CN115287250A - 体外皮肤模拟器官及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及体外皮肤模拟器官及其构建方法与应用。本发明利用三维细胞培养技术，建立一种高通量、低成本测试化妆品成分安全性的皮肤类器官试剂盒。本发明形成了与人体皮肤类似的、具有微小体积的皮肤模型，该模型与微流控芯片技术相结合，在持续灌流培养条件下可以保持细胞长时程活性，可用于多条件、高通量微流控培养体系进行细胞活性检测，解决了化妆品安全性检测的问题。

Description

体外皮肤模拟器官及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及体外皮肤模拟器官及其构建方法与应用。
背景技术
皮肤是包在身体表面，直接同外界环境接触，具有保护、***、调节体温和感受外界刺激等作用的一种器官，是人的身体器官中最大的器官。皮肤覆盖于人体表面，分为表皮和真皮两层，表皮在皮肤表面，又可分成角质层和生发层两部分。已经角质化的细胞组成角质层，脱落后就成为皮屑。生发层细胞不断***，能补充脱落的角质层。生发层有黑色素细胞，产生的黑色素可以防止紫外线损伤内部组织。真皮则是致密***，有许多弹力纤维和胶原纤维，故有弹性和韧性。皮肤是人体感知和接触外界环境的最外屏障，也最容易受到损伤。
自古以来，人们尝试利用各种物质对皮肤进行保护，现代社会中，各种化妆品更是琳琅满目。化妆品质量安全关乎企业发展和消费者的切身利益，开发快速有效的化妆品质量安全检测技术是保障化妆品质量的基石。随着大国间贸易的增加，检测通量大幅度提升，开发高通量检测技术和现场快速检测技术已成为当下化妆品检测领域的热点，现场快速检测可大大缩短分析周期，提高工作效率。
目前在化妆品功效评价方面，主要采用的为二维细胞培养方法，具有易操作、费用低和可大量应用等优点。但由于细胞在平面内生长，无法构建出一个符合人体皮肤生长环境的立体微环境，造成评估结果的不准确。因此，初筛一般用二维培养的细胞进行测试；精准筛选用体外构建的皮肤模型进行筛选，这种皮肤模型制备周期约21天，且一块底面积为0.75平方厘米的体外皮肤模型价格约2000元，且仅能测试一种受试物。因此，构建一种与人体真实皮肤微环境相似的三维皮肤模型迫在眉睫。
微流控***是一种以微流体技术为核心的微型芯片高通量分析***，已广泛应用于生物、化学、医学等分析检测领域。微流控***具有高通量、超微量、高度集成等特点，可同时进行数个，甚至数十个、数百个平行试验，严格控制相同的实验条件；微流控***还可以提供与人体内环境相似的复杂的环境因素，如流体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等理化刺激，模拟体内的微环境。但细胞在微流控***的微小环境中，很难实现良好的生长。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供体外皮肤模拟器官及其构建方法与应用。
本发明提供的体外皮肤模拟器官，包括：含有成纤维细胞的真皮微球，和包被在所述真皮微球外的多层表皮细胞。
本发明中，所述体外皮肤模拟器官为球形，直径为4.5mm～34.8mm。
本发明中，所述成纤维细胞和表皮细胞的数量比为(2000～10000)：(3000～10000)。
本发明提供的体外皮肤模拟器官体积微小，且培养所在的芯片的空间也非常有限，为了维持细胞在芯片中的良好生长，本发明对细胞培养的试剂进行了筛选和优化。
本发明还提供了体外皮肤模拟器官的试剂组合，其包括成纤维细胞培养基、表皮细胞培养基和角质分化培养基。
所述成纤维细胞培养基：包括DMEM培养基、新生牛血清1vol％～20vol％和1vol％双抗。一些实施例中，所述成纤维细胞培养基由DMEM培养基、新生牛血清10vol％和1vol％双抗组成。
所述表皮细胞培养基：包括基础培养基和L-谷氨酰胺2～10mM，肾上腺素0.5～5μM，Adenin 10～50μg/ml，氢化可的松10～200ng/ml，T3 5～50μM，胰岛素1～10μg/ml，EGF 2～20ng/ml。一些实施例中，所述表皮细胞培养基由L-谷氨酰胺6mM，肾上腺素1.0μM，Adenin24.3μg/ml，氢化可的松100ng/mL，T3 20μM和胰岛素5μg/mL，EGF 10ng/ml组成。一些实施例中，所述表皮细胞培养基中的基础培养基为DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为(70～80):(20～30)。作为优选，所述表皮细胞培养基的基础培养基中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为75:25。
所述角质分化培养基：包括基础培养基和L-谷氨酰胺2～10mM，肾上腺素0.5～5μM，rh-TGF-α0.1～2.0ng/ml，氢化可的松10～200ng/ml，胰岛素1～10μg/ml，转铁蛋白1～50μg/ml，EGF 2～20ng/ml。一些实施例中，所述角质分化培养基由基础培养基和L-谷氨酰胺10mM，肾上腺素1.0μM，rh TGF-α0.5ng/mL，氢化可的松100ng/mL，胰岛素5μg/mL，转铁蛋白5μg/mL和rh-EGF 10ng/ml组成。一些实施例中，所述角质分化培养基中的基础培养基为DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为(60～70):(30～40)。作为优选，所述角质分化培养基的基础培养基中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为65:35。
本发明筛选获得的培养试剂的组合中，各种培养基在体外皮肤模拟器官的构建过程中都起到至关重要的作用，前期研究表明，在此基础上更改培养基组分或浓度都会对培养效果起到显著的负面作用，或者是延长培养时间，或者是影响细胞的活性。
本发明中，所述试剂组合中还包括胶原凝胶。一些实施例中，所述胶原凝胶中，胶原为鼠尾Ⅰ型胶原。所述胶原凝胶中，胶原的质量分数为1.5mg/mL。
本发明还提供了一种微流控芯片***，该***包括注射泵、连接通道1、连接通道2、培养液入口、受试物入口、微流控芯片和收集管。
整个微流控***由微流控芯片及外接注射泵构成。本发明微流控芯片主要由底层玻片，微流体通道层，PC膜层，细胞培养小室和上层超洁净玻片的顶面组成(图2b)。可在芯片内实现从培养-诱导分化-检测一体化的长期培养。随着不同培养阶段改变不同培养基及液体灌流速度，模拟皮肤内血液流动，给予皮肤类器官适当剪切力，并且保证皮肤类器官有足够营养和氧气，使得皮肤类器官向更接近真实皮肤结构发育；并且检测过程中通过控制液体流速，更换检测液体，将复杂的检测过程集成在一块芯片上，更加高效快速的得出所需数据。
本发明还提供了一种微流控芯片，包括芯片和本发明所述的体外皮肤模拟器官。
本发明中，所述芯片依次由底层玻片，微流体通道层，PC膜层，细胞培养小室、上层超洁净玻片和顶面组成；其中，所述细胞培养小室、所述微流体通道层，所述PC膜层与所述底面固定连接，所述细胞培养小室、所述上层洁净玻片与所述顶面可拆卸式连接。
本发明所述微流控芯片中，PC膜起支撑作用，其设置在微流体通道层，和上层超洁净玻片之间，在PC膜存在的一层中设置有细胞培养小室；且PC膜层与细胞小室的位置相对应。
所述芯片中，微流体通道层设置培养液入口、受试物入口，所述培养液入口和受试物入口与集流通道连通，所述集流通道与细胞培养小室组的入口连通，所述细胞培养小室组为多列，且多列细胞培养小室组的入口沿分流通道排布；每列细胞培养小室的出口用于与一个检测液收集池连接。
本发明中，所述集流通道与四列细胞培养小室组连通，每列细胞培养小室的数量为3个。即本发明所述细胞培养小室阵列为3×4，阵列通量为12个，每个细胞培养小室间隔为1mm。检测时，每列小室检测一种受试物，每个芯片可以同时检测1种受试物，3个药物浓度。培养小室直径范围为4.5mm～34.8mm，优选的直径为6mm；进液孔和出液孔直径一致，范围为0.2-1.0mm，优选的直径为0.6mm；
所述细胞培养小室呈圆柱形，顶部覆盖超洁净玻片，底部通过PC膜封接在微流体通道层。
本发明中，所述芯片在细胞培养过程中，整体放置于细胞培养箱中，随着培养的不同阶段通过注射泵调节液体流速而调整液面高度。
本发明提供的微流控芯片中各元件的尺寸经过合理优化，在有限的空间内，在保证细胞培养效果的基础上，尽可能多的划分更多的培养小室，从而进一步提高筛选的效率。
本发明还提供了所述的微流控芯片的制备方法，其包括：
在所述细胞培养小室中以所述试剂组合中的成纤维细胞培养基培养成纤维细胞制备真皮微球；
以所述试剂组合中的表皮细胞培养基培养表皮细胞后与胶原凝胶混合制得表皮细胞凝胶悬液；
将所述表皮细胞凝胶悬液添加入含有所述真皮微球的细胞培养小室中，使所述表皮细胞凝胶包裹真皮微球、凝固；
以所述试剂组合中的角质分化培养基使表皮细胞向多层分化，制得所述微流控芯片。
在本发明所述微流控芯片的制备方法中，真皮微球的制备由注射泵泵入培养液，角质分化培养基也由注射泵泵入，而表皮细胞凝胶悬液的加入由人工完成，既保证凝胶能够包裹真皮微球也避免通道的堵塞。
本发明中，所述真皮微球的制备步骤中，所述培养的0～24h不泵入液体，24h～72h泵入所述试剂组合中的成纤维细胞培养基，流速为1μl/min～30μl/min；
本发明中，所述表皮细胞向多层分化的步骤中，分化的时间为21天，其中第1～7天，所述试剂组合中的角质分化培养基泵入的流速为5μl/min，第8～21天，所述试剂组合中的角质分化培养基泵入的流速为10μl/min。
在本发明中，微流控芯片制备的过程中，芯片的两个入口即培养液入口和受试物入口都泵入相同的培养液。而在有效成分筛选的过程中，培养液入口仅泵入培养液，而受试物入口要泵入受试物溶液。
本发明还提供了一种有效成分筛选方法，其包括：
将有效成分加入本发明所述的微流控芯片的细胞培养小室中，收集培养液和/或细胞，进行检测。
本发明中所述的有效成分是指化妆品中的有效成分，其包括化学单质、组合物或提取物。所述提取包括植物源提取物，动物源提取物、微生物提取物或来自细胞培养物的提取物。所述有效成分的筛选中，有效成分加入芯片的流速5μl/min。
本发明中细胞培养小室组通过集流通道与入口相连通，集流通道和分流通道彼此相通，且粗细一致，培养液入口和受试物入口孔径一致，但二者的孔径小于培养小室的出口。在泵入液体的过程中，靠近培养液入口且远离受试物入口的第一组细胞培养小室中，仅流入培养液，其余三组细胞培养小室中，由培养液入口向受试物入口方向，受试物的浓度依次增加。
本发明利用三维细胞培养技术，建立一种高通量、低成本测试化妆品成分安全性的皮肤类器官试剂盒。本发明形成了与人体皮肤类似的、具有微小体积的皮肤模型，该模型与微流控芯片技术相结合，在持续灌流培养条件下可以保持细胞长时程活性、高质量细胞活性，可用于多条件、高通量微流控培养体系进行细胞活性检测，解决了化妆品安全性检测的问题。
附图说明
图1示单个小室及通道纵面视图，其中，1示细胞培养小室层、2示PC膜层、3示微流体通道层、4示底层玻片、5示细胞培养小室、6示细胞培养小室直径、7示培养液/受试物入口、8示培养液/受试物出口；
图2a示微流控芯片俯视图，其中，1示培养液入口、2示受试物入口、3示集流通道、4示分流通道、5示细胞培养小室、6示细胞培养小室组的出口；
图2b示微流控芯片侧视图，其中，1示顶面、2示细胞培养小室、3示PC膜层、4示微流体通道层、5示底层玻片；
图2c示微流控芯片泵入液体后浓度梯度，最左侧一列细胞培养小室组仅有培养液流入，其余三个细胞培养小室组中受试物的浓度自左至右浓度依次增加；
图3示三维细胞构建方法；
图4示微流控芯片***，其中1示注射泵、2示连接通道1、3示连接通道2、4示微流控芯片、5示检测液收集池；
图5示皮肤类器官微球H&E染色；
图6示细胞活性检测结果；
图7示组织相对活性的检测结果；
图8示细胞IL-1α释放量的检测结果。
图9示细胞Col-1含量的检测结果；
图10示细胞MMP1含量的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了体外皮肤模拟器官及其构建方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1微流控装置构建：
芯片采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，该材质具有易于加工成型、低毒性、光学透性好等优点，广泛用于微流控的制备。
1.1微流控芯片的设计
本发明采用标准软光刻技术加工所需图形的模板。首先，使用AutoCAD软件绘制微流控芯片图案(图1，展示为单个小室及通道纵面视图、芯片俯视图，芯片各层拆解图)。底层微流控芯片包括进液口，浓度梯度生成单元(包括分流通道和集流通道)，细胞培养小室，检测液收集池。细胞培养小室层对应底层微流控芯片的细胞培养小室。图片用高分辨率打印机将其打印在透明胶片上作为光刻掩膜。
该微流控芯片由底层、微流控芯片，PC膜层，细胞培养小室和上层超洁净玻片组成。
底层微流控芯片由上游浓度梯度生成通道和下游阵列为3×4的开放式3D细胞培养小室组成。浓度梯度生成单元有两个进液口组成，在注射泵推动下，含有不同物质的溶液从进液口泵入，依次形成0％、33％、67％、100％的浓度梯度(图2b)，并作用于下游3×4细胞培养小室。微流体通道高为100μm，宽为100μm，相邻梯度间长度为2mm。下游3×4开放式培养小室与多通道移液器相匹配，便于滴加细胞悬液，简化操作步骤。每组培养小室分别各有不同末端收集池，便于后续液体采集进行后续检测。
PC膜层，主要在组织培养过程中提供支撑作用，并且在后期Air-liquid阶段提升组织，保证器官组织在暴露在空气中。
细胞培养小室层，该层主要用于3D器官培养，培养小室阵列为3×4，阵列通量为12个，每个小室间隔为2mm；培养小室直径为6mm，小室高度为2mm；进液孔和出液孔直径一致，直径为0.6mm；
上层为超洁净玻片，培养过程中将其覆盖在3D细胞培养小室，该可拆卸式设计有利于细胞悬液滴加，器官组织的形成及Air-liquid培养。
培养过程中通过控制注射泵流速调节细胞培养中液面高度而调整不同的培养阶段。
1.2阳膜的制作方法
根据实验需要设计模型，整体芯片尺寸为3×3cm～16×16cm；用AutoCAD制作图纸并打印在透明胶片上；
1)本发明采用硅片制作阳膜。暗室中，将除污清洗干净后的硅片，使用SU-8负性光刻胶滴胶5-10s，用于制备微流体通道层和细胞培养小室层；然后将硅片放置于甩胶机上，以400～700r/min，甩胶20s～40s，使得光刻胶均匀分布在硅片表面；
2)将旋涂好光刻胶的硅片放在干燥箱中80℃1～3min；取出硅片，冷却至室温备用；
3)将制备好印刻有微流体通道层和细胞培养小室层的光刻阳膜板，依次用紫外光刻机曝光；曝光后将硅片浸泡在配制好的显影液中显影5～10min，显影完毕后取出硅片用异丙醇1～3次；
4)冲洗后将其放置于干燥箱中90～100℃干燥5～10min，取出冷却至室温；
5)PDMS层制备：根据需要称取一定量的PDMS预聚体和固化剂，两者比例为10:1，充分混匀后真空抽去混杂的气泡；把混合物倒入上述设计好的阳膜中，具体量以实验中设计的培养小室高度为标准。本发明中，培养小室的高度为5-15mm，优选的高度为6mm。75℃加热50min；取出冷却后，把PDMS层从阳膜上揭下；
6)封接：按照上述方法制备好底层微流控芯片，细胞培养小室，将PC膜封接到两层中间。(1)用等离子体处理PC膜和PDMS层1min；(2)将PC膜浸入5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中30min；(3)用双蒸水冲洗PC膜3次去除未反应的APTES；(4)用氮气吹干PC膜，处理后尽快封接；(5)将PC膜封接在底层微流控芯片和细胞培养小室之间，得到完整芯片。芯片封接应在无尘条件下完成，将制备好的芯片置于重物下过夜，使各层封接更为牢固。
芯片包含三层，底层微流控芯片包含进液口，细胞培养小室阵列，检测液收集池，细胞培养小室层具有3×4个阵列，对应底层微流控芯片小室阵列，以及中间层的PC膜层。
1.3微流控芯片***如图4，包括注射泵，含有培养基的注射器，连接通道(红色为空白组不含受试物培养基，绿色为实验组含有受试物培养基)，芯片及样品收集管。
实施例2不同培养阶段使用方法及流速规定
真皮成纤维细胞在重力作用下会形成一个致密的细胞球，形成紧密的细胞-细胞间联系；表皮细胞与胶原支架混合后滴加在真皮细胞球外，形成细胞-基质联系，由于胶原支架的加入，表皮细胞与真皮细胞球可以良好连接在一起，形成一种类似于皮肤结构的表皮-真皮连接；微流控***中，随着培养基持续泵入，给予皮肤类器官持续的营养支持，并且加速细胞代谢物质的排出，该过程可以加速皮肤类器官形成，并且保证其长时间的良好活性(图3，类器官形成流程图)。
以下实验操作描述仅表示实施在一块芯片上，该体系可同时进行4种受试物同时检测，实现高通量，自动化细胞培养。
2.1、真皮微球构建阶段
2.1.1成纤维细胞培养：
该操作步骤完全在微流控芯片中实施。
本发明芯片长度为6cm，宽度为4cm，实验过程中将所有检测芯片用无菌3M胶带固定在15×15cm玻片上，以便进行后续操作。
复苏真皮成纤维细胞至T25中，培养3天，待细胞融合度达到80-90％时，用含有0.05％EDTA-Typsin消化细胞，离心，计数；
本发明的成纤维细胞培养基为：新生牛血清体积比为10％；双抗(青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100μg/ml，体积比为1％，溶于500mlDMEM培养基中)；
2.1.2用成纤维细胞制备真皮微球结构。
采用悬滴方法，将调整好密度的成纤维细胞悬液，吸取5-50μl/滴，最优为8μl/滴，滴加在微流控细胞培养小室底面，保证每滴细胞悬液2000-10000个细胞，最优为5000个细胞，翻转培养小室将其轻轻的倒扣,此时细胞由于重力作用，细胞聚集在液滴低垂部形成细胞球组织，细胞悬液会形成液滴状,然后将培养皿放入培养箱中培养。
悬滴培养时期为保证微球形成致密结构灌流泵不泵入液体，24h后明显见液滴底部形成致密球体后，泵入成纤维细胞培养基，流速设定范围3μL/min，该流速利于真皮微球致密结构形成，持续作用72h；
2.2表皮微球构建阶段
2.2.1表皮细胞培养：
复苏冻存的表皮细胞，培养3天，待细胞融合度达到80％-90％时，消化细胞，离心，计数；
本发明采用的表皮细胞培养基由基础培养基+添加因子组成：
基础培养基：DMEM70vol％-80vol％，F12 20vol％-30vol％，
添加因子：L-谷氨酰胺6mM，肾上腺素1.0μM，Adenin24.3μg/ml，氢化可的松100ng/mL，T3 20μM，胰岛素5μg/mL，EGF 10ng/ml。
2.2.2表皮微球构建：真皮微球制备完成后(大约72h)，消化表皮细胞制得表皮细胞悬液，然后将微流控芯片取出，用胶原凝胶与调整好密度的表皮细胞悬液混合制得表皮细胞凝胶悬液，细胞密度为3000-10000个细胞，最优为8000个细胞。将细胞凝胶悬液滴加在真皮微球表面继续倒置培养，将其放置在培养箱中30min使胶原完全凝固，该步骤可以使真皮微球在液滴顶端；然后取出微流控芯片，在真皮微球表面再滴加一层细胞凝胶悬液，正置放置在培养箱中30min使胶原完全凝固，此步骤确保真皮微球夹在在双层表皮细胞凝胶悬液中间。
按照设定流速速设定范围1μl/min-30μl/min；优选的流速为5μl/min，该流速快速给予营养物质与氧气，更适于表皮微球生长。持续泵入新鲜培养基，泵入过程中保证皮肤类器官完全浸没在培养基中。浸没式培养3-10天，显微镜下观察形成中心致密，边缘被胶原包裹的皮肤类器官组织(图5)。
2.3分化阶段
将泵入的液体更换为角质分化培养基，通过灌流泵向微流控芯片中灌入角质分化培养基。
a)分化1-7天，灌流泵设定流速为5μl/min，分化前期微球需要更多营养物质促进表皮干细胞增殖，因此低流速利于维持稳定良好微环境；
b)分化8-21天，灌流泵设定流速为10μl/min，分化后期微球向上向外分化为多种皮肤细胞，因此高流速保证细胞营养物质的同时给予微球更多氧气，以保证皮肤角质化的形成。
本发明采用的角质分化培养基由基础培养基和添加因子组成：
基础培养基：DMEM60vol％-70vol％，F12 30vol％-40vol％；
添加因子：L-谷氨酰胺10mM，肾上腺素1.0μM，rh TGF-α0.5ng/mL，氢化可的松100ng/mL，胰岛素5μg/mL，转铁蛋白5μg/mL，EGF 10ng/ml。
2.4微小类皮肤的组织学鉴定：
收集分化所得皮肤类器官模型于OCT胶包埋，冷冻于-20℃，进行H&E染色。所得组织皮肤用OCT包埋，冷冻处理后做8μm组织切片，经苏木精-伊红染色，95％酒精Ⅰ→95％酒精Ⅱ→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→1:1无水乙醇：二甲苯→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，脱水和透明后，树胶封片，用显微镜观察并拍照(图5)。本发明形成良好组织结构，细胞核染色较深，由于细胞体积微小，细胞活性较好，细胞微球内核细胞凋亡较少；微球外层可见良好结构的多层表皮层细胞。
实施例3检测阶段
按照方法的不同，将检测分为两组：对照组为二维细胞培养组，实验组为本发明方法构建的皮肤类器官模型，以COL-1含量为指标，对5种受试物进行评价。
3.1受试物选择：
本发明选取皆为具有明显抗衰老作用的单体化合物，如维生素C、烟酰胺、积雪草苷、葡萄籽提取物、羽衣草提取物；空白对照为DMEM溶液。
维生素C浓度：1mg/mL；
烟酰胺浓度、积雪草苷浓度、葡萄籽提取物浓度：0.1mg/mL；
羽衣草提取物浓度：0.01mg/mL；
将上述受试物溶液通过注射器的通道注入芯片中的培养小室，两通道其一注入含有受试物的培养基，另一通道注入不含有受试物的培养基，通过控制流速生成不同受试物浓度梯度(图2-c)。
3.2自然培养状态下检测两组细胞活性：
采用CCK-8法检测自然培养状态下，对照组细胞及皮肤类器官的细胞活性。操作步骤如下：
3.2.1对照组：二维细胞培养组
a.消化收集细胞，将一定浓度的细胞接种于96孔板中，孵育24h、48h、72h后分别检测细胞活性；
b.每孔加入200ul新鲜角质分化培养基，继续静态培养24h，DMEM作为对照组；
c.根据CCK8测定细胞活力方法进行操作，每孔加入20ulCCK8溶液，置于孵箱中孵育4h，吸出培养基使用酶标仪测定其在490nm处吸光值OD，计算细胞活力。
细胞活力％＝(A样品组OD值-A空白组OD值)/(A对照组OD值-A空白组OD值)×100％
3.2.2实验组：
a.按实施例2所述方法构建皮肤类器官组织，按照8.3μL/h流速持续泵入角质分化培养基，培养24h；
b.根据CCK8测定活力方法进行操作，将泵入体系换为含有相同浓度的CCK8溶液，待通道中全部复孔充满CCK8溶液后停止注射泵泵入，置于孵箱中孵育4h，开启注射泵将培养基泵出并收集，使用酶标仪测定其在490nm处吸光值OD，计算细胞活力。
细胞活力％＝(A样品组OD值-A空白组OD值)/(A对照组OD值-A空白组OD值)×100％
c.检测结束后换为角质分化培养基继续培养，按照上述方法检测48h、72h细胞活性。
结果如图6，CCK8方法常用于检测细胞存活率和增殖率，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多产生的Formazan就越多，颜色也会越深。自然培养状态下，二维细胞培养方法24h-72h可以保持细胞良好活性，96h以后细胞活性逐渐降低；本发明实施例2方法构建的组织24h-72h细胞活性良好，且比二维培养方法的细胞活性高，72h-120h活性保持稳定没有出现活性降低情况。这与本发明方法中持续灌流培养相关，持续不断新鲜培养基促进细胞保证良好细胞活性。
3.3检测实验组中，受试物刺激后IL-1α表达量：
通过ELISA法检测物质受试物作用于对照组和本发明方法组，释放IL-1α含量的影响，具体操作步骤如下：
3.3.1对照组：二维细胞培养组。
a.消化收集细胞，用培养基重悬后，以每孔2ml接种于6孔板，置于培养箱中孵育24h；
b.小心吸出6孔原培养液，每孔加入3ml含受试物的DMEM培养基，空白组中加入3ml无受试物DMEM，置于培养箱中孵育24h；
c.小心收集上清液到离心管中，离心3000r，10min，去除细胞碎片等杂志，取上清液用于人IL-1α含量检测；
d.按照人IL-1αELISA试剂盒说明书进行实验操作后用酶标仪检测各孔吸光值(OD值)，以540nm为检测波长，630nm为参照波长；
3.3.2本发明方法组：
a.消化收集细胞，按实施例2的方法构建皮肤类器官组织，置于微流控培养小室中培养24h，持续泵入培养基；
b.将泵入的通道培养基，左侧为空白组不含受试物的DMEM，右侧为实验组含有受试物的DMEM培养基，置于培养箱中孵育24h，流速为125μL/h(以维生素C为例，浓度为1mg/mL，该流速保证与二维培养组在相同时间24h接触到的受试物质量相同)持续泵入培养基；
c.按照芯片设计，浓度梯度生成单元可形成4种浓度梯度，从左至右依次分别为0％，33％，67％，100％，并且作用于下游细胞培养小室；
d.检测液收集池处收集泵出的培养基转移到离心管中，离心3000r，10min，去除细胞碎片等杂质，取上清液用于人IL-1α含量检测；
e.按照人IL-1αELISA试剂盒说明书进行实验操作后用酶标仪检测各孔吸光值(OD值)，以540nm为检测波长，630nm为参照波长；
只有当受试物处理后的组织活性＞50％的情况下才测定IL-1α，以pg/mL表示；IL-1α＝处理组织IL-1α-对照组IL-1α。
判定标准：结合组织活性和IL-1α释放的最终结果判定
测试结果 刺激性分类结论
平均组织活性≤50％ 刺激性(I)R38
平均组织活性＞50％且IL-1α释放量≥50pg/mL 刺激性(I)R38
平均组织活性＞50％且IL-1α释放量＜50pg/mL 非刺激性(NI)
本发明对5种受试物皮肤刺激性的测试结果：如下
Figure BDA0003786612590000131
结果如图7～8：
细胞受到受试物刺激后会释放炎性因子，刺激性越大炎性因子释放量越多，因此在评估受试物刺激性时，除了测定组织活性更要测定炎性因子IL-1α的释放量，提高对受试物刺激性的预测程度。
本发明中采用的两种方法检测的组织活性和IL-1α含量，与对照组相比，本发明方法所测得的活性相对较高，IL-1α存在差异但差异并不明显。两组方法测定的受试物分类判断一致。
3.3检测实验组和对照组中，五种受试物对两组细胞产生的COL-1含量的影响：
通过ELISA法检测五种受试物作用于对照组和本发明方法组分泌到胞外的COL-1含量的影响，操作步骤如下：
3.3.1对照组：二维细胞培养组。
e.消化收集细胞，用培养基重悬后，以每孔2ml接种于6孔板，置于培养箱中孵育24h；
f.小心吸出6孔原培养液，每孔加入3ml含受试物的DMEM培养基，空白组中加入3ml无受试物DMEM，置于培养箱中孵育24h；
g.小心收集上清液到离心管中，离心3000r，10min，去除细胞碎片等杂志，取上清液用于人COL-1含量检测；
h.按照人1型胶原ELISA试剂盒说明书进行实验操作后用酶标仪检测各孔吸光值(OD值)，以450nm为检测波长，630nm为参照波长；
3.3.2本发明方法组：
f.消化收集细胞，按实施例2方法构建皮肤类器官组织，置于微流控培养小室中培养24h，持续泵入培养基；
g.将泵入的通道培养基，左侧为空白组不含受试物的DMEM，右侧为实验组含有受试物的DMEM培养基，置于培养箱中孵育24h，流速为125μL/h(以维生素C为例，浓度为1mg/mL，该流速保证与二维培养组在相同时间24h接触到的受试物质量相同)持续泵入培养基；
h.按照芯片设计，浓度梯度生成单元可形成4种浓度梯度，从左至右依次分别为0％，33％，67％，100％，并且作用于下游细胞培养小室；
i.检测液收集池处收集泵出的培养基转移到离心管中，离心3000r，10min，去除细胞碎片等杂质，取上清液用于人COL-1含量检测；
j.按照人1型胶原ELISA试剂盒说明书进行实验操作后用酶标仪检测各孔吸光值(OD值)，以450nm为检测波长，630nm为参照波长；
根据标准品的已知浓度和所测OD值(OD450-OD630)计算标准曲线回归方程(R2＞0.98)，将样品孔的OD值代入计算所测样品的浓度，在乘稀释倍数即得到原样品实际COL-1浓度。
COL-1相对产量(％)＝COL-1浓度(受试物)/COL-1(空白对照组)×100％
结果如图9：COL-1是皮肤中含量最多的胶原蛋白，是构成胶原纤维的最主要成分，而胶原纤维是皮肤结构的职称框架，对皮肤的外观状态起到至关重要的决定作用。通过检测受试物对二维细胞和本发明方法构建的皮肤类器官COL-1产量的影响，评价受试物对其胶原含量的作用。结果如图：
本发明中采用的受试物皆为具有抗衰老作用的化合物。与对照组相比，受试物维生素C、烟酰胺、积雪草苷、葡萄籽提取物、羽衣草提取物加入后均能促进COL-1分泌，且本发明方法中分泌COL-1含量比二维培养方法高。说明受试物刺激后，本方法构建模型更易促进COL-1分泌。
3.4检测五种受试物对两组细胞产生的MMP-1含量的影响：
通过ELISA法检测五种受试物作用于对照组和本发明方法组分泌到胞外的MMP-1含量的影响。
结果如图10，基质金属蛋白酶(MMPs)降解真皮胞外基质在皱纹等皮肤衰老外观的呈现中发挥极其重要的作用。本发明中采用的受试物皆为具有抗衰老作用的化合物。与对照组相比，受试物维生素C、烟酰胺、积雪草苷、葡萄籽提取物、羽衣草提取物加入后均能降低MMP1分泌，且本发明方法中分泌MMP-1含量比二维培养方法低。说明受试物刺激后，物质抗衰作用明显，抑制MMP1分泌，并且本方法构建模型抑制明显。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.体外皮肤模拟器官，其特征在于，包括：含有成纤维细胞的真皮微球，和包被在所述真皮微球外的多层表皮细胞；所述体外皮肤模拟器官为球形，直径为4.5mm～34.8mm。
2.根据权利要求1所述的体外皮肤模拟器官，其特征在于，所述成纤维细胞和表皮细胞的数量比为(2000～10000)：(3000～10000)。
3.构建权利要求1所述的体外皮肤模拟器官的试剂组合，其特征在于，包括：
成纤维细胞培养基：包括DMEM培养基、新生牛血清1vol％～20vol％和1vol％双抗；
表皮细胞培养基：包括基础培养基和L-谷氨酰胺2～10mM，肾上腺素0.5～5μM，Adenin10～50μg/ml，氢化可的松10～200ng/ml，T3 5～50μM，胰岛素1～10μg/ml，EGF 2～20ng/ml；
角质分化培养基：包括基础培养基和L-谷氨酰胺2～10mM，肾上腺素0.5～5μM，rh-TGF-α0.1～2.0ng/ml，氢化可的松10～200ng/ml，胰岛素1～10μg/ml，转铁蛋白1～50μg/ml，EGF2～20ng/ml。
4.根据权利要求3所述的试剂组合，其特征在于，
所述表皮细胞培养基中的基础培养基为DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为(70～80):(20～30)；
所述角质分化培养基中的基础培养基为DMEM培养基和F12培养基，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为(60～70):(30～40)。
5.根据权利要求3或4所述的试剂组合，其特征在于，还包括胶原凝胶。
6.微流控芯片，包括芯片和权利要求1所述的体外皮肤模拟器官。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于，所述芯片依次由底层玻片，微流体通道层，PC膜层，细胞培养小室、上层超洁净玻片和顶面组成；其中，所述细胞培养小室、所述微流体通道层，所述PC膜层与所述底面固定连接，所述细胞培养小室、所述上层洁净玻片与所述顶面可拆卸式连接。
8.权利要求6或7所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括：
在所述细胞培养小室中以权利要求2所述试剂组合中的成纤维细胞培养基培养成纤维细胞制备真皮微球；
以权利要求2所述试剂组合中的表皮细胞培养基培养表皮细胞后与胶原凝胶混合制得表皮细胞凝胶悬液；
将所述表皮细胞凝胶悬液添加入含有所述真皮微球的细胞培养小室中，使所述表皮细胞凝胶包裹真皮微球、凝固；
以权利要求2所述试剂组合中的角质分化培养基使表皮细胞向多层分化，制得所述微流控芯片。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，
所述真皮微球的制备步骤中，所述培养的0～24h不泵入液体，24h～72h泵入权利要求2所述试剂组合中的成纤维细胞培养基，流速为1μl/min～30μl/min；
所述表皮细胞向多层分化的步骤中，分化的时间为21天，其中第1～7天，权利要求2所述试剂组合中的角质分化培养基泵入的流速为5μl/min，第8～21天，权利要求2所述试剂组合中的角质分化培养基泵入的流速为10μl/min。
10.一种有效成分筛选方法，其特征在于，包括：将有效成分加入权利要求6或7所述的微流控芯片的细胞培养小室中，收集培养液和/或细胞，进行检测。
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