CN115252893B - 一种抗炎抗氧化性神经导管的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗炎抗氧化性神经导管的制备，属于药物制备技术领域，解决了现有技术中生物相容性差、炎症反应大、神经再生困难的问题，包括确定不同浓度UA对细胞活力的影响，PCL NGCs的制备，载药水凝胶collagen/UA的制备，PCL/collagen及PCL/collagen/UA支架的制备。本发明PCL/Collagen/UA NGCs经机械性能等测试后表明具有优异的支架机械性和拓扑性，有利于负载药物的缓释，便于导管内部微环境维持的稳定；体外试验表明具有良好生物相容性，能够为细胞生长和神经再生提供有利的微环境；通过免疫调节作用，减轻损伤后炎症及氧化损伤，促进了神经再生。

Description

一种抗炎抗氧化性神经导管的制备
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体地说，尤其涉及一种抗炎抗氧化性神经导管的制备。
背景技术
中枢神经***与四肢的完整衔接是保证人正常活动的必要条件，周围神经正是连接中枢神经和四肢的桥梁，当周围神经损伤(PNI)时，这种衔接便中断了。PNI可能导致终身残疾，严重影响患者肢体功能，一般由车祸伤、枪伤、刀割等创伤引起，肿瘤压迫或血管紊乱性疾病也可能引起。
周围神经损伤(PNI)治疗效果欠佳，在损伤部位的局部炎症反应和持续氧化应激状态是影响神经再生的主要因素之一。自体神经移植是周围神经治疗的金标准，但自体移植要取自其他区域，需额外手术，对供区部位不可避免地造成新的损伤，造成供区功能牺牲，同时供体来源又很局限。研究显示周围神经在轻中度创伤后表现出一定的自我修复潜力，在损伤后会自发地出现新的轴突萌芽，但难以实现完整的神经再生，尤其长距离神经缺损，通常需要植入神经移植物来桥接断裂的神经，解决PNI在治疗上所面临的难题。
纳米技术、组织工程技术及活性生物材料备受关注，活性生物材料通过合理、精准的修饰后用于合成神经支架，能够有效地促进神经损伤修复，纳米结构的功能性生物材料已广泛用作组织工程支架来改善神经再生，如纳米发电机、微球、水凝胶等的应用。研究证实神经导管(NGCs)对长段周围神经损伤具有很大的再生潜能，NGCs可通过其物理化学特性使细胞发生定向迁移，促进细胞增殖分化。聚己内酯(PCL)等合成材料具有生物降解性好、无毒和结构稳定等优点，已证实在组织工程应用中有积极作用，广泛用于制备NGCs治疗PNI。
尿石素A(UA)是由肠道菌群分解鞣花单宁类物质的代谢中间产物，主要来源于石榴、草莓、核桃等，研究发现UA有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤以及免疫调节作用，可用于治疗炎症、氧化损伤以及衰老相关的疾病，具备抗炎抗氧化作用的药物对于改善PNI的治疗效果具有积极的作用，多项研究均表明UA有明确的神经保护作用。
基于此，利用UA促进损伤后的周围神经再生，胶原蛋白水凝胶神经导管提供机械支撑、生长空间、桥接断裂是当前临床应用过程新的研究方向。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供了一种生物相容性佳、机械性强、减轻炎症反应、有效促进神经再生的抗炎抗氧化性神经导管的制备。
为了实现上述技术目的，本发明抗炎抗氧化性神经导管的制备采用的技术方案为：
一种抗炎抗氧化性神经导管的制备，包括以下步骤：
S1确定药物浓度：将血旺细胞(RSCs)按2000个/孔规格接种在96孔板上，用高糖完全培养基(Dulbecco，s改进的Eagle培养基，含10％胎牛血清和1％青霉素或链霉素)孵育细胞24小时，待细胞完全贴壁后，分别加入不同浓度UA，明确不同浓度UA对RSC的影响，在加药24、48h两个时间点使用CCK8试剂盒分别检测细胞活力；
S2 PCL NGCs的制备：按6:1(ml/g)配比，向反应罐中加入一定量的2,2,2-三氟乙醇(TFE)和PCL颗粒，于室温下磁力搅拌24h至PCL完全溶解，形成16.7％(w/v)的透明粘合液，将溶液转移至10ml注射器中，静电纺丝机在直流电压条件下制备PCL NGCs，旋转收集1h后将中空的PCL NGCs剥离，真空干燥48h去除多余的三氟乙醇；
S3载药水凝胶(collagen/UA)的制备：鼠尾来源的I胶原蛋白溶解在0.1％的醋酸溶液中，胶原蛋白溶液的浓度为10mg/ml，UA加入至胶原蛋白溶液中，形成2uM的UA溶液，然后用EDC对溶液进行交联10min形成载药水凝胶，双蒸水去除未反应的EDC；
S4 PCL/collagen/UA支架的制备：将PCL NGCs放入模具中，三根细线穿过中空的NGCs拉紧固定，再通过27G超细针头将不同浓度的载药水凝胶注入管腔内，-80℃冷冻48h，冷冻干燥24h，制得PCL/collagen/UA NGCs。
优选的，所述步骤S2中静电纺丝机电纺参数为12kV高直流电压，溶液流速为0.8ml/h。
优选的，所述步骤S2中旋转收集器为钨钢棒，转速200rpm，直径2mm，接收距离25cm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明PCL/Collagen/UANGCs经机械性能等测试后表明具有优异的支架机械性和拓扑性，有利于负载药物的缓释，便于导管内部微环境维持的稳定；通过体外试验，表明具有良好生物相容性，能够为细胞生长和神经再生提供有利的微环境；通过体内试验表明，PCL/Collagen/UANGCs有效改善了神经再生，促进髓鞘的形成，有效减轻坐骨神经创伤后的氧化应激和炎症反应。
附图说明
图1为本发明制备流程图；
图2为水凝胶交联前后对比图；
图3为本发明中制备的NGCs尺寸；
图4为本发明中不同浓度UA对RSC细胞活力的影响；
图5为本发明进行活死染色实验后的生物相容性对比图；
图6为本发明进行鬼笔环肽实验后的生物相容性对比图；
图7为本发明中再生神经透射电镜(TEM)的结果示意图；
图8为本发明进行体内试验后的组织形态分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，对发明进一步说明：
如图1所示，一种抗炎抗氧化性神经导管的制备，包括以下步骤：
S1确定药物浓度：将血旺细胞(RSCs)按2000个/孔规格接种在96孔板上，用高糖完全培养基(Dulbecco，s改进的Eagle培养基，含10％胎牛血清和1％青霉素或链霉素)孵育细胞24小时，待细胞完全贴壁后，分别加入不同浓度UA，明确不同浓度UA对RSC的影响，在加药24、48h两个时间点使用CCK8试剂盒分别检测细胞活力；
S2 PCL NGCs的制备：按6:1(ml/g)配比，向反应罐中加入一定量的2,2,2-三氟乙醇(TFE)和PCL颗粒，于室温下磁力搅拌24h至PCL完全溶解，形成16.7％(w/v)的透明粘合液，将溶液转移至10ml注射器中，静电纺丝机在直流电压条件下制备PCL NGCs，旋转收集1h后将中空的PCL NGCs剥离，真空干燥48h去除多余的三氟乙醇；
S3载药水凝胶(collagen/UA)的制备：鼠尾来源的I胶原蛋白溶解在0.1％的醋酸溶液中，胶原蛋白溶液的浓度为10mg/ml，UA加入至胶原蛋白溶液中，形成2uM的UA溶液，然后用EDC对溶液进行交联10min形成载药水凝胶，双蒸水去除未反应的EDC；
S4 PCL/collagen/UA支架的制备：将PCL NGCs放入模具中，三根细线穿过中空的NGCs拉紧固定，再通过27G超细针头将不同浓度的载药水凝胶注入管腔内，-80℃冷冻48h，冷冻干燥24h，制得PCL/collagen/UA NGCs。
其中，所述步骤S2中静电纺丝机电纺参数为12kV高直流电压，溶液流速为0.8ml/h。
其中，所述步骤S2中旋转收集器为钨钢棒，转速200rpm，直径2mm，接收距离25cm。
如图2所示，胶原水凝胶在交联前有一定的流动性，经过EDC交联后流动性几乎消失，而且能维持稳定的形态，SEM结果显示冷冻干燥后的水凝胶具有相互连接的多孔网络结构，这种结构在冻干过程中由于相分离而形成，是负债药物缓释的基础，多孔网络结构和孔的大小是影响营养物质、代谢废物和细胞渗透至水凝胶深层结构中的影响因素之一，有利于细胞浸润和迁移。
如图3所示，本发明中制备的NGCs长度为12mm，内径2mm，对PCL膜的机械性能测试后，支架平均厚度为0.41mm，断裂伸长率34.2％，弹性模量1.17Mpa，孔隙率77.9％，说明该支架具有优异的机械性、拓扑性、理想的刚性以及韧性，利于导管内局部微环境维持稳定。
实施例1、体外试验
S1细胞培养：在37℃，5％CO2的培养箱中，细胞在完全培养基(Dulbecco，s改进的Eagle培养基，含10％胎牛血清和1％青霉素或链霉素)中孵育，由于大鼠血旺细胞(RSC)是周围神经***最主要的神经胶质细胞，与周围神经生长和修复密切相关，故选用该细胞；
S2明确不同浓度UA对RSC细胞活力的影响：将RSC细胞以2000个/孔接种在96孔板上，培养箱中孵育24h，待细胞完全贴壁后加入不同浓度的UA，分别为0、1、2、4、8、16、32μmol/L，加药24、48后分别使用CCK8试剂盒对细胞活力进行检测，每孔加入10μLCCK-8试剂，避光孵育4h，使用酶标仪在450nm处检测上清液吸光度值，明确不同浓度UA对RSC细胞活力的影响，筛选最佳浓度；
S3细胞增殖分析：准备适量的PCL膜、PCL/Collagen膜、PCL/Collagen/UA膜，将膜裁剪成圆形、24孔板大小，75％酒精浸泡过夜，PBS润洗三遍以上以完全洗去剩余酒精，紫外线正反分别照射2小时，放入24孔板，使膜完全铺展开，用铁环压住稳定使其不漂浮，将RSC接种在膜上，TCP作为对照，20000个/孔，第1、3、5、7天往检测孔加入40μLCCK-8试剂，避光孵育4h，然后将对应24孔板里的上清液体吸取100μL转移至96孔板中，使用酶标仪在450nm处检测上清液的吸光度值；
S4细胞毒性分析：准备一定数量的PCL膜、PCL/Collagen膜、PCL/Collagen/UA膜，经过灭菌消毒处理后将膜放入24孔板，然后把RSC接种在对应的膜上，TCP作为对照，每个孔接种40000个细胞，孵育24h后将培养基吸出，用PBS润洗三遍，然后用活死细菌染色试剂盒量化细胞活力，在最后观察之前吸出工作液，再次用PBS轻轻润洗1-2遍，在倒置荧光显微镜镜下对各组细胞进行拍照；
S5细胞形态评估：RSC分别接种到PCL膜、PCL/Collagen膜、PCL/Collagen/UA膜及TCP上孵育4天，隔天更换培养基，满4天后，PBS缓冲液润洗3遍，3.7％多聚甲醛室温固定1h，然后用梯度酒精(10、30、50、70、80、90、95、100％)进行脱水处理，每次15分钟，室温下干燥，使用扫描电子显微镜拍摄评估细胞在不同的材料支架上的黏附形态；
S6细胞染色后观察其在不同支架上的黏附能力和形态：将RSC接种在膜上4天后，吸出培养基，用PBS缓冲液轻轻润洗3次，洗涤后用3.7％的多聚甲醛固定10-20min，吸出固定液，使用含有0.1％Triton X-100的PBS洗涤2-4次，每次5min，用含有1-5％的BSA和0.1％Triton X-100的PBS以1：40-200稀释Actin-tracker Red配置成工作液，每个孔板内加入400μL工作液，避光孵育30-60min，孵育完成后再次使用含有0.1％Triton X-100的PBS洗涤2-4次，最后使用DAPI对细胞进行核染色3-5min，倒置荧光显微镜下观察细胞分布及黏附情况，拍照记录。
RSCs是周围神经***最主要的神经胶质细胞，与周围神经生长和修复密切相关，如图4所示，使用不同浓度UA孵育RSCs，24h后各浓度组细胞吸光度值无明显差异，48h后1μmol/L略高于2μmol/L组，但无统计学意义，明显高于其余各组，差异有统计学意义，因此可以明确适宜浓度的UA对于RSCs细胞的增殖是积极的。
如图5所示，经LIVE/DEAD染色试剂盒及CCK-8试剂盒检测细胞活力后表明：图片内均显示出了高占比的活细胞，死细胞占比极低，同时各组之间的活死比值无显著差异。同样，24h时后结果显示各组之间细胞活力无明显统计学差异。
如图6所示，分别在第1，3，5，7天使用CCK-8试剂盒在450nm处检测细胞的吸光度值，各组间24h时吸光度值差异无统计学意义；在72h、120h、178h三个时间点，PCL+UA组明显高于其他组，TCP与PCL两组间无明显差异，显示PCL膜与含有UA的培养基具有良好的生物相容性。
支架上细胞的附着情况也是评估细胞活力的关键因素，将细胞接种在不同的支架，4天后每个组随机取一个孔使用Actin-Tracker Red-555进行染色，结果表明RSCs在膜上黏附良好，具有该细胞正常的结构，并有伪足延伸。
如图7所示，通过imageJ软件统计新生神经有髓鞘轴突直径、厚度及相同视野下的有髓鞘轴突的密度，再生神经透射电镜(TEM)结果显示：PCL/collagen/UA导管组与自体神经移植(Autograft)导管组接近，均优于PCL导管组及PCL/collagen导管组。
实施例2、体内试验
S1动物手术：20只大鼠随机分为四组，戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内麻醉，备皮暴露右腿表面皮肤，俯卧固定在手术台上，在右侧大腿中部切开一个1.5-2cm切口，钝性分离、显露坐骨神经，眼科剪切断坐骨神经两端，形成1长的坐骨神经缺损，用可吸收缝线将残端缝合至预先备好的导管支架上，使残端神经完全置入导管内部。自体组将神经切断后立即旋转半周后与残端神经缝合，所有大鼠随机分为PCL组、PCL/Collagen组、PCL/Collagen/UA组、自体组，每组n＝5。术后第4、8、12周对每个大鼠进行足迹采集并记录，第12周处死所有大鼠，取材分析。其中，创造长度10mm的坐骨神经缺损，然后将NGCs植入损伤部位，桥接神经残端，在自体组中，将剪断的神经旋转半周后与神经残端缝合，为预防感染，在软组织和皮肤缝合结束后往腹腔内注射antibiotic(ceftriaxone sodium,0.1g/kg)，持续三天。
S2坐骨神经指数与电生理评价：用合适大小的隔板将跑步机分隔为三个跑道，将大鼠放在跑步机上，进行5min适应性训练，将白纸放置在跑道上方，双侧脚掌涂抹红色印泥后再次放入跑道，记录足迹，计算坐骨神经功能指数：SFI＝[-38.3×(EPL-NPL)/NPL]+[109.5×(ETS-NTS)/NTS]+[13.3×(EIT-NIT)/N IT]-8.8。
IT：第二脚趾到第四脚趾的距离，PL：第三脚趾远端到脚跟的长度，TS：第一趾至第五趾的长度；N为健侧，E为术侧。SFI值的范围为-100到0，0表示坐骨神经功能正常，-100表示神经功能完全丧失。
术后12周通过电生理分析仪器记录包括复合动作(DCMAP)和神经传导速度(NCV)等电信号。
S3大鼠腓肠肌湿重评估：大鼠处死后取出患侧及健侧的腓肠肌，使用显微器械仔细分离肌肉表面的多余组织后称重：腓肠肌标准化湿重(％)＝Wx/Wo*100％，Wo是健侧腓肠肌湿重，Wx为患侧腓肠肌湿重。
S4组织形态分析：所有大鼠在术后12周完成电生理评估后处死，分离患侧神经及双侧腓肠肌，收集新生神经及患侧腓肠肌样品，神经组织通过HE染色、TB染色及TEM观察横切面形态，肌肉组织通过HE染色观察肌肉横切面形态；
HE染色，样品用4％多聚甲醛固定，然后包埋在石蜡中，切片制样；
TB染色和TEM，将样品组织放入4℃的2.5％戊二醛固定，固定后用环氧树脂包埋，切片制样。
如图8所示，术后4周、8周、12周观察大体情况，没有伤口延迟愈合、伤口化脓感染或者伤口溃疡出现，4、8、12周SFI值对比，结果表明PCL/Collagen/UA组在三个时间点均明显高于PCL组及PCL/Collagen组，均低于自体移植组，但与自体移植组的差异在第8周和第12周不明显；
电生理分析结果表明，PCL/Collagen/UA组再生神经DCMAP和NCV(38.9ms-1和3.0mV)，显著高于PCL组(21.4ms-1和1.6Mv，p＜0.05)和PCL/Collagen组(25.4ms-1和2.1mV，p＜0.05)，并且在术后12周与自体组(41.28ms-1和3.6mV，p＞0.05)无显著差异；
腓肠肌是坐骨神经支配的重要靶器官,当坐骨神经发生损伤后，该神经所支配的肌肉就发生萎缩，如腓肠肌，而且肌肉的萎缩程度与神经损伤的严重程度呈正相关,对所有大鼠进行评估，结果表明，PCL/Collagen/UA组肌肉纤维直径显著高于PCL组、PCL/Collagen组，低于自体移植组，但差异无统计学意义；
与PCL组和PCL/Collagen组相比，PCL/Collagen/UA NGCs有助于神经纤维的再生和髓鞘形成，在PCL/Collagen/UA组和自体组中，髓磷脂结构紧凑，呈多层螺旋状包裹在轴突周围，PCL/Collagen/UA组的有髓轴突的直径和密度、髓鞘厚度(3.91μm、2.71×104和0.64μm)与自体移植组(4.09μm、2.98×104和0.685μm)相比无显著差异，相比之下，PCL组及PCL/Collagen组仅出现少量神经纤维和大量空泡，有髓轴突髓鞘厚度的直径和密度明显小于PCL/Collagen/UA组自体移植组；
免疫荧光染色评估血旺细胞标记蛋白(S-100)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经丝特异性蛋白(NF-200)、以及β-III-微管蛋白(Tuj-1)，结果表明，在PCL/Collagen/UA组的MBP和S-100表达水平分别是PCL组的3.12和2.93倍(p＞0.05)，分别是PCL/Collagen组的2.21和2.08倍(p＞0.05)，而自体组是PCL组的3.53和3.21倍数(p＞0.05)，是PCL/Collagen的3.19和2.58倍(p＞0.05)，以上结果证实了PCL/Collagen/UA支架有效改善了神经再生，促进髓鞘的形成。
UA具有明确的抗炎抗氧化作用，而创伤性神经损伤会导致损伤部位及附近出现严重的氧化应激及炎症反应。因此我们在术后第12周评估了几个与氧化应激和炎症相关的标记物。与PCL/Collagen/UA组及自体移植组相比，PCL组中的nNOS、TNF-α和CD68的表达显著增加(Figure14)。我们还评估了MnSOD表达水平，与PCL/Collagen/UA组及自体移植组相比，MnSOD在PCL组中的表达明显更低，而PCL/Collagen/UA组与自体移植组相比无显著差异。这些结果均表明PCL/Collagen/UA可以减轻坐骨神经创伤后的氧化应激和炎症反应。
综上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，凡依本发明权利要求范围的形状、构造、特征及精神所为的均等变化与修饰，均应包括于本发明的权利要求范围内。

Claims (3)

1.一种抗炎抗氧化性神经导管的制备，其特征在于，包括以下步骤：
S1确定药物浓度：将血旺细胞(RSCs)按2000个/孔规格接种在96孔板上，用高糖完全培养基孵育细胞24小时，待细胞完全贴壁后，分别加入不同浓度UA，明确不同浓度UA对RSC细胞活力的影响，在加药24、48h两个时间点使用CCK8试剂盒分别检测细胞活力；
S2 PCL NGCs的制备：按6:1(ml/g)配比，向反应罐中加入一定量的2,2,2-三氟乙醇(TFE)和PCL颗粒，于室温下磁力搅拌24h至PCL完全溶解，形成16.7％(w/v)的透明粘合液，将溶液转移至10ml注射器中，静电纺丝机在直流电压条件下制备PCL NGCs，旋转收集1h后将中空的PCL NGCs剥离，真空干燥48h去除多余的三氟乙醇；
S3载药水凝胶(collagen/UA)的制备：鼠尾来源的I胶原蛋白溶解在0.1％的醋酸溶液中，胶原蛋白溶液的浓度为10mg/ml，UA加入至胶原蛋白溶液中，形成2uM的UA溶液，然后用EDC对溶液进行交联10min形成载药水凝胶，双蒸水去除未反应的EDC；
S4 PCL/collagen/UA支架的制备：将PCL NGCs放入模具中，三根细线穿过中空的NGCs拉紧固定，再通过27G超细针头将不同浓度的载药水凝胶注入管腔内，-80℃冷冻48h，冷冻干燥24h，制得PCL/collagen/UA NGCs。
2.根据权利要求1所述抗炎抗氧化性神经导管的制备，其特征在于：所述步骤S2中静电纺丝机电纺参数为12kV高直流电压，溶液流速为0.8ml/h。
3.根据权利要求1所述抗炎抗氧化性神经导管的制备，其特征在于：所述步骤S2中旋转收集器为钨钢棒，转速200rpm，直径2mm，接收距离25cm。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117771445A (zh) * 2023-05-16 2024-03-29 上海市第十人民医院 一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006020994A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Angiotech International Ag Compositions and methods using hyaluronic acid and hyluronidase inhibitors
CN104399131A (zh) * 2014-10-21 2015-03-11 赵红斌 具有组织诱导性功能的多通道神经修复导管及模具
KR101541999B1 (ko) * 2014-03-28 2015-08-05 동국대학교 산학협력단 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관
CN106074668A (zh) * 2016-08-03 2016-11-09 刘石磊 用于神经退行性疾病或神经再生的中药制剂
KR20200119919A (ko) * 2019-03-19 2020-10-21 고려대학교 산학협력단 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관
CN114288478A (zh) * 2021-12-24 2022-04-08 南通大学 一种组织工程神经复合体及其制备方法和应用
CN114732814A (zh) * 2022-01-27 2022-07-12 中山大学 尿石素a在防治过敏性鼻炎及过敏性哮喘中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL245399B1 (pl) * 2018-11-29 2024-07-15 Warszawski Uniwersytet Medyczny Kompozycja farmaceutyczna zawierająca urolitynę A lub jej pochodną do zastosowania zewnętrznego miejscowego w leczeniu, hamowaniu i zapobieganiu chorobom skóry i błon śluzowych o podłożu zapalnym

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006020994A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Angiotech International Ag Compositions and methods using hyaluronic acid and hyluronidase inhibitors
KR101541999B1 (ko) * 2014-03-28 2015-08-05 동국대학교 산학협력단 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관
CN104399131A (zh) * 2014-10-21 2015-03-11 赵红斌 具有组织诱导性功能的多通道神经修复导管及模具
CN106074668A (zh) * 2016-08-03 2016-11-09 刘石磊 用于神经退行性疾病或神经再生的中药制剂
KR20200119919A (ko) * 2019-03-19 2020-10-21 고려대학교 산학협력단 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관
CN114288478A (zh) * 2021-12-24 2022-04-08 南通大学 一种组织工程神经复合体及其制备方法和应用
CN114732814A (zh) * 2022-01-27 2022-07-12 中山大学 尿石素a在防治过敏性鼻炎及过敏性哮喘中的应用

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