CN115248237A - 铜基mof材料修饰的微电极及其在超氧阴离子检测上的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提出一种铜基MOF材料修饰的微电极，该微电极的具体制备过程如下：把碳纤维穿到玻璃毛细管孔里，碳纤维和铜线通过银导电胶连接；用指甲油密封微电极的尖端；去除微电极尖端表面的污染物；再将微电极置于铜基MOF材料配置的悬浮液中，制得铜基MOF材料包裹的碳纤维微电极。本发明选用的是金属铜作为金属中心制备的MOF材料，这是模仿SOD活性中心有易于变价的铜元素，所以具有良好的催化O2 ·‑歧化分解为O2和H2O2的能力。
Description
技术领域
本申请涉及新材料技术领域，尤其涉及一种铜基MOF材料及其在超氧阴离子清除上的应用、铜基MOF材料修饰的微电极及其在超氧阴离子的检测上的应用。
背景技术
O2 ·-属于活性氧物质(ROS)，是常见的化学生物学反应生成的产物，例如黄嘌呤氧化酶(XOD)可以催化黄嘌呤与O2的氧化还原反应，并且对生物体的生理功能至关重要。O2 ·-参与调节多种正常的细胞和活体功能相关的信号传导机制。为了维持有机体内氧化还原平衡，测量O2 ·-的浓度和清除过量的O2 ·-是非常重要的。因此，设计用于检测和清除生物***中的O2 ·-电催化和催化材料很有必要。研究较为广泛的是利用生物酶(超氧化物歧化酶SOD)构建传感器，但由于酶的价格昂贵、在恶劣条件下或长时间贮存时可能失去活性，并且酶活性中心易被蛋白质覆盖造成传递电子速率降低，因此发明价格低廉、制备简单、稳定性好的类酶材料代替SOD用于研究细胞和活体中的O2 ·-。
MOF是通过金属离子与有机配体的配位而形成的高度有序的晶体材料，其具有独特的化学和物理特性(包括超高孔隙率、大比表面积、可调结构、高热稳定性和化学稳定性)，因此在电化学传感器中引起了广泛关注。在生物体中，SOD活性中心有易于变价的铜元素，所以具有良好的催化O2 ·-歧化分解为O2和H2O2的能力，因此，我们设计了一种以铜为金属离子的MOF材料来实现O2 ·-的检测。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本申请的目的在于提出一种铜基MOF材料及其在超氧阴离子清除上的应用、铜基MOF材料修饰的微电极及其在超氧阴离子的检测上的应用，铜基MOF材料以铜作为金属中心、导电配体噻吩衍生物2,5-二羧酸-3,4-乙撑二氧噻吩(H2L)为有机配体合成了一种铜基金属有机框架纳米材料(Cu-MOF)，将Cu-MOF材料修饰在碳纤维电极(CFE)上，可以作为电催化剂，在-0.05V即可实现对O2 ·-的电化学还原检测，另一方面，Cu-MOF具有类似于SOD的化学催化性质，即歧化分解O2 ·-。本发明制备的Cu-MOF催化剂制备方法简单、易操作，具有优异的电催化和SOD模拟酶性能，已实现在细胞和活体层次清除活细胞中的O2 ·-功能。
为达到上述目的，本申请提出的一种铜基MOF材料修饰的微电极，该微电极的具体制备过程如下：
把碳纤维穿到玻璃毛细管孔里，碳纤维和铜线通过银导电胶连接；
用指甲油密封微电极的尖端；
去除微电极尖端表面的污染物；
再将微电极置于铜基MOF材料配置的悬浮液中，制得铜基MOF材料包裹的碳纤维微电极。
进一步地，通过将微电极在氢氧化钠中施加恒电位去除微电极尖端表面的污染物。
进一步地，所述铜基MOF材料悬浮液的浓度为50～800mg/mL。
进一步地，所述铜基MOF材料悬浮液是由铜基MOF材料与2％Nafion溶液超声均匀混合制备。
进一步地，所述铜基MOF材料的具体制备方法如下：
将2,5-二羧酸-3,4-乙撑二氧噻吩和N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1.5:1～3.5:1配置溶液，同时将二水合氯化铜溶于蒸馏水得到物质的量浓度为0.01～0.1mol·L-1的溶液；
溶解后得到的两种溶液混合加入到聚四氟乙烯衬底高压反应釜中，高温加热后获得结晶良好的Cu-MOF晶体，然后将其研磨得到铜基MOF材料。
进一步地，所述聚四氟乙烯衬底高压反应釜中高温加热温度为80～150℃，加热时间为24～60h。
一种铜基MOF材料修饰的微电极作为电化学传感器在细胞和活体中超氧阴离子浓度检测方面的应用。
进一步地，铜基MOF材料修饰的碳纤维微电极在细胞和活体中超氧阴离子浓度检测方面的应用，具体检测过程如下：采用三电极***，Cu-MOF修饰的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝作为对电极，以含有O2 ·-的0.1M pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液作为电解液，在工作电位为-0.05V下，进行计时电流扫描；在特定的O2 ·-浓度范围20-100uM(微摩尔)内，响应电流Ip与O2 ·-浓度呈良好的线性关系，通过响应电流Ip的数值得到O2 ·-浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明选用的是金属铜作为金属中心制备的MOF材料，这是模仿SOD活性中心有易于变价的铜元素，所以具有良好的催化O2 ·-歧化分解为O2和H2O2的能力。
(2)本发明合成的Cu-MOF材料的制备方法简单，且产量和纯度较高，通过单晶衍射可解析出MOF的准确结构。
(3)本发明制备的Cu-MOF材料可用于检测和清除生物***中的O2 ·-。
附图说明
本申请上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1(A)是本发明实施例1中合成的铜基MOF材料的TEM图；
图1(B)是本发明实施例1中合成的铜基MOF材料的SEM图；
图1(C)是本发明实施例1中合成的铜基MOF材料的能量色散X射线光谱图(EDX)；
图1(D)是本发明实施例1中合成的铜基MOF材料的XRD图谱和通过Diamond软件拟合得到的XRD图；
图2(A)是本发明实施例1中裸CFE的SEM图；
图2(B)是本发明实施例1中修饰了铜基MOF材料的CFE的SEM图；
图3(A)是本发明实施例1中Cu-MOF/CFE在0.1M PBS中20圈的循环伏安图，扫描速度为100mV/s；
图3(B)是本发明实施例1中O2 ·-引入PBS前后的循环伏安图；
图3(C)是本发明实施例1中裸CFE对O2 ·-的循环伏安图；
图4是本发明实施例1中Cu-MOF/CFE在-0.05V(vs.Ag/AgCl)电位下对20至100μMO2 ·-的安培响应图，每次加入的O2 ·-浓度为20μM；
图5是本发明实施例1中Cu-MOF/CFE在-0.05V(vs.Ag/AgCl)电位下对O2 ·-的选择性和对其它物质的抗干扰性测试图，其中图中实验过程中在不同时间分别加入了20μM AA、5μM DA、5μM 5-HT、5μM H2O2、20μM UA和10μM O2 ·-；
图6(A)是本发明实施例1中Cu-MOF/CFE在-0.05V(vs.Ag/AgCl)的电位下安培法记录Hela细胞释放O2 ·-，其中插图为位于Hela细胞簇上Cu-MOF/CFE和微注射管的明场显微镜照片；
图6(B)是本发明实施例1中Cu-MOF/CFE在-0.05V(vs.Ag/AgCl)的电位下记录Fe2+刺激大鼠大脑皮层释放O2 ·-，微注射速率为2.5μL/min，分别在1300s、1500s和1700s时进行刺激，每次持续20s；
图6(C)是本发明实施例1中在-0.05V(vs.Ag/AgCl)时，Cu-MOF/CFE在对酵母聚糖A的刺激下释放O2 ·-的电流响应；
图6(D)是本发明实施例1中在-0.05V(vs.Ag/AgCl)时，Cu-MOF/CFE检测Fe2+刺激大鼠大脑皮层释放O2 ·-的电流响应；
图7是本发明实施例1中在荧光显微镜和相应的明场显微镜下进行观察Cu-MOF清除细胞内ROS的实验。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
在该实施例中，按照下列方法制备铜基MOF材料，并将制备的铜基MOF材料用于修饰微电极，得到的微电极应用于细胞和活体中超氧阴离子的检测，同时铜基MOF材料用于细胞中超氧阴离子的清除，详细制备方法和应用如下：
(一)、一种铜基MOF材料(Cu-MOF)的制备方法，具体制备过程如下：
将34.1mg H2L(导电配体噻吩衍生物2,5-二羧酸-3,4-乙撑二氧噻吩)溶解在5mLN,N-二甲基乙酰胺(DMA)中，同时将46.04mg CuCl2·2H2O溶解在10mL H2O中；然后将两种溶液混合加入到规格20mL的聚四氟乙烯衬底高压反应釜中，在90℃下加热48h，获得结晶良好的Cu-MOF，然后将其在玛瑙研钵中研磨为Cu-MOF粉末。
对上述制备的Cu-MOF材料进行结构表征，具体表征结果如下：
图1(A)和图1(B)中所示为Cu-MOF的透射电子显微镜(TEM)和SEM图，从图中可以看到所合成的Cu-MOF形貌为矩形片状，尺寸在60～200nm之间。
图1(C)为该铜基MOF材料相应的能量色散X射线光谱(EDX)，表明所制备的Cu-MOF由C、O、S和Cu元素组成，不含任何其它元素。
图1(D)为该铜基MOF材料的XRD图谱和通过Diamond软件拟合得到的XRD图，所合成的Cu-MOF材料在XRD图谱上存在一系列尖锐的衍射峰，与Cu-MOF的模拟模型(DatabaseIdentifier IHONOK,Deposition Number 1040717,Cambridge Crystallographic DataCentre)相同，表明我们成功合成了相同的晶体结构的Cu-MOF，通过谢乐公式计算出平均晶粒尺寸为约76.2nm，结合Cu-MOF的形貌数据尺寸，表明在水热反应过程中形成了完美的Cu-MOF晶体，并且可以认为每个矩形纳米片都是单晶纳米材料。
(二)、上述制备的铜基MOF材料修饰的微电极的制备过程如下：
用P-97型拉制仪拉制玻璃毛细管，设置的参数为：HEAT 560，PULL 55，VEL 95，TIME200，P 200；
用手术刀片切开毛细管尖端，把直径为30μm的碳纤维穿到孔里，碳纤维和铜线通过银导电胶连接，用指甲油密封电极的尖端，避免在浸入溶液时产生虹吸现象，影响电化学测量；
将微电极(CFE)浸入乙醇中以去除碳纤维表面的指甲油，等电极表面干燥后，在0.1M NaOH中施加1.5V(vs.Ag/Cl)恒电位持续80s去除CFE尖端表面的污染物；
将Cu-MOF粉末(300mg/mL)与2％Nafion超声均匀混合，再将CFE放置上述溶液浸泡，即得到Cu-MOF修饰的碳纤维微电极(Cu-MOF/CFE)。
对上述铜基MOF材料修饰的碳纤维微电极的形貌和电化学性能表征结果如下：
图2(A)中是裸CFE的SEM图，而图2(B)是Cu-MOF/CFE的SEM图，与图2(A)对比，可以明显地看出图2(B)中在碳纤维表面有密布的矩形片状Cu-MOF，这说明在Nafion的辅助下，Cu-MOF可以成功地修饰在CFE上，为后续的电化学实验奠定了基础。
图3(A)为Cu-MOF/CFE在0.1M的PBS中连续20圈的循环伏安图，由该图可知，在-0.2V处的还原峰归因于CuII还原为Cu0，可重现的伏安图也表明Cu-MOF在CFE上是比较稳定的，适合于进一步的活体活细胞分析应用。
图3(B)为将O2 ·-引入PBS前后的循环伏安图，其中图3(B)中PBS曲线为Cu-MOF/CFE在0.1M PBS的循环伏安图，PBS+XOD曲线为含1μL XOD的PBS的循环伏安图，PBS+XOD+400μMXanthine为含有1μL XOD和400μM黄嘌呤的PBS中的循环伏安图，由图可知，将O2 ·-引入PBS时，Cu-MOF/CFE在-0.05V左右出现明显的还原峰；
同时作为对照，我们还测试了裸CFE对O2 ·-的循环伏安响应，具体见图3(C)(其中PBS为裸CFE的循环伏安图，PBS+XOD+400μM Xanthine为含有1μL XOD和400μM黄嘌呤的裸CFE的循环伏安图)，在-0.05V没有发现明显的还原峰，表明O2 ·-是Cu-MOF/CFE产生还原峰的原因，这些结果表明，Cu-MOF/CFE可以用于检测O2 ·-的活体分析和细胞分析应用中。
我们利用计时电流法研究了Cu-MOF/CFE对O2 ·-的电化学传感性能，在20至100μM浓度范围内，Cu-MOF/CFE表现出很好的线性响应(如图4)，相关系数(R2)为0.962，最低检测限为5.18μM(信噪比＝3)；如图5所示，表征了Cu-MOF/CFE的选择性，并且在施加恒定电压-0.05V时，传感器对实际生理浓度的AA、DA、UA、5-HT和H2O2的响应远低于10μM O2 ·-，表明Cu-MOF/CFE有望应用于活细胞和活体分析应用。
(三)、将上述制备的Cu-MOF/CFE用于细胞和活体中检测O2 ·-，具体检测过程如下：
为了实时监测O2 ·-释放，Hela细胞在培养箱中培养了两天以上，以形成细胞簇。在电化学测量之前，将细胞培养液替换为不含任何蛋白质的PBS，防止对电极造成污染。据文献报道，在酵母聚糖A刺激作用下，这种活细胞簇会释放出大量的O2 ·-。如图6(A)、6(B)、6(C)和6(D)所示，以含有O2 ·-的0.1M pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液作为电解液，在工作电位为-0.05V下，进行计时电流扫描；在特定的O2 ·-浓度范围20-100μM(微摩尔)内，响应电流Ip与O2 ·-浓度呈良好的线性关系，通过相应电流测定得到O2 ·-浓度；微电极和刺激用的微注射管在一簇活细胞上互相靠近放置，用于刺激并检测细胞释放O2 ·-,585s时出现了一个尖锐的电流下降信号，该信号表示在酵母聚糖A刺激下，O2 ·-的大量释放。电极表面检测到的O2 ·-局部最大浓度约为20μM，这可能是源于癌细胞旺盛的代谢和细胞内部大量的生物化学反应。由于O2 ·-扩散到溶液中，电流逐渐回到刺激之前的基础水平。细胞实验结果表明，Cu-MOF/CFE具有在细胞水平上实时检测O2 ·-的能力。
为了测试所制备的Cu-MOF/CFE传感器活体检测O2 ·-的性能，我们将其植入SD大鼠大脑皮层进行安培法检测，并使用Fe2+刺激产生O2 ·-，然后对其中的O2 ·-浓度进行检测，具体检测条件和方法与上述Cu-MOF/CFE用于细胞中检测O2 ·-检测的方法和条件相同，通过相应电流测定得到O2 ·-浓度，如图6(B)所示，分别在1300s、1500s和1700s中分别以2.5μL/min的速率用微注射泵注射Fe2+，电流快速下降，表明大鼠脑内产生了O2 ·-；然后，电流值回到基线，原因是O2 ·-可能扩散到整个脑区，或被AA、GSH等其它保护性还原剂分解。这些结果表明Cu-MOF/CFE也可以成功地应用于活体实验。Cu-MOF的多样性、可调性等优异性能可以拓展MOF在生物分析中的应用，为电极界面的设计开辟新的道路。
(四)、将上述制备的Cu-MOF材料用于消除细胞内的O2 ·-，具体过程如下：
将Cu-MOF分散液与Hela细胞在培养基中孵育温育24小时，在荧光显微镜下进行实验，观察由ROS和DCFH-DA反应产生的绿色荧光。另外，用β-Lap孵育细胞6小时引起大量活性氧物质(ROS)生成。
参照图7，(其中图中(E)为对照试验，没有任何ROS引发剂和清除剂的Hela细胞；(F)孵育有Cu-MOF的细胞；(G)孵育有DCFH-DA的细胞；(H)孵育有DCFH-DA和Cu-MOF的细胞)，由图中记载可知，未处理的细胞中有浅绿色荧光，其中浅绿色荧光可能来源于Hela细胞内固有的ROS。与Cu-MOF孵育后，荧光强度减弱。而经β-Lap处理后，绿色荧光明显增强，显示细胞内ROS的大量产生。然而，Cu-MOF孵育细胞经β-Lap处理后，几乎没有观察到绿色荧光，即体系中几乎没有ROS。这些荧光强度反映的细胞内ROS浓度变化的实验为该Cu-MOF具有清除细胞内ROS的优异能力提供了有力的证据。
实施例2：
在该实施例中，可以将实施例1中使用的铜基MOF材料按照如下方法制备，具体制备过程如下：
将34.1mg H2L溶解在5mL N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中，同时将92.08mg CuCl2·2H2O溶解在10mL H2O中；将两种溶液混合加入到规格20mL的聚四氟乙烯衬底高压反应釜中，在90℃下加热48h。然后获得结晶良好的Cu-MOF，然后将其在玛瑙研钵中研磨为Cu-MOF粉末。
实施例3：
在该实施例中，可以将实施例1中使用的铜基MOF材料按照如下方法制备，具体制备过程如下：
将34.1mg H2L溶解在10mL N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中，同时将46.04mg CuCl2·2H2O溶解在10mL H2O中，将两种溶液混合加入到规格20mL的聚四氟乙烯衬底高压反应釜中，在90℃下加热48h。然后获得结晶良好的Cu-MOF，然后将其在玛瑙研钵中研磨为Cu-MOF粉末。
实施例4：
在该实施例中，可以将实施例1中使用的铜基MOF材料按照如下方法制备，具体制备过程如下：
将34.1mg H2L溶解在5mL N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中，同时将46.04mg CuCl2·2H2O溶解在10mL H2O中，将两种溶液混合加入到规格20mL的聚四氟乙烯衬底高压反应釜中，在120℃下加热48h。然后获得结晶良好的Cu-MOF，然后将其在玛瑙研钵中研磨为Cu-MOF粉末。
实施例5：
在该实施例中，可以将实施例1中铜基MOF材料修饰的微电极按照如下方法制备：
用P-97型拉制仪拉制玻璃毛细管，然后用手术刀片切开毛细管尖端，把直径30μm碳纤维穿到孔里，碳纤维和铜线通过银导电胶连接，用指甲油密封电极的尖端，并用乙醇中以去除碳纤维表面的指甲油；
在0.1M NaOH中施加1.5V(vs.Ag/Cl)恒电位持续80s去除CFE尖端表面的污染物。将Cu-MOF粉末(600mg/mL)与2％Nafion超声均匀混合，再将CFE放置上述溶液浸泡，即得到Cu-MOF修饰的碳纤维微电极(Cu-MOF/CFE)。
需要说明的是，在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。此外，在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更多个用于实现特定逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本申请的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本申请的实施例所属技术领域的技术人员所理解。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种铜基MOF材料修饰的微电极，其特征在于，该微电极的具体制备过程如下：
把碳纤维穿到玻璃毛细管孔里，碳纤维和铜线通过银导电胶连接；
用指甲油密封微电极的尖端；
去除微电极尖端表面的污染物；
再将微电极置于铜基MOF材料配置的悬浮液中，制得铜基MOF材料包裹的碳纤维微电极。
2.如权利要求1所述的一种铜基MOF材料修饰的微电极，其特征在于，通过将微电极在氢氧化钠中施加恒电位去除微电极尖端表面的污染物。
3.如权利要求1所述的一种铜基MOF材料修饰的微电极，其特征在于，所述铜基MOF材料悬浮液的浓度为50～800mg/mL。
4.如权利要求1或3所述的一种铜基MOF材料修饰的微电极，其特征在于，所述铜基MOF材料悬浮液是由铜基MOF材料与2％Nafion溶液超声均匀混合制备。
5.如权利要求1-3中任一项所述的一种铜基MOF材料修饰的微电极，其特征在于，所述铜基MOF材料的具体制备方法如下：
将2,5-二羧酸-3,4-乙撑二氧噻吩和N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1.5:1～3.5:1配置溶液，同时将二水合氯化铜溶于蒸馏水得到物质的量浓度为0.01～0.1mol·L-1的溶液；
溶解后得到的两种溶液混合加入到聚四氟乙烯衬底高压反应釜中，高温加热后获得结晶良好的Cu-MOF晶体，然后将其研磨得到铜基MOF材料。
6.如权利要求5所述的一种铜基MOF材料修饰的微电极，其特征在于，所述聚四氟乙烯衬底高压反应釜中高温加热温度为80～150℃，加热时间为24～60h。
7.一种如权利要求1所述的铜基MOF材料修饰的微电极作为电化学传感器在细胞和活体中超氧阴离子浓度检测方面的应用。
8.如权利要求7所述的铜基MOF材料修饰的碳纤维微电极在细胞和活体中超氧阴离子浓度检测方面的应用，其特征在于，具体检测方法如下：采用三电极***，Cu-MOF修饰的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝作为对电极，以含有O2 ·-的0.1M pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液作为电解液，在工作电位为-0.05V下，进行计时电流扫描；在特定的O2 ·-浓度范围内，响应电流Ip与O2 ·-浓度呈良好的线性关系，通过响应电流Ip的数值得到O2 ·-浓度。
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