CN115267169A - 一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物残留检测及免疫分析技术领域，尤其涉及一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物、制备方法与应用，该组合物包括上转换发光纳米粒子‑抗体偶联物和磁微粒‑全抗原偶联物，其中上转换发光纳米粒子为具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子。对兽药残留进行检测时，将偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品进行磁分离，检测上清中的上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现同时对多种待检测物的定量检测。相较于传统的非均相免疫分析方法，该方法具有无需洗板、检测时间短的优点，可同时对多种待检测物的定量检测。

Description

一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物、制 备方法及其应用
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物、制备方法及其应用。
背景技术
为切实解决禁限用药物违法使用、常规农兽药残留超标等问题，农业农村部等7部门发布了《食用农产品“治违禁控药残促提升”三年行动方案》，其中对于农产品中禁药使用坚持“零容忍”，推荐快速检测手段，实行精准监管。但是，一些农兽药残留，例如水产禁药金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿这三类抗病毒、抗菌、抗寄生虫药，由于其在人体内蓄积而产生耐药性、致癌等危害已被农业部明令禁止用于养殖业，但其相当高的性价比和便捷的投放方式使其在水产养殖中屡禁不止。如何快速准确地对这些禁药的含量进行检测是检测过程中的难题。
较于传统的仪器检测方法的复杂耗时，检测高成本、周期长，无法实现现场的快速检测。而基于免疫学的分析检测方法如ELISA、胶体金免疫层析试纸条、FRET均相检测法具有特异性佳、灵敏度高与检测高效的优点，可以很好地弥补仪器检测方法的不足，适用于农、兽药残留的快速检测。
将磁分离技术与免疫学的分析检测相结合可以建立一种磁分离均相免疫检测方法，检测小分子物质的原理是：将抗体与信号元件(如酶、荧光分子、荧光蛋白等)偶联为抗体- 信号元件，同时制备抗原与磁微粒的偶联物，将两种偶联物与待测样本混合孵育反应。当待测样本中不含靶标物质时，溶液中形成“磁微粒-抗原-抗体-信号元件”复合物，将反应液置于磁场中后“磁微粒-抗原-抗体-信号元件”会吸附于反应管壁，这时分离出的上清中剩余的抗体-信号元件含量最低，加入酶促底物或给与激发光，检测出的信号值也最低；当待测样本中含有靶标物质时，靶标会竞争结合抗体-信号元件，使形成的“磁微粒-抗原-抗体-信号元件”复合物减少，而形成的“靶标-抗体-信号元件复合物”增加，将反应物置于磁场作用后，“磁微粒-抗原-抗体-信号元件”复合物将固定于反应管壁，分离出上清中的游离的抗体- 信号元件，加入酶促底物或给与激发光后，由于游离的抗体-信号元件量增加，其信号值将会上升，并且其上升的量与加入的待测靶标量呈现正向线性关系，从而实现定量检测。该方法具有无需洗板、检测时间短、线性范围宽等优点。其中常用的信号元件有量子点微球、时间分辨荧光微球、上转换发光微球等。
然而，在食品有害物质的检测过程中，食品基质中的某些本底荧光信号以及色素、有机物质等会对检测信号带来严重干扰，从而影响检测方法的准确性和灵敏度。
近年来，上转换发光纳米材料由于其光化学稳定、Stokes位移大、受环境影响小、荧光寿命长的独特优势适用于免疫学分析检测，此外通过对基质与掺杂离子组合与调节，能够获得在同一激发波长而发射波长不同的上转换发光纳米材料，可以用于基于免疫学分析的多重检测方法。目前还没有同时检测多种农兽药残留物的磁分离均相免疫检测法，例如同时检测三种水产禁药(金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿)的磁分离均相免疫检测法，有待进一步研究。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物、制备方法及其应用，通过该组合物将磁分离技术、免疫分析技术与三种不同发射波长的上转换发光纳米粒子相结合，可以同时对多种兽药残留物的含量进行检测，特别是对金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿三种水产禁药的含量进行检测，相比较于传统的非均相免疫分析方法，本发明的检测方法具有无需洗板、检测时间短，灵敏度达0.07ng/mL。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物，包括上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物，所述上转换发光纳米粒子-抗体偶联物为具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子与待检测物抗体的偶联物，所述磁微粒-全抗原偶联物为磁微粒与待检测物全抗原的偶联物。
优选地，所述上转换发光纳米粒子种类与待检测物种类对应。
优选地，所述磁微粒为含有磁性内核及包覆在其内核外表面的外壳结构，直径范围为 100-2000nm，进一步优选地，所述磁微粒为Fe3O4@聚合物。
优选地，所述上转换发光纳米粒子由氧化物、氟化物、卤氧化物等基质掺杂三价稀土离子得到。
优选地，所述待检测物为农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿，或为其他呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物、氟喹诺酮类、磺胺类常用药物中至少两种的组合。
本发明还提供了一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物的制备方法，包括步骤：(1)通过活泼酯法，分别将羧基化的上转换发光纳米粒子和羧基化的磁微粒活化；(2)将活化后的上转换发光纳米粒子通过偶联缓冲液与待检测抗体偶联、将活化后的磁微粒通过偶联缓冲液与待检测全抗原偶联，其中上转换发光纳米粒子的发射波长种类与待检测物的数量相同；(3)偶联后分别用酪蛋白酸钠封闭，得到上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物。
优选地，所述步骤(1)的活化方法为：取200μL 10mg/mL羧基化的上转换发光纳米粒子或羧基化的磁微粒到含有800μL 10mM PB，pH6.0，含0.005％SDS的离心管中，加入20mg/mL EDC和NHS溶液分别为20μL，40μL，快速混匀后，室温下活化30min；所述步骤(2)的偶联缓冲液为10mM的PB，pH5.5-7.0。
本发明还提供了一种上述多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物在同时检测农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的中的应用。
此外，本发明还提供了一种多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法，将上述上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物利用磁分离均相免疫法同时对待检测物的浓度进行定量检测。
优选地，上述检测方法包括以下检测步骤：将上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品震荡孵育后进行磁分离，检测上清中的上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现同时对多种待检测物的定量检测。
优选地，将待检测物的标准品配制为一系列具有不同线性浓度的标准溶液，以RFU为纵坐标，待检测物标准溶液的浓度分别为横坐标，绘制多重上转换发光磁分离均相免疫检测法标准曲线；根据定量标准曲线测定样本中对应待测物的浓度，优选地，线性浓度的范围为：0.1-18ng/mL。
本发明还提供了一种多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法在同时检测多种兽药残留中的应用。
本发明还提供了一种多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法在同时检测农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿中的应用，用以同时对农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿三种水产禁药进行定量检测。
优选地，将待检测样品使用本发明的检测方法检测时具体包括如下步骤：(1)将三种具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子分别与金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体偶联，得到三种上转换发光纳米粒子-抗体偶联物；(2)将磁微粒分别与金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原偶联，得到三种磁微粒-全抗原偶联物；(3)将上述六种偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品震荡孵育后进行磁分离，检测上清中的上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现对金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的定量检测。
优选地，所述磁微粒为含有磁性内核及包覆在其内核外表面的外壳结构，直径范围为 100-2000nm，优选地，所述磁微粒的材料为Fe3O4@聚合物，进一步优选为Fe3O4@PMMA，PMAO，即Fe3O4@聚丙烯酸甲酯(PMMA),聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(PMAO)。
优选地，所述上转换发光纳米粒子由氧化物、氟化物、卤氧化物等基质掺杂三价稀土离子得到；进一步优选地，所述上转换发光纳米粒子的材料组分为NaYF4,Yb,Tm@ NaYF4,Yb,Nd核壳结构，激发波长和发射波长分别为Ex:808nm、Em:365nm；Ex:808nm、 Em:540nm；Ex:808nm、Em:650nm。
优选地，所述步骤(1)中，通过活泼酯法，将羧基化的上转换发光纳米粒子活化后用偶联缓冲液分别与金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体偶联，再用酪蛋白酸钠封闭；
所述步骤(2)中，通过活泼酯法，将羧基化的磁微粒活化后用偶联缓冲液分别与金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原偶联，再用酪蛋白酸钠封闭。
优选地，所述步骤(1)和步骤(2)中，活化方法分别为：取200μL 10mg/mL羧基化的上转换发光纳米粒子或羧基化的磁微粒到含有800μL 10mM PB，pH6.0，含0.005％SDS 的离心管中，加入20mg/mL EDC和NHS溶液分别为20μL，40μL，快速混匀后，室温下活化30min。
进一步优选地，所述步骤(1)和步骤(2)中，偶联缓冲液均为10mM的PB，pH5.5-7.0。
进一步优选地，所述金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体的偶联过程中偶联缓冲液pH分别为6.0，5.5，7.0；金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原的偶联过程中偶联缓冲液pH分别为7.0，5.5，5.5。
优选地，所述步骤(3)中，将金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的标准样品配制为一系列具有不同线性浓度的标准溶液，线性浓度范围为：金刚烷胺0.1-2ng/mL，氯霉素0.1-16.7ng/mL，孔雀石绿0.1-2ng/mL，以RFU为纵坐标，三种标准溶液的浓度分别为横坐标，绘制多重上转换发光磁分离均相免疫检测法标准曲线；得到的标准曲线的线性相关系数分别为：金刚烷胺R2＝0.9353，氯霉素R2＝0.9831，孔雀石绿R2＝0.9265，灵敏度均达0.07ng/mL。
进一步优选地，所述金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿标准溶液的线性浓度分别为50ng/mL、 16.7ng/mL、5.6ng/mL、1.9ng/mL、0.6ng/mL、0.2ng/mL、0.07ng/mL。
本发明的有益效果是：本发明所建立的多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法，将磁分离技术、免疫分析技术相结合，以多种不同发射波长的上转换发光纳米粒子为信号元件，可实现同时检测多种农兽药残留物的含量，例如对三种金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿靶标同时进行浓度检测，较仪器检测方法具有操作简单、灵敏度高(达0.07ng/mL)、成本低廉等优点；较传统的酶联免疫吸附实验具有可以多重检测、无需清洗、反应时间短的优点；较快检方法如免疫层析试纸条具有高通量检测的优势，极大的满足快速筛查水产禁药的现实要求。
附图说明
图1为多重上转换发光磁分离均相免疫检测法检测原理；
图2为多重上转换发光磁分离均相免疫检测法标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物，包括上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物，所述上转换发光纳米粒子-抗体偶联物为具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子与待检测物抗体的偶联物，所述磁微粒-全抗原偶联物为磁微粒与待检测物全抗原的偶联物。
优选地，所述上转换发光纳米粒子种类与待检测物种类对应。
优选地，所述磁微粒为含有磁性内核及包覆在其内核外表面的外壳结构，直径范围为 100-2000nm，进一步优选地，所述磁微粒为Fe3O4@聚合物。
优选地，所述上转换发光纳米粒子由氧化物、氟化物、卤氧化物等基质掺杂三价稀土离子得到。
优选地，所述待检测物为农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿，或为其他呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物、氟喹诺酮类、磺胺类常用药物中至少两种的组合。
本发明还提供了一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物的制备方法，包括步骤：(1)通过活泼酯法，分别将羧基化的上转换发光纳米粒子和羧基化的磁微粒活化；(2)将活化后的上转换发光纳米粒子通过偶联缓冲液与待检测抗体偶联、将活化后的磁微粒通过偶联缓冲液与待检测全抗原偶联，其中上转换发光纳米粒子的发射波长种类与待检测物的数量相同；(3)偶联后分别用酪蛋白酸钠封闭，得到上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物。
此外，本发明还提供了一种多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法，将上述上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物利用磁分离均相免疫法同时对待检测物的浓度进行定量检测。
优选地，上述检测方法包括以下检测步骤：将上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品震荡孵育后进行磁分离，检测上清中的上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现同时对多种待检测物的定量检测。
优选地，将待检测物的标准品配制为一系列具有不同线性浓度的标准溶液，以RFU为纵坐标，待检测物标准溶液的浓度分别为横坐标，绘制多重上转换发光磁分离均相免疫检测法标准曲线；根据定量标准曲线测定样本中对应待测物的浓度，优选地，线性浓度的范围为：0.1-18ng/mL。
上述多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法可以应用在同时检测多种兽药残留方面。具体地，可以同时检测农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿三种水产禁药的浓度：将三种具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子作为信号元件，利用磁分离均相免疫法对金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的浓度同时检测。具体步骤如下：
选用三种具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子作为信号元件，通过活泼酯法将三种不同发射波长的羧基化上转换发光纳米粒子分别与金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体偶联，再用活泼酯法将羧基化磁微粒分别与金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原偶联，将上述六种偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品震荡孵育后进行磁分离，检测上清中的三种上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现对金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的同时检测。
本发明的检测原理为：当样本中不存在待测靶标时，标记有上转换发光纳米粒子的对应抗体将全部与磁珠上的对应全抗原相结合，经磁分离后，上清中不会存在有标记有上转换发光纳米粒子的对应抗体，因此其信号值最低；当样本中存在待测靶标时，待测靶标与全抗原竞争结合对应抗体，使得形成的磁珠-全抗原-抗体-信号元件(上转换发光纳米粒子) 复合物减少，而形成的“靶标-抗体-信号元件复合物”增加，将反应物置于磁场作用后，“磁微粒-抗原-抗体-信号元件”复合物将固定于反应管壁，而游离在上清中的抗体-信号元件(上转换发光纳米粒子)增多，经激发后，上清中的荧光信号增强，信号的增加量与检测靶标的量呈现正相关。由于抗体分别标记了不同发射波长的上转换发光纳米粒子，因此可实现多种待测抗原的同时检测。多重上转换发光磁分离均相免疫检测法检测原理图如图1所示。
下面以同时检测三种水产禁药(金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿)为例对本发明做进一步解释说明。
实施例1同时检测三种水产禁药(金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿)的多重上转换发光磁分离均相免疫检测法的建立
(1)磁微粒-全抗原偶联物的制备：磁微粒与三种水产禁药全抗原的偶联
取200μL 10mg/mL羧基化磁微粒(Fe3O4@PMMA,PMAO)到含有800μL 10mM PB(pH6.0，含0.005％SDS)的2mL离心管中，加入新鲜配制的20mg/mL EDC和NHS溶液分别为20μL，40μL，快速混匀后，利用垂直混合仪在室温下活化30min。活化结束后， 10000rpm离心15min，去上清，用1mL 0.005％SDS清洗1遍后，用偶联缓冲液10mM PB (pH5.5-7.0)补至1mL，超声10min至充分分散，再加入200μg全抗原充分混匀，用旋转混合仪室温偶联2h，再加入110μL 2％酪蛋白酸钠封闭1h，10000rpm离心15min，去上清，用1mL保存液(20mM Tris-HCl，0.5％酪蛋白酸钠，0.5％Tween-20，0.02％叠氮钠，pH 8.0) 清洗一遍后，用保存液补至1mL，4℃备用。其中金刚烷胺全抗原的偶联过程中偶联缓冲液 pH为7.0；氯霉素全抗原的偶联过程中偶联缓冲液pH为5.5；孔雀石绿全抗原的偶联过程中偶联缓冲液pH为5.5。
(2)上转换发光纳米粒子-抗体偶联物的制备：上转换发光纳米粒子信号元件与三种水产禁药抗体的偶联
取20μL 10mg/mL羧基化上转换发光纳米粒子，成分为NaYF4,Yb,Tm@NaYF4,Yb,Nd核壳结构(三种纳米粒子的激发及发射波长分别为：Ex:808nm Em:365nm、Ex: 808nm Em:540nm、Ex:808nm Em:650nm)，分别加入到含有800μL 10mM PB(pH6.0，含0.005％SDS)的2mL离心管中，加入新鲜配制的20mg/mL EDC和NHS溶液分别为 20μL，40μL，快速混匀后，利用垂直混合仪在室温下活化30min。活化结束后，12000rpm 离心10min，去上清，用1mL 0.005％SDS清洗1遍后，用偶联缓冲液10mM PB(pH5.5-7.0) 补至1mL，超声10min至充分分散，再分别加入100μg金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体充分混匀，用旋转混合仪室温偶联2h，再加入110μL 2％酪蛋白酸钠封闭1h， 12000rpm离心10min，去上清，用1mL保存液(20mMTris-HCl，0.5％酪蛋白酸钠， 0.5％Tween-20，0.02％叠氮钠，pH 8.0)清洗一遍后，用保存液补至1mL，4℃备用。其中金刚烷胺抗体的偶联过程中偶联缓冲液pH为6.0，抗体投入量为10μg；氯霉素抗体的偶联过程中偶联缓冲液pH为5.5，抗体投入量为5μg；孔雀石绿抗体的偶联过程中偶联缓冲液 pH为7.0，抗体投入量为40μg。
(3)磁分离免洗均相免疫检测方法的建立
分别将三种磁微粒-全抗原、三种上转换发光纳米粒子信号元件(上转换发光探针)- 抗体按体积比20:1混合再用PBS稀释1000倍，每孔100μL加入到黑色酶标孔中，再加入一系列不同线性浓度的三种水产禁药标准溶液100μL(50、16.7、5.6、1.9、0.6、0.2、0.07ng/mL)，37℃震荡孵育15min，磁分离5min，吸取100uL上清检测上转换发光信号， RFU为纵坐标，三种水产禁药标准溶液浓度为横坐标，绘制多重上转换发光磁分离均相免疫检测法标准曲线如附图2所示，灵敏度均达0.07ng/mL。线性范围分别为，金刚烷胺：0.1-2 ng/mL(R2＝0.9353)，氯霉素：0.1-16.7ng/mL(R2＝0.9831)，孔雀石绿：0.1-2ng/mL(R2＝0.9265)。
实施例2检测方法的应用-实际样品检测
分别以鳊鱼、乌鳢、鲫鱼为例，将鱼去鳞片取背部油脂较少部位，切碎后用均质机均质；称取2g±0.1g均质物于15mL离心管中；向上述离心管中加入2mL氯化钠溶液，剧烈震荡2分钟，依次加入提取剂溶液150μL，萃取剂溶液4mL，中性氧化铝1g，拧紧盖帽剧烈震荡2分钟，室温下4000rpm/分钟，离心3分钟；取上清液2mL于5mL离心管中，加入氧化剂，平均轻摇混匀30秒，65℃下用氮吹仪吹干；向吹干的离心管中加入1mL 1xPBS，反复吹打1分钟，吸取100μL溶液用磁分离免洗均相免疫检测方法检测，根据定量标准曲线测定样本中对应待测物的浓度，具体为：向体系中添加不同浓度的标准品进行检测，计算荧光增强强度F-F0(其中F为待测阴性样本加入标准品的荧光强度，F0为待测阴性样本的荧光强度)，以标准品浓度(单位为ng·mL-1)为横坐标，RFU(即F-F0)为纵坐标，得到目标物浓度与荧光增强的关系曲线，由此得到的加标回收结果见表1。其中提取剂为 0.25g/mL盐酸羟胺溶液，萃取剂为1％乙酸乙腈，氧化剂为1μmol/L二氯二氰基苯醌溶液。
表1
Figure BDA0003801009150000091
从表1数据可知，三种鱼类中金刚烷胺的添加回收率为80％-121％，变异系数为7.7％-33.3％；氯霉素的添加回收率为70％-101％，变异系数为3.5％-28.5％；孔雀石绿的添加回收率为80％-120％，变异系数为13.6％-55.6％，除检测孔雀石绿的精密度欠佳外，总体上该方法的准确度较好。
以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (14)

1.一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物，其特征在于：包括上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物，所述上转换发光纳米粒子-抗体偶联物为具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子与待检测物抗体的偶联物，所述磁微粒-全抗原偶联物为磁微粒与待检测物全抗原的偶联物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述磁微粒为含有磁性内核及包覆在其内核外表面的外壳结构，直径范围为100-2000nm，优选地，所述磁微粒为Fe3O4@聚合物；
优选地，所述上转换发光纳米粒子由氧化物、氟化物、卤氧化物等基质掺杂三价稀土离子得到。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述上转换发光纳米粒子种类与待检测物种类对应；所述待检测物为农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿，或为其他呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物、氟喹诺酮类、磺胺类常用药物中至少两种的组合。
4.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)通过活泼酯法，分别将羧基化的上转换发光纳米粒子和羧基化的磁微粒活化；(2)将活化后的上转换发光纳米粒子通过偶联缓冲液与待检测抗体偶联、将活化后的磁微粒通过偶联缓冲液与待检测全抗原偶联，其中上转换发光纳米粒子的发射波长种类与待检测物的数量相同；(3)偶联后分别用酪蛋白酸钠封闭，得到上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的活化方法为：取200μL10mg/mL羧基化的上转换发光纳米粒子或羧基化的磁微粒到含有800μL 10mM PB，pH6.0，含0.005％SDS的离心管中，加入20mg/mL EDC和NHS溶液分别为20μL，40μL，快速混匀后，室温下活化30min；所述步骤(2)的偶联缓冲液为10mM的PB，pH5.5-7.0。
6.一种多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法，其特征在于：将权利要求1的上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物利用磁分离均相免疫法同时对待检测物的浓度进行定量检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：具体包括以下检测步骤：将上转换发光纳米粒子-抗体偶联物和磁微粒-全抗原偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品震荡孵育后进行磁分离，检测上清中的上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现同时对多种待检测物的定量检测。
8.一种权利要求6或7所述的多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法在同时检测多种兽药残留方面的应用。
9.一种权利要求6或7所述的多重上转换发光磁分离均相免疫检测方法在同时检测农兽药残留物金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体包括如下步骤：(1)将三种具有同一激发波长、不同发射波长的上转换发光纳米粒子分别与金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体偶联，得到三种上转换发光纳米粒子-抗体偶联物；(2)将磁微粒分别与金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原偶联，得到三种磁微粒-全抗原偶联物；(3)将上述六种偶联物混合加入黑色酶标孔中，再加入待测样品震荡孵育后进行磁分离，检测上清中的上转换发光信号，根据待测样品中的靶标浓度与上转换发光强度变化量之间的对应关系，实现对金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的定量检测。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述磁微粒为含有磁性内核及包覆在其内核外表面的外壳结构，直径范围为100-2000nm，优选地，所述磁微粒的材料为Fe3O4@聚合物，进一步优选为Fe3O4@PMMA，PMAO；
所述上转换发光纳米粒子由氧化物、氟化物、卤氧化物等基质掺杂三价稀土离子得到；优选地，所述上转换发光纳米粒子的材料组分为NaYF4,Yb,Tm@NaYF4,Yb,Nd核壳结构，激发波长和发射波长分别为Ex:808nm、Em:365nm；Ex:808nm、Em:540nm；Ex:808nm、Em:650nm。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)中，通过活泼酯法，将羧基化的上转换发光纳米粒子活化后用偶联缓冲液分别与金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体偶联，再用酪蛋白酸钠封闭；
所述步骤(2)中，通过活泼酯法，将羧基化的磁微粒活化后用偶联缓冲液分别与金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原偶联，再用酪蛋白酸钠封闭。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中，活化方法分别为：取200μL 10mg/mL羧基化的上转换发光纳米粒子或羧基化的磁微粒到含有800μL10mM PB，pH6.0，含0.005％SDS的离心管中，加入20mg/mL EDC和NHS溶液分别为20μL，40μL，快速混匀后，室温下活化30min；
优选地，所述步骤(1)和步骤(2)中，偶联缓冲液均为10mM的PB，pH5.5-7.0；
优选地，所述金刚烷胺抗体、氯霉素抗体、孔雀石绿抗体的偶联过程中偶联缓冲液pH分别为6.0，5.5，7.0；金刚烷胺全抗原、氯霉素全抗原、孔雀石绿全抗原的偶联过程中偶联缓冲液pH分别为7.0，5.5，5.5。
14.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述步骤(3)中，将金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿的标准样品配制为一系列具有不同线性浓度的标准溶液，线性浓度范围为：金刚烷胺0.1-2ng/mL，氯霉素0.1-16.7ng/mL，孔雀石绿0.1-2ng/mL，以RFU为纵坐标，三种标准溶液的浓度分别为横坐标，绘制多重上转换发光磁分离均相免疫检测法标准曲线；
优选地，所述金刚烷胺、氯霉素、孔雀石绿标准溶液的线性浓度分别为50ng/mL、16.7ng/mL、5.6ng/mL、1.9ng/mL、0.6ng/mL、0.2ng/mL、0.07ng/mL。
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