CN115266993A - 一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，属于医药化学分析技术领域。本发明公开了一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，所述检测方法采用高效液相色谱法，且以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(含0.1％的三乙胺，用磷酸调节pH至2.0)‑乙腈(70：30)为流动相，进行等度洗脱。本发明提供了一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，对液相仪器的要求低，操作简单，成本低，能够快速、准确地定量检测乙磺酸尼达尼布软胶囊样品中尼达尼布的含量。

Description

一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法

技术领域

本发明涉及医药分析化学技术领域，更具体的说是涉及一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法。

背景技术

尼达尼布(Nintedanib)是勃林格殷格翰公司开发的一种口服三联血管激酶抑制剂，2014年10月经FDA批准

(尼达尼布)用于治疗特发性肺纤维化(IPF)，成为首个获准用于治疗IPF的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。尼达尼布(Nintedanib)针对已被证实在肺纤维化病理机制中具有潜在影响的生长因子受体发挥作用，其中最为重要的就是血小板源性生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)。通过阻断这些参与纤维化进程的信号转导通路，尼达尼布(Nintedanib)能够通过减少肺功能下降速度、从而减缓IPF疾病进展。

目前，中国药典(现行版)、美国药典(现行版)、日本药局方(JP17)，欧洲药典(EP10.5)均未收载乙磺酸尼达尼布原料药及制剂，但乙磺酸尼达尼布软囊中尼达尼布含量的准确测定是保证乙磺酸尼达尼布软胶囊质量的关键。乙磺酸尼达尼布软胶囊(规格：150mg和100mg)已在国内上市，乙磺酸尼达尼布软胶囊进口注册标准中尼达尼布含量的测定采用高效液相的分析方法进行检测，方法采用梯度洗脱的方法进行测定，样品运行的时间周期较长，在测定的过程中，检测波长在样品运行周期内是变化的，方法对仪器的要求较高。

因此，针对现有技术中存在的缺陷，为降低方法对仪器的要求和分析时间，提供一种能降低其对液相色谱的要求，又能简单、快速、准确地检测出乙磺酸尼达尼布软胶囊中尼达尼布的含量是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，该方法专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，且能降低其对液相色谱的要求，又能简单、快速、准确地检测出乙磺酸尼达尼布软胶囊中尼达尼布的含量，能够保证对乙磺酸尼达尼布软胶囊的质量控制。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，所述高效液相色谱法采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以缓冲液溶液和有机溶剂的混合溶液为流动相，进行等度洗脱；

所述缓冲盐溶液为用磷酸调节pH的磷酸盐溶液或醋酸盐溶液；

所述有机溶剂选自乙腈、甲醇中的至少一种。

优选地，所述缓冲盐溶液为0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸二氢钾缓冲液含体积浓度为0.1-0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH至1.8-2.2。

上述技术方案的技术效果：采用磷酸盐缓冲液在低pH时，其pH值受温度和稀释的影响小，当不同pH的样品加入后其pH较稳定；加入三乙胺不仅可以调节pH值，还可以改善峰型。

优选地，所述有机溶剂为乙腈。

优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液与所述乙腈的体积比为(68-72)：(28-32)。

上述技术方案的技术效果：选择乙腈能够使色谱柱压力比较小，而且洗脱能力比甲醇强，负离子模式乙腈要优于甲醇；流动相比例的选择基于出峰时间，过高会导致出峰时间过早，色谱峰容易被干扰。

优选地，所述高效液相色谱法中，柱温为20-30℃，流速为0.8-1.2mL/min，运行时间为15-25min。

上述技术方案的技术效果：在该柱温下，能准确、稳定地控制液相色谱柱的稳定性，有利于提高高效液相色谱柱的灵敏度，加快分离速度，缩短分析时间，保证分析结果的准确度和再现性。

优选地，所述高效液相色谱法中，检测波长为218-222nm，进样量为10-50μL。

优选地，所述色谱柱规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。优选地，所述色谱柱为Waters Xbridge C18，4.6×250mm，5μm或等同。

上述技术方案的技术效果：该色谱柱价格便宜，且能对乙磺酸尼达尼布达到有效地分离和检测。一般柱长在2-250mm，柱越长，分离度越高，但柱压更高，分离所需时间更长；粒径越小，分离越快，柱效越高，但柱压力越高，柱容易被污染，导致柱寿命降低，针对本产品使用250mm以及5μm填料分析能力较好。

优选地，具体包括以下步骤：

S1、溶液配制：

样品溶液配制：取乙磺酸尼达尼布软胶囊，置于容量瓶中，加稀释剂并水浴振摇，冷却后定容，摇匀并过滤，再移取滤液于容量瓶中，并用稀释剂定容，摇匀，备用；

对照品溶液配制：称取乙磺酸尼达尼布对照品，加入稀释剂，经两步稀释定容配制成含乙磺酸尼达尼布35-210μg/mL的对照品溶液；

S2、进样检测：分别取步骤S1的所述样品溶液和对照品溶液进样，采用高效液相色谱法进行色谱分析，按外标法以峰面积计算样品溶液中尼达尼布的含量。

优选地，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为(25-30):(70-75)；

所述两步稀释具体为：乙磺酸尼达尼布对照品置25mL量瓶中，加适量稀释剂使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液5mL，置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果包括：该方法专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，能降低其对液相色谱的要求，又能简单、快速、准确地检测出乙磺酸尼达尼布软胶囊中尼达尼布的含量，能够保证对乙磺酸尼达尼布软胶囊的质量控制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例1中空白安慰剂色谱图。

图2为实施例1中对照品溶液色谱图。

图3为实施例1中样品溶液色谱图。

图4为实施例1中乙磺酸尼达尼布线性图。

图5为实施例1中特定杂质和尼达尼布的光谱吸收图。

图中YN-E的结构为：

YN02的结构为：

YN-Q的结构为：

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中，乙腈为色谱纯，水为纯化水，磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸为分析纯，高效液相色谱仪为Waters；分析天平为Sartorius Mettler Toledo，采用的试剂及仪器均可通过常规渠道购买，在此不再赘述。

实施例1

本实施例提供一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，包括以下内容：

1、色谱***

流动相：取磷酸二氢钾1.36g，精密称定，加1000mL水搅拌使溶解，加三乙胺1mL，混匀，用磷酸调节pH至2.0，滤过，然后与乙腈按照体积比70：30混合，摇匀即得。

2、具体步骤：

稀释剂为乙腈与水按体积比25：75混合，摇匀即得。

2.1样品溶液的制备

取乙磺酸尼达尼布软胶囊5粒，置250mL量瓶中，加稀释剂约100mL，50℃水浴振摇约30min，冷却后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤膜过滤，精密量取续滤液适量1-1.5mL，置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

2.2对照品溶液制备

取乙磺酸尼达尼布对照品约18mg，精密称定，置25mL量瓶中，加适量稀释剂使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5mL，置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得到对照品溶液(含乙磺酸尼达尼布约为70μg/mL)。

3、检测方法验证结果

3.1***适应性

如图1和图2所示，空白溶液在尼达尼布保留时间处无任何干扰峰。5针工作对照品溶液中主峰峰面积的RSD为0.2％。工作对照品溶液第一针尼达尼布峰的理论塔板数为8224，拖尾因子为1.4。检查对照品溶液和5针工作对照品溶液平均峰面积的回收率应为100.0％。所有工作对照品溶液主峰峰面积RSD为0.1％。

3.2专属性

空白溶液在主峰(尼达尼布)保留时间处无任何干扰峰，样品溶液主峰(尼达尼布)与相邻峰之间的最小分离度大于1.5，具有较好专属性。

强降解试验：

样品	纯度角	纯度阈值
			未破坏	0.038	0.238
酸破坏	0.044	0.239
			碱破坏	0.037	0.235
氧化破坏	0.046	0.240
			液体高温破坏	0.038	0.236
溶液光照3天	0.035	0.236
			胶囊光照3天	0.033	0.234

1)在破坏试验条件下，产生的任何杂质峰对主峰没有明显干扰。

2)样品溶液和破坏后样品溶液主峰峰纯度阈值均大于纯度角。

3.3线性和范围

如图4所示，乙磺酸尼达尼布的线性与范围结果符合规定，表明该分析方法在乙磺酸尼达尼布合适的浓度范围内线性良好，能进行准确地定量检测。乙磺酸尼达尼布的浓度范围为14.25μg/mL～106.91μg/mL。

3.4精密度

样品溶液重复进样6次，主峰RSD均小于1.0％，结果显示方法精密度良好。

不同的人、不同的时间、采用不同的色谱柱和不同仪器进行6份样品溶液的检测，6份供试品溶液中，主成分含量的RSD≤2.0％，12份供试品溶液中主成分含量的RSD≤2.0％，结果显示，重现性良好。

3.5准确度

每个浓度的供试品溶液回收率(n＝3)均在98.0％～101.0％之间，且所有供试品溶液回收率(n＝9)的RSD为0.4％，符合接受标准。因此，该方法准确度较好。

3.6耐用性

通过改变流速1.0±0.1mL/min，柱温25±2℃，有机相起始比例30±2％，缓冲盐pH值2.0±0.2测定样品溶液，与正常条件下所测溶液的结果进行比较，含量变化值均未超过1.1％，结果显示，在上述条件下变化时方法的耐受性良好。

3.7溶液稳定性

考察对照品溶液和样品溶液的稳定性，结果显示对照品溶液室温放置5天，稳定性良好；100mg规格供试品溶液在室温下放置2天稳定性良好；150mg规格供试品溶液在室温下放置4天稳定性良好。

3.8滤膜吸附

通过滤膜未产生干扰主峰测定的杂质峰，舍去1mL滤液后样品主峰响应值与离心后样品主峰响应值比值均在98.0％～102.0％内，结果显示该滤膜适用于本产品的过滤。

4、波长的选择

如图5所示：通过对3个已知特定杂质(YN-E、YN02、YN-Q)和尼达尼布进行了光谱吸收研究，发现杂质与尼达尼布峰在低波长220nm和280nm左右有较大的吸收，兼顾其他杂质的吸收，故波长定为218-222nm是合适的。

对比例1

本对比例提供一种乙磺酸尼达尼布软胶囊中含量的检测方法(国家食品药品监督管理总局进口药品注册标准)，该方法的色谱条件为：用十八烷基合硅胶键合硅胶(Nucleodur C18 Gravity，50mm*4.0mm，5m；保护柱：Nucleodur C18 Gravity,8mm*4.0mm,5um)为填充剂：以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二氨1.0g,加水1000mL使溶解，用磷酸调节pH值至6.4±2，为流动相A；乙睛为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

流速为1.0mL/min；柱温为40℃±2℃；0-7.0min检测波长为235nm,7.0-19.0min，检测波长为357nm。

根据上述对比例1公开的方法可知，该方法采用梯度洗脱的方法进行测定，样品运行的时间周期较长，在测定的过程中，检测波长在样品运行周期内是变化的，方法对仪器的要求较高；本申请采用的高效液相色谱法检测乙磺酸尼达尼布含量方法，采用等度单波长检测，降低其对液相色谱仪器的要求，并且能够准确检测。

综上所述，本发明采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，能降低其对液相色谱仪器的要求，又能简单、快速、准确地检测出乙磺酸尼达尼布软胶囊中尼达尼布的含量，能够保证对乙磺酸尼达尼布软胶囊的质量控制。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以缓冲液溶液和有机溶剂的混合溶液为流动相，进行等度洗脱；

所述缓冲盐溶液为用磷酸调节pH的磷酸盐溶液；

所述有机溶剂选自乙腈、甲醇中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液为0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸二氢钾缓冲液含体积浓度为0.1-0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH至1.8-2.2。

3.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。

4.根据权利要求3所述的一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾缓冲液与所述乙腈的体积比为(68-72)：(28-32)。

5.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，柱温为20-30℃。

6.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，流速为0.8-1.2mL/min，运行时间为15-25min。

7.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，检测波长为218-222nm，进样量为10-50μL。

8.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述色谱柱规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。

9.根据权利要求1-8任一项所述的采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、溶液配制：

样品溶液配制：取乙磺酸尼达尼布软胶囊，置于容量瓶中，加稀释剂并水浴振摇，冷却后定容，摇匀并过滤，再移取滤液于容量瓶中，并用稀释剂定容，摇匀，备用；

对照品溶液配制：称取乙磺酸尼达尼布对照品，加入稀释剂，经两步稀释定容配制成含乙磺酸尼达尼布35-210μg/mL的对照品溶液；

S2、进样检测：分别取步骤S1的所述样品溶液和对照品溶液进样，采用高效液相色谱法进行色谱分析，按外标法以峰面积计算样品溶液中尼达尼布的含量。

10.根据权利要求9所述的采用高效液相色谱法检测尼达尼布含量的方法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为(25-30):(70-75)；

所述两步稀释具体为：乙磺酸尼达尼布对照品置25mL量瓶中，加适量稀释剂使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液5mL，置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

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