CN115244397A - 用于 lc-ms 的质量控制工具 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：a)通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来确定样品的色谱图；b)对步骤a)中采集的所述数据点的至少一部分确定分析物定量因子与分析物定性因子的比率；c)将步骤b)中确定的所述比率与基准进行比较；以及d)基于比较步骤c)识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。本发明还涉及一种用于识别和/或验证针对分析物的包含内标的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，以及涉及与其相关的***和计算机程序产品。

Description

用于 LC-MS 的质量控制工具

本发明涉及一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点，确定样品的色谱图；并且，在样品包含内标的情况下，任选地随时间推移采集内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定比率类型，该比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii)内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及 d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。本发明还涉及一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的包含内标的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度的多个数据点，以及，任选地随时间推移采集定性因子信号强度的多个数据点，确定样品的色谱图；b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定比率类型，该比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及 d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰；以及涉及与其相关的方法、***和计算机程序产品。

技术领域

本发明涉及一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，涉及一种应用前述方法的质量控制方法，以及涉及与其相关的***和计算机程序产品。

背景技术

对于 LC-MS 测定，峰面积的比率是获得计算或验证的常用方法。它们是用于验证质谱测定的若干国际指南的一部分，例如 CLSI（临床和实验室标准研究所）、EMA（欧洲药品管理局）或 GTFCh（德国毒理学和法医化学学会）制定的指南。为了保证分析测定的质量，在分析运行之前测得的加标化合物的非提取***适用性测试必须满足可接受性要求，例如与目标值的最小绝对峰面积或最大保留时间偏差。在分析运行中，质量控制 (QC) 样品随后会以一定的频率进行测试，并根据可接受范围检查计算结果。此外，通常在每个样品中监测保留时间、峰宽（由峰边界之间的保留时间差给出）、内标 (ISTD) 的绝对峰面积和分析物的定量因子/定性因子峰面积比率，并且应该满足最大偏差或特定截止值的可接受性要求。但是，这些参数中的大多数都是基于峰积分：

峰边界、干扰检测和对结果的计算都直接取决于峰积分。然而，噪声背景（例如由于老化的 MS 源）或拖尾峰（例如由于老化的 LC 柱）可导致不当峰积分。峰边界的确定通常定义为积分峰的保留时间的外点，因此会受到不当峰积分的影响。同一分析物的两个不同跃迁的峰面积比率（例如定量因子/定性因子的比率）用于验证峰的同一性并排除干扰。该原理是由于以下事实：不同分析物跃迁的峰面积比率在固定值附近偏离，该固定值与分析物浓度无关。但是，该值不仅会因单个质量跃迁的检测伪影（即干扰）而改变，而且还会因不当峰积分而改变。仅通过监测这些峰面积比率无法明确区分这两个问题，因此经常需要专家手动检查峰。在分析物和内标 (ISTD) 的峰面积的情况下，它们的比率（分析物/ISTD比率）得出对结果即所需浓度的计算。由于结果计算直接依赖于峰积分，其失败将直接影响结果。

此外，由于积分程序不成熟，峰积分失败非常普遍，并且这些失败不能自动与相应的***故障区分开来。因此，通常需要由专家手动进行峰检查。另一方面，这种峰检查很大程度上取决于操作员的经验，并增加了人的工作负荷。因此，需要采用与峰积分无关的参数的替代程序来进行验证。

待解决的问题

尽管如此，本领域仍需要有助于确保 LC-MS 测量中峰识别和结果计算的正确性的方式和方法。

发明内容

该问题通过具有独立权利要求的特征的方法、***、计算机程序产品、计算机或计算机网络、计算机可加载的数据结构、计算机程序和存储介质来解决。在从属权利要求中列出了可能以单独的方式或者以任何任意组合实现的有利实施例。

因此，本发明涉及一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来提供，在一个实施例中为确定，样品的色谱图；并且，在样品包含内标的情况下，任选地随时间推移提供，在一个实施例中为采集，内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；

b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定比率类型，该比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

如本领域技术人员将理解的，仅在样品包含内标的情况下，才能确定内标定量因子和/或内标定性因子以及包含这些值的比率。因此，前述方法可以是用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子和定性因子信号强度的多个数据点来提供，在一个实施例中为确定，样品的色谱图；

b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定分析物定量因子与分析物定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

此外，前述方法还可以是用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的包含内标的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来提供，在一个实施例中为确定，样品的色谱图；并且，任选地随时间推移提供，在一个实施例中为采集，内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；

b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定比率类型，该比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

如本文所使用的术语是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义；因此，除非另有说明，本文所使用的术语不限于特殊或自定义的含义。如下文所用，术语“具有”、“包括”或“包含”或者它们的任何任意语法变化形式以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指其中除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况，也可以指其中存在一个或多个另外的特征的情况。作为示例，表述“A 具有 B”、“A 包括 B”和“A 包含 B”既可指其中除 B 之外，A 中不存在其他要素的情况（即，其中 A 由 B 单独且唯一地组成的情况），也可指其中除 B 之外，实体 A 中还存在一个或多个另外的要素（诸如要素 C、要素 C 和要素 D 或甚至另外的要素）的情况。此外，如本领域技术人员所理解的，表述“包括一个”和“包括一种”优选地是指“包括一个或多个”，即等同于“包括至少一个”。同样，术语“确定一个 X”是指确定一个 X，以及确定多于一个 X，例如两个、三个或四个 X。此外，术语“多个”涉及大量所指示的项，在一个实施例中，至少两个所指示的项，在进一步的实施例中，在进一步的实施例中，至少三个所指示的项，在进一步的实施例中，至少四个所指示的项，在进一步的实施例中，至少五个所指示的项。

此外，如下所用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选的特征结合使用，而不限制进一步的可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可通过使用替代性特征来执行。类似地，由“在一个实施例中”引入的特征或类似表述意图成为任选的特征，而对本发明的进一步实施例没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以此类方式引入的特征与本发明的其他任选的或非任选的特征相结合的可能性也没有任何限制。

如本文所用，术语“约”涉及具有相关领域普遍接受的技术精确性的指示值，优选地涉及指示值 ±20%，更优选地 ±10%，最优选地 ±5%。此外，术语“基本上”表示不存在对指示结果或使用有影响的偏差，即潜在偏差不会导致指示结果偏离超过 ±20%，更优选地±10%，最优选地 ±5%。因此，“基本上由...组成”是指包括指定的组分，但排除其他组分，以下除外：作为杂质存在的材料、由于用于提供所述组分的过程而存在的不可避免的材料，以及出于实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由...组成”定义的组合物包括任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物将包含按重量计小于 5%、更优选地按重量计小于 3%、甚至更优选地按重量计小于 1%、最优选地按重量计小于 0.1% 的非指定组分。如本文所述，测量和计算所得参数是在示例性基础上描述的；如本领域技术人员所理解的，可以通过标准数学运算来修改参数，特别是通过乘法、除法、加法、减法、倒数形成、缩放以及本领域技术人员已知的其他运算；在一个实施例中，基准作相应调整，特别是通过应用相同的数学运算。测量和计算所得参数也可以用于得分计算，该得分可以基于一个或多个参数值来计算，其可以任选地通过加权，和/或通过进一步的数学运算，特别是上文所述方式计算，例如缩放。

用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法是一种体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可涉及例如为步骤 a) 提供样品，或步骤 b) 和/或 c) 中的进一步计算等。此外，该方法可以包括步骤 a1) 确定对应于分析物的推定的下峰边界和/或推定的上峰边界，以及任选地确定对应于内标的推定的下峰边界和/或推定的上峰边界。此外，所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。在一个实施例中，具体地，步骤 b) 和 c) 由处理器执行，具体地由计算机执行，其可以配置为评估装置，如本文其他地方所规定。在一个实施例中，用于识别和/或验证包含内标的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法进一步包括在步骤 a) 中随时间推移采集内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点。在一个实施例中，为每个数据点独立地选择要确定的信号强度或其组合（定量因子信号强度、定性因子信号强度、内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度，如果有的话）。在一个实施例中，确定信号强度使得可以确定步骤 b) 中指定的比率中的至少一个。在一个实施例中，对于至少所有已知或怀疑与分析物的洗脱时间相关的数据点，至少确定定量因子信号强度和定性因子信号强度。在进一步的实施例中，对于至少已知或怀疑与分析物的洗脱时间相关的所有数据点，确定定量因子信号强度、定性因子信号强度、内标定量因子信号强度和内标定性因子信号强度。

术语“液相色谱质谱仪装置”，缩写为“LC-MS 装置”，是本领域技术人员所理解的。在一个实施例中，该术语涉及配置用于组合液相色谱装置 (LC) 和质谱仪 (MS) 的装置。因此，在一个实施例中，该装置包括至少一个 LC 单元和至少一个 MS 单元，其中 LC 单元和 MS 单元经由至少一个接口耦接。如本文所用，术语“液相色谱 (LC) 单元”，在一个实施例中，涉及分析模块，该分析性模块配置用于通过液相色谱将样品的一种或多种目标分析物从样品的其他组分中分离，在一个实施例中，用于使用质谱装置来检测所述一种或多种分析物。LC 可基于技术人员认为合适的任何分离原则；在一个实施例中，LC 是反相色谱、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱、亲和色谱或手性色谱；在进一步的实施例中，LC 是反相色谱。LC 装置可包括至少一个 LC 柱。例如，LC 装置可为单柱 LC 装置或具有多个 LC 柱的多柱 LC 装置。LC 柱可具有固定相，流动相被泵送穿过该固定相，以便分离和/或洗脱和/或转移目标分析物。LC 单元可为或可包括至少一种高效液相色谱(HPLC) 单元和/或至少一种微流液相色谱 (µLC) 装置。如本文所用，在一个实施例中，术语“质谱单元”涉及一种质量分析仪，该质量分析仪配置用于基于分析物或其片段的质荷比检测至少一种分析物。质谱单元可为或可包括至少一个四极杆质谱装置。耦接 LC 单元和MS 单元的接口可包括至少一个电离源，该电离源配置用于生成分子离子并且用于将分子离子转移至气相中。在一个实施例中，MS 单元是串联质谱分析 (MS/MS) 单元，在进一步的实施例中，是三重四极杆 MS/MS，在进一步的实施例中，处于多反应监测 (MRM) 模式。

术语“色谱图”是技术人员众所周知的。在一个实施例中，该术语涉及通过 MS 检测器从样品获得的一个或多个信号的定量测度与色谱分离的过程的相关性图，在一个实施例中，随时间推移，例如保留时间和/或洗脱体积。在一个实施例中，所述信号的定量测度与至少部分样品成分的浓度相关，特别是与分析物或内标相关；因此，信号的定量测度更具体地可以是信号强度。因此，在一个实施例中，色谱图是 MS 色谱图，在进一步的实施例中是MS/MS 色谱图。在一个实施例中，所述信号的定量测度包括分析物信号强度和/或内标信号强度。在一个实施例中，信号的定量测度包括分析物定量因子、内标定量因子、分析物定性因子和/或内标定性因子。因此，在一个实施例中，确定至少一个色谱图包括随时间和/或洗脱时间推移测量分析物定量因子、内标定量因子、分析物定性因子和内标定性因子中的至少一者，如上所述；在这种情况下，在一个实施例中，MS 是串联 MS。如本领域技术人员将理解的，前述表示可以是但不一定是图形表示；但是，表示还可以提供为，例如值对列表（例如洗脱时间/定量因子值对和/或洗脱时间/定性因子值对）或数学模型。如上所述，色谱图可以表示多于一个信号；在一个实施例中，色谱图表示两个信号，例如定量因子信号强度和定性因子信号强度；在进一步的实施例中，色谱图表示三个信号，在进一步的实施例中，色谱图表示四个信号，例如分别为分析物和内标的定量因子信号强度和定性因子信号强度。应当理解，色谱图也可以表示另外的信号；然而，上述大量信号也可以由多个色谱图表示，每个色谱图表示一个信号。如本领域技术人员进一步理解的，洗脱时间可以由本领域技术人员认为合适的 LC 进展的任何其他测度来代替，特别是由洗脱体积或保留时间代替。色谱图可以包括样品的整个 LC-MS 运行期间的数据点；在一个实施例中，特别是在色谱图中分析物峰的位置可以例如从之前的运行中进行预测的情况下，色谱图可包含例如从推定的下峰边界到推定的上峰边界的预测的分析物峰宽上的数据点，任选地进一步包括延伸分析物峰的下游和/或上游的相应推定边界值的 1%、在一个实施例中为 5%、在进一步的实施例中为 10%、在进一步的实施例中为 50%、在进一步的实施例中为 100% 的数据。

术语“峰”是技术人员众所周知的，并且在一个实施例中，涉及色谱图的至少一个局部最大值。相应地，术语“分析物峰”涉及与分析物相关的峰，在一个实施例中用于表示目标分析物的已识别峰。峰积分方法是本领域已知的，在一个实施例中，术语“峰积分”涉及用于确定由色谱图的峰所包围的峰面积的至少一种数学运算和/或数学算法。具体地，峰的积分可包括色谱图的曲线特征的识别和/或测量。峰积分可包括以下项中的一项或多项：峰检测、峰发现、峰识别、峰拟合、峰评估、确定下峰边界和/或上峰边界、确定背景以及确定基线。峰积分可允许确定以下项中的一项或多项：峰面积、保留时间、峰高和峰宽。在一个实施例中，自动执行峰检测和/或积分，即无需手动操作或与用户进行交互。特别地，峰识别和/或峰检测和/或确定峰面积可在非手动并且无需手动操作或与用户进行交互的情况下执行。

如本文所用，术语“识别分析物峰”涉及确定色谱图中峰的至少一个参数的任何措施。在一个实施例中，所述识别包括识别下峰边界和/或上峰边界，识别峰同一性和/或峰纯度，和/或识别分析物峰面积与内标峰面积的比率（峰面积比率）。

如本文所用，术语“验证分析物峰”包括通过色谱图确认分析物的预先建立的测量的任何措施；因此，在一个实施例中，所述验证是验证峰的推定的下峰边界和/或峰的推定的上峰边界，验证峰同一性和/或峰纯度，和/或验证分析物峰面积与内标峰面积的比率（峰面积比率）。

如本文所用，术语“推定的峰边界”涉及未通过如本文指定的方法验证的峰边界。因此，在一个实施例中，推定的峰边界是初步的峰边界，并且可以基于如本文别处指定的色谱图通过常规方法确定，例如峰检测和/或峰积分；推定的峰边界也可以是基于不同色谱图确定的峰边界，例如 LC-UV/VIS- 色谱图；此外，推定的峰边界可以是预先确定的峰边界，该峰边界例如基于先前使用相同或相似样品或使用基本上纯的分析物和/或内标的 LC-MS运行确定。在一个实施例中，推定的峰边界也可以是预测的峰边界，例如基于先前使用化学上与分析物相似的化合物的运行进行预测。相应地，推定的峰边界可以通过特定值或范围来识别，在进一步的实施例中，通过特定值，例如保留时间或洗脱体积的值来识别。

根据上文，术语“推定的分析物峰面积与内标峰面积的比率”，也称为“推定的峰面积比率”涉及未通过如本文指定的方法验证的分析物峰面积与内标峰面积的比率；因此，在一个实施例中，推定的峰面积比率为初步的峰面积比率，并且可以基于如本文别处指定的色谱图通过常规方法确定。如本领域技术人员理解的，如上所述的峰面积比率通常用于量化 LC-MS 方法中的分析物，特别是使用校准曲线。

如本文所用，术语“样品”，也称为“测试样品”，涉及任何类型的物质组合物；因此，该术语可以指但不限于任何任意样品，例如生物样品。在一个实施例中，样品是液体样品，在进一步的实施例中是水性样品。在一个实施例中，测试样品可选自由以下项组成的组：生理流体，包括血液、血清、血浆、唾液、眼晶状体液、泪液、脑脊液、汗液、尿液、乳液、腹水、粘液、滑膜液、腹膜液、羊水；灌洗液；组织、细胞等。在一个实施例中，样品是血液、血浆、血清、唾液或尿液样品，在进一步的实施例中是血液、血浆或血清样品，在进一步的实施例中是血清或血浆样品。然而，样品也可以是天然或工业液体，特别是地表水或地下水、污水、工业废水、加工液、土壤洗脱液等。在一个实施例中，样品包含或疑似包含至少一种目标化学化合物，即应确定的化学物质，其被称为“分析物”。样品可以包含一种或多种其他化学化合物，它们无需确定并且通常被称为“基质”。样品可在从相应来源获得时直接使用，或者可经过一种或多种预处理和/或样品制备步骤。因此，样品可通过物理和/或化学方法预处理，在一个实施例中，通过离心、过滤、混合、均质化、色谱分析、沉淀、稀释、浓缩、与结合剂和/或检测试剂接触，和/或技术人员认为合适的任何其他方法预处理。即在样品制备步骤之前、期间和/或之后，可以将一种或多种内标添加到样品中。样品可掺有内标。例如，可将内标以预定义浓度加入样品中。可选择内标，使得它可在质谱装置的正常操作条件下易于鉴别。内标的浓度可预先确定并且显著高于分析物的浓度。

如上所述，如本文所用，术语“分析物”涉及样品中应确定的任何化合物或化合物基团。在一个实施例中，分析物是大分子，即具有大于 1000 u（即大于 1 kDa）的分子量的化合物。在进一步的实施例中，分析物是生物大分子，特别是多肽、多核苷酸、多糖或任何上述的片段。在一个实施例中，分析物是小分子化合物，即具有至多 1000 u(1 kDa) 的分子量的化合物。在进一步的实施例中，分析物是受试者，特别是人类受试者的身体代谢的化合物，或者是施用于受试者以引起受试者新陈代谢变化的化合物。因此，在一个实施例中，分析物是滥用药物或其代谢物，例如安非他明；***；***；乙基葡糖醛酸苷；硫酸乙酯；***，特别是丁丙诺啡、6-单酰基***、可待因、二氢可待因、***、***-3-葡糖醛酸苷和/或曲马多；和/或阿片类药物，特别是乙酰芬太尼、卡芬太尼、芬太尼、氢可酮、去甲芬太尼、氧可酮和/或羟***酮。

在一个实施例中，分析物是治疗药物，例如丙戊酸；氯硝西泮；甲氨蝶呤；伏立康唑；霉酚酸（总）；霉酚酸-葡糖醛酸苷；对乙酰氨基酚；水杨酸；茶碱；地高辛；免疫抑制剂，特别是环孢霉素、依维莫司、西罗莫司和/或他克莫司；镇痛剂，特别是哌替啶、去甲哌替啶、曲马多和/或O-去甲基曲马多；抗生素，特别是庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、耐万古霉素、哌拉西林（他唑巴坦）、美罗培南和/或利奈唑胺；抗癫痫药，特别是苯妥英钠、丙戊酸、游离苯妥英钠、游离丙戊酸、左乙拉西坦、卡巴西平、卡巴西平-10,11-环氧化物、***、扑米酮、加巴喷丁、唑尼沙胺、拉莫三嗪和/或托吡酯。在一个实施例中，分析物是激素，特别是皮质醇、***、孕酮、睾酮、17-羟孕酮、醛固酮、脱氢表雄酮 (DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)、二氢睾酮和/或可的松；在一个实施例中，样品是血清或血浆样品并且分析物是皮质醇、DHEA-S、***、孕酮、睾酮、17-羟孕酮、醛固酮、DHEA、二氢睾酮和/或可的松；在一个实施例中，样品是唾液样品并且分析物是皮质醇、***、孕酮、睾酮、17-羟孕酮、雄烯二酮和/或可的松；在一个实施例中，样品是尿液样品并且分析物是皮质醇、醛固酮和/或可的松。在一个实施例中，分析物是维生素，在一个实施例中是维生素 D，特别是麦角钙化醇（维生素 D2）和/或胆钙化醇（维生素 D3）或其衍生物，例如 25-羟基-维生素-D2、25-羟基-维生素-D3、24,25-二羟基-维生素-D2、24,25-二羟基-维生素-D3、1,25-二羟基-维生素-D2和/或 1,25-二羟基-维生素-D3。在进一步的实施例中，分析物是受试者的代谢物。

如本文所用，在一个实施例中，术语“内标”涉及以限定浓度存在于样品中的分析物。因此，在一个实施例中，内标的浓度是已知的；然而，也可以设想标准品的浓度是未知的，但至少对于目标样品和至少一个校准样品是相同的；在这种情况下，在一个实施例中，内标的浓度对于所有分析的样品是相同的。在一个实施例中，内标在结构上与分析物相似，在进一步的实施例中，在结构上与分析物相同。特别是在后一种情况下，在一个实施例中，内标是同位素标记的分子，特别是分析物的同位素标记形式，例如 ²H（氘代）、¹⁵N 和/或¹³C-标记的衍生物。内标样品可为包含至少一种具有预定量的内标物质的样品。有关标准样品的更多详细信息，请参阅例如 EP 3 425 369 A1。

如本文所用，术语“提供”涉及使指示的信息或对象可用。因此，在提供色谱图的情况下，色谱图可作为数据，例如作为图形表示，作为测量值列表，例如作为值对，诸如洗脱时间/定量因子值对和/或洗脱时间/定性因子值对，或作为数学模型提供。色谱图可以通过本领域技术人员认为合适的任何介质来提供，特别是通过 MS 装置与评估装置之间的操作连接、通过数据连接例如数据网络、或通过数据存储介质来提供。在一个实施例中，提供是如下文指定的确定。

本领域技术人员所理解的术语“确定”是指决定、得出结论或确定事实和/或数据。因此，在一个实施例中，确定涉及定量确定。此外，“确定色谱图”涉及测量色谱图的如本文别处指定的参数值，具体地将数据点记录并任选地存储在合适的存储装置上，该数据点表示在 LC-MS 运行过程期间记录的 LC-MS 装置的信号。类似地，在一个实施例中，“确定比率”是确立如本文别处指定的比率的值。如本领域技术人员将理解的，通常，比率是由在例如具有相同的洗脱时间或洗脱体积的色谱分析过程中同时测得的值计算得出。

在本说明书的上下文中，本领域技术人员理解术语“定量因子”和“定性因子”。在一个实施例中，这些术语涉及在串联 MS 中生成的分析物的片段的信号，其中通常最丰富和/或最可靠地检测到的片段用于定量分析物（分析物定量因子），而第二片段用于确认分析物的同一性（分析物定性因子）。相应的术语经常缩写为 AQN（分析物定量因子）和 AQL（分析物定性因子）。在一个实施例中，特别是如果用于计算定量因子/定性因子的比率，所述值是单循环值，即在一个扫描循环、选定离子监测 (SIM) 循环或多反应监测 (MRM) 循环中确定的强度。在进一步的实施例中，特别是如果用于计算定量因子/定性因子的比率，所述值是通过标准数学计算从单循环强度值导出的，包括特别是归一化、标准化、计算多个单循环值的平均值或中值、多个单循环值数据平滑等。因此，在一个实施例中，用作定量因子或定性因子值的每个值是从最多十个、在一个实施例中最多五个、在进一步的实施例中最多两个单循环强度值、在一个实施例中连续单循环强度值导出的。这两个参数的值通常确定为具有相应 m/z 值的离子的信号强度，并且可与 LC 进程相关，以生成本说明书的色谱图；相应地，AQN 或 AQL 的值可确定为单循环值或通过已知的峰积分方法确定。表述“确定定量因子与定性因子的比率”涉及通过将定性因子的值除以定量因子的值来计算该比率。在一个实施例中，AQN/AQL 比率是分析物的化合物特定的和测量方法特定的参数。应当理解，上述方法作必要的修改后适用于内标定量因子和定性因子的测量。

如本文所用，术语“数据点的一部分”涉及所确定的数据点的子部分。如将从本文的公开内容中理解的，记录和/或选定的数据点的一部分可取决于待识别或验证的参数。因此，在应识别或验证推定的（上或下）峰边界的情况下，在一个实施例中，数据点的一部分包括推定的峰边界的数据点上游和/或下游。因此，在一个实施例中，数据点的一部分可以包括 50 个，在进一步的实施例中 25 个，在进一步的实施例中十个，在进一步的实施例中五个包含推定的峰边界，在一个实施例中对称地包含推定的峰边界的数据点。相应地，在应识别和/或验证峰同一性、峰纯度和/或峰面积比率的情况下，数据点的一部分，在一个实施例中，包括适当离散的，在一个实施例中，在峰宽上规则地离散的数据点，例如数据点 1-3、7-9、13-15 等，或在峰宽上均匀离散的数据点，例如每第二个或每第三个数据点；在此情况下，在一个实施例中，对对应于至少第 1/4，在进一步的实施例中至少第 1/3 的峰宽的数据点，在进一步的实施例中至少一半对应于峰宽的数据点进行分析；在进一步的实施例中，对邻近的数据点进行分析；在此情况下，在一个实施例中，对对应于峰宽的至少 50%，在进一步的实施例中至少 75%，在进一步的实施例中至少 90%，在进一步的实施例中至少 95%，在进一步的实施例中至少 99% 的数据点进行分析；在进一步的实施例中，对峰的所有数据点进行分析。

如本文所用，术语“基准”是指允许识别相关参数和/或其验证的鉴别器。此类鉴别器可以是目标比率值，例如指示基本上纯的分析物的 AQN/AQL 比率。在一个实施例中，基准是定量指标，在进一步的实施例中是值（例如阈值），是范围（例如值的范围），是得分，或是技术人员认为合适的任何其他值或范围。在一个实施例中，取决于所选基准的类型，基准是分析物特定的、装置特定的和/或方法特定的参数，在进一步的实施例中是分析物特定的参数。用于建立适当基准的方法在本文别处基于示例提供。在一个实施例中，在对分析物的定量因子/定性因子比率进行分析的情况下，基准是针对基本上纯的分析物确定的定量因子/定性因子比率的值；相应地，在一个实施例中，在对内标的定量因子/定性因子比率进行分析的情况下，基准是针对基本上纯的内标确定的定量因子/定性因子比率的值。在进一步的实施例中，在对分析物的定量因子/定性因子比率进行分析的情况下，基准是从针对基本上纯的分析物确定的定量因子/定性因子比率推导出的范围，例如针对基本上纯的分析物确定的定量因子/定性因子比率 ±100%，在一个实施例中 ±50%，在进一步的实施例中 ±30%；相应地，在一个实施例中，在对内标的定量因子/定性因子比率进行分析的情况下，基准是从针对基本上纯的内标确定的定量因子/定性因子比率推导出的范围，例如，针对基本上纯的内标确定的定量因子/定性因子比率 ±100%，在一个实施例中 ±50%，在进一步的实施例中±25%，在进一步的实施例中±10%。上述方法作必要的修改后适用于其他比率，例如分析物定量因子与内标定量因子的比率。

在一个实施例中，识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界。在此情况下，在一个实施例中，特别是对包含推定的峰边界的数据点进行分析。在进一步的实施例中，仅分析接近推定的峰边界和分析物峰内的数据点可能就足够。在一个实施例中，在以下情况下识别和/或验证分析物峰：确定的比率符合基于基准的预定义接受标准，特别是在预定义基准范围内，在进一步的实施例中，比率位于针对数据点的预定义部分的预定义基准范围内，例如，至少 5 个数据点中的 3 个。在一个中，在以下情况下实施例识别和/或验证峰边界：众多 n 个数据点上的所述比率的平均值符合预定义接受标准，在一个实施例中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施例中为至少三个数据点，在进一步的实施例中为至少四个数据点，在进一步的实施例中为至少五个数据点，在进一步的实施例中为至少七个数据点，在进一步的实施例中为至少十个数据点。如本文所用，值的“平均值”的表述涉及指示技术人员认为合适的平均值的任何参数，特别是中值或平均值。

在一个实施例中，识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证峰同一性和/或峰纯度。在此情况下，在一个实施例中，在步骤 b) 中对其确定比率的数据点的一部分包括推定的下峰边界和推定的上峰边界之间的数据点。在一个中，在确定的比率符合基于基准的预定义接受标准，特别是在预定义基准范围内的情况下，验证峰同一性实施例和/或峰纯度。在进一步的实施例中，在以下情况下验证峰同一性：众多 n 个数据点上的所述比率的平均值在预定义基准范围内，在一个实施例中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施例中为至少三个数据点，在进一步的实施例中为至少四个数据点，在进一步的实施例中为至少五个数据点，在进一步的实施例中为至少七个数据点，在进一步的实施例中为至少十个数据点。在进一步的实施例中，在以下情况下验证峰纯度：比率位于针对数据点的预定义部分的预定义基准范围内，所述数据点的预定义部分在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 80% 所分析的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 90% 所分析的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 95% 所分析的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 80% 的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 90% 的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 95% 的数据点。

在一个实施例中，识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证推定的峰面积比率。在一个实施例中，在此情况下，该方法进一步包括基于在步骤 a1) 中识别的推定的峰边界确定推定的峰面积比率，并且进一步包括确定分析物定量因子与内标定量因子的比率，或分析物定性因子与内标定性因子的比率。在此情况下，在一个实施例中，在步骤b) 中对其确定比率的数据点的一部分包括推定的下峰边界和推定的上峰边界之间的数据点，在一个实施例中如本文上文所指定的一部分。进一步地，在此情况下，在以下情况下验证推定的峰面积比率：在推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间的至少 10% 的数据点上，在一个实施例中在推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间的至少 50% 的数据点上，在一个实施例中在推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间的至少 90% 的数据点上计算得出的所述比率的平均值位于由所述峰面积比率 ±X 定义的范围内，X 为峰面积比率的 100%，在一个实施例中为 50%，在进一步的实施例中为 30%。

在一个实施例中，该方法是验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率的一种方法。在一个实施例中，在此情况下，所述方法包括确定分析物定量因子与内标定量因子的比率、分析物定性因子与内标定性因子的比率、分析物定量因子与分析物定性因子的比率、内标定量因子与内标定性因子的比率、分析物定量因子与内标定性因子的比率和内标定量因子与分析物定性因子的比率，并且进一步包括确定所述比率的分布。如本文所用，术语“分布”值涉及指示技术人员认为合适的值的统计学上的离散程度的任何参数。在一个实施例中，分布是特定比率值的频率的表示，例如可以是以图形方式表示为比率值与其频率的关系图。在一个实施例中，分布值是偏度或峰度。在一个实施例中，在此情况下，基准是关于以下样品预先确定的所述分布的值或范围：包含至少部分纯的分析物的样品，在一个实施例中，确定分析物与潜在干扰物分离的样品，在进一步的实施例中，包含基本上纯的分析物的样品。在进一步的实施例中，样品是以下样品：其与最近干扰的平均峰分辨率确定为至少约 0.7，在一个实施例中为至少约 0.8，在进一步的实施例中为至少约 0.9。在进一步的实施例中，如果分布值对应于基准值或基准范围，验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率。在一个实施例中，基准范围是针对至少部分纯的分析物确定的分布值 ±100%，在一个实施例中为 ±75%，在进一步的实施例中为 ±50%。

如本领域技术人员根据本说明书将理解的，用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法可包括识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰同一性、峰纯度和/或峰面积比率；因此，该方法可包括上述的一种或多种识别和/或验证；此外，该方法可包括与一个或多个验证相结合的一个或多个识别，例如，可将至少一个峰边界的识别与峰面积比率的验证相结合。还将理解，例如分析位于推定的峰边界内的数据点可用于识别和/或验证分析物峰的下和上推定的峰边界、峰同一性、峰纯度和峰面积比率。在一个实施例中，此类分析以分层方式执行，例如通过首先识别和/或验证至少一个推定的峰边界，并且仅在可以识别/验证至少一个推定的峰边界的情况下才继续识别和/或验证峰同一性、峰纯度和/或峰面积比率；和/或首先识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰同一性和/或峰纯度，并且仅在可以识别/验证至少一个推定的峰边界、峰同一性和/或峰纯度的情况下才继续识别和/或验证峰面积比率。

有利地，在本发明的基础工作中发现，单循环质量跃迁参数可用于识别和/或验证分析 LC-MS 的关键参数，特别是峰边界、峰同一性、峰纯度，以及峰面积比率。有利地，为此使用的数据点可以从初始分析运行的原始 LC-MS 数据中检索，并且不需要额外的测试或试剂。

上面给出的定义在细节上作必要的修改后适用于以下内容。下文进一步作出的附加定义和解释在细节上作必要的修改后也适用于本说明书中描述的所有实施例。

本发明还涉及样品中分析物的液相色谱质谱 (LC-MS) 测量的质量控制方法，该方法包括以下步骤：

A) 使用液相色谱质谱仪装置测量样品中的所述分析物并确定至少一个色谱图；

B) 执行本发明的用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的步骤 b) 至d)，以及

C) 基于步骤 B) 的结果评估所述 LC-MS 测量的质量。

质量控制的方法是一种体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可涉及例如为步骤 a) 提供样品，或步骤 b) 和/或 c) 中的进一步计算等。此外，如果在步骤 B) 中未验证推定的峰边界、峰同一性、峰纯度和峰面积比率中的至少一者，该方法可以包括进一步的步骤，该步骤是以下一项或多项：i) 将步骤 A) 的结果标记为不可靠；ii) 不输出步骤 A) 的结果，以及 (iii) 启动所述样品的重新运行，任选地使用不同的 LC-MS 方案。该方法可以由自动化设备辅助或执行，例如如下文所述的评估单元。

如本文所用，术语“质量控制”是技术人员众所周知的。在一个实施例中，质量控制是确保由实体执行的过程和/或生产的商品符合预定义的质量标准的过程。在进一步的实施例中，样品测量中的质量控制，特别是诸如患者样品之类的医学样品的测量中，例如在临床诊断和/或临床化学中，包括确保采用特定测量方法获得的分析结果对应于采用金标准方法可获得的结果，因此，在一个实施例中，对应于在预先指定的范围内理论上可获得的结果。因此，在一个实施例中，用于质量控制的方法包括作为进一步的步骤，基于步骤 B) 的结果评估所述 LC-MS 测量的质量，并且任选地采取适当的措施，在一个实施例中如本文上文指定的。

本领域技术人员理解术语“测量样品中的分析物”。在一个实施例中，该术语涉及对样品中分析物的量的定性、半定量或定量确定，在一个实施例中涉及对样品中分析物的量的定量确定。如本文所用，术语分析物的“量”涉及分析物的任何定量测度，并且等效于其他相应的测度，例如质量分数和浓度，其在已知样品质量或样品体积的情况下可由量计算得出。因此，样品中分析物的测量结果可以用本领域技术人员认为合适的任何单位来表示，包括任意单位，重量、质量分数、浓度等的测量值，或由此得出的测量值，例如根据预定义的定义的国际单位。

通过 LC-MS 确定分析物的量的方法原则上是本领域技术人员已知的。在一个实施例中，该方法包括通过确定分析物的峰面积（分析物峰面积）来定量确定样品中分析物的量；在进一步的实施例中，进一步确定内标的峰面积（IS 峰面积）并确定分析物峰面积与IS 峰面积的比率，并且在一个实施例中，将所述比率与校准函数进行比较，由此确定浓度值。相应的方法是技术人员已知的。

本发明还涉及一种用于确定样品中至少一种分析物的浓度的***，包括：

(I) 至少一个液相色谱质谱仪装置，其中液相色谱质谱仪装置配置用于测量样品中的分析物并用于随时间推移采集数据点，在一个实施例中，用于执行本发明的用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的步骤 a)；以及

(II) 至少一个评估装置，其中评估装置配置用于执行至少步骤 b)、c) 和/或d)，在一个实施例中，用于执行本发明的用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的所有步骤 b) 至 d)。

如本文所用，术语“***”涉及彼此可操作地联接的不同装置。所述装置可在单个物理单元中实现，或者可以是彼此可操作地联接的物理分离单元。合适的组件和它们的特性在下文其他地方以及上文在用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的上下文中进行了描述。因此，本发明的方法可以由本文指定的***来实施。因此，在一个实施例中，该装置配置用于执行如本文别处指定的用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法，和/或如别处指定的质量控制方法。该***可以包括其他装置或单元，特别是数据收集器、输出单元、通信接口和/或技术人员认为合适的任何其他装置或单元。

用于确定至少一个色谱图的 LC-MS 装置和方法已在上文中在本发明的用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的上下文中进行了描述。

术语“评估装置”通常是指适于执行如上所述的方法步骤的任意装置，在一个实施例中通过使用至少一个数据处理装置，并且，在进一步的实施例中通过使用至少一个处理器和/或至少一个专用集成电路。因此，作为示例，所述至少一个评估装置可包括至少一个数据处理单元，所述至少一个数据处理单元具有存储在其上的软件代码，该软件代码包括多个计算机命令。评估装置可提供用于执行一个或多个指定操作的一个或多个硬件元件，和/或可向一个或多个处理器提供在其上运行的用于执行一个或多个方法步骤的软件。

如本文所用，术语“数据收集器”涉及配置用于存储数据的任何任意存储单元，特别是由 LC-MS 装置确定的数据点、色谱图、确定的比率、识别和/或验证的结果，和/或就样品的进一步处理提供的推荐和/或作出的决定。在一个实施例中，数据收集器包括至少一个配置用于接收和/或存储至少一个色谱图的数据库。在一个实施例中，数据收集器包括至少一个数据库，该数据库包括一个或多个基准值。

如本文所用，术语“输出单元”涉及配置用于将信息从***传输到其他实体的任何任意单元，其中其他实体可以是其他数据处理装置和/或用户。因此，输出装置可以包括用户界面，例如适当配置的显示器，或者可以是打印机。然而，输出单元也可以是指示器，例如指示灯，指示例如残留检测。

本领域技术人员理解，术语“通信接口”涉及配置用于信息交换，特别是数据交换的任何任意接口。此类数据交换可以通过永久性或临时性物理连接来实现，诸如同轴电缆、纤维电缆、光纤或双绞线电缆、10 BASE-T 电缆、存储单元连接器，例如 USB、火线及类似连接器。可替代地，其可以通过使用例如无线电波的临时性或永久性无线连接来实现，该无线电波诸如 Wi-Fi、LTE、LTE 进级或蓝牙等。

本发明进一步公开并提出了一种包括计算机可执行指令的计算机程序，当在计算机或计算机网络上执行该程序时，所述计算机可执行指令用于在本文所附的一个或多个实施例中执行根据本发明的方法。具体地，计算机程序可以存储在计算机可读数据载体上。因此，具体地，可通过使用计算机或计算机网络，优选地通过使用计算机程序来辅助或执行如上文所指示的一个、多于一个或甚至所有方法步骤。

本发明进一步公开并提出了一种具有程序代码工具的计算机程序产品，以便在计算机或计算机网络上执行该程序时，在本文所附的一个或多个实施例中执行根据本发明的方法。具体地，程序代码工具可存储在计算机可读数据载体上。

本发明进一步公开并提出了一种具有存储在其上的数据结构的数据载体，在加载到计算机或计算机网络中之后，诸如在加载到计算机或计算机网络的工作存储器或主存储器中之后，该数据载体可执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法。

本发明进一步提出并公开了一种具有存储在机器可读承载件上的程序代码工具的计算机程序产品，以便在计算机或计算机网络上执行该程序时，执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法。如本文所用，计算机程序产品是指作为可交易产品的程序。该产品通常能够以任意格式（诸如以纸质格式）存在，或在计算机可读数据载体上存在。具体地讲，计算机程序产品可以分布在数据网络上。

本发明进一步提出并公开了一种包含可由计算机***或计算机网络读取的指令的调制数据信号，用于执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法。

在一个实施例中，参考本发明的计算机实现方面，可通过使用计算机或计算机网络来执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法的一个或多个方法步骤或甚至所有方法步骤。因此，一般来讲，可通过使用计算机或计算机网络来执行包括提供和/或处理数据的任何方法步骤。一般来讲，这些方法步骤可包括通常除需要手动操作（诸如提供样品和/或执行实际测量的某些方面）的方法步骤之外的任何方法步骤。

具体地，本发明进一步公开：

计算机或计算机网络，该计算机或计算机网络包括至少一个处理器，其中该处理器适于执行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，

计算机可加载数据结构，该计算机可加载数据结构适于当在计算机上执行该数据结构时，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，

计算机程序，其中该计算机程序适于当在计算机上执行该程序时，执行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，

计算机程序，该计算机程序包括程序工具，这些程序工具用于当在计算机上或在计算机网络上执行该计算机程序时，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，

计算机程序，该计算机程序包括根据前述实施例的程序装置，其中这些程序装置存储在计算机可读的存储介质上，

存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上并且其中该数据结构适于在被加载到计算机或计算机网络的主存储器和/或工作存储器中之后，执行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，以及

具有程序代码工具的计算机程序产品，其中该程序代码工具能够被存储或被存储在存储介质上，以用于在计算机或计算机网络上执行该程序代码工具的情况下，执行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法。

本发明还涉及一种用于优化 LC-MS 装置上针对分析物的分析方法的方法，该方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和定性因子信号强度的多个数据点来提供，在一个实施例中为确定，样品的色谱图；

b) 确定推定的下峰边界、推定的上峰边界、推定的峰最大值、峰同一性和/或峰纯度；

c) 通过本发明的用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法来验证步骤 (b)的推定的下峰边界、推定的上峰边界、推定的峰最大值、峰同一性和/或峰纯度；

d) 如果在步骤 (c) 中未验证推定的下峰边界、推定的上峰边界、推定的峰最大值、峰同一性和/或峰纯度中的至少一者，则修改样品预处理参数、LC 参数和/或 MS 参数；以及

e) 由此优化分析物的分析方法。

用于优化分析方法的方法为体外方法。该方法可包括除上述步骤之外的步骤；例如进一步的步骤可涉及提供用于分析的样品。在用于优化分析方法的方法中，样品可包括部分或基本上纯的分析物；然而，在一个实施例中，样品是体液样品或来自体细胞的样品，在一个实施例中是体液样品。该方法可由自动化设备辅助。在一个实施例中，该方法是全自动方法。

原则上，术语“优化分析方法”是本领域技术人员所理解的。在一个实施例中，该术语涉及包括修改分析 LC-MS 方法的参数使得可以基本上无干扰地测量目标分析物的过程，在一个实施例中，在基质成分的存在下，在进一步的实施例中，在预期存在于样品中的基质成分的存在下。因此，在一个实施例中，重复方法步骤 a) 至 e)，直至在步骤 d) 中，推定的下峰边界、推定的上峰边界、推定的峰最大值、峰同一性和/或峰纯度得以验证。

本领域技术人员理解，术语“样品预处理参数”涉及已知或假定对所述样品的分析LC-MS 运行的结果具有影响的任何预处理参数。在一个实施例中，该参数涉及在分析实验室接收之后的样品预处理。因此，在一个实施例中，样品预处理参数是样品处理的参数，例如温度，是物理样品预处理的参数，例如离心、过滤、加热和/或冷却，是化学样品预处理的参数，例如样品沉淀和/或萃取以及为此使用的溶剂、样品成分的衍生化等。

本领域技术人员理解，术语“LC 参数”涉及已知或假定对样品的分析 LC-MS 运行的结果具有影响的任何 LC 参数。在一个实施例中，所述 LC 参数选自样品稀释、样品体积、分离原理和 LC 柱的选择、一种或多种溶剂的选择、梯度形式、柱温等。

本领域技术人员理解，术语“MS 参数”涉及已知或假定对样品的分析 LC-MS 运行的结果具有影响的任何 MS 参数。在一个实施例中，所述 MS 参数选自电离方法、检测器类型、裂解数量等。

如本文所用，术语“修改参数”涉及已知或假定对分析 LC-MS 运行的结果具有影响的参数的任何变化。因此，该修改通常达到预期结果会发生变化的程度。在一个实施例中，经修改的参数是 LC 参数。在一个实施例中，参数由 LC-MS 装置的操作员修改，在进一步的实施例中，参数自动修改，特别是根据优化算法自动修改。合适的算法是本领域已知的。因此，在一个实施例中，用于优化分析方法的方法在如上文指定的***上实现；如本领域技术人员所理解的，在这种情况下，该***可以包括多个 LC-MS 装置，它们可操作地连接至指定的至少一个评估装置。

本发明还涉及一种用于在 LC 装置上从制备样品中纯化目标化合物的方法，该方法包括

a) 通过所述 LC 装置将所述制备样品的成分分离为级分并初步分配一个或多个级分用于池化；

b) 记录在步骤 a) 中初步分配用于池化的级分中的至少一个的等分试样的 MS色谱图；

c) 通过根据用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的方法，验证步骤 b)的用于池化的至少一个级分的分配；

d) 将具有经验证分配的样品包括在包含该化合物的级分的池化中；以及

e) 由此纯化所述目标化合物。

用于纯化化合物的方法是体外方法，在一个实施例中是制备型方法。此外，该方法可包括除上述步骤之外的进一步的步骤。例如进一步的步骤可涉及样品预处理和/或样品预纯化。因此，在一个实施例中，样品是预纯化的样品。此外，可以记录 LC 分离的色谱图，例如 UV/VIS 色谱图。在一个实施例中，该方法是化合物的制备型纯化中的最后一个 LC步骤。

如本文所用，术语“目标化合物”包括本领域技术人员认为感兴趣纯化或进一步纯化的任何化学分子。在一个实施例中，目标化合物是来自上述指示为分析物的基团之一的化合物，或上述指示为分析物的化合物之一。因此，在一个实施例中，目标化合物是低分子量化合物，具有至多 1 kDa 的分子量。在进一步的实施例中，目标化合物是大分子，在一个实施例中是生物大分子，在一个实施例中具有大于 1 kDa 的分子量。在一个实施例中，目标化合物是多肽，在进一步的实施例中是治疗性多肽。

如本文所用，术语“制备型样品”涉及包含足以用于制备型纯化的量的目标化合物的样品。如本领域技术人员理解的，足以用于制备型纯化的量很大程度上取决于所包含的目标化合物的类型；在一个实施例中，制备型样品包含至少 1mg、在一个实施例中为至少10mg、在进一步的实施例中为至少 100mg、在进一步的实施例中为至少 1g、在进一步的实施例中为至少 10g，在进一步实施例中为至少 100g，在进一步实施例中为至少 1kg 目标化合物。如上所述，在一个实施例中，制备型样品是预纯化样品；因此，在一个实施例中，目标化合物以至少 10%、在进一步的实施例中至少 25%、在进一步的实施例中至少 50%、在进一步的实施例中至少 75%、在进一步的实施例中至少 85%、在进一步的实施例中至少 90%、在进一步的实施例中至少 95%、在进一步的实施例中至少 99% 的纯度包含在制备型样品中。正如本领域技术人员所理解的，制备型样品的体积很大程度上取决于目标化合物的类型、其浓度和要执行的 LC；因此，制备型样品的体积可以从几微升到数千升。通常，制备型样品不含内标。

本领域技术人员理解，术语“级分”涉及物质组合物的子部分，在一个实施例中，如本文所述的 LC 分离的洗脱液的子部分，由对制备型样品应用分离步骤产生。在一个实施例中，级分中的至少一个已知或疑似包含目标化合物。特别是在获得较少数量级分的情况下，特别是三个或两个级分，该级分不必具有相同的体积。在一个实施例中，如本文所指定的级分是虚拟级分，即通过将分离步骤的洗脱液正式划分为子部分而产生，该子部分可具有相同或不同的体积。在进一步的实施例中，所述级分是物理级分，其可具有相同或不同的体积，包含在单独的容器中。在一个实施例中，至少部分级分是已知或疑似包含目标化合物的级分，例如从执行该方法的既往实例。

如本文所用，术语“级分的等分试样”涉及级分的子部分，通常与级分的体积相比为较小的子部分，例如级分的十分之一、百分之一、千分之一甚至更小。

本领域技术人员理解，术语“级分中的至少一个”涉及所提供的所有级分的多个至少一个级分。在一个实施例中，级分中的至少一个是至少两个，在一个实施例中为至少 5个，在进一步的实施例中为至少 10 个级分。在进一步的实施例中，级分中的至少一个涉及至少 1%，在一个实施例中至少 5%，在进一步的实施例中至少 10%，在进一步的实施例中至少 25%，在进一步的实施例中至少 50% 所提供的所有级分。在一个实施例中，至少部分级分包括所提供的所有级分。如上所述，在一个实施例中，至少部分级分已知或疑似包含目标化合物，例如从执行该方法的既往实例；此外，可知道纯度仅对部分级分至关重要，例如 LC色谱图中接近产物峰的起点和/或终点。因此，在用于纯化目标化合物的方法中，MS 色谱图仅针对需要确定目标化合物的纯度的级分，即如下文所述需要验证分配到池化的级分进行记录，便可为足够的。因此，在一个实施例中，用于纯化目标化合物的方法可以包括如上文指定的识别和/或验证目标化合物峰的至少一个峰边界，和/或如上文指定的识别和/或验证目标化合物峰的峰同一性和/或峰纯度。

如本文所用，术语“分配样品用于池化”涉及分配级分以成为未来纯化或进一步纯化的目标化合物池的一部分。在一个实施例中，池化包括物理组合至少两个单独的级分以形成一个池的行为；然而，鉴于上述，该术语还包括将可包含几个虚拟级分的 LC 运行的洗脱液的子部分重定向到池中。在一个实施例中，要池化的级分的数量也可以是一个。如本文所用，术语“初步分配”涉及级分的非最终分配；此类初步分配可以基于相同 LC 运行的早期实例、基于 LC 运行的 UV/VIS 色谱图的分析和/或技术人员认为合适的任何其他方法。初步分配后，该级分需要确认其是否纳入池；特别地，此类级分可以是接近目标化合物的峰的预期起点或终点的级分。在一个实施例中，可以存在无需验证分配的级分，例如如果已知此类级分在干扰方面无关紧要；此类样品最终可以在未经验证的情况下被分配用于池化。在这种情况下，获得的池通常包括最终分配的级分和经验证分配的级分。如本领域技术人员所理解的，池化还可以建立多于一个目标化合物池；例如可以生成一个高纯度池和第二较低纯度池，第二个池例如用于重复相同的 LC 运行或用于另一种不同的分离方法。根据上文，术语“经验证的分配”涉及级分的非初步分配；在一个实施例中，在经验证的分配之后，该级分纳入目标化合物池中。

综上所述，特别地设想如下实施例：

实施例 1. 一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来提供样品的色谱图；并且，在样品包含内标的情况下，任选地随时间推移提供，在一个实施例中为采集，内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；

b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定比率类型，该比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

实施例 2. 根据实施例 1 所述的方法，其中所述样品包含内标并且其中所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来提供样品的色谱图；并且，任选地随时间推移提供，在一个实施例中为采集，内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；

b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定比率类型，该比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰；

或者

其中所述样品不包含内标并且其中所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子和定性因子信号强度的多个数据点来提供样品的色谱图；

b) 对步骤 a) 中采集的数据点的至少一部分确定分析物定量因子与分析物定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

实施例 3. 根据实施例 1 或 2 所述的方法，其中提供色谱图是确定色谱图。

实施例 4. 根据实施例 1 至 3 中任一项所述的方法，其中所述方法还包括进一步的步骤 a1)，该进一步的步骤 a1) 确定对应于分析物的推定的下峰边界和/或推定的上峰边界，以及任选地确定对应于内标的推定的下峰边界和/或推定的上峰边界。

实施例 5. 根据实施例 1 至 4 中任一项所述的方法，其中所述推定的下峰边界和/或推定的上峰边界是预定义的推定的峰边界，和/或其中所述推定的下峰边界和/或推定的上峰边界是基于色谱图，在一个实施例中，通过进行自动化峰识别来确定的。

实施例 6. 根据实施例 1 至 5 中任一项所述的方法，其中所述基准是预先确定的基准值、基准范围或基准得分，在一个实施例中为预定义基准范围。

实施例 7. 根据实施例 1 至 6 中任一项所述的方法，其中所述基准是针对分析物和/或内标志物，在一个实施例中为纯化的分析物和/或纯化的内标志物而预先确定的比率或根据该比率计算得出。

实施例 8. 根据实施例 7 所述的方法，其中所述基准是所述预先确定的比率 ±X，在一个实施例中是针对纯化的分析物的预先确定的比率 ±X，X 是预先确定的比率的100%，在一个实施例中为 50%，在进一步的实施例中为 30%。

实施例 9. 根据实施例 1 至 8 中任一项所述的方法，其中所述识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界。

实施例 10. 根据实施例 9 所述的方法，其中在步骤 b) 中对其确定比率的数据点的所述一部分包括在待识别或验证的峰边界的下游和/或上游的数据点。

实施例 11. 根据实施例 9 或 10 所述的方法，其中在所述比率位于预定义基准范围内的情况下，识别和/或验证所述峰边界。

实施例 12. 根据实施例 9 至 11 中任一项所述的方法，其中在所述比率位于针对数据点的预定义部分的预定义基准范围内，在一个实施例中 5 个连续数据点中至少 3个的情况下，识别和/或验证所述峰边界。

实施例 13. 根据实施例 9 至 12 中任一项所述的方法，其中在以下情况下识别和/或验证所述峰边界：众多 n 个数据点上的所述比率的平均值符合预定义接受标准，在一个实施例中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施例中为至少三个数据点，在进一步的实施例中为至少四个数据点，在进一步的实施例中为至少五个数据点，在进一步的实施例中为至少七个数据点，在进一步的实施例中为至少十个数据点。

实施例 14. 根据实施例 1 至 13 中任一项所述的方法，其中所述识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证峰同一性和/或峰纯度。

实施例 15. 根据实施例 1 至 14 中任一项所述的方法，其中在步骤 b) 中对其确定比率的数据点的所述一部分包括推定的下峰边界和推定的上峰边界之间的数据点。

实施例 16. 根据实施例 13 至 15 中任一项所述的方法，其中在所述比率位于预定义基准范围内的情况下，验证峰同一性和/或峰纯度。

实施例 17. 根据实施例 13 至 16 中任一项所述的方法，其中所述比率位于针对数据点的预定义部分的预定义基准范围内的情况下，验证峰同一性。

实施例 18. 根据实施例 13 至 17 中任一项所述的方法，其中在以下情况下验证峰同一性：众多 n 个数据点上的所述比率的平均值在预定义基准范围内，在一个实施例中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施例中为至少三个数据点，在进一步的实施例中为至少四个数据点，在进一步的实施例中为至少五个数据点，在进一步的实施例中为至少七个数据点，在进一步的实施例中为至少十个数据点。

实施例 19. 根据实施例 13 至 16 中任一项所述的方法，其中在以下情况下验证峰纯度：所述比率位于针对数据点的预定义部分的预定义基准范围内，所述数据点的预定义部分在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 80% 所分析的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少90% 所分析的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 95% 所分析的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 80% 的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 90% 的数据点，在一个实施例中为，位于推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 95% 的数据点。

实施例 20. 根据实施例 13 至 16 或 19 中任一项所述的方法，其中在以下情况下验证峰纯度：对推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 80% 的数据点，在一个实施例中为推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 90% 的数据点，在一个实施例中为推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 95% 的数据点，众多 n 个数据点上的所述比率的平均值符合预定义接受标准；在一个实施例中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施例中为至少三个数据点，在进一步的实施例中为至少四个数据点，在进一步的实施例中为至少五个数据点，在进一步的实施例中为至少七个数据点，在进一步的实施例中为至少十个数据点。

实施例 21. 根据实施例 2 至 20 中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定推定的分析物峰面积与内标峰面积的比率（峰面积比率），其中所述方法包括确定分析物定量因子与内标定量因子的比率，或分析物定性因子与内标定性因子的比率，并且其中所述识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证所述峰面积比率。

实施例 22. 根据实施例 21 所述的方法，其中在步骤 b) 中对其确定比率的数据点的所述一部分包括推定的下峰边界和推定的上峰边界之间的数据点。

实施例 23. 根据实施例 21 或 22 所述的方法，其中在以下情况下验证所述推定的峰面积比率：对推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 10% 的数据点计算得出的所述比率的平均值，在一个实施例中为推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 50% 的数据点，在一个实施例中为推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 90%的数据点，位于所述峰面积比率 ±X 定义的范围内，X 为峰面积比率的 100%，在一个实施例中为 50%，在进一步的实施例中为 30%。

实施例 24. 根据实施例 2 至 23 中任一项所述的方法，其中所述方法包括识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率。

实施例 25. 根据实施例 24 所述的方法，其中所述方法包括确定分析物定量因子与内标定量因子的比率或分析物定性因子与内标定性因子的比率，并且进一步包括确定所述比率的分布，在一个实施例中包括确定所述数据点的偏态和/或峰态，在一个实施例中，其中所述方法是验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率的方法。

实施例 26. 根据实施例 23 至 25 中任一项所述的方法，其中在以下情况下识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率：众多 n个数据点上的所述比率的分布符合预定义接受标准，在一个实施例中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施例中 n 为至少三个数据点，在进一步的实施例中 n 为至少四个数据点，在进一步的实施例中 n 为至少五个数据点，在进一步的实施例中 n 为至少七个数据点，在进一步的实施例中 n 为至少十个数据点。

实施例 27. 一种样品的液相色谱质谱 (LC-MS) 测量的质量控制方法，该方法包括以下步骤：

A) 使用液相色谱质谱仪装置测量目标样品中的所述分析物并确定至少一个色谱图；

B) 执行根据实施例 1 至 23 中任一项所述的方法的步骤 b) 至 d)，以及

C) 基于步骤 B) 的结果评估所述 LC-MS 测量的质量。

实施例 28. 根据实施例 27 所述的方法，其中如果在步骤 B) 中未验证推定的峰边界、峰同一性、峰纯度和峰面积比率中的至少一者，则执行以下项中的至少一项：i) 将步骤 A) 的结果标记为不可靠；ii) 不输出步骤 A) 的结果，以及 (iii) 启动所述样品的重新运行，任选地使用不同的 LC-MS 方案。

实施例 29. 根据前述实施例中任一项所述的方法，其中方法步骤 b)、c) 和/或d)，在一个实施例中，步骤 b) 至 d)，由计算机执行。

实施例 30. 根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述色谱质谱仪装置包括串联质谱仪 (MS/MS) 单元。

实施例 31. 一种用于确定样品中至少一种分析物的浓度的***，该***包括：

(I) 至少一个液相色谱质谱仪装置，其中液相色谱质谱仪装置配置用于测量样品中的分析物并用于随时间推移采集数据点，在一个实施例中，用于执行根据实施例 1 至28 中任一项所述的方法的步骤 a)；以及

(II) 至少一个评估装置，其中评估装置配置用于执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施例中，用于执行所有步骤 b) 至d)。

实施例 32. 根据前述实施例所述的装置，其中所述装置配置用于执行根据实施例 27 至 30 中任一项所述的质量控制方法。

实施例 33. 一种包括至少一个处理器的计算机或计算机网络，其中该处理器适于执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施例中，执行所有步骤 b) 至 d)。

实施例 34. 一种计算机可加载的数据结构，当该数据结构正在计算机上执行时，其适于执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施例中，执行所有步骤 b) 至 d)。

实施例 35. 一种计算机程序，其中所述计算机程序适于当所述程序在计算机上执行时执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施例中，执行所有步骤 b) 至 d)。

实施例 36. 一种包含程序装置的计算机程序，当所述计算机程序在计算机或计算机网络上执行时，执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c)和/或 d)，在一个实施例中，执行所有步骤 b) 至 d)。

实施例 37. 计算机程序，该计算机程序包括根据前述实施例的程序装置，其中这些程序装置存储在计算机可读的存储介质上。

实施例 38. 存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上并且其中该数据结构适于在被加载到计算机或计算机网络的主存储装置和/或工作存储装置之后，执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施例中，执行所有步骤 b) 至 d)。

实施例 39. 具有程序代码工具的一种计算机程序产品，其中该程序代码工具能够被存储在存储介质上或被存储在存储介质上，所述计算机程序产品用于当在计算机上或在计算机网络上执行所述程序代码工具时，执行根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施例中，执行所有步骤 b) 至 d)。

实施例 40. 一种用于优化 LC-MS 装置上针对分析物的分析方法的方法，该方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和定性因子信号强度的多个数据点来提供，在一个实施例中为确定，样品的色谱图；

b) 确定推定的下峰边界、推定的上峰边界、峰同一性和/或峰纯度；

c) 通过根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法验证步骤 (b) 的推定的下峰边界、推定的上峰边界、峰同一性和/或峰纯度；

d) 如果在步骤 (c) 中未验证推定的下峰边界、推定的上峰边界、峰同一性和/或峰纯度中的至少一者，则修改样品预处理参数、LC 参数和/或 MS 参数；以及

e) 由此优化分析物的分析方法。

实施例 41. 一种用于在 LC 装置上从制备样品中纯化目标化合物的方法，该方法包括

a) 通过所述 LC 装置将所述制备样品的成分分离为级分并初步分配一个或多个级分用于池化；

b) 记录在步骤 a) 中初步分配用于池化的级分中的至少一个的等分试样的 MS色谱图；

c) 通过根据用于识别和/或验证至少一个分析物峰的方法的方法，验证步骤 b)的用于池化的至少一个级分的分配；

d) 将具有经验证分配的样品包括在包含该化合物的级分的池化中；以及

e) 由此纯化所述目标化合物。

实施例 42. 前述实施例中任一项的主题，其中定量因子信号强度、定性因子信号强度、内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的值是单循环信号强度或通过标准数学运算从其导出来的值，在一个实施例中为单循环信号强度。

本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。

附图图例

图 1 示出了氯硝西泮 (A) 和 EDDP (B) 的色谱图及其定量因子/定性因子比率印迹。

图 2 示出了苯甲酰芽子碱的色谱图及其定量因子/定性因子比率印迹。

图 3 示出了在同质异位素干扰表睾酮的不同峰分辨率下，睾酮的分析物定量因子与内标单循环比率的偏态印迹。

以下实例仅说明本发明。无论如何，不应将其视为限制本发明的范围。

实例 1：通过 LC-MS 测量掺有含苯甲酰芽子碱、氯硝西泮和 EDDP 及其 ISTD（内标）苯甲酰芽子碱-13C6、氯硝西泮-d4 和 EDDP-d3 的混合物的血清样品。从 MS 原始数据中读取单个数据点，并针对每种分析物/ISTD 组合对齐跃迁的保留时间。下表 1 总结了按峰积分和单循环比率的计算以及它们与各自目标值的偏差以及可接受的范围。

表 1：按峰积分和单循环比率计算的峰边界、定量因子/定性因子比率和分析物/内标 (ISTD) 比率及其与目标值的偏差；粗体表示未经验证的结果

	目标值	按峰积分	按单循环比率	Δ 与目标值的偏差或验证状态
					苯甲酰芽子碱
峰边界起点	100±30%	8,078 ms	0/5	未验证
					峰边界终点	100±30%	12,590ms	4/5	已验证
定量因子/定性因子比率	4.03±10%	4.12	4.05	2.2% <i>/ </i>0.5%
					分析物/ISTD 比率	42.53±10%	46.62	42.27	12.0% <i>/ </i>-0.6%
					氯硝西泮
峰边界起点	100±30%	11,956 ms	5/5	已验证
					峰边界终点	100±30%	18,557 ms	4/5	已验证
定量因子/定性因子比率	1.15±10%	1.16	1.14	0.9% <i>./ </i>-0.9%
					分析物/ISTD 比率	4.30±10%	4.03	4.63	-6.3% <i>./ </i>7.7%
					EDDP
峰边界起点	100±30%	43,664ms	4/5	已验证
					峰边界终点	100±30%	56,774ms	4/5	已验证
定量因子/定性因子比率	4.64±10%	4.75	4.54	2.4% <i>./ </i>-2.2%
					分析物/ISTD 比率	14.08±10%	14.14	14.28	0.4% <i>./ </i>1.4%

实例 2：相对于它们的目标值计算实例 1 的定量因子/定性因子单循环比率。图1 示出了氯硝西泮和 EDDP 的色谱图及其定量因子/定性因子比率印迹，图 2 示出了苯甲酰芽子碱的色谱图及其定量因子/定性因子比率印迹。为验证峰边界，检测到苯甲酰芽子碱的峰边界为 8,078 和 12,590 ms、氯硝西泮为 11,956 和 18,557 ms 以及 EDDP 为 43,664 和 56,774 ms，对它们检测到的峰边界周围的五个连续单循环比率进行了监测。对符合目标值 ±30% 误差的可接受范围的平滑数据点数进行计数。五个数据点中至少有三个在可接受范围内，则得以验证。除苯甲酰芽子碱的峰起始边界差异显著外，按峰积分确定的峰边界均得以验证。

实例 3：实例 2 中苯甲酰芽子碱的峰起始边界的显著偏差以及该测量中定量因子/定性因子单循环比率的高度改变导致人们假设，峰起始边界附近的共洗脱化合物存在潜在干扰。此类共洗脱干扰无法通过任何峰形参数监测，因为它不会明显影响峰曲线。然而，另外计算的峰边界内的单循环比率的中值可以通过与相应目标值作比较来验证接近峰起点的干扰。

实例 4：确定分析物/ISTD 单循环比率并计算其在峰边界内的中值。与按峰积分确定的峰面积比率作比较，可以验证为所有化合物确定的量，除苯甲酰芽子碱之外。该结果再次导致人们假设，苯甲酰芽子碱峰下存在干扰物质，因此与实例 3 中描述的假设一致。这种干扰直接影响最终结果，即测得的苯甲酰芽子碱浓度，并且无法通过定量因子/定性因子峰面积比率等传统参数进行监测，从而导致忽略干扰的风险。

实例 5：通过 LC-MS 在六种不同的 LC 方案和六次分析重复中测量掺有含睾酮和表睾酮以及 ISTD（内标）睾酮-13C3 的混合物的血清样品。从 MS 原始数据中读取单个数据点，并针对分析物/ISTD 组合对齐跃迁的保留时间。

实例 6：计算并监测实例 5 的分析物/ISTD 单循环比率偏态，以验证样品的峰同一性和/或纯度。图 3 示出了在同质异位素干扰表睾酮的不同峰分辨率下，睾酮的分析物/ISTD 单循环比率的偏态印迹，以及各自的目标值和可接受范围。偏态值符合目标值 ±100% 误差的可接受范围，则得以验证。可以为在 LC 方案一、二和三中测量的样品验证峰同一性和/或纯度。对于在 LC 方案四、五和六中测量的样品，偏态值超出了可接受范围，因此无法验证这些样品中的峰同一性和/或纯度。

实例 7：实例 6 中未通过在其分布中偏离分析物/ISTD 单循环比率偏态来验证的样品导致人们假设，共洗脱化合物存在潜在干扰。此外，估计了每个 LC 方案和样品的睾酮和表睾酮（作为干扰）之间的平均峰分辨率。在平均峰分辨率等于或大于 0.9 的所有样品中，峰同一性和/或纯度可以通过相应的偏态来验证，在值低于 0.9 的样品中，无法验证峰同一性和/或纯度。这些观察结果证实了以下假设：这些样品中存在共洗脱干扰，在本实例中为表睾酮。

文献：

EP 3 425 369 A1

Claims (15)

1.一种用于识别和/或验证来自液相色谱质谱仪装置的针对分析物的样品的色谱图中的至少一个分析物峰的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来确定所述样品的色谱图；并且，在所述样品包含内标的情况下，任选地随时间推移采集内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；

b) 对步骤 a) 中采集的所述数据点的至少一部分确定比率类型，所述比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其中所述样品包含内标并且其中所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子信号强度和/或定性因子信号强度的多个数据点来提供样品的色谱图；并且，任选地随时间推移采集内标定量因子信号强度和/或内标定性因子信号强度的多个数据点；

b) 对步骤 a) 中采集的所述数据点的至少一部分确定比率类型，所述比率类型选自由以下项组成的列表：(i) 分析物定量因子与分析物定性因子的比率，(ii) 内标定量因子与内标定性因子的比率，(iii) 分析物定量因子与内标定量因子的比率，以及 (iv) 分析物定性因子与内标定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰；

或者

其中所述样品不包含内标并且其中所述方法包括以下步骤：

a) 通过随时间推移采集定量因子和定性因子信号强度的多个数据点来提供样品的色谱图；

b) 对步骤 a) 中采集的所述数据点的至少一部分确定分析物定量因子与分析物定性因子的比率；

c) 将步骤 b) 中确定的比率与基准进行比较；以及

d) 基于比较步骤 c) 识别和/或验证色谱图中的至少一个分析物峰。

3.根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其中所述方法包括进一步的步骤 a1)确定对应于所述分析物的推定的下峰边界和/或推定的上峰边界，以及任选地确定对应于所述内标的推定的下峰边界和/或推定的上峰边界。

4.根据权利要求 1 至 3 中任一项所述的方法，其中所述基准是针对所述分析物和/或内标志物，在一个实施方案中为纯化的分析物和/或纯化的内标志物而预先确定的比率或根据所述比率计算得出。

5.根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的方法，其中所述识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界。

6.根据权利要求 5 所述的方法，其中在步骤 b) 中对其确定比率的所述数据点的所述一部分包括在待识别或验证的所述推定的峰边界的下游和/或上游的数据点，和/或其中在所述比率位于针对数据点的预定义部分的预定义基准范围内，在一个实施方案中 5 个连续数据点中至少 3 个的情况下，识别和/或验证所述推定的峰边界。

7.根据权利要求 1 至 6 中任一项所述的方法，其中所述识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证峰同一性和/或峰纯度，在一个实施方案中，其中在所述比率位于预定义基准范围内的情况下，验证峰同一性和/或峰纯度。

8.根据权利要求 2 至 7 中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定推定的分析物峰面积与内标峰面积的比率（峰面积比率），其中所述方法包括确定分析物定量因子与内标定量因子的比率，或分析物定性因子与内标定性因子的比率，并且其中所述识别和/或验证至少一个分析物峰包括识别和/或验证所述峰面积比率。

9.根据权利要求 1 至 8 中任一项所述的方法，其中在步骤 b) 中对其确定比率的所述数据点的所述一部分包括所述推定的下峰边界和所述推定的上峰边界之间的数据点。

10.根据权利要求 1 至 9 中任一项所述的方法，其中所述方法包括识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率，包括确定分析物定量因子与内标定量因子的比率，或分析物定性因子与内标定性因子的比率，并且进一步包括确定所述比率的分布。

11.根据权利要求 10 所述的方法，其中在以下情况下识别和/或验证分析物峰的至少一个推定的峰边界、峰纯度和/或推定的峰面积比率：众多 n 个数据点上的所述比率的分布符合预定义接受标准，在一个实施方案中其中 n 为至少两个数据点，在进一步的实施方案中 n 为至少三个数据点，在进一步的实施方案中 n 为至少四个数据点，在进一步的实施方案中 n 为至少五个数据点，在进一步的实施方案中 n 为至少七个数据点，在进一步的实施方案中 n 为至少十个数据点。

12.根据权利要求 10 或 11 所述的方法，其中在以下情况下验证所述推定的峰面积比率：对所述推定的下峰边界和/或推定的上峰边界之间至少 10% 的数据点计算得出的所述比率的平均值位于由基准峰面积比率 ±30% 定义的范围内。

13.一种样品的液相色谱质谱 (LC-MS) 测量的质量控制的方法，所述方法包括以下步骤：

A) 使用液相色谱质谱仪装置测量感兴趣的样品中的所述分析物并确定至少一个色谱图；

B) 执行根据权利要求 1 至 12 中任一项所述的方法的步骤 b) 至 d)，以及

C) 基于步骤 B) 的结果评估所述 LC-MS 测量的质量。

14.一种用于确定样品中至少一种分析物的浓度的***，所述***包括：

(I) 至少一个液相色谱质谱仪装置，其中所述液相色谱质谱仪装置被配置用于测量所述样品中的所述分析物并用于随时间推移采集数据点，在一个实施方案中，用于执行根据权利要求 1 至 11 中任一项所述的方法的步骤 a)；以及

(II) 至少一个评估装置，其中所述评估装置被配置用于执行根据权利要求 1 至 11中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施方案中，用于执行所有步骤b) 至 d)。

15.一种具有程序代码工具的计算机程序产品，其中所述程序代码工具能够被存储在存储介质上或被存储在存储介质上，所述计算机程序产品用于当在计算机上或在计算机网络上执行所述程序代码工具时，执行根据权利要求 1 至 11 中任一项所述的方法的至少步骤 b)、c) 和/或 d)，在一个实施方案中，执行所有步骤 b) 至 d)。

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