CN115247168A

CN115247168A - 燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用

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Publication number: CN115247168A
Application number: CN202111016897.3A
Authority: CN
Inventors: 薛哲勇; 梁苗苗
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2041-08-31
Also published as: CN115247168B

Abstract

本发明涉及三萜的生物合成，具体涉及燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用。所述氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明首次发现并克隆了燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2，并通过烟草体外瞬时表达、GC‑MS和核磁共振鉴定了该酶的产物，为17(21)‑烯何伯醇(hop‑(17)21‑en‑3β‑ol)的生物合成奠定了基础。

Description

燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及三萜的生物合成，具体涉及燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用。

背景技术

三萜类化合物是天然产物中种类最多的一类，迄今为止，已经发现超过20000种，主要分布在植物中，其中双子叶植物三萜化合物的分布较为丰富，动物和微生物中也有分布，如在海洋动物海参和海星中发现了三萜类化合物的存在，在真菌灵芝中发现150余种灵芝三萜，细菌中可以催化鲨烯(squalene)合成三萜何伯烯(hopane)。

三萜类化合物具有重要的生物学活性和药用价值，早已广泛应用于食品、工业和医药等各个领域。2,3-氧化鲨烯是三萜苷元合成的直接前体，催化这一三萜合成的关键步骤的2，3-氧化鲨烯环化酶(OSC)又称三萜合酶。三萜骨架的多样性是由于植物中三萜合酶的多样性。目前有超过170种来源于植物的氧化鲨烯环化酶的功能得到验证，其中大多数是利用酵母菌株异源表达鉴定的。这些氧化鲨烯环化酶中大约三分之一为甾醇合酶(sterolsynthase)，包括环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase，CAS)和羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase，LAS)。催化三萜合成的氧化鲨烯环化酶有β-香树脂醇合酶(β-amyrin synthase，bAS)、羽扇豆醇合酶(Lupeol synthase，LUS)、达玛二烯醇合成酶(dammarenediol synthase，DS)等，其中常见的为β-香树脂醇合酶和羽扇豆醇合酶(Thimmappa et al.,2014)。

近年来，随着基因组测序的快速发展，一些植物的全基因组序列已经发表出来，很多OSC基因已经被克隆出来。双子叶植物的OSC已经被广泛研究，但是鲜有发现具有新颖功能的OSC酶。对禾本科单子叶植物水稻和高粱中的OSC进行功能分析，分别发现了几种前所未有的三萜合酶，如异乔木萜醇酶、fernenol合酶和simiarenol合酶(Busta et al.,2021)。挖掘具有新颖功能的OSC酶将有助于深入解析三萜生物合成途径，为三萜类化合物的生物合成奠定基础。

发明内容

基于上述领域的研究现状，我们推测从单子叶植物中更有可能挖掘到具有新颖功能的OSC酶。本发明通过对燕麦转录组数据进行分析，从燕麦中发现并克隆了燕麦氧化鲨烯环化酶基因AsHS2，利用Gateway技术构建了AsHS2烟草异源表达载体并进行烟草瞬时表达，通过GC-MS比较转基因烟草和对照烟草的提取物，找到了差异化合物，并通过核磁共振技术鉴定为17(21)-烯何伯醇(hop-(17)21-en-3β-ol)，该化合物即燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2的产物。

本发明提供的氧化鲨烯环化酶AsHS2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述氧化鲨烯环化酶AsHS2的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有权利要求2或3所述的基因的表达盒、载体和重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述的基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物中化合物hop-(17)21-en-3β-ol的含量发生改变。

优选地，所述基因是通过重组表达载体导入出发植物中的；所述重组表达载体是将所述基因***出发载体pEAQ-HT-DEST1中得到的；所述出发植物为对照烟草；所述转基因植物为转基因烟草。

所述转基因烟草与所述对照烟草相比，产生了化合物hop-(17)21-en-3β-ol。

所述氧化鲨烯环化酶AsHS2或所述基因在hop-(17)21-en-3β-ol生物合成中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明首次克隆了燕麦氧化鲨烯环化酶基因AsHS2并验证了其功能，为深入解析17(21)-烯何伯醇(hop-(17)21-en-3β-ol)的生物合成途径奠定了基础。

附图说明

图1.琼脂糖凝胶回收AsHS2基因的电泳图片。

图2.烟草表达产物GC-MS的总离子流色谱图(TIC)以及提取色谱谱图(EIC455.4)；图中数字1指示AsHS2转基因烟草产生的差异化合物(与对照烟草相比)，称作化合物1。tHMGR表示转入了pEAQ-HT-DEST1-tHMGR载体的对照烟草叶片样品；tHMGR-AsHS2表示转入了pEAQ-HT-DEST1-tHMGR和pEAQ-HT-DEST1-AsHS2表达载体的AsHS2转基因烟草叶片样品，每个样品三次重复。

图3.化合物1的TMS衍生物的质谱图。

图4.化合物1的碳谱。

图5.化合物1的氢谱。

图6.化合物1的结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。

生物材料

植物：以下实施例中使用的燕麦(Avena strigosa)品种为S75。以下实施例中使用的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)种子来自实验室保存，该材料已在Ting H,etal.SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressedcaryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.Molecular Plant.2015；8:454-466中公开。烟草瞬时表达实验中使用的是6周龄的烟草植株。

菌株：大肠杆菌Trelief^TM5α感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司。根癌农杆菌GV3101感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于必要的验证试验。

载体：中间载体pDONR207购自Invitrogen公司，是Gateway***的DONR载体，大小为5585bp，抗性为庆大霉素和氯霉素。植物双元瞬时表达载体pEAQ-HT-DEST1购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，载体大小为11654bp，Gateway技术兼容，带有35S启动子，P19基因沉默抑制蛋白编码基因，Kan抗性。

引物合成委托北京擎科生物科技有限公司和苏州金唯智生物科技有限公司完成。

DNA测序委托睿博生物技术有限公司和北京擎科生物科技有限公司完成。

主要试剂与耗材：

TRIzon总RNA提取试剂盒(货号：CW0580S)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：CW2302)，购自康为世纪生物科技股份有限公司。SuperScript^TMIII反转录试剂盒，购自Invitrogen公司，货号：18080093。2×

Max Master Mix(货号：P515-01)，2×RapidTaq Master Mix(货号：P222-01)，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

BP

II Enzyme mix(货号：11789021)，

LR

II Enzyme mix(货号：11791100)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher scientific)。质粒小量提取试剂盒(货号：D1100)，购自北京索莱宝科技有限公司。MES购自Sigma-Aldrich，CAS号：4432-31-9，货号：M3671。乙酰丁香酮购自Sigma-Aldrich，CAS号：2478-38-8，货号：D134406。Coprostanol(粪醇)购自Sigma-Aldrich，CAS号：360-68-9，货号：C7578。乙酸乙酯购自Sigma-Aldrich，CAS号：141-78-6，货号：270989。1-(Trimethylsilyl)imidazole-Pyridine mixture，中文名：1-(三甲基硅基)咪唑-吡啶混合物，购自Sigma-Aldrich，CAS号：8077-35-8，货号：92718。DNA Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)。各类抗生素、琼脂粉购自纳川生物科技公司。酵母提取物(Yeast Extract)、蛋白胨(Tryptone)购自Oxid公司。氯化钠(分析纯)、氢氧化钾(分析纯)购自永大试剂。去离子水购自屈臣氏。

仪器与设备：

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册(SambrookJ & Russell DW，Molecularcloning:a laboratory manual，2001)，公知文献或产品说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1.燕麦氧化鲨烯环化酶基因AsHS2的发现与克隆

1、燕麦AsHS2基因的发现

以燕麦转录组数据(http://db.ncgr.ac.cn/oat/RNAseq.php)为基础，用水稻的OSC基因序列进行比对，找到了1条完整的OSC基因序列，命名为AsHS2。AsHS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

燕麦AsHS2基因编码的氨基酸序列(755aa)：

MWRLKVSEGGGPWLRSSNGFLGRQVWEFDADAGTPDERAQIERLRHNFTEHRFHRRESHDLLLRFQYAKLNNLPANPPLTKLEKSTEVTEEIITRSLRRALNQYSTLQAHDGHWPGDYSGILFLMPMFIFSLYVTRSLNIVLSSEHRREICRHIYNHQNEDGGWGIHVAGPSTMLGSCLNYVALRLLGEMLDDKNDALIKGQAWILSHGSATAVPQWGKIFLSIIGVYDWSGNNPIIPELWLVPYFLPIHPGRYWCFCRLVYMSMAYLYGKKFVGPITATILELREELYGTSYENIDWSKTRNTCAQEDLRRPRSKVLSVILDCVNKFVEPMLNCWPAEKLRERALNNVMEQIQYNNETTEYIGLCPVDKALSMICCWVQNPNSDSFRQHLPRVYDYFWLAEDGMKAKIADGCTGWDTSFIIQAFCSTDMISEFSSTIKKAHEFIKKSQVRSNFPSYEIFYRHRSKGSWPLSTVDIGWSSSDCTAEAVKTLMLLSNNSPKLVGDSIEEEKLYDAIDCLISFMNKDGSVSTYEPKRGYSWLEILNPTESFKNIVVDHPTVEVTASVLDALMSFRELYPQYHEKEIRQHTESSAMYIESEQRDDGSWYGSWAICFTYGTLFAVKGLVAAGRTYENSSYIRKACNFLLSKQQITGGWGESYLSVETEDYVDTGSPHAVNTAWAMLALIYAGQAEIDPVPLYRGARVLINMQLDTGEFPQQEYTGAANSAFFFNYSNYRNIYPIMALGELRRKLAASRK(SEQ ID NO:1)。

燕麦AsHS2基因的核苷酸序列(2268bp)：

ATGTGGCGGCTGAAGGTGAGCGAGGGTGGCGGGCCGTGGCTACGATCGAGCAACGGCTTCCTCGGCAGGCAGGTGTGGGAGTTCGACGCCGACGCCGGCACACCCGACGAGCGCGCCCAGATCGAGAGGCTGCGTCACAACTTCACCGAGCACCGCTTCCACAGGAGGGAGTCCCACGACCTTCTCCTACGCTTCCAGTATGCAAAGTTAAACAACCTTCCAGCCAATCCTCCATTAACGAAGCTTGAAAAGAGTACCGAAGTCACTGAAGAAATCATAACAAGATCATTGAGACGAGCTCTAAATCAATACTCCACTCTACAAGCACATGATGGCCATTGGCCCGGTGATTACAGCGGAATATTGTTCCTTATGCCAATGTTTATATTCTCATTATATGTTACTAGATCACTTAACATTGTTTTATCGTCTGAACATCGACGTGAAATATGTCGCCACATTTACAACCACCAGAATGAGGATGGTGGTTGGGGAATACATGTTGCAGGGCCTAGCACGATGCTTGGCTCATGCTTGAATTATGTTGCATTAAGGCTCCTTGGTGAGATGCTAGATGACAAAAATGACGCATTGATAAAAGGGCAAGCTTGGATTTTATCTCATGGAAGCGCAACTGCGGTACCCCAATGGGGAAAGATATTTCTCTCGATAATTGGTGTATATGATTGGTCAGGAAACAATCCAATTATTCCTGAACTGTGGTTAGTTCCTTATTTTCTTCCAATACACCCAGGACGATATTGGTGCTTTTGCCGACTAGTGTATATGTCAATGGCATATCTTTATGGGAAGAAATTCGTTGGGCCCATTACTGCAACTATATTGGAACTACGCGAAGAGCTATATGGGACATCGTACGAAAATATTGATTGGAGTAAGACACGCAATACTTGTGCCCAGGAAGACCTTCGTCGTCCCCGCTCAAAGGTGCTGAGTGTTATTTTGGATTGTGTTAACAAGTTTGTGGAGCCAATGTTAAATTGTTGGCCAGCAGAGAAGCTCAGAGAGAGAGCTTTGAATAATGTCATGGAGCAAATTCAGTACAATAATGAAACAACTGAATACATTGGTCTTTGTCCTGTGGACAAGGCATTGAGCATGATTTGTTGTTGGGTACAAAATCCAAATTCAGATTCTTTCCGCCAACATCTTCCTCGAGTTTATGATTACTTTTGGCTCGCTGAAGATGGCATGAAGGCAAAGATAGCTGATGGCTGCACTGGCTGGGATACATCATTTATAATTCAAGCATTTTGCTCAACGGACATGATTAGTGAGTTCAGTTCAACTATAAAAAAGGCTCATGAGTTTATAAAAAAATCACAGGTTCGTTCAAATTTCCCAAGTTATGAAATATTTTATCGCCATAGATCAAAAGGTTCATGGCCTCTTTCAACTGTGGACATTGGTTGGTCTTCGTCTGACTGCACAGCAGAAGCAGTTAAGACATTGATGTTGTTATCAAATAATTCCCCCAAACTTGTTGGTGATTCGATAGAGGAAGAGAAGTTGTATGATGCAATTGATTGCCTCATTTCCTTCATGAATAAAGATGGCTCTGTTTCTACATACGAACCCAAAAGAGGTTACTCATGGTTAGAGATTCTCAATCCGACAGAGAGTTTTAAGAACATTGTCGTCGATCATCCAACGGTTGAAGTTACAGCATCTGTACTTGACGCCCTTATGTCATTCAGAGAGCTATATCCACAGTATCACGAAAAAGAGATAAGACAACATACAGAAAGTTCTGCTATGTATATTGAGAGTGAACAACGCGATGATGGTTCTTGGTATGGATCTTGGGCAATTTGTTTTACTTACGGGACTTTATTTGCGGTAAAAGGATTAGTTGCCGCTGGAAGAACATACGAGAATAGTTCTTATATTAGGAAAGCATGCAACTTCCTCTTGTCAAAGCAACAAATAACGGGTGGATGGGGCGAAAGCTACCTTTCCGTGGAAACCGAGGATTATGTTGACACTGGTAGTCCTCATGCGGTCAACACTGCATGGGCAATGTTAGCTCTAATTTATGCTGGGCAGGCTGAAATTGATCCGGTACCACTGTATCGTGGAGCAAGAGTATTGATCAACATGCAGCTAGACACAGGAGAGTTTCCTCAGCAGGAATACACTGGAGCTGCTAACTCGGCTTTTTTCTTTAACTACTCCAACTATCGCAACATCTACCCCATTATGGCTCTTGGAGAGCTTCGGCGCAAACTTGCTGCGAGCAGAAAGTAA(SEQID NO:2)。

2、克隆引物设计

根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计AsHS2基因的克隆引物，并委托苏州金唯智生物科技有限公司完成引物合成。引物的核苷酸序列如下：

AsHS2-F:5'-ATGTGGCGGCTGAAGGTGAGC-3'(SEQ ID NO:3)；

AsHS2-R:5'-TTACTTTCTGCTCGCAGCAAGTTTGCG-3'(SEQ ID NO:4)。

3、燕麦花序总RNA提取

采用康为世纪的TRIzon总RNA提取试剂盒(CW0580S)，按照试剂盒说明书记载的方法提取燕麦花序总RNA，步骤如下：

(1)取燕麦花序于液氮中迅速研磨成粉末，用离心管装取50mg粉末样品，然后加入1ml TRIzon，混匀，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

(2)再往离心管中加入200μL的氯仿，震荡15s使其充分混匀，室温放置两分钟。

(3)4℃，12,000rpm离心15min，样品分为3层，下层红色有机相、中间层和上层无色水相，RNA主要存在于水相中，把水相(约600μL)转移到一个新的RNase-Free离心管中，避免触及或吸取中层和下层。

(4)在得到的水相中加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀，室温放置10分钟。

(5)4℃，12,000rpm离心15min，弃上清。

(6)加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀。

(7)4℃，12,000rpm离心3min，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。

(8)室温放置2-3min，晾干，加入50μL无RNase的水，充分溶解RNA。

(9)RNA质量检测：分别用1％琼脂糖凝胶、Nanodrop分光光度计检测RNA的提取质量和提取浓度。

经Nanodrop分光光度计检测，获得了浓度为120ng/μL的燕麦花序总RNA溶液。

4、燕麦花序总RNA反转录

采用Invitrogen公司的SuperScript^TMIII反转录试剂盒(18080093)，按照试剂盒说明书记载的方法对提取的燕麦花序总RNA进行反转录，步骤如下：

(1)将以下试剂按顺序加入PCR管中，轻柔混匀并短暂离心。

65℃反应5min，然后立即冰浴3min。

(2)在冰上依次向上述PCR管中加入以下溶液，配置反转录体系：

50℃反应1h，时间可适当延长。

(3)70℃失活15min，终止反应，获得cDNA溶液，取1μL用1％琼脂糖凝胶检测反转录效果，剩余溶液保存于-20℃。

5、AsHS2基因扩增

以上述反转录得到的cDNA为模板，采用克隆引物(AsHS2-F/AsHS2-R)，按照下列反应体系和反应程序进行PCR，扩增燕麦AsHS2基因片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取1μL反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确。

6、AsHS2基因片段的回收

使用康为世纪的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CW2302)对正确的目的条带进行胶回收，步骤如下：

(a)电泳：2％琼脂糖凝胶电泳区分DNA条带。

(b)切胶：条带充分分开后，在紫外灯下迅速切下条带并称重。

(c)溶胶：按照W/V＝1:100加入溶胶液，50℃水浴15min，期间不断晃动，直到胶块完全溶解。若胶块不能完全溶解，可适当添加溶胶液或延长溶胶时间。

(d)DNA柱吸附：待融化的胶块冷却到室温后，将溶液转移到离心吸附柱内，静置2min，室温12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新***到回收管内。

(e)漂洗：取600μL漂洗液加入离心吸附柱内，室温12,000rpm离心1min，弃废液。重复一次，室温12,000rpm离心2min彻底去除漂洗液。

(f)洗脱：将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入40μL洗脱缓冲液，室温静置5min，12,000rpm离心2min，获得AsHS2基因片段(图1)。

实施例2.燕麦AsHS2烟草体外瞬时表达载体的构建

1、带重组接头的AsHS2基因克隆

(1)设计带重组接头的引物

根据AsHS2的基因序列，设计带有重组接头的引物，引物序列如下：

G-AsHS2-F:

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGTGGCGGCTGAAGGTGAGC-3'(SEQ ID NO:5)；

G-AsHS2-R:

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTACTTTCTGCTCGCAGCAAGTTTGCG-3'(SEQID NO:6)。

(2)扩增带重组接头的AsHS2基因

以上述胶回收得到的AsHS2基因片段为模板，采用带重组接头的引物(G-AsHS2-F/G-AsHS2-R)，按照下列反应体系和反应程序进行PCR，扩增带重组接头的AsHS2基因片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取1μL反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确。并对目的条带进行回收，获得添加了重组接头的AsHS2基因片段，称作G-AsHS2基因片段。

2、BP反应及转化

(1)BP反应

25℃孵育10h。

Proteinase K 1μL

37℃孵育10min，得到重组产物pDONR207_AsHS2，置于冰上。

(2)转化

取保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞Trelief^TM5α(北京擎科生物)置于冰上融化。加入5μL上述重组产物pDONR207_AsHS2，柔和混匀，静置于冰上30min。42℃热激45s，冰上放置2min。加入500μL不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm活化1h。将活化好的大肠杆菌于3,000rpm离心1min，去除450μL上清，用剩余上清液重悬菌体并将其全部涂布于含50μg/ml Gen⁺(硫酸庆大霉素)的LB固体平板上，37℃过夜培养。

(3)阳性菌落鉴定

从上述LB固体平板上挑取单菌落于500μL含50μg/ml Gen⁺的液体LB培养基中，37℃，200rpm活化3h。然后按照下述体系和方法进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。PCR引物如下：

pDONR-F：5’-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3’(SEQ ID NO:7)；

pDONR-R：5’-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3’(SEQ ID NO:8)。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取5μL反应产物溶液，用1％琼脂糖凝胶检测目的基因条带大小是否正确，并选择阳性菌落菌液，委托北京擎科生物科技有限公司进行测序。

(4)提取质粒

选择测序正确的菌液，取200μL小摇菌液于10mL含50μg/ml Gen⁺的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。取600μL菌液与600μL 60％甘油混合，保菌。剩余菌液采用质粒小量提取试剂盒(北京索莱宝，D1100)，按照试剂盒使用说明书记载的方法提取质粒，具体步骤如下：

收菌：将4mL菌液12,000rpm离心1min离心收菌，弃上清。

重悬：吸弃离心管中残留菌液，加入250μL含有RNase的细胞悬浮液，充分混旋使菌体彻底悬浮。

裂解：加入250μL细胞裂解液，轻轻上下颠倒混匀，此时溶液呈半透明状。

中和：加入350μL中和缓冲液，轻轻上下颠倒使其充分混匀，室温，12,000rpm离心15min。

DNA结合：小心将上清转移至带有离心管的离心吸附柱中，室温，12,000rpm离心1min，弃除滤液，将离心吸附柱重新放入离心管中。

漂洗：向吸附柱中加入500μL DNA漂洗液，室温，12,000rpm离心1min，弃除滤液，将离心吸附柱重新放入离心管中。重复一次，12,000rpm离心2min，彻底除去柱中残留液体。

洗脱：将离心吸附柱转移至1.5mL离心管中，向柱中央加入80μL洗脱缓冲液，室温放置2min，12,000rpm离心2min收集质粒。

凝胶检测：1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒质量，并用Nanodrop分光光度计检测质粒质量和浓度。

3、LR反应及转化

(1)LR反应体系：

25℃孵育10h。

Proteinase K 1μL

37℃孵育10min，得到重组产物pEAQ-HT-DEST1-AsHS2，置于冰上。

(2)转化

取保存于-80℃的大肠杆菌Trelief^TM5α感受态细胞置于冰上融化。加入5μL上述重组产物pEAQ-HT-DEST1-AsHS2，柔和混匀，静置于冰上30min。42℃热激45s，冰上放置2min。加入500μL不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm活化1h。将活化好的大肠杆菌于3,000rpm离心1min，去除450μL上清，用剩余上清液重悬菌体并将其全部涂布于含有100μg/ml Kan⁺的固体LB平板上，37℃过夜培养。

(3)阳性菌落鉴定

从上述固体LB平板上挑取单菌落于500μL Kan⁺(100μg/ml)液体LB培养基中，37℃，200rpm活化3h。然后按照下述体系和方法进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。PCR引物如下：

pEAQ-F：5’-CTTGCTGAAGGGACGACCTGCTAAA-3’(SEQ ID NO:9)；

pEAQ-R：5’-TAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTG-3’(SEQ ID NO:10)。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

(4)质粒提取

选择测序正确的菌液，取200μL小摇菌液于10mL含100μg/ml Kan⁺的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。取600μL菌液与600μL 60％甘油混合，保菌。剩余菌液用质粒小量提取试剂盒(北京索莱宝，D1100)，按照试剂盒使用说明书记载的方法提取质粒。

实施例3.燕麦AsHS2的烟草体外瞬时表达

1、烟草体外瞬时表达载体转化

将pEAQ-HT-DEST1-AsHS2表达载体转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞。

农杆菌转化方法如下：

(1)将-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞置于室温下或手心片刻，等待其部分融化，在冰水混合状态时***冰中。

(2)每50μL感受态细胞加入0.5μg质粒DNA，用手指拨打管底使其与质粒混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

(3)然后加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃使用摇床200rpm培养3小时。

(4)将培养的菌液于5000rpm离心1分钟收集菌体，留取100μL左右上清液，轻轻吹打重悬菌块后涂布于抗性筛选(50μg/ml Gent⁺,50μg/ml Kan⁺,20μg/ml Rif⁺)的LB平板上，倒置在28℃培养箱中培养2天。

2、菌落阳性鉴定

从上述LB固体培养基上挑取单菌落于含有50μg/ml Gent⁺、50μg/ml Kan⁺、20μg/mlRif⁺抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养1天。按照下列体系和程序进行菌液PCR，鉴定菌落是否为阳性。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

PCR反应结束后，取5μL反应产物溶液，用1％琼脂糖凝胶检测目的基因条带大小是否正确，并选择阳性菌落的菌液，委托北京擎科生物科技有限公司进行测序。

3、菌液扩大培养及烟草瞬时转染

(1)将测序正确的阳性菌落的菌液于10mL含有50μg/ml Gent⁺、50μg/ml Kan⁺、20μg/ml Rif⁺抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右。

(2)按照如下体系配制AgroMix缓冲液，混匀后于4℃保存。

(3)将培养好的菌液于5000rpm离心5min，收集菌体。去除上清，用AgroMix缓冲液重悬菌体并调节OD₆₀₀＝0.4，得到pEAQ-HT-DEST1-AsHS2-GV3101转染用菌液。同时制备pEAQ-HT-DEST1-tHMGR-GV3101转染用菌液。pEAQ-HT-DEST1-tHMGR-GV3101表示含有pEAQ-HT-DEST1-tHMGR表达载体的农杆菌GV3101，tHMGR为部分的HMGR催化亚基(3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，GeneBank ID：KY284573)，其构建方法已在非专利文献James Reed et al.,Atranslational synthetic biology platform for rapid access to gram-scalequantities of novel drug-like molecules.Metabolic Engineering 42(2017)185-193.中公开，通过引用将该文献的全部内容包含于此。

(4)采用pEAQ-HT-DEST1-tHMGR-GV3101转染用菌液注射烟草叶片，培养得到对照烟草。将pEAQ-HT-DEST1-tHMGR-GV3101转染用菌液与pEAQ-HT-DEST1-AsHS2-GV3101转染用菌液等体积混匀后注射烟草叶片，培养得到AsHS2转基因烟草。注射方法为：用一次性注射器吸取1mL菌液，取针头在烟草叶片上轻刺2-3个小孔，将注射器压在针孔部位，以手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内的菌液压送并渗透到叶片组织中，用标记笔在注射部位做好标记。经注射的烟草植株在25℃下，在12h光照和12h黑暗的光周期下培养七天，然后剪取对照烟草和AsHS2转基因烟草的叶片进行化合物测定。

实施例4.AsHS2烟草表达产物分析

1、烟草表达产物的提取

按照如下方法，分别提取实施例3获得的对照烟草和AsHS2转基因烟草叶片中的化合物：

(1)配制皂化试剂乙醇：水：KOH(固体)＝9ml：1ml：1g，加入Coprostanol(Sigma，C7578)作为内标，终浓度为10ng/mL。

(2)将烟草叶片冻干并研磨成粉末，取10mg粉末样品于新的eppendorf管中，加入1000μL皂化试剂。

(3)75℃加热1h，期间间歇涡旋，之后打开盖子再加热1-2h使乙醇蒸发。

(4)向干燥的样品中加入500μL色谱级乙酸乙酯(Sigma，270989)并涡旋使样品重新悬浮。

(5)再加入500μL水，再次涡旋。

(6)于8,000rpm离心1min使溶液分层(上层液体为黄色、下层液体为绿色)，转移上层液体至玻璃自动样品瓶中，可以长期保存在-20℃。

2、烟草表达产物的分析

(1)将50μL乙酸乙酯层转移于带有衬管的进样瓶中，氮吹干后加入50μL衍生化试剂1-(Trimethylsilyl)imidazole-Pyridine mixture(Sigma，92718)，涡旋振荡以确保干燥提取物的完全再溶解，70℃反应30min即可上机分析。

(2)用GC-QQQ-MS平台对衍生化的样品进行检测分析；GC-QQQ-MS平台为ThermoScientific TM TRACE TM 1310气相色谱仪和Thermo Scientific TM ISQTM 7000单四极杆GC-MS***；色谱柱为ZB-5HT(0.25mm×30m，Thermo Fisher scientific)；载气为He，流速为1.0mL/min；进样器温度为280℃。升温程序为：起始温度170℃，6℃/min升温至290℃，保持4min，10℃/min升温至340℃。进样量为1μL，分流比为20:1。MS检测器在70eV条件下，扫描区间为60～800。

(3)GC-MS的结果用Dionex Chromeleon 7色谱数据***软件进行分析。

从GC-MS检测结果可以看到，AsHS2转基因烟草与对照烟草相比，产生了一种差异化合物，即AsHS2酶的产物，称作化合物1。化合物1的出峰时间为19.37min(图2)，特征离子为365.37、455.41、498.48(图3)。

3、AsHS2烟草表达产物的分离鉴定

(1)化合物分离

将pEAQ-HT-DEST1-tHMGR-GV3101转染用菌液与pEAQ-HT-DEST1-AsHS2-GV3101转染用菌液等体积混合后批量侵染约200株烟草，收取侵染7天后的烟草叶片并冷冻干燥，干燥后的叶片称重并按比例加入皂化试剂(100mL/g)后于75度加热1小时。加入等体积的正己烷萃取三次，收集上层正己烷相旋干。使用中低压分离***(Biotage)对提取物进行分离，硅胶柱规格为45g，流动相是乙酸乙酯/正己烷(梯度洗脱0％-50％)，流动相流速为60mL/min。用TLC板对各组分进行检测，并确认目的化合物所在组分。根据检测结果合并相似组分，旋干，用二氯甲烷溶解，并再次过硅胶柱。硅胶柱规格为5g，流动相是乙酸乙酯/正己烷(梯度洗脱0％-2％)，流动相流速为25mL/min。用TLC板对各组分进行检测，并确认目的化合物所在组分。根据检测结果合并相似组分，旋干。使用高效液相色谱对化合物进一步纯化，所用半制备柱为Thermo Hypersil GOLD C18 column，250mm×10mm，5μm，流动相为水(A)和甲醇(B)，梯度程序为0～8min，60％～100％B；8～22min，100％～100％B；22～25min，100％～60％B，流速为5mL/min，柱温为30度，进样量为80μL，检测波长为210nm。共分离得到3mg化合物1。

(2)化合物鉴定

将分离的化合物样品用CDCl₃溶解，加入核磁管，由首都医科大学中心实验室应用Bruker 500MHz核磁共振波谱仪对纯化的化合物进行分析，获得了对应的碳谱和氢谱。化合物1的碳氢归属如表1所示，其碳谱和氢谱分别如图4和图5所示。根据碳谱和氢谱信息对化合物1的结构进行解析，结果显示，化合物1为hop-(17)21-en-3β-ol，其结构如图6所示。

表1 化合物1的碳氢归属

NO.	δ<sub>H</sub>	δ<sub>C</sub>	NO.	δ<sub>H</sub>	δ<sub>C</sub>	NO.	δ<sub>H</sub>	δ<sub>C</sub>
									1	0.95m,1.70m	38.9	11	1.26m,1.53m	21.4	21	/	136.1
2	1.60(2H,m)	27.4	12	1.39(2H,m)	24.0	22	2.64,m	26.4
									3	3.21ddd(11.2,6.1,4.9)	79.0	13	1.41m	49.3	23	0.98,s	28.0
4	/	38.8	14	/	41.7	24	0.76,s	15.4
									5	0.66(d,11,4)	55.3	15	1.26(2H,m)	31.8	25	0.83,s	16.2
6	1.37m,1.51m	18.4	16	1.89m,2.26(3.7,14.2)	19.8	26	0.93,s	16.3
									7	1.29m,1.43m	33.5	17	/	139.9	27	1.03,s	15.0
8	/	42.0	18	/	49.8	28	0.84,s	19.1
									9	1.27m	50.9	19	1.30m,1.65m	41.6	29	0.92,d(6.5)	21.3
10	/	37.2	20	1.63m,2.14m	27.5	30	0.97,d(6.6)	21.9

参考文献：

Thimmappa R,Geisler K,Louveau T,O'Maille P,Osbourn A.2014.Triterpenebiosynthesis in plants.Annu Rev Plant Biol 65:225-257.

Busta L,Schmitz E,Kosma DK,Schnable JC,Cahoon EB.2021.A co-optedsteroid synthesis gene,maintained in sorghum but not maize,is associated witha divergence in leaf wax chemistry.Proc Natl Acad Sci U S A 118(12):e2022982118.。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用

<130> P210499-DBL

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 755

<212> PRT

<213> Avena strigosa

<400> 1

Met Trp Arg Leu Lys Val Ser Glu Gly Gly Gly Pro Trp Leu Arg Ser

1 5 10 15

Ser Asn Gly Phe Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu Phe Asp Ala Asp Ala

20 25 30

Gly Thr Pro Asp Glu Arg Ala Gln Ile Glu Arg Leu Arg His Asn Phe

35 40 45

Thr Glu His Arg Phe His Arg Arg Glu Ser His Asp Leu Leu Leu Arg

50 55 60

Phe Gln Tyr Ala Lys Leu Asn Asn Leu Pro Ala Asn Pro Pro Leu Thr

65 70 75 80

Lys Leu Glu Lys Ser Thr Glu Val Thr Glu Glu Ile Ile Thr Arg Ser

85 90 95

Leu Arg Arg Ala Leu Asn Gln Tyr Ser Thr Leu Gln Ala His Asp Gly

100 105 110

His Trp Pro Gly Asp Tyr Ser Gly Ile Leu Phe Leu Met Pro Met Phe

115 120 125

Ile Phe Ser Leu Tyr Val Thr Arg Ser Leu Asn Ile Val Leu Ser Ser

130 135 140

Glu His Arg Arg Glu Ile Cys Arg His Ile Tyr Asn His Gln Asn Glu

145 150 155 160

Asp Gly Gly Trp Gly Ile His Val Ala Gly Pro Ser Thr Met Leu Gly

165 170 175

Ser Cys Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg Leu Leu Gly Glu Met Leu Asp

180 185 190

Asp Lys Asn Asp Ala Leu Ile Lys Gly Gln Ala Trp Ile Leu Ser His

195 200 205

Gly Ser Ala Thr Ala Val Pro Gln Trp Gly Lys Ile Phe Leu Ser Ile

210 215 220

Ile Gly Val Tyr Asp Trp Ser Gly Asn Asn Pro Ile Ile Pro Glu Leu

225 230 235 240

Trp Leu Val Pro Tyr Phe Leu Pro Ile His Pro Gly Arg Tyr Trp Cys

245 250 255

Phe Cys Arg Leu Val Tyr Met Ser Met Ala Tyr Leu Tyr Gly Lys Lys

260 265 270

Phe Val Gly Pro Ile Thr Ala Thr Ile Leu Glu Leu Arg Glu Glu Leu

275 280 285

Tyr Gly Thr Ser Tyr Glu Asn Ile Asp Trp Ser Lys Thr Arg Asn Thr

290 295 300

Cys Ala Gln Glu Asp Leu Arg Arg Pro Arg Ser Lys Val Leu Ser Val

305 310 315 320

Ile Leu Asp Cys Val Asn Lys Phe Val Glu Pro Met Leu Asn Cys Trp

325 330 335

Pro Ala Glu Lys Leu Arg Glu Arg Ala Leu Asn Asn Val Met Glu Gln

340 345 350

Ile Gln Tyr Asn Asn Glu Thr Thr Glu Tyr Ile Gly Leu Cys Pro Val

355 360 365

Asp Lys Ala Leu Ser Met Ile Cys Cys Trp Val Gln Asn Pro Asn Ser

370 375 380

Asp Ser Phe Arg Gln His Leu Pro Arg Val Tyr Asp Tyr Phe Trp Leu

385 390 395 400

Ala Glu Asp Gly Met Lys Ala Lys Ile Ala Asp Gly Cys Thr Gly Trp

405 410 415

Asp Thr Ser Phe Ile Ile Gln Ala Phe Cys Ser Thr Asp Met Ile Ser

420 425 430

Glu Phe Ser Ser Thr Ile Lys Lys Ala His Glu Phe Ile Lys Lys Ser

435 440 445

Gln Val Arg Ser Asn Phe Pro Ser Tyr Glu Ile Phe Tyr Arg His Arg

450 455 460

Ser Lys Gly Ser Trp Pro Leu Ser Thr Val Asp Ile Gly Trp Ser Ser

465 470 475 480

Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Val Lys Thr Leu Met Leu Leu Ser Asn

485 490 495

Asn Ser Pro Lys Leu Val Gly Asp Ser Ile Glu Glu Glu Lys Leu Tyr

500 505 510

Asp Ala Ile Asp Cys Leu Ile Ser Phe Met Asn Lys Asp Gly Ser Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Glu Pro Lys Arg Gly Tyr Ser Trp Leu Glu Ile Leu Asn

530 535 540

Pro Thr Glu Ser Phe Lys Asn Ile Val Val Asp His Pro Thr Val Glu

545 550 555 560

Val Thr Ala Ser Val Leu Asp Ala Leu Met Ser Phe Arg Glu Leu Tyr

565 570 575

Pro Gln Tyr His Glu Lys Glu Ile Arg Gln His Thr Glu Ser Ser Ala

580 585 590

Met Tyr Ile Glu Ser Glu Gln Arg Asp Asp Gly Ser Trp Tyr Gly Ser

595 600 605

Trp Ala Ile Cys Phe Thr Tyr Gly Thr Leu Phe Ala Val Lys Gly Leu

610 615 620

Val Ala Ala Gly Arg Thr Tyr Glu Asn Ser Ser Tyr Ile Arg Lys Ala

625 630 635 640

Cys Asn Phe Leu Leu Ser Lys Gln Gln Ile Thr Gly Gly Trp Gly Glu

645 650 655

Ser Tyr Leu Ser Val Glu Thr Glu Asp Tyr Val Asp Thr Gly Ser Pro

660 665 670

His Ala Val Asn Thr Ala Trp Ala Met Leu Ala Leu Ile Tyr Ala Gly

675 680 685

Gln Ala Glu Ile Asp Pro Val Pro Leu Tyr Arg Gly Ala Arg Val Leu

690 695 700

Ile Asn Met Gln Leu Asp Thr Gly Glu Phe Pro Gln Gln Glu Tyr Thr

705 710 715 720

Gly Ala Ala Asn Ser Ala Phe Phe Phe Asn Tyr Ser Asn Tyr Arg Asn

725 730 735

Ile Tyr Pro Ile Met Ala Leu Gly Glu Leu Arg Arg Lys Leu Ala Ala

740 745 750

Ser Arg Lys

755

<210> 2

<211> 2268

<212> DNA

<213> Avena strigosa

<400> 2

atgtggcggc tgaaggtgag cgagggtggc gggccgtggc tacgatcgag caacggcttc 60

ctcggcaggc aggtgtggga gttcgacgcc gacgccggca cacccgacga gcgcgcccag 120

atcgagaggc tgcgtcacaa cttcaccgag caccgcttcc acaggaggga gtcccacgac 180

cttctcctac gcttccagta tgcaaagtta aacaaccttc cagccaatcc tccattaacg 240

aagcttgaaa agagtaccga agtcactgaa gaaatcataa caagatcatt gagacgagct 300

ctaaatcaat actccactct acaagcacat gatggccatt ggcccggtga ttacagcgga 360

atattgttcc ttatgccaat gtttatattc tcattatatg ttactagatc acttaacatt 420

gttttatcgt ctgaacatcg acgtgaaata tgtcgccaca tttacaacca ccagaatgag 480

gatggtggtt ggggaataca tgttgcaggg cctagcacga tgcttggctc atgcttgaat 540

tatgttgcat taaggctcct tggtgagatg ctagatgaca aaaatgacgc attgataaaa 600

gggcaagctt ggattttatc tcatggaagc gcaactgcgg taccccaatg gggaaagata 660

tttctctcga taattggtgt atatgattgg tcaggaaaca atccaattat tcctgaactg 720

tggttagttc cttattttct tccaatacac ccaggacgat attggtgctt ttgccgacta 780

gtgtatatgt caatggcata tctttatggg aagaaattcg ttgggcccat tactgcaact 840

atattggaac tacgcgaaga gctatatggg acatcgtacg aaaatattga ttggagtaag 900

acacgcaata cttgtgccca ggaagacctt cgtcgtcccc gctcaaaggt gctgagtgtt 960

attttggatt gtgttaacaa gtttgtggag ccaatgttaa attgttggcc agcagagaag 1020

ctcagagaga gagctttgaa taatgtcatg gagcaaattc agtacaataa tgaaacaact 1080

gaatacattg gtctttgtcc tgtggacaag gcattgagca tgatttgttg ttgggtacaa 1140

aatccaaatt cagattcttt ccgccaacat cttcctcgag tttatgatta cttttggctc 1200

gctgaagatg gcatgaaggc aaagatagct gatggctgca ctggctggga tacatcattt 1260

ataattcaag cattttgctc aacggacatg attagtgagt tcagttcaac tataaaaaag 1320

gctcatgagt ttataaaaaa atcacaggtt cgttcaaatt tcccaagtta tgaaatattt 1380

tatcgccata gatcaaaagg ttcatggcct ctttcaactg tggacattgg ttggtcttcg 1440

tctgactgca cagcagaagc agttaagaca ttgatgttgt tatcaaataa ttcccccaaa 1500

cttgttggtg attcgataga ggaagagaag ttgtatgatg caattgattg cctcatttcc 1560

ttcatgaata aagatggctc tgtttctaca tacgaaccca aaagaggtta ctcatggtta 1620

gagattctca atccgacaga gagttttaag aacattgtcg tcgatcatcc aacggttgaa 1680

gttacagcat ctgtacttga cgcccttatg tcattcagag agctatatcc acagtatcac 1740

gaaaaagaga taagacaaca tacagaaagt tctgctatgt atattgagag tgaacaacgc 1800

gatgatggtt cttggtatgg atcttgggca atttgtttta cttacgggac tttatttgcg 1860

gtaaaaggat tagttgccgc tggaagaaca tacgagaata gttcttatat taggaaagca 1920

tgcaacttcc tcttgtcaaa gcaacaaata acgggtggat ggggcgaaag ctacctttcc 1980

gtggaaaccg aggattatgt tgacactggt agtcctcatg cggtcaacac tgcatgggca 2040

atgttagctc taatttatgc tgggcaggct gaaattgatc cggtaccact gtatcgtgga 2100

gcaagagtat tgatcaacat gcagctagac acaggagagt ttcctcagca ggaatacact 2160

ggagctgcta actcggcttt tttctttaac tactccaact atcgcaacat ctaccccatt 2220

atggctcttg gagagcttcg gcgcaaactt gctgcgagca gaaagtaa 2268

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtggcggc tgaaggtgag c 21

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttactttctg ctcgcagcaa gtttgcg 27

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgtggcgg ctgaaggtga gc 52

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ttactttctg ctcgcagcaa gtttgcg 57

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgcgttaac gctagcatgg atctc 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtaacatcag agattttgag acac 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttgctgaag ggacgacctg ctaaa 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tagtgcggcg ccattaaata acgtg 25

Claims

1.一种氧化鲨烯环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述的基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述的基因的载体。

6.含有权利要求2或3所述的基因的重组菌。

7.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物中化合物hop-(17)21-en-3β-ol的含量发生改变。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基因是通过重组表达载体导入出发植物中的；所述重组表达载体是将所述基因***出发载体pEAQ-HT-DEST1中得到的；所述出发植物为对照烟草；所述转基因植物为转基因烟草。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述转基因烟草与所述对照烟草相比，产生了化合物hop-(17)21-en-3β-ol。

10.权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶或权利要求2或3所述的基因在hop-(17)21-en-3β-ol生物合成中的应用。