CN115261334B - 一株葡萄球菌噬菌体、噬菌体制剂及其在防治葡萄球菌感染的疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株葡萄球菌噬菌体、其噬菌体组合物及其在防治葡萄球菌感染的疾病中的应用,该噬菌体被命名vB_SauM_SA34,保藏编号为CGMCC NO.19976,于2020年05月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心,该噬菌体具有宽裂解谱,与抗生素组合的噬菌体制剂可进一步拓宽的裂解谱范围,且该制剂具有灵活的给药方式,无毒副作用,安全性高,不同给药方式对猪渗出性皮炎均有良好的治疗作用,相对于单独使用抗生素,提高了仔猪的存活率,上述噬菌体及制剂可被用于制备防治葡萄球菌感染的疾病的药物、环境消毒剂、饲料和水添加剂等。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,尤其涉及一株葡萄球菌噬菌体、噬菌体制剂及其在防治葡萄球菌感染的疾病中的应用。
背景技术
葡萄球菌是革兰氏阳性菌,是一种条件性人畜共患病菌,广泛存在于自然界以及人、动物的皮肤、鼻咽部粘膜及肠道内,当机体的抵抗力下降或皮肤黏膜破损时,病原菌就可以进入黏膜内,可引起机体发病,对人、动物均有很大的危害。猪渗出性皮炎就是由葡萄球菌感染引起的疾病。
猪渗出性皮炎又叫“油皮病”,多发生于5日龄后的哺乳仔猪以及3~5周龄的断奶仔猪,能在短时间内引起整窝仔猪被感染发病。本病一年四季均可发生,但以潮湿的夏秋季较为多发,发病率无规律,发病率在10%~70%,死亡率通常在20%~40%,严重影响猪的生长及猪场的经济效益。猪渗出性皮炎常见的临床症状有病猪精神沉郁、被毛粗乱、食欲减退。从面颊开始出现发红,肿胀,随后全身出现由红棕色到黑色不同深度颜色的斑点或斑块,刮下表面痂皮可见出血点,油性分泌物,并散发臭味。剖检后常见全身***肿胀、出血,心冠脂肪出血,肝脏肿胀淤血。部分猪出现消瘦,拉稀等症状。猪渗出性皮炎如果不在早期治疗,通常会发生死亡。
猪葡萄球菌渗出性皮炎通常采用抗生素治疗,常用的抗生素有阿莫西林,头孢噻呋、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、新霉素、庆大霉素和卡那霉素等。但随着抗生素的使用,具有多重耐药性的葡萄球菌菌株的出现对猪渗出性皮炎的临床治疗造成了很大的困难,所以目前亟需一种能替代抗生素或辅助抗生素的抗菌物质来治疗猪葡萄球菌渗出性皮炎。
噬菌体是生物界中数量最大的生物群体,也是目前已知的最大病毒群。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体,烈性噬菌体可以在短时间内侵入宿主细菌,迅速复制并裂解宿主细菌,目前已广泛应用于细菌性疾病的治疗。
此外,已经有研究表明,在抗生素与噬菌体联合应用时,具有协同作用(PAS效应):抗生素即使在对细菌的亚抑菌浓度(Sub-Mic)仍然可以引起细菌的DNA损失诱导反应(SOS反应),但SOS反应的结果是细菌暂停***,并且呈丝状化。细菌的这种状态更有利于噬菌体进行复制,因为SOS反应使细菌由肽聚糖组成的细胞壁不稳定,这种不稳定会使细菌对噬菌体产生的溶菌酶、穿孔素更加敏感,进而加快噬菌体进入细菌。尽管同时使用两种抗菌物质,但细菌很小概率会对两种物质都产生抗性,即使对两者物质都产生抗性,也会导致细菌致病性降低或生长速度减缓。因此,同时使用抗生素和噬菌体联合应用来降低细菌耐药性,提高杀菌效率在理论上是切实可行的。
但是,目前防治猪葡萄球菌渗出性皮炎的葡萄球菌噬菌体少且裂解谱宽度有限,如申请人于2017年申请的专利(授权公告号:CN107779440B)公开了一种葡萄球菌噬菌体SA1,其裂解谱为72%(裂解50株葡萄球菌中的36株);并且,目前还未出现噬菌体和抗生素的组合制剂在此方面的应用。
因此,现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一株广裂解谱的新葡萄球菌噬菌体vB-SauM-SA34及其应用,上述噬菌体对引起猪渗出性皮炎的葡萄球菌具有很强的裂解作用,可被用于制备防治葡萄球菌感染的疾病的药物、环境消毒剂、饲料和水添加剂等,在解决葡萄球菌感染的同时,避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。
本发明的技术方案具体如下:
第一方面,本发明提供了自青岛某猪场的污水中分离得到的一株具有广谱强裂解性的葡萄球菌噬菌体,该噬菌体被命名为vB_SauM_SA34,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2020年05月15日,保藏编号为CGMCC NO.19976。
该噬菌体vB_SauM_SA34该噬菌体头部呈多面体结构,有细长的尾部,噬菌体头部约140-150nm,宽约120-130nm,具有可收缩的尾部约260-270nm,根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法,其形态符合肌尾噬菌体科的特征,属于肌尾噬菌体。
第二方面,本申请还提供一种噬菌体组合物,其包括葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34。在实际应用中,为了进一步拓宽噬菌体制剂的裂解谱,充分发挥不同噬菌体的裂解谱的差异,进行优势互补,可将上述葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34和其他噬菌体进行组合使用,如与同为葡萄球菌噬菌体的SA1或其他噬菌体组合使用,用于杀灭环境中的葡萄球菌,用于葡萄球菌病的防治。此外,也可将上述葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34与其他不同种类的噬菌体(抑制引发同类疾病的不同病原菌)配合,用于同一类疾病的防治。
第三方面,本申请还提供一种噬菌体制剂,其有效成分包括其有效成分包括前述的葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34和抗生素。所述药物制剂形式为经皮给药剂型、口服给药剂型。
可选地,所述抗生素包括但不限于:阿莫西林、头孢噻呋、头孢西丁、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氯霉素、利福平、阿奇霉素、诺氟沙星、四环素、万古霉素、呋喃妥因、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、阿米卡星、奈替米星、红霉素等有效防治葡萄球菌的抗生素。
优选地,所述抗生素为头孢噻呋,如可采用盐酸头孢噻呋溶液。通过实验发现,葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34和头孢噻呋组合制备的噬菌体制剂对猪渗出性皮炎的防治效果最佳,裂解谱得到大幅度的拓宽。此外,本发明提供的噬菌体组合物中的盐酸头孢噻呋溶液有广谱抗菌效果,可以在噬菌体组合物中起到防腐的作用。
可选地,所述噬菌体制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂,药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和各种培养基。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要,可以加入其它常规添加剂,例如,抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时,还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂型(例如,水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型,如冻干剂。
优选地,本发明提供的噬菌体制剂使用NB液体培养基作为葡萄球菌噬菌体和头孢噻呋药学上的载体。
根据待治疗的动物的年龄、体重、性别、状态和饮食,给药时间,给药途径,***速率以及应答敏感度的多种因素,当施用、喷射或给予时,本发明噬菌体制剂的合适剂量可以不同。本领域技术人员显而易见的是,当给予患者药物组合物时,主治医生或兽医通过适当的医学判断可以确定合适的单日总剂量。
本发明提供的噬菌体制剂中盐酸头孢噻呋溶液为对该噬菌体宿主菌的亚抑菌浓度:2.5μg/ml,所述噬菌体组合物中盐酸头孢噻呋溶液在2.5μg/ml的浓度时仍有部分抑菌效果。实验证明,所述盐酸头孢噻呋溶液在亚抑菌浓度时可以提高该葡萄球菌噬菌体滴度。
本发明提供的葡萄球菌噬菌体对256株猪源葡萄球菌中的224株具有裂解作用,裂解率可以达到87.5%。而头孢噻呋单独作用时,仅对256株猪源葡萄球菌中的109株具有抑制作用,抑制率可以达到42.58%。而上述两种活成成分组成的噬菌体制剂对256株猪源葡萄球菌中的241株具有抑制作用,抑制率可以达到94.14%,可裂解17株头孢噻呋和噬菌体单独作用都不能裂解的猪源葡萄球菌,由此可见,头孢噻呋和所述葡萄球菌相互之间具有协同作用,拓宽了两者的裂解范围。
第四方面,本申请还提供了上述葡萄球菌噬菌体、噬菌体组合物或前述的噬菌体制剂在制备防治葡萄球菌感染的疾病中的应用。所述防治包括预防和治疗。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选地,所述葡萄球菌感染的疾病包括猪渗出性皮炎。
第五方面,本申请还提供一种环境消毒剂,其有效成分包括如上所述的葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34、噬菌体组合物或前述的噬菌体制剂。基于上述物质对葡萄球菌病原菌具有优异的裂解性能,皆可分别作为环境消毒剂进行使用,杀灭猪场环境中的病原菌。优选地,噬菌体的浓度为108PFU/ml以上。
可选地,环境消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分;优选的,可应用环境消毒剂的环境包括饲料、水和养殖环境,所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
第六方面,本申请还提供上述环境消毒剂在养殖场环境消毒中的应用,具体地,所述环境消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具进行葡萄球菌的消毒,所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
第七方面,本申请还提供一种饮用水添加剂或者饲料添加剂,其有效成分包括上述的葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34、噬菌体组合物。可选地,饮用水添加剂还包含其他用于水中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分;所述饮用水添加剂的形式为液体剂型、粉末剂型或固体剂型,但不仅限于以上三种剂型。
第八方面,本申请还提供一种食品保鲜剂,其包括如上所述的葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34或噬菌体组合物,将其喷洒于肉质表面,或将浸泡在加有食品保鲜剂的溶剂,都可达到抑制肉质产品中葡萄球菌的效果,达到保鲜效果。
第九方面,本申请还提供一种检测试剂盒,该试剂盒包括前述的葡萄球菌噬菌体。基于葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34对宿主菌的裂解特异性,本发明的葡萄球菌噬菌体可应用于葡萄球菌的快速检测,包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对葡萄球菌进行检测,或对临床样本中的目标致病菌进行筛选,有效确保检测的灵敏度。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明提供的葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34,裂解谱宽,对引起猪渗出性皮炎的葡萄球菌具有很强的裂解作用,能够有效防治葡萄球菌病,具有防治葡萄球菌渗出性皮炎的作用。该噬菌体可用作环境消毒剂的活性成分,对饲料、环境等也具有良好的葡萄球菌消毒作用。
2、本发明还提供一种由葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34和抗生素组合的噬菌体制剂,优选的,抗生素采用头孢噻呋。通过头孢噻呋和所述葡萄球菌相互之间具有协同作用,进一步大幅度地拓宽了噬菌体vB_SauM_SA34的裂解范围,提高了该噬菌体制剂的应用价值。
3、上述噬菌体制剂的给药方式多样,内用外用皆可,相比于采用肌肉注射的抗生素,外用给药方式时可以直达患病处杀灭细菌,方便高效。本发明提供的噬菌体组合物可以解决由于滥用抗生素导致的耐药性的问题,该葡萄球菌噬菌体与抗生素相互作用,可以互相促进对方的杀菌效用。
4、上述噬菌体制剂中葡萄球菌噬菌体和抗生素不会对互相的效价产生不利影响,且葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34通过与盐酸头孢噻呋溶液的协同作用,且效价可被提高为109PFU/ml。上述两种活性成分可以长期稳定的存在,其可有效杀灭葡萄球菌生物膜,减少环境中葡萄球菌残留。
附图说明
图1为噬菌体vB_SauM_SA34的电镜图片;
图2为噬菌体vB_SauM_SA34的热稳定性测试结果;
图3为噬菌体vB_SauM_SA34的pH值稳定性测试结果;
图4为噬菌体vB_SauM_SA34的一步生长曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。在本发明中,若非特指,所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域的常规方法。
实施例一噬菌体的筛选与纯化、生物学特性的研究
1、噬菌体的筛选与纯化
本噬菌体分离自青岛某猪场的污水,利用双层平板法分离得到噬菌体,挑取单个噬菌斑反复纯化三次后得到单一噬菌体,将该噬菌体命名为vB_SauM_SA34,其宿主菌为ZB12。
2、噬菌体的生物学特性
(1)噬菌体的电镜观察
A、实验方法:取20μL噬菌体样本滴在带有碳涂布膜的铜网上,待其自然沉淀15min,用滤纸稍吸干后,再用2%(W/V)磷钨酸(PTA)染色1~2min,滤纸稍吸干,待干燥后,采用透射电子显微镜下进行观察拍照。
B、实验结果:其形态如图1所示,在透射电镜下观察到,该噬菌体头部呈多面体结构,有细长的可伸缩尾部,噬菌体头部约长140-150nm,宽约120-130nm,尾部约260-270nm。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法,本研究噬菌体形态符合肌尾噬菌体科的特征,属于肌尾噬菌体。将该噬菌体命名为vB_SauM_SA34。
(2)温度对噬菌体vB_SauM_SA34的影响
A.实验方法:
①将加有相同体积的5.2×109pfu/mL的噬菌体增殖液的各个容器分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下,每一温度两个平行样,各保温20min、40min和60min后,待作用结束后取样,并立即将各个样品置于冰浴中冷却,再进行10倍比稀释,取合适稀释梯度测定其效价。以温度为横坐标,以噬菌体效价的对数值为纵坐标,绘制噬菌体的热稳定性曲线。
②取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的NB肉汤4.5mL,各三支,然后将试管置于37℃的水浴锅中,待温度稳定之后,各加入500μL的5.2×109pfu/mL噬菌体增殖液,混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后,立即向混合液中加入适量的1mol/L的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7,进行10倍比稀释,取合适稀释梯度测定效价,每个pH值试管设定2个重复。以pH值为横坐标,噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体pH值稳定性曲线。
B、实验结果及分析
如图2所示,噬菌体vB_SauM_SA34在40℃-60℃作用1h后依然保持较高活性,活性稳定,且在70℃的条件下20~40min内依然能保留部分活性。说明本发明噬菌体的热稳定性较好,能够满足在噬菌体制剂治疗猪渗出性皮炎中使用的需要。
如图3所示,噬菌体vB_SauM_SA34在pH4-11范围内效价基本不变,且在PH12的条件下作用3h后仍然能保留部分活性,所以该噬菌体具有较好的耐酸碱性能。
(3)噬菌体裂解谱的测定
A、实验材料:准备新鲜的噬菌体增殖液vB_SauM_SA34和临床分离的来自山东、北京、河南、河北、广西这些不同地区养殖场分离的256株葡萄球菌。所述256株猪源葡萄球菌均包含一种或一种以上的毒力基因,如表皮脱落毒素、杀白细胞素、毒素休克征毒素、α溶血毒素等等。
B、实验方法:
①采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱,步骤如下:在划线有葡萄球菌的培养皿中挑取单菌落,接种到5ml NB液体培养基中,37℃空气振荡器中,180rpm振荡培养18h,得到单一的菌悬液。将100μl的菌悬液与100μl的3.4×103pfu/mL噬菌体37℃孵育5min后,加入上层琼脂中制备双层平板,待琼脂凝固后置于37℃的恒温箱中倒置培养过夜观察结果。
②与现有噬菌体的对比:同时将噬菌体vB_SauM_SA34和本公司已授权专利CN107779440B中噬菌体SA1,对上述256株葡萄球菌进行裂解谱测定,比较两株不同葡萄球菌噬菌体的裂解差异性。
C、实验结果及分析:
256株猪源葡萄球菌毒力基因信息及两株葡萄球菌噬菌体的裂解谱见表1,从表1的结果可知,噬菌体vB_SauM_SA34对256株葡萄球菌中的224株葡萄球菌有裂解作用,裂解率为87.5%,有较宽的裂解谱。而噬菌体SA1对256株葡萄球菌中的192株葡萄球菌有裂解作用,裂解率仅为75%;显然,噬菌体vB_SauM_SA34对上述256株猪源葡萄球菌的裂解谱显著宽于噬菌体噬菌体SA1。
表1 256株猪源葡萄球菌毒力基因信息及葡萄球菌噬菌体裂解谱
(4)葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34的一步生长曲线
1、实验方法:
将感染复数为10的噬菌体增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1mL,充分混匀(此时开始计时),37℃孵育5min,13000rpm离心30s,用微量移液器尽量吸去上清,再用5mL NB肉汤洗涤1次(13000rpm离心30s),弃上清。用预热的NB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀,迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养,在0时刻和每隔5min取出150μL,10000rpm离心1min,用NB肉汤做10倍倍比稀释后采用双层平板法测噬菌体效价,做3个平行,结果取平均值,以感染时间为横坐标,感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标,绘制一步生长曲线,得到噬菌体vB_SauM_SA34的潜伏期、爆发期,计算出爆发量。
爆发量=噬菌体爆发末期的总个数/爆发初期细菌的总个数
2、实验结果及分析
本发明提供的葡萄球菌噬菌体以葡萄球菌为宿主,一步生长曲线发现,其潜伏期为20min,爆发期为90min,爆发量为85。与噬菌体SA1相比,vB_SauM_SA34潜伏期和爆发期短,爆发量大。
(5)噬菌体vB_SauM_SA34对非宿主性细菌的裂解试验
1、实验方法
选10株大肠杆菌、10株沙门氏菌、10株绿脓杆菌这些不同的非宿主性细菌,按照实施例一的双层平板法进行裂解实验。
2、实验结果及分析
噬菌体vB_SauM_SA34均无法识别上述30株非宿主性细菌。说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性,且对微生物群落无损伤作用。
实施例二猪源葡萄球菌对头孢噻呋的药敏试验
使用微量肉汤稀释法测定256猪猪源葡萄球菌对头孢噻呋药物的敏感性:
1、盐酸头孢噻呋溶液最小抑菌浓度(MIC)的测定
按照前述方法得到vB_SauM_SA34宿主菌ZB12的单一菌悬液,使用分光光度计测定细菌菌液的吸光度,检测波长为600nm,将吸光度换算为细菌浓度后,将细菌菌液稀释至5×105CFU/ml。将盐酸头孢噻呋溶液分别稀释至40960、20480、10240、5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml。MIC值测定:将96孔板进行分区,每个组选取3排(如A~C)作为MIC测定区域,共计重复3次。每排先加入100μl菌液,再在每排1~12孔分别加入上述12个稀释度的抗生素稀释液100μl;设置菌液对照并重复3次,菌液对照为100μl稀释后的菌液和100μl灭菌蒸馏水;设置空白对照并重复3次,加入100μl生理盐水和100μl灭菌蒸馏水。测定培养24h的OD600值,并计算出试验孔透光率。
注:阳性对照和空白对照均为平均值
当试验孔透光率高于95%时,认定达到此标准的最小浓度为盐酸头孢噻呋溶液的最小抑菌浓度。试验结果确定,盐酸头孢噻呋溶液的最小抑菌浓度为5μg/ml。
2、256株猪源葡萄球菌药物敏感性试验:
(1)实验方法:将256株猪源葡萄球菌按照前述方法得到单一菌悬液,使用分光光度计测定各株细菌菌液的吸光度,检测波长为600nm,将吸光度换算为细菌浓度后,将各株细菌菌液稀释至5×105CFU/ml。在96孔板中每孔加入100μl菌液和100μl浓度为5μg/ml的盐酸头孢噻呋的溶液,菌液对照为100μl稀释后的菌液和100μl灭菌蒸馏水;设置空白对照并重复3次,加入100μl生理盐水和100μl灭菌蒸馏水。
测定培养24h的OD600值,并计算出试验孔透光率。当试验孔透光率高于95%时,认定该株葡萄球菌对盐酸头孢噻呋溶液敏感,盐酸头孢噻呋溶液对该猪株葡萄球菌有抑制作用。
(2)实验结果及分析:
通过试验发现,盐酸头孢噻呋溶液对256株猪源葡萄球菌中的109株有抑制作用,抑制率为42.58%。具体抑制信息见表1。
实施例三噬菌体制剂对葡萄球菌的抑制率测定
1、实验方法:测定噬菌体制剂对256株猪源葡萄球菌的抑制率。噬菌体制剂中,vB_SauM_SA34和盐酸头孢噻呋溶液的体积比为1:1,vB_SauM_SA34效价为1×108PFU/ml,混合后盐酸头孢噻呋溶液浓度为2.5μg/ml。溶剂为NB肉汤。
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱,步骤如下:在划线有葡萄球菌的培养皿中挑取单菌落,接种到5ml NB液体培养基中,37℃空气振荡器中,180rpm振荡培养18h,得到单一的菌悬液。将100μl的菌悬液与100μl的噬菌体制剂37℃孵育5min后,加入上层琼脂中制备双层平板,待琼脂凝固后置于37℃的恒温箱中倒置培养过夜观察结果。
2、实验结果及分析:
该噬菌体制剂对256株猪源葡萄球菌抑制作用信息见表1。从表1的结果可知,该噬菌体制剂对241株猪源葡萄球菌有抑制作用,抑制率为94.14%,高于单独使用葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34和单独使用头孢噻呋时的抑制效果。
其次,从表1的结果可知,噬菌体制剂中葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34通过与头孢噻呋的协同配合,扩大了各自的裂解谱宽度。噬菌体制剂可特异的裂解17株宿主菌(包括ZB03、ZB08、ZB16、ZB29、ZB58、ZB73、ZB84、ZB88、ZB117、ZB122、ZB138、ZB152、ZB172、ZB182、ZB199、ZB211、ZB239),而单独作用的噬菌体VB-SAUM-SA34和头孢噻呋都难以裂解这些宿主菌。
实施例四亚抑菌浓度盐酸头孢噻呋溶液提高噬菌体vB_SauM_SA34效价试验
1、实验方法:
将噬菌体vB_SauM_SA34的宿主菌ZB12接种于5ml NB液体培养基中,37℃,170rpm于空气振荡器中培养过夜;对照组在含有5mlNB液体培养基的试管中接种vB_SauM_SA34和其宿主菌ZB12各100μl;试验组在含有5mlNB液体培养基的试管中接种vB_SauM_SA34和其宿主菌ZB12各100μl后加入盐酸头孢噻呋溶液,使液体中盐酸头孢噻呋溶液的浓度为2.5μg/ml;试验组和对照组中各取1支试管只接种vB_SauM_SA34的宿主菌ZB12。将试验组和对照组共同培养于37℃170rpm空气振荡器中,至接种有噬菌体的试管清亮透明。将得到的噬菌体溶液过滤后使用双层平板法测定效价。
2、实验结果和分析:结果显示加入亚抑菌浓度的盐酸噻呋溶液后,噬菌体vB_SauM_SA34的效价提高了一个滴度,单独噬菌体增殖液效价为5.8×108PFU/ml,加入亚抑菌浓度的盐酸噻呋溶液后噬菌体增殖液效价为7.2×109PFU/ml。
实施例五噬菌体与抗生素药物制剂的安全性实验
1、实验方法:选择20只18-20g初成年的昆明小鼠,随机分成实验组和对照组(每组雌雄各半),腹腔注射前述的该噬菌体制剂原液200μl,对照组注射NB肉汤200μl,7d后剖检观察体内器官的临床变化并选其肝、肺、脾脏器官组织做切片观察病理变化。
2、实验结果及分析:经过剖检,注射噬菌体制剂的小鼠的肺脏、肝脏及脾脏与对照组在表现上无差异,从组织切片观察来看,该噬菌体制剂未对小鼠的肺脏、肝脏及脾脏造成明显病理变化。
实施例六噬菌体制剂的模型治疗实验
1、实验方法:选择2只健康的20日龄仔猪,雌雄各一头利用0.25%-0.5%的普鲁卡因进行局部浸润麻醉,利用16mm的切割器进行切割至深筋膜,脊柱左右各4各切口,减去切开内的组织形成全面皮肤缺损创面,止血,创面滴加0.1ml的ZB12(细菌量为1×109CFU/ml)对创面利用无菌纱布进行包扎;脊柱左侧作为噬菌体制剂组,右侧为对照组,噬菌体制剂组每日创面进行接种0.1ml前述噬菌体制剂,对照组接种等量的NB肉汤,连续5d,观察20d。
2、实验结果及分析:停用10d后进行观察,结果发现噬菌体制剂组的创面局部出现黑色结痂,而对照组边缘红肿,创面有脓性分泌物;停用20d后进行观察,发现噬菌体制剂组的创面全部形成黑色结痂将创面覆盖,对照组创面小范围内形成结痂但仍有脓性分泌物渗出。
实施例七噬菌体制剂不同给药方式下的治疗试验
1、实验方法:
从临床收集到60头15-20日龄的渗出性皮炎猪,试验随机分为5组,每组12头,分别设置为药物制剂肌肉注射组、药物制剂外用组、抗生素治疗组、噬菌体治疗组和对照组,各组按照下述方式进行分别处理,停药10d后进行观察。实验中采用的噬菌体制剂的制备方法与实施例3相同,各组的处理方法为:
①药物制剂肌肉注射组每头每天肌肉注射噬菌体制剂1ml,连续注射5d;
②药物制剂外用组每头每天均匀喷洒5-10ml的噬菌体制剂在患病猪只皮肤上,连续喷洒5d;
③抗生素治疗组使用盐酸头孢噻呋注射液每天进行肌肉注射(3mg/kg),连续注射5d;
④噬菌体治疗组使用噬菌体溶液每只均匀喷洒5-10ml在患病猪只皮肤上,连续喷洒5d;
⑤对照组不进行处理。
2、实验结果及分析:
(1)停药10d后进行观察到:
①药物制剂肌肉注射组:83%猪只皮肤出现结痂愈合,其余17%猪只皮炎症状有所减轻;
②药物制剂外用组:92%猪只皮肤出现结痂愈合,8%猪只皮炎症状有所减轻;
③噬菌体治疗组:75%猪只出现皮肤出现结痂愈合,其余25%猪只皮炎症状有所减轻;
④抗生素治疗组:50%猪只皮炎症状有所减轻,其余25%猪只皮炎症状没有减轻,25%猪只死亡;
⑤对照组:67%猪只死亡,其余33%猪只皮炎症状没有减轻。
(2)停药20d后进行观察到:药物制剂肌肉注射组和药物制剂外用组,皮肤全部痊愈;噬菌体治疗组的92%患病猪只皮肤痊愈,8%猪只生长缓慢,成为僵猪;抗生素治疗组的58%患病猪只皮肤全部痊愈,25%猪只死亡,17%猪只生长缓慢成为僵猪;对照组患病猪只的75%死亡,其余25%猪只生长缓慢,成为僵猪。通过猪只生长状况统计发现,外用噬菌体制剂组和肌肉注射药物制剂组的治疗效果明显优于噬菌体治疗组、抗生素治疗组各自单独使用的效果。
实施例八噬菌体制剂环境消毒试验
1、实验方法:青岛某个人猪场,随机选取爆发过猪渗出性皮炎的畜棚10间,每间畜棚选取采样点20个,如料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。对这20个取样点分别取样后,使用1ml生理盐水分别浸泡后,取100μl溶液在MSA培养基中涂布,计算葡萄球菌含量。
使用1×108PFU/ml噬菌体制剂对选取的畜棚进行喷雾消毒,每个畜棚2L,消毒24h后在相同取样点取样。取样后使用1ml生理盐水浸泡后,取100μl溶液在MSA培养基中涂布,计算葡萄球菌含量。
2、实验结果及分析:如表2的结果显示,葡萄球菌的含量明显降低,噬菌体制剂对环境中葡萄球菌的清除率达到了98%以上。
表2消毒前后各畜棚环境葡萄球菌含量
可以理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变,而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (14)
1.一株葡萄球菌噬菌体,其特征在于,被命名为vB_SauM_SA34,其保藏编号为CGMCCNO.19976。
2.一种噬菌体组合物,其特征在于,包括权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体和其他噬菌体。
3.一种噬菌体制剂,其特征在于,其有效成分包括如权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体和抗生素。
4.根据权利要求3所述的噬菌体制剂,其特征在于,所述药物制剂形式为经皮给药剂型或口服给药剂型。
5.根据权利要求3所述的噬菌体制剂,其特征在于,所述抗生素为头孢噻呋。
6.根据权利要求5所述的噬菌体制剂,其特征在于,所述头孢噻呋为液体制剂。
7.根据权利要求3所述的噬菌体制剂,其特征在于,所述抗生素采用的是亚抑菌浓度。
8.根据权利要求5所述的噬菌体制剂,其特征在于,葡萄球菌噬菌体的效价不低于109PFU/ml。
9.如权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体、如权利要求2所述的噬菌体组合物或权利要求3所述的噬菌体制剂在制备防治葡萄球菌感染的疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,葡萄球菌感染的疾病包括猪渗出性皮炎。
11.一种饲料添加剂或饮用水添加剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
12.一种环境消毒剂,其特征在于,有效成分包括如权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体、如权利要求2所述的噬菌体组合物或如权利要求4所述的噬菌体制剂。
13.根据权利要求12的环境消毒剂,其特征在于,噬菌体的使用浓度为1×109PFU/ml以上。
14.一种食品保鲜剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体vB_SauM_SA34或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
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