CN115261332A - 杂交瘤细胞株、单克隆抗体及制备方法、试剂盒及应用 - Google Patents

杂交瘤细胞株、单克隆抗体及制备方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物技术的技术领域，具体公开了一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及制备方法、试剂盒及应用。上述单克隆抗体是利用杂交瘤细胞株L001和/或杂交瘤细胞株L002制得的；且上述单克隆抗体的制备方法具体为：制备杂交瘤细胞株；利用杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，制得所述抗E蛋白单克隆抗体。以及包含上述单克隆抗体的检测试剂盒。本申请提供的应用抗E蛋白单克隆抗体制备的试剂盒能够快速、准确检测出乙脑灭活疫苗中E蛋白免疫原的含量。

Description

杂交瘤细胞株、单克隆抗体及制备方法、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及生物技术的技术领域，更具体地说，涉及一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及制备方法、试剂盒及应用。
背景技术
日本乙型脑炎(JEV)，又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由乙型脑炎病毒引起的人畜共患的蚊媒急性传染病。乙脑病毒囊膜糖蛋白(E蛋白)是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用，也是诱导中和抗体的重要区域。
利用抗E蛋白单克隆抗体结合有效示踪物，即可在相关试剂中快速准确鉴定E蛋白抗原。例如，可以通过抗E蛋白单克隆抗体可快速、准确检测出乙脑灭活疫苗中E蛋白免疫原含量。因此，抗E蛋白单克隆抗体的研发，已成为目前相关技术中专业人士最为关心的研发课题。
发明内容
为了快速、准确检测出乙脑灭活疫苗中E蛋白免疫原的含量，本申请提供一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及制备方法、试剂盒及应用。
第一方面，本申请提供一种杂交瘤细胞株，采用如下技术方案：
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202214。
上述保藏编号为CCTCC NO：C202214的杂交瘤细胞株，保藏时间为2022年1月12日，命名为杂交瘤细胞株L001。
第二方面，本申请提供一种杂交瘤细胞株，采用如下技术方案：
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202215。
上述保藏编号为CCTCC NO：C202215的杂交瘤细胞株，保藏时间为2022年1月12日，命名为杂交瘤细胞株L002。
第三方面，本申请提供一种抗E蛋白单克隆抗体，采用如下技术方案：
一种抗E蛋白单克隆抗体，所述抗E蛋白单克隆抗体是利用上述保藏编号为CCTCCNO：C202214的杂交瘤细胞株和/或保藏编号为CCTCC NO：C202215的杂交瘤细胞株制得的。
优选地，所述抗E蛋白单克隆抗体在乙脑病毒蚀斑减少中和试验中具备中和效应。
优选地，所述抗E蛋白单克隆抗体为IgG1型，轻链均为κ链。
第四方面，本申请提供一种抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，采用如下技术方案：
一种抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
制备所述杂交瘤细胞株；利用所述杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，制得所述抗E蛋白单克隆抗体。
优选地，所述杂交瘤细胞株的制备方法，具体包括以下步骤：
利用免疫原免疫小鼠，并制备乙脑病毒免疫脾细胞；将骨髓瘤细胞与乙脑病毒免疫脾细胞进行融合培养，制备杂交瘤细胞；利用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株及亚克隆，并采用乙脑病毒蚀斑减少中和试验筛选具备中和效应的单克隆杂交瘤细胞株，最终获取分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
骨髓瘤细胞具有无限***能力，由于该细胞并非高度分化细胞，因此***能力较强，而其他肿瘤细胞***能力较弱。因此，多在制备单克隆抗体时与B淋巴细胞融合，使单克隆抗体迅速大量增殖。本申请中，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制得稳定分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞具有无限增殖的特点，有利于其大量增殖，使抗E蛋白单克隆抗体可以规模化生产。
在一个具体的实施方式中，所述杂交瘤细胞株的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)使用乙型脑炎灭活疫苗对小鼠进行免疫，获得免疫后的小鼠。
(2)从步骤(1)免疫后的小鼠体内去除脾脏，经过处理获得乙脑病毒免疫脾细胞。
(3)将骨髓瘤细胞SP2/0与步骤(2)制备的乙脑病毒免疫脾细胞进行融合培养，获得杂交瘤细胞。
(4)利用ELISA法从步骤(3)获得的杂交瘤细胞中筛选阳性杂交瘤细胞株及亚克隆，获得系列阳性杂交瘤细胞。
(5)采用乙脑病毒蚀斑减少中和试验从步骤(4)获得的系列阳性杂交瘤细胞中筛选具备中和效应的单克隆杂交瘤细胞株，并采用Western-blot试验鉴别与变性后乙脑E蛋白结合反应，最终获得分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
优选地，利用上述杂交瘤细胞株获得抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：使用杂交瘤细胞株在小鼠体内进行诱生增殖，制得抗E蛋白单克隆抗体。
在一个具体的实施方式中，利用上述杂交瘤细胞株获得抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-14d后腹腔注入3×105-4×105个上述杂交瘤细胞株，7-10d后分别抽取腹水并标记，纯化获得抗E蛋白单克隆抗体。
优选地，利用抗E蛋白单克隆抗体的制备方法制得的抗E蛋白单克隆抗体纯度达到90％以上。
第六方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下技术方案：
一种试剂盒，所述试剂盒包含上述抗E蛋白单克隆抗体、或利用上述制备方法制得的抗E蛋白单克隆抗体。
在一个具体的实施方式中，上述试剂盒可以是使用抗E蛋白单克隆抗体进行夹心法检测乙脑灭活疫苗中E蛋白免疫原含量的试剂盒。
该试剂盒利用双抗体夹心的时间分辨荧光分析原理，采用制备的抗E蛋白单克隆抗体L001包被反应板，加入乙脑标准品剂待测样品，待测样品中的乙脑病毒抗原与已包被的抗E蛋白单克隆抗体L001结合，形成抗体-抗原复合物；再加入稀土元素标记的抗E蛋白单克隆抗体L002，形成抗体-抗原-抗体-稀土元素的复合物。增强液将复合物上的金属离子解离到溶液中，通过仪器检测离子信号强度，离子信号强度与待测样品中的抗原含量成正比，从而可以计算待测样品中乙脑病毒抗原含量。使用该试剂盒可以达到快速、有效地监控乙脑灭活疫苗中E蛋白免疫原的含量。
优选地，所述试剂盒利用双抗体夹心法检测乙脑病毒疫苗中的抗原浓度。
优选地，所述试剂盒包括包被于微孔板上的所述杂交瘤细胞L001产生的抗E蛋白单克隆抗体，以及稀土元素标记后的所述杂交瘤细胞L002产生的抗E蛋白单克隆抗体。
第七方面，本申请提供上述杂交瘤细胞株、上述抗E蛋白单克隆抗体、和/或上述试剂盒在在检测E蛋白含量方面的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
抗乙型脑炎病毒(JEV)病毒E蛋白(囊膜蛋白)特异性单克隆抗体，即为抗E蛋白单克隆抗体。目前，尚无抗E蛋白单克隆中和抗体。本申请提供的抗E蛋白单克隆抗体使用免疫小鼠与杂交瘤细胞融合技术，然后通过ELISA筛选阳性细胞株克隆，结合乙脑病毒蚀斑减少中和试验，最终获取抗E蛋白单克隆中和抗体的杂交瘤细胞株，并进行单克隆细胞培养，最后得到针对E蛋白的特异性单克隆中和抗体。
本申请提供的抗E蛋白单克隆抗体区别于一般使用地、从免疫小鼠血清中直接提取使用的多克隆抗体，能够避免无关抗体的影响，E蛋白可以直接包被使用。由于生产抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株均来源于最初的一个阳性杂交瘤细胞的复制繁殖，相同基因在同种细胞中进行表达，抗体各种特性一致，同时利用杂交瘤细胞可以无限繁殖的特点，从而达到大量生产同种抗E蛋白单克隆抗体的目的，填补乙脑病毒E蛋白单克隆抗体制备工艺的空白。
本申请提供的试剂盒是利用双抗体夹心法检测乙脑病毒疫苗中抗原浓度的。将抗E蛋白单克隆抗体L001包被于微孔板内，利用镧系稀土元素进行标记示踪的抗E蛋白单克隆抗体L002，将待测乙脑病毒疫苗或已知抗原浓度的乙脑病毒疫苗标记，利用上述两种处理后的抗E蛋白单克隆抗体和乙脑病毒疫苗中的抗原形成夹心复合物，检测乙脑病毒疫苗中的抗原浓度。通过使用已知抗原浓度的乙脑病毒疫苗，制作随着乙脑病毒疫苗抗原浓度变化、信号值变化的标准曲线。将未知乙脑病毒疫苗抗原浓度的信号值代入拟合的标准曲线，求得未知乙脑病毒疫苗中的抗原浓度，从而达到检测待测乙脑病毒疫苗中抗原浓度的目的。其中，待测乙脑病毒疫苗可以是乙脑疫苗样品，也可以是乙脑感染样品。
附图说明
图1为实施例1中杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002在乙脑病毒蚀斑减少中和试验中的蚀斑结果(图中，L001 5×表示杂交瘤细胞株L001制备的抗体与稀释5倍的病毒悬液混合后的蚀斑结果；L001 10×表示杂交瘤细胞株L001制备的抗体与稀释10倍的病毒悬液混合的蚀斑结果；L002 5×表示杂交瘤细胞株L002制备的抗体与稀释5倍的病毒悬液混合的蚀斑结果；L002 10×表示杂交瘤细胞株L002制备抗体与稀释10倍的病毒悬液混合的蚀斑结果；阴性对照表示病毒悬液原液中未加入待测抗体的结果)。
图2为本申请提供的杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002制备的抗体的Western-blot鉴定试验的电泳结果。
图3为利用实施例4提供的试剂盒中各标准品浓度对应的荧光信号值制得的标准曲线。
具体实施方式
本申请提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202214，命名为杂交瘤细胞株L001。
同时，本申请提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202215，命名为杂交瘤细胞株L002。
本申请还提供了利用上述杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002制得的抗E蛋白单克隆抗体。上述抗E蛋白单克隆抗体在乙脑病毒蚀斑减少中和试验中具备中和效应。上述抗E蛋白单克隆抗体为IgG1型，轻链均为κ链。
上述抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：制备所述杂交瘤细胞株；利用所述杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，制得所述抗E蛋白单克隆抗体。
另外，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述抗E蛋白单克隆抗体、或利用上述制备方法制得的抗E蛋白单克隆抗体。
进一步地，所述试剂盒利用双抗体夹心法检测乙脑病毒疫苗中的抗原浓度。
进一步地，所述试剂盒包括包被于微孔板上的所述杂交瘤细胞L001产生的抗E蛋白单克隆抗体，以及稀土元素标记后的所述杂交瘤细胞L002产生的抗E蛋白单克隆抗体。
上述试剂盒包括镧系稀土元素标记后的抗E蛋白单克隆抗体L002、包被于微孔板上的抗E蛋白单克隆抗体L001。另外，上述试剂盒还可以包括标准品、稀释液、分析缓冲液、增强液。
以下结合实施例1-4对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种杂交瘤细胞株的制备方法。其中，本实施例所用的免疫原为辽宁成大生物股份有限公司生产的乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)。利用上述杂交瘤细胞株的制备方法获得的杂交瘤细胞株分别命名为杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002。
上述杂交瘤细胞株的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)使用免疫原(乙型脑炎灭活疫苗)对BALB/c小鼠进行免疫。
初次免疫时，将乙型脑炎灭活疫苗与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma公司)充分乳化，经皮下多点注射至6-8周龄的雌性BALB/c小鼠体内，乙型脑炎灭活疫苗的用量为100μg/只。
每间隔2周，将乙型脑炎灭活疫苗与等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma公司)充分乳化注射至BALB/c小鼠腹腔，乙型脑炎灭活疫苗的用量为100μg/只。
第四次免疫后第7天，对BALB/c小鼠进行静脉采血，免疫小鼠的采血部位分别为尾部、左后腿部、背部、右后腿部、头部、左前腿部，同时，从未免疫小鼠的尾部采集阴性血清，作为对照。采集的血样分别按照1：32000对采集的血样进行稀释，测定血清效价，检测结果如表1所示。在细胞融合前3天，选择血清效价1.0×105以上的BALB/c小鼠用乙型脑炎灭活疫苗进行脾脏加强免疫，乙型脑炎灭活疫苗的用量为100μg/只，最后获得免疫后的BALB/c小鼠。
表1小鼠免疫后的血清效价检测结果
Figure BDA0003769575080000061
(2)制备乙脑病毒免疫脾细胞。
将所述步骤(1)免疫后的BALB/c小鼠处死，用75％酒精浸润，用消毒后的剪刀和镊子取出脾脏，除去脂肪和***后，用75％酒精洗涤，再用无血清1640培养基淋洗，置于筛网上，用无菌注射器的橡胶头充分研磨，通过无血清1640培养基使脾脏细胞冲洗进入无菌离心管，以1500rpm离心3min，最后用无血清1640培养基重悬，并进行计数，调整细胞浓度至2×108个/mL，作为乙脑病毒免疫脾细胞。
(3)将骨髓瘤细胞与乙脑病毒免疫脾细胞进行融合培养。
将骨髓瘤细胞SP2/0与步骤(2)制备的乙脑病毒免疫脾细胞按体积比1：7的比例充分混匀，以1500rpm离心3min，弃去上清液，置于37℃水浴环境中，在1min内缓慢加入已预热的1mL PEG-1500，边加边摇晃，加完后用已预热的20ml无血清1640培养基终止融合作用。
以1500rpm离心3min，弃去上清液，沉淀用HAT完全培养基充分悬浮，以每孔300μL/孔加入到96孔板内，置于温度为37℃，置于含5％CO2的细胞培养箱内进行细胞培养。其中，HAT完全培养基由次黄嘌呤100μmol/L、氨基喋呤0.4μmol/L、胸腺嘧啶核苷16μmol/L、15％(v/v)胎牛血清的1640培养基组成。
(4)利用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株及亚克隆。
以免疫原(乙型脑炎灭活疫苗)作为包被抗原，用pH值为9.6的0.05mol/L CB缓冲液稀释至2μg/ml，以100μL/孔加入酶标板，4℃包被过夜后拍干，用质量体积比为1％的明胶-PBS缓冲液封闭，300μL/孔，4℃封闭过夜后拍干备用。
取步骤(3)融合培养后的细胞培养液上清液，以100μL/孔加入酶标板，放置37℃孵育60min后，用含Tween-20的0.01mol/L PBST缓冲液洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记羊抗鼠二抗，放置37℃孵育60min后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，放置37℃避光显色10min，加入50μL/孔的1mol/L HCl终止反应。
将ELISA方法检测到的阳性杂交瘤细胞株接种至HT不完全培养基，使用有限稀释法进行多次亚克隆，获得阳性率达100％并稳定分泌系列单克隆杂交瘤细胞株，为系列阳性杂交瘤细胞。
(5)筛选单克隆杂交瘤细胞株
从步骤(4)获得的系列阳性杂交瘤细胞中，采用乙脑病毒蚀斑减少中和试验筛选具备中和效应的单克隆杂交瘤细胞株。
具体操作过程如下：
1)制备BHK21细胞24孔板；
细胞培养液MEM(1X)，使用前加入以下成分：新生牛血清(无乙型脑炎病毒抗体)10％(V/V)；3％L-谷氨酰胺1％(V/V)；7.5％碳酸氢钠溶液1％(V/V)；
配制BHK21细胞悬液；取对数生长期的BHK21细胞制成8×104～1.2×105/mL的悬液接种于24孔细胞培养板，每孔1mL，置二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)培养2d后长满单层，备用。
2)病毒与抗体中和
a.利用步骤(4)
取200PFU/0.4mL的检定用乙型脑炎病毒，分别取待测抗体300μL与稀释好的病毒悬液等体积混合(分别将病毒悬液稀释5倍和10倍)；将上述抗体病毒混合液于37℃水浴中和90min，每30min摇匀一次。
b.细胞与病毒的吸附
将长满单层的BHK21细胞板中的培养液吸出，然后加入中和后的抗体与病毒混合液每组各1孔；病毒对照组12孔，每孔0.1mL。轻轻摇动24孔细胞培养板，使液体均匀分布；将24孔细胞培养板置二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)中吸附90min，每30min摇动一次，每次摇动30s。
c.覆盖甲基纤维素覆盖液
吸附90min后，于24孔细胞培养板中缓慢加入甲基纤维素覆盖液，每孔1mL；然后放在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)中继续培养5d，培养期间禁止晃动细胞板。
3)计算结果
培养5d后，将24孔细胞培养板孔中液体吸出，加入结晶紫染色工作液，约1mL/孔；室温中染色30min，然后弃去染色工作液；用流动水轻轻冲洗各孔，直至水流看不到颜色，晾干后计数每孔蚀斑数。
最终获得分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株两株。扩大培养后液氮冻存，将筛选两株杂交瘤细胞株分别命名为杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002。
杂交瘤细胞株L001于2022年01月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202214。
杂交瘤细胞株L002于2022年01月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202215。
利用上述杂交瘤细胞株L001制备的抗体进行乙脑病毒蚀斑减少中和试验的蚀斑结果如图1所示。
利用上述杂交瘤细胞株L002制备的抗体进行乙脑病毒蚀斑减少中和试验的蚀斑结果如图1所示。
结合图1，说明本申请提供上述杂交瘤细胞制备的抗体在乙脑病毒蚀斑减少中和试验中具备中和效应。通过乙脑病毒蚀斑减少中和试验筛选获得的具备中和效应的单克隆杂交瘤细胞株分别为杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002。
上述杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002分泌获得的抗E蛋白单克隆抗体，经鉴定为IgG1型，轻链均为κ链。
实施例2
本实施例提供了一种抗E蛋白单克隆抗体。本实施例提供的抗E蛋白单克隆抗体是利用杂交瘤细胞株L001制得的，为抗E蛋白单克隆抗体L001。
上述抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
选择8-10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-14d后腹腔注入3×105-4×105个杂交瘤细胞株L001，7-10d后用注射器分别抽取腹水并标记。
腹水经12000rpm离心10min后收集上清，采用Protein A(购于GE公司)进行纯化：将填料装于色谱纯化玻璃柱中，将纯化柱于Bio-rad常压纯化仪连接，采用平衡缓冲液(按说明书方案配置)冲洗5个柱体积，待纯化的腹水用平衡液稀释10倍后按0.5ml/min流速上样，上样后继续用平衡液冲洗至基线，用洗脱液洗脱抗体，收集峰尖信号样本，洗脱的抗体采用中和液中和，采用Bio-rad公司的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定抗体浓度，其浓度为2.52mg/ml。
通过Sepharose S-200分子筛脱盐，SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达93.7％。
将纯化后获得的抗E蛋白单克隆抗体保存于-20℃环境下，备用。
实施例3
本实施例提供了一种抗E蛋白单克隆抗体。
本实施例与实施例2的不同之处在于：本实施例提供的抗E蛋白单克隆抗体是利用杂交瘤细胞株L002制得的，为抗E蛋白单克隆抗体L002。最终测得的抗体浓度为2.86mg/ml，纯度达94.8％。
检测试验一
分别以实施例2和实施例3制得的抗体为检测对象，进行Western-blot鉴定试验。Western-blot鉴定试验的方法为本领域常用的方法。Western-blot鉴定结果如图2所示。
根据图2的结果可知，利用本申请提供的杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002制得的抗体的电泳结果显示，在53kd位置出现了显影条带。由此可知，利用本申请提供的杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002制备的抗体均能够与E蛋白结合，即利用本申请提供的杂交瘤细胞株L001和杂交瘤细胞株L002制备的抗体为抗E蛋白单克隆抗体。
实施例4
本实施例提供了一种试剂盒。
其中，该试剂盒包括实施例2制备的抗E蛋白单克隆抗体L001和实施例3制备的抗E蛋白单克隆抗体L002。
该试剂盒包括：镧系稀土元素标记后的抗E蛋白单克隆抗体L002、包被于微孔板上的抗E蛋白单克隆抗体L001、标准品、稀释液、分析缓冲液、增强液。
上述试剂盒中各试剂的制备方法如下：
(1)抗E蛋白单克隆抗体L002的标记
将抗E蛋白单克隆抗体L002与铕标记试剂(PerkinElmer)在标记缓冲液中充分混匀，室温振荡10h，再利用层析柱纯化，同时收集流出液，获得镧系稀土元素标记后的抗E蛋白单克隆抗体L002。测量流出液的荧光信号值，加入10％BSA保护剂，于-20℃保存。
其中，抗E蛋白单克隆抗体L002与铕标记试剂的重量比为5：1。具体的，抗E蛋白单克隆抗体L002的添加量为1mg，铕标记试剂的添加量为0.2mg。标记缓冲液为pH＝9.0且50mmol/L Na2CO3。层析柱为SephadexTM G-50凝胶层析柱。
(2)抗E蛋白单克隆抗体L001的包被
将抗E蛋白单克隆抗体L001与包被液(50mmol/L Na2CO3，pH＝9.0)充分混合，混合后溶液中抗E蛋白单克隆抗体L001的浓度为3.5μg/ml。并将1ml混合后的溶液加入微孔板的反应孔中，37℃振荡包被2h，弃去孔内包被液。
继续向反应孔内加入封闭液(50mmol/L Tris-HCl，0.1％BSA，4％海藻糖，0.05％NaN3，pH＝7.2)，加入量为150μl/孔，4℃封闭10h，弃去孔内封闭液，从而将抗E蛋白单克隆抗体L001包被于微孔板的反应孔内，拍干，抽真空，4℃保存，备用。
(3)标准品的配制
利用乙脑灭活疫苗效力试验国家参考品(250010-20070201)作为乙脑病毒抗原浓度的参考物。
利用注射用水1ml复溶乙脑灭活疫苗效力试验国家参考品，复溶后溶液中抗原的含量为100U/ml。用稀释液(50mmol/L Tris-HCl，0.9％NaCl，0.1％NaN3，0.01％Tween-20，1.5％BSA，pH＝7.8)系列稀释，制备标准溶液：25U/ml、12.5U/ml、6.25U/ml、3.125U/ml、1.5625U/ml、0.78125U/ml，作为标准品，用于制备标准曲线。
检测试验二
利用实施例4提供的试剂盒对乙脑病毒疫苗中的抗原浓度进行检测。待测样本为2个未知抗原浓度的乙脑病毒疫苗。
利用上述试剂盒检测乙脑病毒疫苗的方法具体如下：
(1)将实施例4提供的试剂盒从冰箱中取出，室温下平衡15min后，向包被有抗E蛋白单克隆抗体L001的微孔板的反应孔内加入待测乙脑病毒疫苗25μL、镧系稀土元素标记后的抗E蛋白单克隆抗体L002 25μL、分析缓冲液(PerkinElmer)50μL，37℃下振荡孵育60min，然后洗板6次后，加入100μL增强液(PerkinElmer)，37℃振荡孵育5min后，在Biotek Neo2时间分辨荧光免疫分析检测荧光信号值。
上述方法中，利用标准品代替待测乙脑病毒疫苗，测得荧光信号值，制作标准曲线。并将待测乙脑病毒疫苗的荧光信号值带入标准曲线，计算出乙脑病毒疫苗中的抗原浓度。
利用实施例4提供的标准品检测获得的信号值如表2所示，制作的标准曲线如图3所示。
表2不同抗原浓度标准品的荧光信号值
标准品浓度(U/ml)/标准曲线中x值 荧光信号值 标准曲线中y值
0 434 0
0.78125 36762 36328
1.5625 67024 66590
3.125 147412 146978
6.25 247529 247095
12.5 520165 519731
25 957319 956885
由图3可知，测量信号值与标准品浓度之间的关系符合y＝a×x+b的线性关系，根据表2的数据拟合，曲线中a＝38113，b＝16288，相关系数R2＝0.998。
本试验中，2个待测样本的荧光信号值的检测结果如表3所示。
表3 2个待测样本的检测结果
Figure BDA0003769575080000111
由表3可知，利用本申请提供的试剂盒进行乙脑病毒疫苗中抗原浓度的检测，乙脑病毒疫苗在各稀释度下的结果接近，稀释度线性均在80％以上，能够达到乙脑病毒疫苗抗原浓度的检测标准。结合相关系数R2为0.998，说明利用本申请提供的试剂盒检测乙脑病毒疫苗中抗原的浓度，具有高准确度和高精密度，检测结果可靠。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202214。
2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202215。
3.一种抗E蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗E蛋白单克隆抗体是利用权利要求1和/或2所述的杂交瘤细胞株制得的。
4.根据权利要求3所述的抗E蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗E蛋白单克隆抗体在乙脑病毒蚀斑减少中和试验中具备中和效应。
5.根据权利要求3所述的抗E蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗E蛋白单克隆抗体为IgG1型，轻链均为κ链。
6.如权利要求3-5中任一项所述的抗E蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：制备所述杂交瘤细胞株；利用所述杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，制得所述抗E蛋白单克隆抗体；
优选地，制备所述杂交瘤细胞株的方法具体如下：利用免疫原免疫小鼠，并制备乙脑病毒免疫脾细胞；将骨髓瘤细胞与所述乙脑病毒免疫脾细胞进行融合培养，制备杂交瘤细胞；利用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株及亚克隆，并采用乙脑病毒蚀斑减少中和试验筛选具备中和效应的单克隆杂交瘤细胞株，最终获取分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
优选地，利用所述杂交瘤细胞株制备所述抗E蛋白单克隆抗体的制备方法具体如下：小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-14d后腹腔注入3×105-4×105个所述杂交瘤细胞株，7-10d后分别抽取腹水并标记，纯化获得抗E蛋白单克隆抗体。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3-5中任一项所述的抗E蛋白单克隆抗体、或利用权利要求6所述的制备方法制得的抗E蛋白单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用双抗体夹心法检测乙脑病毒疫苗中的抗原浓度。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于微孔板上的权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的抗E蛋白单克隆抗体，以及稀土元素标记后的权利要求2所述的杂交瘤细胞产生的抗E蛋白单克隆抗体。
10.如权利要求1-2中任一项所述的杂交瘤细胞株、权利要求3-5中任一项所述的抗E蛋白单克隆抗体、和/或权利要求7-9中任一项所述的试剂盒在检测E蛋白含量方面的应用。
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