体的人肝癌Hep3B(HB-8064TM)，人胰腺癌BxPC-3细胞，可从例如ATCC(CRL-1687TM)获得。
以正常人肝细胞和正常人胰腺导管上皮细胞H6c7(Kerafast ECA001-FP)为阴性对照，观察MR1-MOP构建体对肝脏和胰腺的保护作用。由于在mRNA构建体的3’UTR中分别存在miR122和miR375结合序列，因此外源MR1不会在健康肝细胞和胰腺细胞中翻译。
mRNA的转染采用DMPCTx技术进行，转染前一天，细胞分别接种在微孔板中，并在完全培养基(EMEM/10％FBS)中生长。第二天，用PBS(阴性对照)、DMPCTx MR1-MOP或MR1来转染细胞。所述转染是直接向孔内培养基中添加mRNA-DMPCTx来进行的，并根据需要轻轻混合所培养的细胞。
免疫印迹和免疫荧光法检测MR1
基于转染动力学进行免疫印迹和免疫荧光实验。
为了控制MR1的翻译，免疫印迹如下进行。去除培养基，用冷PBS冲洗细胞，用蛋白酶抑制剂混合液(Sigma)在RIPA(放射免疫沉淀分析)缓冲液(Boston Bioproducts)中溶解细胞粒子。将细胞组分从细胞质可溶性蛋白中分离出膜蛋白。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并通过电印记转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。用5％脱脂奶粉封闭TBS-Tween20(Boston Bioproducts)后，用抗MR1或b-actin(对照)的一抗孵育膜，然后用二抗(如HRP(辣根过氧化物酶)-偶联抗体)孵育膜。然后分别使用ClarityTM Western ECL Substrate(Bio Rad)和***(LI-COR)进行蛋白质检测。
为了控制MR1在细胞表面的良好定位，免疫荧光如下所示进行。细胞在盖玻片上生长(用0.2％明胶预孵育30分钟)，在PBS中冲洗，并在补充有10mM氧钒核糖核苷复合物(VRC)(新英格兰生物实验室)的0.5％CSK Triton的冰浴中预提取2分钟。然后将细胞在补充有10mM VRC的CSK中洗涤一次，并在冰浴中孵育2分钟，随后在室温下用4％多聚甲醛在PBS中固定10分钟。之后用PBS洗涤细胞两次，并在室温下在含RNA酶抑制剂(Roche)和1％牛血清白蛋白的PBS中封闭细胞20分钟。在含有1％牛血清白蛋白和RNase抑制剂(Roche)的PBS中，在室温下用1/100的抗MR1(ab229987)的一抗孵育1小时。细胞在含有0.02％吐温-20(PBS-T)的PBS中洗涤三次。在室温下用荧光偶联的山羊抗兔二抗孵育30分钟后，将细胞在PBS-T中洗涤三次。然后用一滴含有4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield包埋载玻片。使用荧光显微镜(来自Thermofisher的EVOS FL Auto或Biotek的酶标仪)进行成像。
结果
转染后，MR1-MOP构建体应该仅在癌细胞系中翻译，而正常细胞由于MPP序列中存在miR122和miR375结合序列而受到保护。免疫印迹结果示出了在两种构建体转染的癌细胞和MR1转染的健康细胞的蛋白质溶解物中观察到约39kDa的更高的条带，与MR1蛋白相对应。MR1-MOP构建体转染的健康细胞和仅用PBS载体对照的所有细胞系的蛋白质溶解物显示MR1表达的降低。免疫荧光实验证明翻译后的MR1蛋白正确地定位在膜上。这一观察结果将意味着所述MR1可以用于MR1限制性T淋巴细胞。动力学可以确定，在这一时间，转染后MR1在表面的最高丰度和/或位置，这将作为T细胞诱导细胞溶解的参考点。
MR1限制性T淋巴细胞对细胞的溶解作用
为了研究MR1翻译是否通过MR1限制性T淋巴细胞增加细胞溶解，使用Sewell实验室的MC.7.G5细胞进行细胞毒性试验。MC.7.G5是一种可以识别MR1并杀死表面呈递MR1的癌细胞的T细胞克隆(Crowther等人，2020)。Hep3B、BxPC-3、正常肝细胞和转染或未转染不同的MR1构建体(靶细胞)的H6c7细胞均用mCim铬(Perkinelmer、Waltham、MA)标记，用FBS冲洗，并允许FBS浸润以去除细胞中任何多余的铬。铬标记后，对靶细胞进行洗涤和铺板。MC.7.G5细胞以所需的MC.7.G5细胞与靶细胞比例添加到靶细胞中。细胞在添加有IL-2和IL-15的靶细胞培养基中共培养，靶细胞还单独或与1％Triton X-100洗涤剂孵育，分别得到靶细胞自发释放的铬和靶细胞中的总铬。孵育后，在37℃和5％CO2下，收集上清液(总体积的10％)，在96孔聚对苯二甲酸乙二醇酯板(Perkinelmer)中与Optiphase supermixscintillation mixture(Perkinelmer)混合，密封，并在1450Microbeta计数器(Perkinelmer)上间接测量释放的铬量。MC.7.G5细胞溶解特异性靶细胞的百分比按以下公式计算：(实验释放[MC.7.G5细胞和靶细胞]–靶细胞自发释放)/(靶细胞总释放–靶细胞自发释放)×100。
结果
与用PBS转化的癌细胞(阴性对照)相比，MC.7.G5细胞诱导的细胞溶解在MR1-MOP和MR1 mRNA构建体诱导的肿瘤细胞系中得到增强。MC.7.G5将对健康细胞保持惰性，因为(i)健康肝细胞和胰腺细胞不会由于存在miRNA结合序列而翻译MR1；(ii)MC.7.G5细胞不会杀死健康细胞。
实施例9：在体内评估MR-1是否增加HSV共感染的感染性
PMBC人源化小鼠中Hep3B和BxPC-3细胞的皮下异种移植
为了研究T淋巴细胞在肿瘤部位的募集，在人外周血单个核细胞(PBMC)人源化小鼠体内进行了活体实验，所述活体实验允许对人T淋巴细胞检测。将PBMC注射到免疫缺陷小鼠体内，如NSGTM/和BRG，可得到人源化小鼠。
Hep3B和BxPC-3细胞用PBS(MatrigelTM)以1:1重悬，然后被注射到每只小鼠的右侧。通过观察和触诊，每周监测肿瘤生长两次。组间肿瘤大小充足且均匀者可用于进行治疗性试验。
MR1的肿瘤内注射及翻译的MR1蛋白的检测
在治疗期间，将配制的DMPCTx MR1-MOP、MR1或生理盐水多次瘤内注射(IT)注射到小鼠体内。在不同的动力学时间点，处死小鼠，收集肿瘤，制备FFPE块，进行免疫组化分析。还收集和制备未患病肝、胰腺和肾的FFPE块，以研究制剂的生物分布和器官保护。用抗MR1一抗和HRP偶联的二抗进行免疫组化。
结果
瘤内注射配制的DMPCTx MR1-MOP或MR1导致MR1在肿瘤细胞表面的表达。由于MOP序列中存在miRNA结合位点，当MR1-MOP在体内施用时，MR1在肿瘤细胞和未患病肝、胰腺和肾细胞中存在表达差异。然而，MR1构建体中缺失MOP序列将导致未患病肝、胰腺和肾中检测的MR1显著增加。
肿瘤生长与T淋巴细胞在肿瘤部位的募集
瘤内注射DMPCTx MR1-MOP、MR1或生理盐水后，每隔3或4天用卡尺测量肿瘤尺寸，以观察治疗对肿瘤生长的影响。
在注射后的不同时间点，小鼠被处死，肿瘤、肝、结肠和肾的一半被离解成单个细胞。器官被切碎成小块，在37℃下，用胶原酶A(Sigma)和DNA酶(Stem Cell)孵育以使细胞分离。用Fixable Live/Dead Violet Dye VIVID和表面荧光偶联抗体对单个细胞进行染色：抗CD3(PerCP)克隆UCHT1(BioLegend)，抗CD8(FITC)克隆BW135/80(Miltenyi Biotec)。然后用流式细胞仪观察单个染色细胞，以确定肿瘤部位T细胞的募集率。
同时，肿瘤、肝、结肠和肾的另一半被收集并制备成FFPE块，使用上述方案进行免疫组化分析。抗溶解caspase-3(Cell Signaling Technology)、Ki67(Pierce)、CD3(Biolegend)和CD8(Miltenyi-Biotec)的抗体分别用于观察细胞凋亡、确定增殖细胞率和T细胞的募集，包括但不限于肿瘤部位的非常规MAIT细胞。
结果
使用MR1-MOP或MR1治疗的肿瘤生长应该减少，肿瘤尺寸应该小于生理盐水处理的肿瘤，这是由于MR1限制性T淋巴细胞的募集诱导的细胞溶解。此外，与生理盐水处理的肿瘤相比，MR1-MOP或MR1治疗的肿瘤细胞凋亡率(caspase-3染色)更高，增殖率更低(Ki67染色)，肿瘤部位T细胞的募集增加。这是因为MR1的表达增强了MR1限制性T淋巴细胞的抗肿瘤作用。MR1-MOP对小鼠的肝、胰腺和肾有保护作用，在用不含MOP序列的MR1处理的小鼠中，这些器官呈现较高凋亡(caspase-3染色)，较低的增殖率(ki67染色)，较高的T细胞募集率。
实施例10:I型干扰素受体B18R的ORF选择，以及增强溶瘤病毒活性的OPS保护
本发明的目的是减少与干扰素介导的应答相关的抗病毒作用，这些应答可降低溶瘤病毒治疗的有效性，例如当用于肿瘤细胞时，包括痘苗病毒在内的痘病毒。B18R限制TLR活化后产生的IFNα的有效性(Waibler，Z.Journal of Virology；2009年2月,1563–1571)，并限制适应性T细胞应答(Gomez，C.E.等人，Journal of Virology；2012年3月,5026–5038)。
例如，如上例所述，将编码B18R作为ORF的mRNA修饰为包含具有至少三个相似或不同miRNA靶序列的MOP，并评估至少一个器官的癌细胞系和相应正常原代细胞中的mRNA的差异表达，所述器官选自：肝、胰腺、大脑和中枢神经***、肾、脾、肠道(包括食道、胃、肠、结肠和直肠)、肺、皮肤和***。用所述修饰后的B18R mRNA构建体转染癌细胞及相应的正常细胞。
B18R mRNA构建体
对于以下实施方案，使用痘苗病毒(Western Reserve strain)B18R mRNA(Genbank ACC:YP233081)。所述mRNA含有一个3'UTR，所述3'UTR包含完美匹配的MOP序列：miR122-miR192-miR30a(122-192-30a)。所述构建体是由Trilink Biotechnologies(加利福尼亚州圣地亚哥)从通用的DNA序列中合成的。这些mRNA模拟完全加工、带帽和聚腺苷酸化的mRNA，且可以通过核糖体进行翻译。相同的不含MOP序列(B18R-w/o_MOP)的构建体被合成，作为阴性对照。
体外B18R转染
为了研究B18R是否有助于联合施用溶瘤病毒的持续和复制，人肝细胞因其对溶瘤痘苗病毒(oVV)感染敏感而被使用。为了体外转染B18R构建体，从ATCC购买(HB-8064TM)人肝癌Hep3B。正常人肝细胞被用于观察肝保护，因为外源性B18R由于miR-122结合序列的保护而不会在健康的肝细胞中被翻译。
采用如下RDMPCTx技术进行mRNA的转染，转染前1天将细胞分别接种到微孔板上。第二天，用仅PBS(阴性对照)、DMPCTx B18R-MOP或B18R转染细胞。所述转染是将mRNA-DMPCTx直接添加到孔内的培养基中，并根据需要轻轻混合所培养的细胞。
免疫印迹法检测B18R
在转染后的不同时间点进行免疫印迹，以控制B18R的翻译，如下所示。去除培养基，用冷PBS冲洗细胞，用蛋白酶抑制剂(Sigma)混合物在RIPA(放射免疫沉淀分析)缓冲液(Boston Bioproducts)中溶解细胞粒子。将细胞组分从细胞质可溶性蛋白中分离出膜蛋白。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并通过电印记转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。用5％脱脂奶粉封闭TBS-Tween 20(Boston Bioproducts)后，用抗B18R或b-actin(对照)的一抗孵育膜，然后用二抗(如HRP((辣根过氧化物酶)-偶联抗体)孵育膜。然后分别使用ClarityTM Western ECL Substrate(Bio Rad)和***(LI-COR)进行蛋白质检测。
结果
转染后，B18R-MOP构建体只在Hep3B癌细胞中翻译，而健康肝细胞由于miR-122的高水平而被保留。由于缺乏MOP序列，DMPCTX B18R的构建体将导致健康和肿瘤细胞系中的高蛋白表达。免疫印迹结果示出了在两种构建体转染的Hep3B细胞的蛋白质溶解物中观察到约80kDa的带，对应于B18R蛋白，而该带仅存在于DMPCTX B18R转染的健康肝细胞中，而无MOP序列。B18R-MOP构建体转染的健康肝细胞和仅用PBS载体对照转染的两种细胞类型的蛋白质溶解产物均无条带。将在转染后的不同时间制备样本，以确定何时表达最高量的B18R蛋白。
溶瘤性痘苗病毒感染的疗效观察
如上所述，B18R通过阻断干扰素抗病毒防御机制来增强溶瘤病毒(如oVV)的抗肿瘤活性(Fu等人，2012；Mol.Ther.Vol.20,Issue 10:1871-1881)。体外观察发现B18R能使溶瘤病毒抵抗外源性干扰素对肿瘤细胞的抑制作用。为了确定在Hep3B细胞中翻译的B18R是否允许缺乏B18R的oVV的持续和复制，体外感染如下进行。用DMPCTx B18R-MOP或B18R mRNA转染或不转染Hep3B和正常肝细胞。在转染前、同时或转染后，应用Western菌株DJ2R、eGFP+、DI4L，在培养基中存在或不存在IFN的情况下，用连续稀释的缺失(oVV_DB18R)的B18R或不缺失(oVV_wt)的B18R的oVV转染。
在感染后的不同时间点，根据供应商的说明(细胞增殖试剂盒I，Sigma)，用MTT法测定转染细胞系的存活率。在550-600nm处用96孔板测量吸光度，以确定剂量效应曲线和50％有效剂量值(ED50)。
由于使用的oVV Western菌株是eGFP阳性，病毒复制情况可以通过在平板读取器上对荧光信号进行定量。
结果
转染B18R-MOP或B18R mRNA构建体的Hep3B癌细胞都能高水平的表达B18R蛋白，这可能导致对外源性干扰素(IFN)的耐药。因此，转染的细胞将被oVV_DB18R感染并杀死。在IFN存在下，用B18RmRNA构建体转染的健康肝细胞也会产生类似的结果。然而，B18R-MOPmRNA构建体转染的健康肝细胞在IFN存在下对oVV DB18R的易感性显著降低，这是因为未患病肝中高水平的miRNA-122被抑制，并且在mRNA构建体中存在MOP序列。
无论是否存在IFN，所有转染细胞系都对oVV_WT的感染敏感。事实上，B18R蛋白可以被病毒本身翻译。最后，在培养基中没有IFN的情况下，所有转染细胞系都对oVV_DB18R或oVV_WT敏感。总之，这些结果表明，外源性转染的B18R作为一种治疗增强因子，与目前的制剂一起，将改善溶瘤病毒的复制和在IFN存在下的持久性。
例11：B18R体内实验
Hep3B和BxPC-3细胞在PBMC人源化小鼠的皮下异种移植
为了确定外源性B18R是否阻断诱导oVV的持续和复制的干扰素α跨膜信号通路，在人外周血单个核细胞(PBMC)人源化小鼠上进行了体内实验。将PBMC注射到免疫缺陷型小鼠体内得到人源化小鼠，如NSGTM/和BRG小鼠。
Hep3B细胞用PBS(MatrigelTM)以1:1重悬。然后注射到每只小鼠的右侧。通过观察和触诊，每周监测肿瘤生长两次。组间肿瘤尺寸充足且均匀者可用于进行治疗性试验。
肿瘤内注射B18R及翻译的B18R蛋白的检测
在治疗期间，将配制的DMPCTx B18R-MOP、B18R或生理盐水瘤内(IT)注射入小鼠。在不同的时间点，小鼠被处死，肿瘤以及肝肾等未患病器官被收集起来，并在液氮中快速冷冻。每个组织都在N2中研磨，过滤后，将粉末重新悬浮于RIPA缓冲液中进行免疫印迹检测，如上所述。
结果
瘤内注射DMPCTx B18R-MOP或B18R都会诱导B18R在肿瘤细胞中的翻译。可以在肿瘤细胞和具有B18R-MOP的未患病肝组织中实现B18R的差异表达。然而，B18R mRNA中缺乏MOP将导致健康肝和肾细胞中B18R水平升高。
溶瘤性痘苗病毒(oVV)的效力
在将配制的DMPCTx B18R-MOP、B18R或生理盐水施用于肿瘤之前、期间或之后，随机分组的小鼠静脉注射溶瘤痘苗病毒(Western株；DJ2R、eGFP+、DI4L)或病毒缓冲液。每3或4天用卡尺测量肿瘤尺寸，观察联合治疗对肿瘤生长的影响。治疗后不同时间点处死小鼠，然后收集肿瘤和肝，并制备成FFPE块进行进一步的免疫组化分析。用抗cleaved caspase-3抗体(Cell Signaling Technology)进行IHC以观察细胞凋亡，Ki67(Pierce)检测增殖细胞的增殖率，然后用适当的HRP偶联二级抗体孵育。由于本实验所用的oVV株携带eGFP基因座，因此可以用抗GFP抗体进行IHC检测，以分析oVV在肿瘤部位的复制和持续性。
结果
与单独使用oVV或病毒缓冲液治疗的肿瘤相比，使用B18R-MOP或B18R预处理的肿瘤对oVV感染的易感性更强，体积显著更小，显示更高的GFP信号(感染标记物)和凋亡(caspase-3染色)，增殖率较低(ki67染色)。与不含MOP序列的B18R小鼠(其器官更容易受到oVV感染)相比，B18R-MOP治疗的小鼠肝将免受oVV感染。与同时给药B18R和oVV或在oHSV注射后注射B18R相比，在oVV感染前用B18R预处理肿瘤，观察到更好的肿瘤抑制作用。由于肿瘤内注射B18R将通过降低肿瘤内的免疫***应答来引发肿瘤感染oVV，因此与未经B18R预处理的肿瘤相比，我们将观察到更高的oVV复制率和肿瘤内oVV的持续性。
实施例12：IL-12和GM-CSF mRNA转染人PBMC
IL-12和/或GM-CSF是免疫调节性细胞因子，可以与抗肿瘤治疗，如与***毒联合使用或作为佐剂与疫苗组合物联合应用。在本实验中，DMPCTx hGM-CSF(人GM-CSF)和hdcIL-12(双链人IL-12p70)或hdcIL-12(单链人IL-12p70)，含有或不含MOP序列，在体外以不同剂量施用于人PBMC。hscIL-12p70和hGMCSF的非编码mRNA也被用作阴性对照(NC)。细胞内蛋白表达与mRNA给药剂量有关。
LNP免疫调节剂IL-12和GM-CSF的体外转染效率及毒性
从5个不同供体(18-55岁)中获得的PBMC细胞(来自AllCells)，并在37℃、在5％CO2的气氛中于AIM V培养基(Gibco)中悬浮培养。在圆底96孔板上每孔接种30万个PBMC细胞，并用编码含有或不含有MOP序列的IL-12单链或双链变异体或GM-CSF的DMPCTx配制的mRNA转染所述细胞(见下文表6)。阳性对照用含有30万个PBMC细胞的孔进行，其中在培养基中加入LPS(Thermofisher，00-4976)至最终浓度为100ng/ml，以验证PBMC的功能。阴性对照在没有PBMC细胞也没有LNP转染(BG-C)的孔中平行进行，孔中仅15万个未转染的PBMC细胞(LC)，以及30万个未转染PBMC细胞(HC)。
转染4小时后，添加人AB热灭活血清(Sigma)至最终浓度为1％。转染6小时后，将每孔的60μL上清液转移到新的96孔板上，离心去除细胞，并在-80℃下冷冻上清液用于MSD分析。转染21小时后，以1.1％的最终浓度将吐温-20添加到HC孔中。转染24小时后，用离心法收集各孔的所有上清液。60μL上清液在-80℃下冷冻用于MSD分析，其余130μL在-80℃下冷冻用于乳酸脱氢酶分析(LDH分析)。
根据制造商的说明，使用U-PLEX分析(Meso Scale Discovery)对人细胞因子IL-12p70和GM-CSF进行MSD分析。使用Graph Pad Prism，数据被绘制为一个条形图。
根据制造商的说明，使用Roche(4744926001)的细胞毒性检测试剂盒(LDH)进行LDH分析。
结果
图12示出了转染6h后从含有MOP构建体中检测到的人IL-12P70和GM-CSF水平。MOP在mRNA中的存在使肝、皮肤、肌肉和肾组织的脱靶表达最小化。LDH分析显示，相比于阴性对照，编码IL-12单链或双链变异体或GM-CSF的DMPCTxmRNA对PBMC的细胞毒性没有明显的诱导作用。
表6 IL-12 MOP和GM-CSF MOP的ORF和3'UTR
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实施例13：表达具有MOP序列的mRNA的荧光素酶的DMPCTx的体内生物分布
为了研究本发明在体内特定ORF差异表达的潜力，将萤火虫荧光素酶(FLuc)mRNA如实施例4所示进行修饰，以在mRNA构建体的3'UTR中包含三个miRNA靶序列的两个不同组合。第一mRNA-MOP序列包含Let7b、miRNA-126和miRNA-30a的靶序列(组2)。第二mRNA-MOP序列包含miRNA-122、miRNA-192、miRNA-30a的靶序列(组3)。所有MOP构建体都包含与相应的miRNA完美匹配的靶序列。所述构建体中还使用了一个不含MOP序列的对照Fluc mRNA序列(组1)。
如上所述制备制剂，并具有以下特点：
表7递送制剂的体内生物分布
组 mRNA 浓度(mg/mL) 封装效率(％) Zave(nm) 聚合物分散性指数(PDI)
1 FLuc 0.319 95.2 70.8 0.117
2 FLuc-let7b-126-30a PM 0.284 92.8 73.6 0.116
3 FLuc-122-192-30a PM 0.359 95.6 73.7 0.099
动物。所有的实验都是在英国诺丁汉的皇家生物科学公司按照当地的法规进行的。所有的小鼠都是从Charles River获得。
非肿瘤生物分布研究。健康7～9周龄雌性balb/c小鼠经尾静脉注射1mg/kg编码萤火虫荧光素酶(FLuc)的DMPCTx-mRNA的制剂，所述制剂含有或不含MOP。使用Living ImageSoftware软件(Caliper LS，US)分别在给药前(0小时)、给药后3.5小时和给药后24小时采集全身图像，并量化荧光素酶信号量。显像前15min，小鼠皮下注射150mg/kg d-荧光素，10min后麻醉，置于显像室进行荧光检测(腹侧和背侧)。在24小时的时点，切除肝、肾、脾和肺并进行离体成像。
肿瘤生物分布研究。将人肝癌细胞(Hep3B细胞)(2x106细胞)皮下植入8～10周龄Fox Chase SCID小鼠的左侧。根据卡尺测量肿瘤负荷，选择肿瘤尺寸约100mm3的小鼠作为研究组。编码萤火虫荧光素酶(FLuc)的制剂(DMPCTx-mRNA)，无论是否有MOP序列，以1mg/kg的剂量注入肿瘤内。使用Living Image Software(Caliper LS，US)分别在给药前(0小时)、给药后3.5小时和给药后24小时采集全身图像，并量化荧光素酶信号量。显像前15min，小鼠皮下注射150mg/kg d-荧光素，10min后麻醉，置于显像室进行荧光检测(腹侧和背侧)。在24h时，切除肿瘤、肝、肾、脾、肺，并进行离体成像。
结果
图16(a)显示，在转染3.5小时后，在所有组的全身成像中都可以看到高水平的荧光素酶表达，包括含有MOP的构建体(组2和3)和不含MOP的构建体的对照组(组1)。然而，在所述两个含有MOP的构建体中，蛋白质的表达有1-2个数量级的减少。这一趋势在24小时后仍然存在，此时所有组的总蛋白表达略低。
所述MOP的存在在最大限度地减少肝、肺、脾和肾组织中的体内脱靶表达方面非常有效。在图16(b)中，与组1(无MOP的对照)相比，组2和组3(含MOP构建体)小鼠器官的离体成像显示肝(miR-122)、肺(let7b、miR-126、miR30a)、脾(let7b、miR-126)和肾(miR-192、miRr-30a)中的荧光素酶表达降低，证实两种MOP构建体都通过表达ORF提供了宝贵的多器官保护。
虽然最大限度地减少健康组织中的脱靶效应很重要，但确保蛋白质在肿瘤等靶组织中的表达也很重要。表8显示，当存在Hep3B肝肿瘤时，三组的蛋白质表达量全部都保持在相同的数量级。此外，当每个MOP在非荷瘤体内研究中存在时，健康肝中的荧光素酶表达降低了2-3个数量级。
表8.离体成像获得的生物发光(BLI)值(光子/秒)
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虽然本发明的具体实施方案已在本文中详细公开，但其仅是以示例的方式来说明本发明的目的。上述实施方案并不旨在限制所附权利要求的范围，如下所示。发明人预期可以对本发明进行各种替换、改变和修改而不背离根据权利要求限定的本发明的精神和范围。包含在根据本发明实施方案的构建体和载体中的任何非人核酸和/或多肽序列可以从英国、美国及欧盟内的来源获得。据发明人所知，没有任何受获取及利益分享协议或相关的传统知识约束的遗传资源。

Claims (16)

1.一种疫苗组合物，包含：
至少第一mRNA构建体，所述第一mRNA构建体包含至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包含至少一个器官保护序列(OPS)，所述OPS包括至少第一和第二微RNA(miRNA)靶序列，其中所述至少第一和第二微RNA靶序列中的每一个都被优化为与不同的对应miRNA序列杂交；
还包含至少第二mRNA构建体，所述第二mRNA构建体包含至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码选自IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα和GM-CSF的促炎细胞因子，其中所述第一ORF编码选自细菌蛋白和/或病毒蛋白的抗原；以及
体内递送组合物；
其中所述第一和第二mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上。
2.根据权利要求1所述的组合物，包含：ORF，所述ORF编码包含全部或部分冠状病毒蛋白的抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述冠状病毒蛋白选自冠状病毒刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白或核壳蛋白。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述冠状病毒蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述ORF编码SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述递送组合物选自脂质体、脂质粒子和病毒载体。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述递送组合物选自脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二ORF编码选自IL-7、IL-15、IL-17和IL-21的细胞因子。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少第一和第二miRNA靶序列选自能够与：miRNA-122、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、Let7 miRNA家族、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-148a/b、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215、miRNA-30a、amiRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-877、miRNA-4300、miRNA-4720和miRNA-6761结合的一条或多条序列。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少第一和第二miRNA靶序列选自SEQ IDNO:44-57中的一条或多条序列。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二ORF编码IL-12蛋白或其衍生物、激动剂或同系物。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一mRNA还包含至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、TGF-β、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、M-CSF、G-CSF和GM-CSF的促炎细胞因子。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述第二ORF编码选自选自IL-7、IL-15、IL-17或IL-21的细胞因子。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包含至少一个OPS，所述OPS包括至少第三和第四miRNA靶序列，并且其中所述至少第三和第四miRNA靶序列中的每一个都被优化为与不同的对应miRNA序列杂交。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述至少第三和第四miRNA靶序列包含能够与：miRNA-122、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、Let7 miRNA家族、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-148a/b、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215、miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-877、miRNA-4300、miRNA-4720和miRNA-6761结合的一条或多条序列。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述至少第三和第四miRNA靶序列选自SEQ IDNO:44-57中的一条或多条序列。
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