CN115261318A - 产生自然杀伤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产生自然杀伤(NK)细胞的方法，该方法包括培养多能干细胞(PSC)以产生胚状体，在包含NK分化因子的分化培养基中分化胚状体以促进分化为NK细胞；在包含IL‑2的扩增培养基中扩增细胞以产生NK细胞。本发明还涉及通过该方法产生的NK细胞、包含通过该方法产生的NK细胞的药物组合物以及该NK细胞或NK细胞群在治疗疾病中的方法和用途。
Description
技术领域
本发明涉及由多能干细胞产生自然杀伤细胞的方法、通过该方法产生的自然杀伤(NK)细胞以及包含通过该方法产生的NK细胞的药物组合物。本发明还涉及通过该方法产生的NK细胞的方法和用途。
背景技术
细胞疗法或利用诸如干细胞和免疫细胞等细胞给药的疗法越来越多地用于治疗诸如癌症和传染病等疾病。现代细胞疗法中使用的免疫细胞的一个实例是自然杀伤细胞或NK细胞。NK细胞是CD3-CD56+固有先天淋巴细胞，被归类为I型固有淋巴细胞(ILC)。NK细胞占人类所有循环淋巴细胞的5-20％，在宿主防御感染源和恶性肿瘤方面发挥着至关重要的作用。已经证明NK细胞可以抵抗病毒或其他细胞内病原体并抑制肿瘤形成。NK细胞可以在没有预先抗原引发的情况下杀伤转化的细胞，并且它们的细胞毒性不受靶细胞主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的限制。
NK细胞活性受广泛的刺激性受体和抑制性受体的调节，这些受体的正负信号的复杂整合决定了NK细胞先天杀伤能力的最终配置。NK细胞通过这些受体识别转化或感染的细胞。转化或感染的细胞中的表面标志物表达发生变化，包括MHC I类分子的下调或诸如MICA/MICB和ULBP等应激诱导的分子的上调。NK细胞通过激活诸如NKG2D等受体来识别这些分子，并刺激NK细胞杀伤这些转化或感染的细胞。
NK细胞通过多种机制发挥杀伤作用。已经证明NK细胞直接递送裂解颗粒和成孔蛋白，包括颗粒酶和穿孔蛋白。还证明NK细胞释放诸如IFN-γ、TNF-α等细胞因子和趋化因子(CCL3、CCL4和CCL5)，它们形成先天性和适应性免疫应答。NK细胞利用的另一条途径是在NK细胞活化时上调FASL和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。NK细胞还表达CD16并识别抗体的与肿瘤细胞结合并触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc部分。
同种异体NK细胞过继转移已在晚期癌症患者中显示出临床益处，同时不会引起严重的不良副作用，例如移植物抗宿主病(GvHD)或细胞因子释放综合征(CRS)。然而，通过单采术从患者分离的NK细胞数量存在固有的局限性，而且供体之间NK细胞的数量和质量存在显著差异，这使得使用多剂量细胞进行治疗极具挑战性。
最近，多能干细胞(PSC)已用于稳定供应多种细胞谱系，包括NK细胞。由PSC分化的NK细胞表现出与从患者分离的常规NK细胞相似的功能，并且对血液学肿瘤和实体瘤具有广泛的细胞毒活性。因此，NK细胞的分化代表了一种有前途的过继性NK细胞免疫疗法的新方法。希望NK细胞可以被提供为现成的(off-the-shelf)细胞疗法，可能与针对抑制性检查点受体的抗体组合以增强抗肿瘤反应。然而，与开发NK分化方案有关的挑战仍然存在，该方案可以扩大规模，从而一致且可靠地产生NK细胞的高产量和周转率。另一个挑战是与NK细胞特性例如NK细胞的先天杀伤能力相关的培养间变异性。因此，需要用于产生NK细胞的改善和可扩展的方法。
本说明书中提及的任何出版物均通过引用并入本文。但是，如果本文引用了任何出版物，则此类参考文献并不构成承认该出版物在澳大利亚或任何其他国家/地区构成本领域公知常识的一部分。
发明内容
本发明人已经找到了以保留或改善NK细胞先天杀伤能力的方式将多能干细胞分化为自然杀伤细胞的改进方法。与本领域已知的方法相比，该方法还允许将NK分化按比例放大到良好操作规范(GMP)规模，并且效率获得提高。
在第一方面，本发明提供了产生自然杀伤(NK)细胞的方法，该方法包括：
a)培养多能干细胞(PSC)以生成胚状体；
b)在包含NK分化因子的分化培养基中分化所述胚状体以促进分化为NK细胞；和
c)在包含IL-2的扩增培养基中扩增b)的细胞以产生NK细胞。
本发明人提出，包括NK分化因子允许NK分化的提高的效率和可靠性。有利的是，与通过本领域已知的分化方案产生的NK细胞相比，通过该方法产生的NK细胞还表现出改善的特性。在一个实施方案中，NK分化因子是白介素-2(IL-2)。
因此，在一个实施方案中，本公开的NK细胞表达以下中的一种或多种：CD45、CD56、CD16、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2D、NKp44、NKp46、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。
在另一个实施方案中，相对于参照NK细胞，本公开的NK细胞表现出以下中的一种或多种的表达增加：CD45、CD56、CD16、KIR、NKG2D、NKp44、NKp46、FasL和TRAIL，所述参照NK细胞根据除了下述的本发明的方法分化：在b)中分化培养基包含NK分化因子和/或在c)中扩增培养基包含IL-2。
在一个实施方案中，本公开的NK细胞的扩增可以用饲养细胞系进行。在优选的实施方案中，饲养细胞系是K562髓系白血病细胞系。在进一步优选的实施方案中，K562髓系白血病细胞系表达膜结合IL-21。
在第二方面，本发明提供了通过第一方面的方法产生的NK细胞。
在第三方面，本发明提供了包含第二方面的NK细胞的药物组合物。
在第四方面，本发明提供了免疫治疗方法，包括向个体施用第二方面的NK细胞或第三个方面的药物组合物。
在第五方面，本发明提供了第二方面的NK细胞在制造用于个体免疫治疗的药物中的用途。
在第四和第五方面的实施方案中，个体患有癌症或传染病，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。
附图说明
下面参考附图仅以举例的方式描述本发明的实施方案。本公开的NK细胞在图中被标识为“iCamuno NK细胞”。本公开的参照NK细胞在图中被标识为“常规NK细胞”。
图1包括实施例2的iPSC分化为NK(iNK)细胞的显微照片。从人iPSC生成造血胚状体(HEEB)并随后分化为NK细胞，比较通过常规方法产生的NK细胞和通过本发明的方法产生的NK细胞。比例尺＝100μm。
图2显示了关键NK细胞标志物的表达水平，并包含显示CD45、CD56、CD16、KIR2DL1、KIR2DS2、NKG2D、NKp44、NKp46、FasL和TRAIL的组评估的柱状图。x轴说明了相对于GAPDH的表达水平，并比较了以下组：iPSC、常规NK细胞和通过本发明的方法产生的NK细胞。相对于常规NK细胞，通过本发明的方法生产的NK细胞中关键NK细胞标志物的表达水平更高或相当。
图3显示了CD45和CD56表面标志物的表达，包括比较以下组的流式细胞术图和柱状图：iPSC、常规NK细胞和通过本发明的方法产生的NK细胞。流式细胞术图显示，本发明的方法产生的NK细胞的更高比例为CD45和CD56二者阳性(本方法产生的NK细胞为80.3％和81.1％；相比之下，常规NK细胞为46.8％和49.8％)。
图4包括评估对K562髓系白血病细胞系的细胞毒性的荧光显微照片。这些图像是比较以下组的14h细胞毒性共培养试验的时程图像：iPSC、常规NK细胞和通过本发明的方法产生的NK细胞。以5:1的效应物:靶标(E:T)比例用mCherry标记K562髓系白血病细胞系，从而允许细胞毒性可视化。右下图显示通过本发明的方法产生的NK细胞对K562髓系白血病细胞系显示出改善的细胞毒性，从5小时时间点开始细胞死亡明显，在14小时时间点，几乎所有K562细胞都经历了细胞凋亡。相比之下，左下角的图像显示，在常规NK细胞和K562细胞的共培养中，细胞死亡仅在9小时时间点附近明显，而更多数量的K562细胞在14小时时间点仍然存活。最上部图显示iPSC和K562细胞的共培养没有导致显著的细胞凋亡，并说明是NK细胞(无论是常规NK细胞，还是通过本发明的方法产生的NK细胞)和K562细胞的共培养导致了细胞死亡。
图5显示了在细胞毒性试验后进行的流式细胞术分析，包括比较以下组的mCherry表达的流式细胞术图：iPSC、常规NK细胞和通过本发明的方法产生的NK细胞。从左到右，NK细胞与K562髓系白血病细胞的接种比率从1:1、2.5:1和5:1增加。顶行显示iPSC和K562细胞的共培养没有导致显著的细胞死亡，mCherry的表达水平读数分别为92.0％(对于1:1的比率)、91.1％(对于2.5:1的比率)和89.2％(对于5:1的比率)。中间一行显示常规NK细胞对K562细胞具有中等细胞毒性，mCherry的表达水平读数分别为49.0％(对于1:1的比率)、33.0％(对于2.5:1的比率)和19.8％(对于5:1比率)。底行显示通过本发明的方法产生的NK细胞对K562细胞表现出提高的细胞毒性，mCherry的表达水平读数分别为67.0％(对于1:1的比率)、35.8％(对于2.5:1的比率)和7.13％(对于5:1的比率)。
具体实施方式
本发明人已经确定了用于产生自然杀伤(NK)细胞的改进方法，特别是用于改善多能干细胞(PSC)的分化和/或扩增的方法。令人惊讶的是，改进的方法为产生NK细胞提供了高度可扩展的方案。此外，本发明人还确定了产生相对于常规NK细胞具有改善的功能特性的NK细胞的方法。
本发明人利用在分化的初始阶段包括细胞培养补充剂来提高PSC分化为NK细胞的单细胞活力。此外，本发明人已经发现包括NK分化因子提高了PSC分化为NK细胞的效率。
本发明人基于对基因表达数据集进行的主成分分析，研究了使用NK分化因子来提高PSC分化成NK细胞的效率。NK细胞和非免疫细胞之间的差异表达分析揭示了某些NK分化因子是关键受体，它们与NK细胞中独特表达的关键转录因子相互作用。基于该信息，本发明人开发了利用在分化过程的某些时间点期间包括NK分化因子以提高分化效率来产生NK细胞的方法。令人惊讶的是，本发明人发现，通过本文所述方法产生的NK细胞表现出改善的关键NK细胞标志物表达。此外，通过本文所述方法产生的NK细胞在共培养期间表现出针对白血病细胞的改善的细胞毒性。
因此，本文公开了利用在包含NK分化因子的分化培养基中培养多能干细胞来促进分化为NK细胞产生NK细胞的方法。
NK细胞与几个关键的表达标志物有关，例如CD45和CD56。这些NK细胞标志物的表达被认为与这些NK细胞的成熟度和功能特性相关并且反映了它们。NK细胞还表达许多控制NK激活状态的抑制性细胞表面受体和激活细胞表面受体。这些受体包括杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)和杀伤激活受体(KAR)。KIR识别“宿主”分子，从而与人类白细胞抗原(HLA)I类分子配对以抑制NK活化，因此允许耐受宿主细胞并保护宿主细胞免受NK细胞攻击。另一方面，成瘤细胞或病毒感染性细胞表达水平上调的KAR的配体，从而触发NK细胞活化，并因此引发这些患病细胞的细胞毒性。
使用从供体中提取的NK细胞的NK细胞疗法面临许多挫折，包括NK细胞的供应有限。为此，研究人员转向使用多能干细胞(PSC)作为NK细胞的来源。PSC能够无限地自我更新，因此对于在细胞疗法中的使用很有吸引力。PSC的一些实例包括人类胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(iPSC)。由于它们的多能性，hESC和iPSC是理想的起始细胞类型，允许开发多种细胞谱系，包括NK细胞。
研究表明，hESC-/iPSC衍生的NK细胞表现出有效抗肿瘤和抗病毒活性，这表明hESC和iPSC可以为这些疾病的基于细胞的标准化治疗的基本无限来源提供可能的解决方案。可能受益于NK细胞给药的疾病状况的一些实例包括癌症和传染病，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。
可以通过多种方式施用NK细胞疗法，例如通过静脉内(IV)途径，或靠近疾病部位的腹膜内。此外，NK细胞可以与诸如抗体癌症疗法等免疫疗法一起使用，以进行抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
除非在本说明书中另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通过参考公开文本通常理解的相同含义。
应当注意，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”是指一个/一种或多个/一种，例如，“一个/一种分子”应当理解为代表一个/一种或多个/多种分子。因此，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。
在随后的权利要求书和本发明的说明书中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另有要求，否则“包含/包括(comprise)”一词或诸如“包含/包括(comprises)”或“包含/包括(comprising)”等变体以包含的意义使用，即规定存在所述特征，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或添加其他特征。
本文所用术语“约”涵盖给定数值的±25％幅度的范围值。在其他实施方案中，术语“约”涵盖给定数值的±20％、±15％、±10％或±5％幅度的范围值。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7-3.3克(即3克±10％)等的值。
类似地，虽然产生NK细胞的方法包括有序的、连续的事件，但事件的时机可以改变例如至少25％。例如，虽然在一个实施方案中可以将具体步骤公开为持续一天，但该事件可以持续多于或少于一天。例如，“一天”可包括约18至约30小时的时间段。在其他实施方案中，时间段可以按该时间段的±20％、±15％、±10％或±5％变化。指示为多天的时间段可以是“一天”的倍数，例如两天可以跨越约36小时到约60小时的时间段等。在另一个实施方案中，可以减少时间变化，例如，第2天是从第0天开始的48±3小时；第4天是从第0天开始的96±3小时，第5天是从第0天开始的120小时±3小时。
如本文所用，“多能干细胞”或“PSC”是指这样的细胞，其能够无限复制自身并分化成形成组织或器官的一部分或三个胚层(内胚层、中胚层或外胚层)中的任何一个的所有细胞。多能干细胞有两种主要类型：胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)。
如本文所用，“胚胎干细胞”或“ESC”是指从已完成体外受精治疗并具有剩余胚胎的患者经同意捐赠的5-7天胚胎中分离的细胞。从人类胚胎中提取细胞的伦理问题在一定程度上阻碍了ESC的使用。
合适的人类PSC包括H1和H9人类胚胎干细胞。
如本文所用，“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指衍生自成体细胞的ESC样细胞。iPSC具有与ESC非常相似的特征，但避免了与ESC相关的伦理问题，因为iPSC不是衍生自胚胎。相反，iPSC通常衍生自已经“重编程”回多能状态的完全分化的成体细胞。该重编程步骤通常涉及以特定时间间隔和以某些浓度使用重编程因子。将成体细胞重编程回多能状态的一些示例性方法涉及使用施用于成体细胞培养物的RNA、蛋白质或其他小分子。或者，人类iPSC系也可商业获得。
合适的人类iPSC包括但不限于衍生自成纤维细胞的iPSC 19-9-7T、MIRJT6i-mND1-4和MIRJT7i-mND2-0以及衍生自骨髓单核细胞的iPSC BM119-9。其他合适的iPSC可以从美国威斯康星州麦迪逊的Cellular Dynamics International获得。
如本文所用，从iPSC分化的NK细胞可以称为“iNK”细胞。
如本文所用，“分化”是指细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型的过程，特别是较少特化类型的细胞变成更特化类型的细胞。
如本文所用，“培养基(medium)”或其复数“培养基(media)”是指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。
PSC向NK细胞的分化通常在受控条件下进行，特别是当生成的NK细胞旨在按照良好操作规范(GMP)施用于人类个体时。该过程的初始步骤涉及在例如组织培养板或培养皿上或生物反应器内培养培养中的PSC。鉴于能够在临床级别扩大NK细胞生产以进行过继转移，生物反应器的使用特别有吸引力。然而，利用组织培养板或培养皿的方案也可以被适当扩大，用于过继NK细胞转移。
将PSC培养在特定培养基中。合适的基础培养基包括但不限于Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium)/F12(IMDM/F12)、不含FGF2和TGF-β的TeSR1基础培养基(mTeSR1TM基础培养基，Stem Cell Technologies)；DF4S基础培养基，即Essential 8TM培养基(Life Technologies；也称为“E8”培养基)。细胞培养基可以补充其他生长因子，以提高PSC的克隆效率和单细胞存活。可以使用的示例性补充剂是CloneR(Stem Cell Technologies)。一旦PSC达到所需的汇合度，就可以收集细胞并接种和平板接种以形成胚状体。
如本文所用，“胚状体”(EB)是指由PSC组成的漂浮的三维聚集体。EB包括造血型EB，它是能够形成内皮祖细胞和血液祖细胞的EB。本领域已知生成EB的各种方法。例如，传统方法通常涉及生成PSC的单细胞悬浮液。然后可以将PSC培养在未包被的非组织培养处理的培养皿或微孔中，以防止PSC附着，从而在保持悬浮的同时促进细胞聚集。或者，可以将PSC培养在低附着培养皿或微孔中。较新的形成EB的方法涉及使用自旋聚集或生物反应器，从而提高效率和过程控制。ROCK抑制剂，例如Y-27632，也已被证明可以促进PSC聚集，从而导致EB的形成。EB具有类似于发育中胚胎的畸胎瘤样结构，并且EB的形成是建立从三个胚层中的任何一层分化为细胞(例如NK细胞)的常用平台。
在一些实施方案中，以约10,000个细胞/cm2至约40,000个细胞/cm2的初始密度，例如10,000个细胞/cm2、15,000个细胞/cm2、20,000个细胞/cm2、25,000个细胞/cm2、30,000个细胞/cm2、35,000个细胞/cm2或40,000个细胞/cm2，对PSC平板接种，以生成EB。
一旦EB形成，就将EB培养在包含NK分化因子的分化培养基中，以促进分化为NK细胞。使用的EB数量取决于所用的组织培养板、组织培养皿或生物反应器的类型。例如，如果使用6孔板，则可以对约10-30个EB平板接种。然而，本领域技术人员将理解，根据所使用的组织培养板、组织培养皿或生物反应器的表面积，确定待平板接种的EB的最佳数量的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，分化培养基包含基础培养基，例如DMEM、GLUTAMAXTM、人血清、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、β-巯基乙醇、***钠(除了基础培养基中存在的任何之外)、乙醇胺和抗坏血酸。
在一些实施方案中，NK分化因子是白介素-2(IL-2)。
在一些实施方案中，分化培养基进一步包含以下中的一种或多种：白介素-3(IL-3)、SCF、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、FLT3配体(FLT3L)和NK分化因子。
如本文所用，“分化因子”是指包括在分化培养基中的促进分化，特别是促进PSC分化成NK细胞的分子。然而，就本公开的目的而言，分化因子不是白介素-3(IL-3)、SCF、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)或FLT3配体(FLT3L)。
尽管本发明公开的培养基可包括特定成分(例如形态发生素、小分子和造血细胞因子)，但预期除了或替代所公开的那些成分之外，还可以使用具有相同、等同或相似特性的其他成分，这在本领域中是已知的。
如本文所用，“分化培养基”是指设计成支持细胞分化，即支持细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型的过程的培养基。根据本发明的方法，分化培养基用于支持将人类PSC转变为NK细胞的过程。
在一些实施方案中，分化培养基中IL-2的浓度为约1-150U/mL；分化培养基中IL-3的浓度约为1-15ng/mL；分化培养基中FLT3L的浓度为约1-30ng/mL；和/或分化培养基中IL-15的浓度为约1-30ng/mL。
在一些实施方案中，分化培养基中IL-2的浓度为约10U/mL、约15U/mL、约20U/mL、约25U/mL、约30U/mL、约35U/mL、约40U/mL、约45U/mL、约50U/mL、约60U/mL、约70U/mL、约80U/mL、约90U/mL、约100U/mL、约110U/mL、约120U/mL、约130U/mL、约140U/mL或约150U/mL。
在一些实施方案中，扩增培养基中IL-2的浓度为约10U/mL、约15U/mL、约20U/mL、约25U/mL、约30U/mL、约35U/mL、约40U/mL、约45U/mL、约50U/mL、约60U/mL、约70U/mL、约80U/mL、约90U/mL、约100U/mL、约110U/mL、约120U/mL、约130U/mL、约140U/mL或约150U/mL。
在一些实施方案中，分化培养基中IL-3的浓度为约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL或约15ng/mL。
在一些实施方案中，分化培养基中FLT3L的浓度为约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL、约20ng/mL、约21ng/mL、约22ng/mL、约23ng/mL、约24ng/mL、约25ng/mL、约26ng/mL、约27ng/mL、约28ng/mL、约29ng/mL或约30ng/mL.
在一些实施方案中，分化培养基中IL-15的浓度为约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL、约20ng/mL、约21ng/mL、约22ng/mL、约23ng/mL、约24ng/mL、约25ng/mL、约26ng/mL、约27ng/mL、约28ng/mL、约29ng/mL或约30ng/mL。
如本文所指，术语“确定培养基”是指培养基的每一成分的特性和数量是已知的。
在一些实施方案中，分化培养基或扩增培养基可以是不含异种物质的，并且掺入从天然来源，例如从胎盘或其他人组织中分离的人蛋白质，或者可以使用重组技术产生的人蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的所有蛋白质都是人类的。在一些实施方案中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。在一些实施方案中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的所有蛋白质都是人重组蛋白质。在一些实施方案中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是重组人蛋白质。
本文所述的所有蛋白质是本领域技术人员已知的，并且本文所述的大部分蛋白质(如果不是全部)都可商业获得。
本领域技术人员将理解，根据具体情况，可以以固定或变化的间隔更换细胞培养基。当细胞保持在培养中时，可能会生成有毒代谢物，培养的细胞会不断利用养分，其数量在扩增阶段稳步增加。因此，可以用新鲜的细胞培养基代替旧的细胞培养基。
在一些实施方案中，可以约每2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天更换分化培养基或扩增培养基。
一旦NK细胞群变得更加成熟，和/或足够数量的PSC已经分化为NK细胞，就需要更多的培养基更换，以补充不断增长和成熟的NK细胞群。在一些实施方案中，该时间段为约10-20天。在这个阶段之后，可以约每1天、约2天或约3天更换分化培养基或扩增培养基。
培养物中NK细胞的数量可以通过本领域已知的多种方法确定。例如，可以使用流式细胞术或显微术。如果使用流式细胞术，细胞样品可以用通常与NK细胞相关的标志物染色，例如CD3、CD56、CD45、CD94、CD122、CD127、CD16、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。
在一些实施方案中，细胞培养基中特定细胞因子、趋化因子、蛋白质、信号因子和生长因子的补充在限定的时间间隔内发生，之后停止这些因子的补充。
在一些实施方案中，在约5-20天后停止补充细胞培养基中特定细胞因子、趋化因子、蛋白质、信号因子和生长因子。例如，可以在约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20后天停止补充特定因子。
在一些实施方案中，在定义的间隔后停止补充一种或多种以下因子：IL-3、SCF、IL-7、IL-15、FLT3L和IL-2。
一段时间后，具有特定纺锤状或细长形态的扩增、漂浮的NK细胞开始出现在培养物中。通常，在培养15-50天左右观察到具有纺锤状或细长形态的NK细胞。在一些实施方案中，在培养约15天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天后观察到具有纺锤状或细长形态的NK细胞。
NK细胞标志物和功能特性的验证可以使用本领域已知的许多试验进行。通常与NK细胞相关的细胞表面标志物包括CD3、CD56、CD45、CD94、CD122、CD127、CD16、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。成熟的NK细胞通过颗粒胞吐作用和细胞毒性蛋白、细胞因子和趋化因子的释放起作用，以诱导靶向细胞死亡。NK细胞介导细胞死亡的示例性机制是通过与胱天蛋白酶酶促级联、凋亡信号传导和炎症信号传导的相互作用。因此，可以通过测量诸如Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)或其他细胞因子和趋化因子等蛋白质的表达水平，来测量NK细胞的成熟度和功能特性，包括细胞毒性和肿瘤杀伤能力。此外，某些标志物的细胞表面表达也是NK细胞归巢特性改善的标志。NK细胞功能特性的变化可以通过某些标志物或蛋白质表达水平的增加或降低来指示。此外，NK细胞功能特性的变化可以通过某些标志物或蛋白质的增加以及其他标志物或蛋白质的伴随降低来指示。
测定通过本发明的方法产生的NK细胞的细胞毒性的合适方法是，共培养NK细胞和作为靶细胞的肿瘤细胞系，例如K562、LN-18、U937、WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1或U266肿瘤细胞等。然后可以例如用对肿瘤细胞特异的荧光标记标记肿瘤细胞。然后可以基于荧光标记表达的减少来评估共培养过程中的细胞毒性，这将指示肿瘤细胞凋亡或细胞死亡。适合给肿瘤细胞加标签的标记的实例包括羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、mCherry或本领域已知的任何其他合适的荧光标记。或者，可以使用流式细胞术，例如通过Annexin-V(膜联蛋白V)或任何其他可固定的活力染料染色，进一步分析细胞凋亡和死细胞群。通常以特定的效应物:靶标比率进行NK细胞和肿瘤细胞的共培养。在一些实施方案中，该比率为约1:1至10:1。在一些实施方案中，该比率为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。用于测定ADCC的方法和试验也是本领域已知的，例如将NK细胞与靶细胞和合适的效应抗体例如NKp46一起孵育。ADCC试验及其试剂盒和试剂也可商业获得，例如Promega ADCC Bioassay。
发明人惊奇地发现，通过本方法产生的NK细胞表现出某些NK细胞标志物的表达增加。不受理论束缚，本发明人假设某些NK细胞标志物表达的增加可与功能特性的增加相关，例如针对感染性细胞或癌细胞的细胞毒性。这可与以下的一种或多种有关：对患病细胞的归巢能力增加、介导凋亡或炎症级联的效率增加、靶标识别增加或ADCC增加。此外，最近的研究表明，NK细胞也可能在适应性免疫中发挥作用，包括改善激活和对同一抗原随后二次攻击的反应。本发明人假设NK细胞标志物的增加也可能在介导或补充NK细胞在适应性免疫中发挥作用的能力方面发挥作用。
在一些实施方案中，NK细胞表达以下中的一种或多种：CD45、CD56、CD16、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2D、NKp44、NKp46、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。
在一些实施方案中，相对于参照NK细胞，NK细胞表现出以下中的一种或多种的表达增加：CD45、CD56、CD16、KIR、NKG2D、NKp44、NKp46、FasL和TRAIL，所述参照NK细胞根据除了下述的第一方面的方法分化：在b)中分化培养基包含NK分化因子和/或在c)中扩增培养基包含IL-2。
在一些实施方案中，NK细胞表现出NK细胞标志物或蛋白质约1％的增加、约2％的增加、约3％的增加、约4％的增加、约5％的增加、约6％的增加、约7％的增加、约8％的增加、约9％的增加、约10％的增加、约20％的增加、约30％的增加、约40％的增加、约50％的增加、约60％的增加、约70％的增加、约80％的增加、约90％的增加、约100％的增加或更多的增加。或者，NK细胞标志物或蛋白质的增加可以是根据本发明的方法产生的NK细胞或NK细胞群中的NK细胞标志物表达的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多倍的增加。
也可以通过共培养NK细胞与饲养细胞系来改善或增强本发明方法的NK细胞产生。饲养细胞被认为通过直接与NK细胞相互作用或通过释放有益的蛋白质和因子来增强NK细胞的分化和扩增。合适的饲养细胞系的一些实例是K562细胞、爱泼斯坦-巴尔淋巴母细胞(Epstein-Barr lymphoblastoid cell)、RPMI8866细胞、Jurkat细胞、Hep3B细胞、Raji细胞、MCF-7细胞和Ramos细胞。
在一些实施方案中，饲养细胞系是K562髓系白血病细胞系。
可以对饲养细胞系进行基因改造或改变，以进一步改善其增加NK细胞分化和扩增效率的能力。例如，可以对饲养细胞系进行基因改造以改变特定膜结合蛋白或受体的表达水平。
在一些实施方案中，K562细胞系表达膜结合IL-21。
在一些实施方案中，NK细胞和饲养细胞的共培养以5:1至1:5的比率进行。在一些实施方案中，该比率为约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
在一些实施方案中，本发明的方法包括在步骤b)中培养5-20天的时间。在一些实施方案中，该方法包括b)培养约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20天。
在一些实施方案中，该方法包括在NK细胞扩增之前在不包含NK分化因子的培养基中将EB培养预定时间间隔。在一些实施方案中，该预定时间间隔为约5-10天。在一些实施方案中，该预定时间间隔为约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。
在一些实施方案中，该方法包括将NK细胞扩增约10-50天的时间段。在一些实施方案中，该方法包括c)扩增约10天、约15天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天。
如本文所用，术语“药物组合物”是指已配制成用于施用于个体的包含本文所述NK细胞或NK细胞群的组合物。优选地，所述药物组合物是无菌的。在一个实施方案中，所述药物组合物是无热原的。
NK细胞或NK细胞群将以符合良好医疗实践的方式配制、按剂量给药和施用。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的具体疾病的类型、正在治疗的具体个体、个体的临床状况、给药部位、给药方法、给药时间安排、可能的副作用和为医师所知的其他因素。其他考虑因素包括在体内使NK细胞的细胞毒性和持久性最大化。待施用的NK细胞或NK细胞群的治疗有效量将由这些考虑因素决定。
可以通过任何合适的方法将NK细胞或NK细胞群施用于个体，包括静脉内(IV)注射和皮下注射。也可以将NK细胞与诸如抗体等另外的治疗剂或旨在在体内增强先天NK细胞特性或NK细胞活性的修饰剂一起施用。也可以在将NK细胞施用于个体之前用修饰剂预处理或引发NK细胞，以在体内增强先天NK细胞特性或NK细胞活性。合适的引发剂或修饰剂的实例是IL-2或IL-15。还设想了其他合适的蛋白质构建体、激动剂、拮抗剂、调节剂或炎症因子。
NK细胞由于在诱发ADCC方面的效应物特性也可用于抗体癌症疗法，抗体癌症疗法利用诸如单克隆抗体等抗体靶向肿瘤细胞。实际上，NK细胞能够通过细胞毒性颗粒胞吐作用、TNF死亡受体信号传导和诸如干扰素-γ等细胞因子的释放来介导抗体依赖性肿瘤杀伤。
术语“有效量”是指NK细胞或NK细胞群有效治疗个体的疾病状况、疾病或病症的量。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和防预性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是预防或改善个体的疾病状况、疾病或病症，或减缓(减轻)个体的疾病状况、疾病或病症的进展。需要治疗的个体包括已经患有疾病状况、疾病或病症的个体以及待预防疾病状况、疾病或病症的个体。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventation)”、“预防性(preventative)”或“防预性”是指防止疾病状况、疾病或病症的发生，或阻止、防御或抵挡住其发生，包括异常或症状。需要预防的对象可能易于发展所述疾病状况、疾病或病症。
术语“改善(ameliorate)”或“改善(amelioration)”是指包括异常或症状在内的疾病状况、疾病或病症的减少、减轻或消除。需要治疗的个体可能已经患有所述疾病状况、疾病或病症，或者可能易于患有所述疾病状况、疾病或病症，或者可能是待预防所述疾病状况、疾病或病症。
本文所用术语“个体”是指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物，特别是人类，或者可以是家畜、动物园动物或伴侣动物。尽管特别考虑本文公开的方法及其所得NK细胞或NK细胞群适合人类的医学治疗，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗诸如马、牛和羊等家畜，诸如狗和猫等伴侣动物，或诸如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物等动物园动物。
实施例
实施例1–试剂
表1.试剂
| 描述 | 供应商 | 目录号 |
| Essential 8培养基 | ThermoFisher | A1517001 |
| CloneR | Stem Cell Technology | 05889 |
| STEMdiff<sup>TM</sup> APEL<sup>TM</sup>2培养基 | Stem Cell Technology | 05275 |
| SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-692 |
| BMP4 | Miltenyi Biotech | 130-111-167 |
| VEGF | Peprotech | 100-20 |
| DMEM+GlutaMAX<sup>TM</sup>-I | ThermoFisher | 10565-018 |
| F12+GlutaMAX<sup>TM</sup>-I | ThermoFisher | 31765-035 |
| 热失活的人AB血清 | Sigma | H3667 |
| P/S(青霉素-链霉素) | ThermoFisher | 15140122 |
| L-谷氨酰胺 | ThermoFisher | 25030081 |
| β-巯基乙醇 | ThermoFisher | 21985023 |
| ***钠 | Sigma | 214485 |
| 乙醇胺 | MP Biomedicals | 193845 |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A4544 |
| IL-3 | Peprotech | 200-03 |
| IL-7 | Miltenyi Biotech | 130-095-361 |
| IL-15 | Miltenyi Biotech | 130-095-762 |
| FLT3L | Miltenyi Biotech | 130-096-477 |
| IL-2 | Peprotech | 200-02 |
| RPMI 1640培养基，无谷氨酰胺 | ThermoFisher | 21870-084 |
| FBS | ThermoFisher/HyClone | SH30071.03 |
表1列出的试剂是本领域技术人员已知的并且具有可接受的组成，例如DMEM和Ham′s F12。GLUTAMAX包含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，通常在0.85％NaCl中以200mM的浓度提供。GLUTAMAX在被培养的细胞切割二肽键后释放L-谷氨酰胺。CloneRTM是一种确定的无血清补充剂，旨在提高PSC的克隆效率和单细胞存活。STEMdiffTMAPELTM2培养基是一种完全确定的、无血清和无动物成分的用于分化PSC的培养基，基于Andrew Elefanty博士公开的APEL配方，并且没有诸如无蛋白质杂交瘤培养基等未确定成分。
表2.形成EB的PSC培养基
表3.分化培养基
| 描述 | 最终浓度 |
| SCF | 20ng/mL |
| DMEM+GlutaMAX<sup>TM</sup>-I | 56.6％ |
| F12+GlutaMAX<sup>TM</sup>-I | 28.3％ |
| 热失活的人AB血清 | 15％ |
| P/S(青霉素-链霉素) | 1％ |
| L-谷氨酰胺 | 2mM |
| β-巯基乙醇 | 1μM |
| ***钠 | 5ng/mL |
| 乙醇胺 | 50μM |
| L-抗坏血酸 | 20mg/L |
| IL-3 | 5ng/mL |
| IL-7 | 20ng/mL |
| IL-15 | 10ng/mL |
| FLT3L | 10ng/mL |
| IL-2 | 50U/mL |
表4.扩增培养基
实施例2–将PSC分化为NK细胞的方案
将人类iPSC常规培养于商业可得的Essential 8培养基中。在启动NK细胞分化之前，将融合度为40-50％的iPSC在补充有10％CloneR的Essential 8培养基中培养至少24小时，直到细胞融合度达到70-80％，以提高单细胞生存力。一旦汇合度达到70-80％，其中iPSC准备好进行分化，用TrypLETMExpress将细胞解离为单个细胞，并用40μm的细胞筛过滤以去除任何未解离的细胞聚集体。对收集的细胞进行计数，并以8000个细胞/孔的密度接种在超低附着圆底96孔板上，于补充有40ng/mL SCF、20ng/mL BMP4、20ng/mL VEGF和10％CloneR的STEMdiffTMAPELTM2培养基中，最终体积为100μL。然后将板以300x g离心5分钟，并在37℃、5％CO2中孵育6天以生成造血型胚状体(HE EB)。然后将在第6天形成的HE EB汇集到15ml Falcon管中并通过沉降收集。将收集的HE EB平板接种到2％明胶包被或未包被的6孔板上，于NK细胞分化培养基中，该培养基的组成为56.6％DMEM+GlutaMAXTM-I、28.3％F12+GlutaMAXTM-I、15％热失活人AB血清、1％P/S、2mM L-谷氨酰胺、1μMβ-巯基乙醇、5ng/mL***钠、50μM乙醇胺、20mg/L抗坏血酸、5ng/mL IL-3、20ng/mL SCF、20ng/mL IL-7、10ng/mLIL-15、10ng/mL FLT3配体(FLT3L)以及50U/mL IL-2。对于6孔板的每个孔，将约16个EB平板接种。在分化的前14天每6天更换培养基，在分化14天后每3天更换培养基。从分化的第7天起，培养基中不再补充IL-3。具有纺锤状形态的漂浮NK细胞在分化21-35天左右逐渐出现，加以收集用于后续分析和验证。对于扩增，将NK细胞与表达mbIL-21的K562髓系白血病细胞系以1:1的比率和2.5x105个细胞/mL的最小密度在NK扩增培养基(RPMI 1640培养基，补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1％P/S和50U/mL IL-2)中共培养。
实施例3–体外试验方案
为了验证实施例2产生的NK细胞，进行流式细胞术分析，来评估CD45/CD56的表达，或进行qPCR，来评估不同的NK标志物，包括CD45、CD56、CD16、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2D、NKp44、NKp46、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。对于NK细胞的流式细胞术分析，在FACS缓冲液(补充有2％(体积/体积)FBS的DPBS)中，将细胞用抗体(CD45-APC、CD56-BUV395)标记30分钟，然后在Fortessa X20分析仪上使用BDFACSTM软件进行分析。
对于细胞毒性试验，将实施例2产生的NK细胞与mCherry标记的K562髓系白血病细胞系以1:1、2:5和5:1效应物:靶标(E:T)比率共培养。在整个细胞毒性试验中获得延时图像，以评估活NK细胞的细胞毒性，并使用流式细胞术评估14h共培养后剩余的mCherry阳性细胞的百分比。细胞毒性被评估为mCherry表达的减少，因为经历细胞死亡或凋亡的K562细胞导致共培养中mCherry标记的观察减少。对于细胞毒性试验，将NK细胞与mCherry标记的K562细胞在NK扩增培养基中以上述各自比率在96孔板中共培养。
实施例4–PSC分化为NK细胞
根据实施例2产生NK细胞，并与在分化和扩增阶段不使用IL-2作为NK分化因子的产生NK细胞的方法进行比较和对比。
结果如图1所示，与不使用IL-2作为分化因子的方案相比，根据实施例2产生的NK细胞具有改善的扩增和分化效率。
实施例5–NK细胞的表征
对于定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)，使用市售试剂盒从实施例2产生的NK细胞制备总RNA。qRT-PCR使用以下步骤进行：1)95℃激活步骤5分钟2)两步循环(95℃下变性10秒，然后60℃下结合退火/延伸30秒)进行40个循环。用于qRT-PCR的引物如下表5所述。
表5.qRT-PCR的引物
图2说明了qRT-PCR分析，其揭示了根据实施例2产生的NK细胞表现出在源自iPSC的常规NK细胞(iNK细胞)中所看到的所有关键NK细胞标志物。此外，与常规iNK细胞相比，在实施例2产生的NK细胞中，某些关键标志物例如CD56的表达上调显著更高，CD56与更成熟的NK细胞相关并被认为与NK效应物特性相关。使用双尾未配对学生t检验进行统计分析。*＝p<0.05，**＝p<0.005，***＝p<0.0005，ns＝不显著。
图3所示的结果说明了实施例2产生的NK细胞的流式细胞术分析。令人惊讶的是，在存在IL-2的情况下，更高百分比的这些NK细胞是CD45+/CD56+，这表明IL-2的添加改善了NK细胞的分化。该结果还与图4和图5中的结果相关，其中使用在存在IL-2的情况下分化的NK细胞进行的试验中观察到更大的细胞毒性。
实施例6–NK细胞的细胞毒性
当与K562髓系白血病细胞系共培养时，将实施例2产生的NK细胞的细胞毒性特性与iPSC(其对K562细胞没有细胞毒性)和常规iNK细胞进行了比较。
图4中的结果说明iPSC(在顶部图中)对K562细胞没有细胞毒性。此外，在整个14小时共培养试验中没有明显的细胞死亡，这表明培养条件足以在整个过程中支持共培养的细胞，而不会引起自发性细胞死亡。iNK细胞(在左下图)对K562细胞具有中度细胞毒性，在10小时时间点附近mCherry表达略有减少，在14小时时间点结束时mCherry表达中度减少。相比之下，令人惊讶的是，实施例2产生的NK细胞和K562细胞的共培养揭示，到4小时时间点时mCherry表达明显减少(与常规iNK细胞中的10小时相比)，到6小时时间点时mCherry表达中度减少(与传统iNK细胞中的14小时相比)，到13小时时间点时几乎没有mCherry表达。
接下来，评估了不同接种密度下NK细胞的细胞毒性特性。以对K562细胞比率为1:1、2.5:1和5:1，接种iPSC、常规iNK细胞和实施例2产生的NK细胞。
图5以流式细胞术图的形式显示了流式细胞术分析的结果，揭示了增加接种密度对于对K562细胞的细胞毒性特性的不同影响。顶行显示了iPSC和K562共培养的结果。尽管将接种密度增加到5:1，但没有观察到明显的细胞毒性作用。在所有接种密度下，mCherry阳性细胞的百分比>90％，表明几乎所有K562细胞都还是活着的。
中间一行显示了常规iNK细胞对K562细胞的结果。在1:1的比率下，共培养物中只有49％的细胞是mCherry阳性的，这表明K562细胞的中度细胞死亡或凋亡。在2.5:1的比率下，33％的细胞是mCherry阳性的，而在5:1的比率下，只有20％的细胞是mCherry阳性的，这表明很大比例的K5623细胞已经经历了细胞死亡。
底行显示实施例2产生的NK细胞的结果。在1:1的比率下，67％的细胞是mCherry阳性的，表明K562细胞的中度细胞死亡或凋亡。在2.5:1的比率下，35.8％的细胞是mCherry阳性的，然而在5:1的比率下，只有7.13％的细胞表达mCherry。这表明实施例2产生的NK细胞对K562细胞表现出高细胞毒活性，高于并超出常规iNK细胞的细胞毒性特性。
这些研究表明，本公开的NK细胞表现出关键NK细胞标志物的表达增加，这与针对肿瘤细胞系的细胞毒性活性的显著增加相关。这表明本公开的NK细胞表现出改善的效应物特性，并且可以对诸如传染病和癌症等疾病和疾病状况具有治疗效用。
Claims (12)
1.产生自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
a)培养多能干细胞(PSC)以生成胚状体；
b)在包含NK分化因子的分化培养基中分化所述胚状体以促进分化为所述NK细胞；和
c)在包含IL-2的扩增培养基中扩增b)的细胞以产生所述NK细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NK分化因子是白介素2(IL-2)；
优选地，所述分化培养基进一步包含以下中的一种或多种：Fms样酪氨酸激酶3配体(FT3L)、白介素3(IL-3)、白介素15(IL-15)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述分化培养基包含浓度为1-150U/mL的IL-2；
优选地，所述分化培养基包含浓度为1-15ng/mL的IL-3；
优选地，所述分化培养基包含浓度为1-30ng/mL的FT3L；
优选地，所述分化培养基包含浓度为1-30ng/mL的IL-15。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述PSC是人类胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(iPSC)；
优选地，所述分化培养基包含人血清。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞表达以下中的一种或多种：CD45、CD56、CD16、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2D、NKp44、NKp46、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；
优选地，相对于参照NK细胞，所述NK细胞表现出以下中的一种或多种的表达增加：CD45、CD56、CD16、KIR、NKG2D、NKp44、NKp46、FasL和TRAIL，所述参照NK细胞根据除了下述的权利要求1所述的方法分化：在b)中所述分化培养基包含所述NK分化因子和/或在c)中所述扩增培养基包含IL-2。
6.根据权利要求1所述的方法，其中c)扩增包括共培养所述NK细胞与饲养细胞系；
优选地，所述饲养细胞系是K562髓系白血病细胞系；
优选地，其中K562细胞系表达膜结合IL-21；
优选地，所述共培养以5:1至1:5的NK细胞与饲养细胞系的比率进行。
7.根据权利要求1的方法，包括b)培养约5-20天；
优选地，包括在b)之后且c)之前，在不包含所述NK分化因子的培养基中培养所述胚状体；
优选地，包括在b)之后且c)之前，在不包含所述NK分化因子的培养基中将所述胚状体培养约5-10天；
优选地，所述方法包括c)扩增约10-50天。
8.自然杀伤(NK)细胞，其根据权利要求1所述的方法产生；
优选地，所述的NK细胞，其表达以下中的一种或多种：CD45、CD56、CD16、杀伤免疫球蛋白样受体(KIRs)、NKG2D、NKp44、NKp46、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；
优选地，相对于参照NK细胞，所述NK细胞表现出以下中的一种或多种的表达增加：CD45、CD56、CD16、KIR、NKG2D、NKp44、NKp46、FasL和TRAIL，所述参照NK细胞根据除了下述的权利要求1所述的方法分化：在b)中所述分化培养基包含所述NK分化因子。
9.药物组合物，其包含权利要求8所述的NK细胞；
优选地，所述的药物组合物，其包含另外的治疗剂；
优选地，所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂是抗体。
10.免疫治疗方法，其包括向个体施用根据权利要求8所述的NK细胞或根据权利要求9所述的药物组合物。
11.根据权利要求8所述的NK细胞在制造用于个体的免疫治疗的药物中的用途。
12.根据权利要求10所述的方法或根据权利要求11所述的用途，其中所述个体患有癌症或传染病；
优选地，所述传染病选自由下列组成的组：人类免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。
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