CN115232079B - 一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用，该抑制剂结构式为：

Description

一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用。
背景技术
神经氨酸酶是分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白，在病毒感染时水解宿主细胞表面的唾液酸与糖蛋白之间糖苷键，促使成熟的病毒从被感染的细胞表面释放出来从而继续感染新的细胞。同时可阻止子代病毒粒子从宿主细胞释放后发生凝聚，还可水解呼吸道黏膜中的唾液酸，从而阻止子代病毒颗粒灭活，促进病毒在呼吸道中的传播，在病毒的复制和感染周期中发挥了重要作用，因此神经氨酸酶是抗流感病毒药物研发设计的重要靶点之一。
目前，美国FDA批准的抗流感病毒的药物仅有6个，2个M2质子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚烷乙胺)、3个神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦)和1个RNA依赖RNA聚合酶抑制剂(索夫鲁扎)。以神经氨酸酶为靶点开发的抗流感病毒药物根据结构可分为以下几类：环己烯类、环戊烷类、吡喃类、吡咯烷类、苯甲酸衍生物类以及天然提取物等。
近年来，由于神经氨酸酶抑制药物广泛应用于临床，己经有耐药病毒株出现，达菲由于是口服制剂，应用最为广泛，但病毒耐药性也最为严重，且达菲的生产原料极其昂贵，合成工艺复杂，而扎那米韦、帕拉米韦和拉尼米韦也有耐药病毒株开始出现。因此，开发新型、高效、安全的神经氨酸酶抑制剂仍是目前抗流感病毒领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂，该抑制剂具有式(I)所示的化学结构式：
其中，R1选自如下结构式中的任意一种：
(X＝F、Cl、Br或I)、/>
R2选自如下结构式中的任意一种：
(X＝F、Cl、Br或I)、
优选地，R1选自如下结构式中的任意一种：
R2选自如下结构式中的任意一种：
进一步优选地，所述的抑制剂具有如下化学结构式中的一种：
一种上述嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将取代苯甲醛、乙醛和有机溶剂形成反应体系，反应后经后处理得到式(II)中间体；
(2)取步骤(1)得到的式(II)中间体溶于有机溶剂中和锌粉形成反应体系，反应后得到式(III)中间体；
(3)取步骤(2)得到的式(III)中间体溶于有机溶剂中加入三溴化磷形成反应体系，反应后经后处理得到式(IV)所示的中间体；
(4)将取代苯乙胺、氯乙酰氯、三乙胺形成反应体系，反应后经后处理得到式(V)中间体；
(5)取步骤(4)得到的式(V)中间体在碱性条件下与4,6-二羟基-2-巯基嘧啶反应后经后处理得到式(VI)所示的中间体；
(6)取步骤(5)得到的式(VI)中间体在弱碱性条件下与步骤(3)得到的式(IV)中间体形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂。
所述制备方法的方程式如下所示：
优选地，步骤(1)中，反应的温度为25-60℃，优选为25℃，反应的时间为8-16h，优选为10h。
优选地，步骤(1)中，采用无水K2CO3作为催化剂，所述有机溶剂采用吡啶。
优选地，步骤(1)中，取代苯甲醛、乙醛、无水K2CO3和有机溶剂的添加量比为(20-30)mmoL:(40-100)mmoL:(30-45)mmoL:(20-60)mL，优选为20mmoL:40mmoL:30mmmoL：20mL。
优选地，步骤(1)中，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(II)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(II)中间体。
优选地，步骤(2)中，反应的温度为0-40℃，优选为25℃，反应的时间为9.5-24h，优选为12h。
优选地，步骤(2)中，采用锌粉和氯化铵体系进行还原，所述有机溶剂采用甲醇。
优选地，步骤(2)中，所述式(II)中间体、锌粉、氯化铵和有机溶剂的添加量比为(10-30)mmoL:(10-30)mmoL：(10-100)mmoL：(20-40)mL，优选为15mmoL:15mmoL：90mmoL：20mL。
优选地，步骤(3)中，反应的温度为0-30℃，优选为25℃，反应的时间为9-17.5h，优选为12h。
优选地，步骤(3)中，所述有机溶剂采用***、乙腈、甲苯、四氢呋喃或二氯甲烷，优选为二氯甲烷。
优选地，所述式(III)中间体、三溴化磷和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(1-5)mmoL：(10-20)mL，优选为5mmoL:2.5mmoL:15mL。
优选地，步骤(4)中，反应的温度为0-35℃，优选为0℃，反应的时间为0.5-2h，优选为1.5h。
优选地，步骤(4)中，萃取所用的有机溶剂采用丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃或二氯甲烷，优选为二氯甲烷。
优选地，步骤(4)中，所述取代苯乙胺、氯乙酰氯、三乙胺和萃取所用的有机溶剂的添加量比为5mmoL：(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(20-50)mL，优选为5mmoL:5.1mmoL:5.1mmoL：30mL。
优选地，步骤(5)中，反应的温度为25-65℃，优选为25℃，反应的时间为8-12h，优选为10h。
优选地，步骤(5)中，碱采用氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、甲醇钠或叔丁醇钾，优选为氢氧化钠；溶剂采用乙酸乙酯、甲醇、乙醇或蒸馏水，优选为蒸馏水。
优选地，步骤(5)中，所述式(V)中间体、4,6-二羟基-2-巯基嘧啶、氢氧化钠和溶剂的添加量比为(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(5-10)mmoL：(10-50)mL，优选为5.5mmoL:5mmoL:10mmoL：15mL。
优选地，步骤(5)中，后处理的过程具体为：用浓盐酸将反应液的PH调节至7，静置，析出固体，过滤收集固体，用大量蒸馏水洗涤，室温晾干，得到式(VI)所示中间体。
优选地，步骤(6)中，反应的温度为25-65℃，优选为25℃，反应的时间为10-20h，优选为18h。
优选地，步骤(6)中，碱采用三乙胺、二乙胺、碳酸氢钠、碳酸铯、碳酸钾或碳酸钠，优选为碳酸钾；有机溶剂采用乙酸乙酯、甲醇、乙醇或DMF，优选为DMF。
优选地，步骤(6)中，所述式(VI)中间体、式(IV)中间体、碱和有机溶剂的添加量比为(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(7.5-15)mmoL：(10-30)mL，优选为5.5mmoL:5.5mmoL:11mmoL：15mL。
优选地，步骤(6)中，后处理的过程具体为：将反应液倒入饱和食盐水中，加入乙酸乙酯萃取多次，有机相再用饱和食盐水洗涤多次并用无水硫酸钠进行干燥，柱层析得到式(I)所示的抑制剂。
一种上述嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的应用，将所述的抑制剂用于制备能够抑制神经氨酸酶活性的药物。
本发明利用基于受体的分子对接虚拟筛选方法，从ZINC数据库中筛选了600000个化合物，得到了理论上具有神经氨酸酶抑制活性的一个化合物，继而对其结构进行改造，设计出了更为合理的化合物，并对其中7个化合物进行了神经氨酸酶测试，以Oseltamivircarboxlate(OSC)作为阳性对照，其中OSC的IC50值为1.12μM。
本发明所合成的如下四个化合物的IC50值都接近于1.12μM：
其中，抑制效果最好的化合物其IC50值为1.36±0.56μM，具有非常优异的神经氨酸酶抑制活性。
与现有技术相比，本发明提供一种具有新骨架结构的神经氨酸酶抑制剂及其制备方法和应用，合成方法简单，制得的抑制剂神经氨酸酶抑制活性好，具有优异的神经氨酸酶抑制效果，可应用于制备抑制神经氨酸酶活性的药物。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂，所述抑制剂具有式(I)所示的结构：
其中，R1选自(X＝F、Cl、Br或I)、 中的任意一种；
R2选自 (X＝F、Cl、Br或I)、/> 中的任意一种。
上述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，制备方法的方程式如下所示：
所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将取代的苯甲醛、乙醛和吡啶形成反应体系，反应后经后处理得到式(II)中间体；
(2)取步骤(1)得到的式(II)中间体溶于有机溶剂中和锌粉形成反应体系，反应后得到式(III)中间体；
(3)取步骤(2)得到的式(III)中间体溶于有机溶剂中加入三溴化磷形成反应体系，反应后经后处理得到式(IV)所示的中间体；
(4)将取代的苯乙胺、氯乙酰氯形成反应体系，反应后经后处理得到式(V)中间体；
(5)取步骤(4)得到的式(V)中间体在碱性条件下与4,6-二羟基-2-巯基嘧啶，反应后经后处理得到式(VI)所示的中间体；
(6)取步骤(5)得到的式(VI)中间体在弱碱性条件下与步骤(3)得到的式(IV)中间体形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的嘧啶类抑制剂；
步骤(1)中，采用无水K2CO3作为催化剂，所述有机溶剂采用吡啶，所述反应体系置于温度为25-60℃，优选为25℃，反应的时间为8-16h，优选为10h，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(II)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(II)中间体，所述取代苯甲醛、乙醛、无水碳酸钾和有机溶剂的添加量比为(20-30)mmoL:(40-100)mmoL:(30-45)mmoL：(20-60)mL，优选为20mmoL:40mmoL:30mmoL:20mL。
步骤(2)中，采用锌粉和氯化铵体系进行还原，所述有机溶剂采用甲醇，所述反应体系置于温度为0-40℃，优选为25℃，反应的时间为9.5-24h，优选为12h，所述式(II)中间体、锌粉、氯化铵和有机溶剂的添加量比为(10-30)mmoL:(10-30)mmoL：(10-100)mmoL：(20-40)mL，优选为15mmoL:15mmoL：90mmoL：20mL。
步骤(3)中，所述有机溶剂采用***、乙腈、甲苯、四氢呋喃或二氯甲烷，优选为二氯甲烷，所述反应体系置于温度为0-30℃，优选为25℃，反应的时间为9-17.5h，优选为12h，所述式(III)中间体、三溴化磷和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(1-5)mmoL：(10-20)mL，优选为5mmoL：2.5mmoL：15mL。
步骤(4)中，所述有机溶剂采用丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃或二氯甲烷，优选为二氯甲烷，所述反应体系置于温度为0-35℃，优选为0℃，反应的时间为0.5-2h，优选为1.5h，所述取代苯乙胺、氯乙酰氯、三乙胺和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(20-50)mL，优选为5mmoL:5.1mmoL:5.1mmoL：30mL。
步骤(5)中，采用氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、甲醇钠或叔丁醇钾作为碱，所述溶剂采用乙酸乙酯、甲醇、乙醇或蒸馏水，优选为蒸馏水，所述反应体系置于温度为25-65℃，优选为25℃，反应的时间为8-12h，优选为10h，后处理的过程具体为：用浓盐酸将反应液的PH调节至7，静置，析出固体，过滤收集固体，用大量蒸馏水洗涤，室温晾干，得到式(VI)所示中间体。所述式(V)中间体、4,6-二羟基-2-巯基嘧啶、氢氧化钠和溶剂的添加量比为(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(5-10)mmoL：(20-50)mL，优选为5.5mmoL:5mmoL:10mmoL：15mL。
步骤(6)中，采用三乙胺、二乙胺、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾作为碱，优选为碳酸钾；所述有机溶剂采用甲醇、乙醇或DMF，优选为DMF。反应温度为25-65℃，优选为25℃，反应的时间为10-20h，优选为18h。后处理的过程具体为：将反应液倒入饱和食盐水中，加入乙酸乙酯萃取多次，有机相再用饱和食盐水洗涤多次并用无水硫酸钠进行干燥，柱层析得到式(I)所示的抑制剂。所述式(VI)中间体、式(IV)中间体、无水碳酸钾和有机溶剂的添加量比为(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(7.5-15)mmoL：(10-30)mL，优选为5.5mmoL:5.5mmoL:11mmoL：15mL。
对制备得到的抑制剂进行抑制神经氨酸酶活性测试，具体测试方法如下：
1.实验仪器和材料
多功能荧光酶标仪，SP-Max 3500FL型，上海闪谱生物科技有限公司；
超净工作台；
Bond A3Pipette手动单道可调试移液器，0.5-10ul，10-100ul，100-1000ul泰坦科技；
96孔板(黑色)，灭菌，康宁；
H5N1神经氨酸酶，购自北京义翘神州科技股份有限公司；酶抑制实验中使用的荧光底物2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神经氨酸钠水合物(4-MUNANA)(Sigma，M8639)，购自Sigma公司；2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、氯化钙、氢氧化钠、无水乙醇，购自泰坦科技。
阳性对照药，奥司他韦酸(Oseltamivir carboxlate，简写为OSC)，上海贺康生物技术有限公司。
2.实验方法
将阳性对照药及实施例制备的目标化合物用DMSO溶解，初始浓度配制成1000μm/l，将其按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为50μm/l、25μm/l、12.5μm/l、6.25μm/l、3.13μm/l、1.56μm/l，每个浓度梯度依次配制三组；
2.1样品检测准备
a.缓冲液(33mM MES，4mM CaCl2)每孔加入70μL于96孔酶标板中；
b.神经氨酸酶每孔加入10μL；
c.每孔加入10μL配好浓度的待测神经氨酸酶抑制剂样品或阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照；
d.神经氨酸酶底物(100μM·L-1 4-MUNANA)每孔加入10μL。
2.2检测
a.将96孔板置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；
b.温度设置为37摄氏度，孵育5分钟，使神经氨酸酶与待测样品充分混匀、相互作用；
c.取出96孔板，每孔再加入神经氨酸酶荧光底物10μL；
d.再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；
e.于37摄氏度下孵育30分钟，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L-1NaOH的83％乙醇水溶液)，再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟，激发波长设置为355nm，发射波长设置为460nm，孵育结束后开始荧光强度(RFU)测定；
f.重复上述操作步骤，做3组平行实验。
注：96孔板中的第一个孔作为空白组，不加待测样品，加入10微升DMSO溶液。
算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC50值。
将阳性对照药及目标化合物用DMSO溶液均配制成初始浓度1000μm/L的混合溶液，再将这两种混合溶液按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为50μm/l、25μm/l、12.5μm/l、6.25μm/l、3.13μm/l、/1.56μm/l，每个浓度梯度依次配制三组。在96孔黑色荧光酶标板中加入神经氨酸酶缓冲液70μL，神经氨酸酶10μL，以及待测的每个梯度浓度的阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照。在多功能荧光酶标仪中震荡1分钟混匀，37℃孵育5min；取出96孔酶标板，每孔加入10μL的神经氨酸酶底物，震荡1分钟混匀，在37℃孵育30min后，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L-1NaOH的83％乙醇水溶液)，再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟，激发波长设置为355nm，发射波长设置为460nm，孵育结束后开始荧光强度(RFU)测定。平行进行三次实验，算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC50值算出每个样品的抑制率，再通过Origin拟合出相应IC50值。
以下为具体示例：
实施例1
2-((5-肉桂基-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(4-甲氧基苯乙基)乙酰胺，其结构式如式I所示：
具体合成步骤如下：
(1)用量筒准确量取2.04mL(20mmoL)苯甲醛、2.25mL(40mmoL)乙醛，倒入50ml圆底烧瓶中，再准确称量无水碳酸钾2.76g(30mmoL)加入圆底烧瓶，倒入20mL吡啶，置于室温25℃下搅拌反应10小时，反应结束后。在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(II)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(II)中间体。
(2)准确称量式(II)中间体1.98g(15mmoL)、Zn粉0.98g(15mmoL)和氯化铵4.81g(90mmoL)于50mL圆底烧瓶中，加入20mL甲醇，25℃下反应12小时。反应完毕后，将反应液过滤，滤饼用10mL甲醇洗涤，真空除去溶剂得到式(III)中间体。
(3)取式(III)中间体0.98g(5mmoL)于25mL圆底烧瓶中，加入15mL二氯甲烷，用恒压地液漏斗缓慢滴加0.24mL(2.5mmoL)三溴化磷，滴加完毕后，于25℃下搅拌12小时，反应结束后，将反应液小心倒入50mL冰水中，再加入3x30mL二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相再用3x50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，收集有机相。用无水硫酸钠干燥，真空减压除去溶剂得式(IV)所示的中间体。
(4)准确称量0.76g(5mmoL)4-甲氧基苯乙胺、0.52g(5.1mmoL)三乙胺于50mL圆底烧瓶中，在冰浴下搅拌15分钟，再用恒压地液漏斗缓慢滴加0.41mL(5.1mmoL)氯乙酰氯，滴加完毕后，置于0℃下搅拌反应1.5小时。反应结束后，将反应液倒入30mL水中，加入30mL二氯甲烷萃取，用分液漏斗分液，取有机相。有机相依次饱和碳酸氢钠溶液、1moL/L的盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，柱层析得到纯净的式(V)中间体。
(5)准确称量1.25g(5.5mmoL)式(V)中间体、0.72g(5mmoL)4,6-二羟基-2-巯基嘧啶于25mL圆底烧瓶中，加入15mL蒸馏水，再分批加入0.4g(10mmoL)氢氧化钠，置于25℃下搅拌反应10小时，反应结束后。用浓盐酸将反应液调节PH至7，静置，析出固体，过滤收集固体，用大量蒸馏水洗涤，室温晾干，得到式(VI)所示中间体。
(6)准确称量1.95g(5.5mmoL)式(VI)中间体、1.08g(5.5mmoL)式(IV)中间体和1.52g(11mmoL)无水碳酸钾于25mL圆底烧瓶中，加入15mLDMF，置于25℃下搅拌反应18小时，反应结束后。将反应液倒入饱和食盐水中，加入乙酸乙酯萃取多次，有机相再用饱和食盐水洗涤多次并用无水硫酸钠进行干燥，柱层析得到式(I)所示的抑制剂。
实验结果：
2-((5-肉桂基-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(4-甲氧基苯乙基)乙酰胺，为淡黄色固体，产率55％，其IC50值为1.36±0.56μM，熔点为256.2-257.3℃，阳性对照药的IC50值为1.12μM。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.32–7.28(m,2H),7.23–7.17(m,5H),6.80(d,J＝7.5Hz,2H),6.47(dt,J＝15.1,1.1Hz,1H),6.32(s,1H),5.93(s,1H),5.82(s,1H),3.80(s,3H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝5.1Hz,2H),2.75–2.71(m,2H),2.63(dd,J＝6.0,0.9Hz,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,159.49,157.83,137.10,131.63,130.34,129.77,128.90,128.56,126.97,126.51,113.78,88.20,55.35,40.53,35.37,34.26,30.03.
实施例2
2-((5-肉桂基-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(4-羟基苯乙基)乙酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
淡黄色固体，产率41％，IC50值为1.65±0.23μM，熔点为310.2-312.1℃。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.30(dd,J＝6.8,3.1Hz,2H),7.20(qd,J＝4.0,1.5Hz,2H),7.04–6.99(m,2H),6.74(s,1H),6.71–6.65(m,1H),6.55(dt,J＝15.1,5.9Hz,2H),6.46(d,J＝15.2Hz,1H),5.80(s,1H),4.51(s,1H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝5.4Hz,2H),2.73(ddd,J＝6.4,4.9,1.1Hz,2H),2.63(d,J＝5.9Hz,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,159.49,155.93,137.10,130.58,130.44,130.34,129.77,128.56,126.97,126.51,116.03,88.20,40.53,35.37,34.26,30.03.
实施例3
2-((5-肉桂基-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯乙基)乙酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
淡黄色固体，产率49％，IC50值为2.89±0.97μM，熔点为235.2-236.5℃。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.35–7.27(m,2H),7.20(dd,J＝5.0,1.8Hz,3H),6.57(dt,J＝15.0,1.1Hz,1H),6.44(d,J＝1.2Hz,2H),6.33(s,1H),6.24(d,J＝15.2Hz,1H),5.93(s,1H),5.26(s,1H),3.87(s,6H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝7.6Hz,2H),2.78(tt,J＝7.7,1.1Hz,2H),2.63(dd,J＝6.2,1.1Hz,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,159.49,147.61,137.10,133.29,132.76,130.34,129.77,128.56,126.97,126.51,107.50,88.20,56.35,40.53,34.66,34.26,30.03.
实施例4
2-((5-肉桂基-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(4-羟基-3-甲氧基苯乙基)乙酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
淡黄色固体，产率39％，IC50值为1.87±0.49μM，熔点为240.8-241.2℃。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.30(qd,J＝3.0,1.7Hz,2H),7.20(qd,J＝4.0,1.4Hz,3H),6.80–6.73(m,1H),6.67(ddt,J＝7.5,2.2,1.1Hz,1H),6.59(dt,J＝2.0,1.1Hz,1H),6.53–6.42(m,2H),5.71(s,1H),5.62(s,1H),3.95(s,3H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝5.2Hz,2H),2.68–2.60(m,4H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,159.49,148.78,144.71,137.10,131.60,130.34,129.77,128.56,126.97,126.51,121.82,115.88,112.94,88.20,56.05,40.53,39.04,34.26,30.03.
实施例5
2-((5-肉桂基-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(4-氟苯乙基)乙酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
淡黄色固体，产率36％，IC50值为4.79±0.97μM，熔点为236.4-237.2℃。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.33–7.23(m,4H),7.21(td,J＝4.3,1.5Hz,3H),6.65(s,2H),6.44(d,J＝14.9Hz,1H),6.33(s,1H),5.68(s,1H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝7.7Hz,2H),2.73(t,J＝7.6Hz,2H),2.63(dd,J＝6.0,0.9Hz,2H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,162.29,160.27,159.49,137.10,133.63,133.61,130.34,130.31,130.25,129.77,128.56,126.97,126.51,115.18,115.02,88.20,40.53,35.37,34.26,30.03.
实施例6
(E)-2-((5-(3-(3-溴苯基)烯丙基)-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(3,4-二甲氧基苯乙基)乙酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
淡黄色固体，产率48％，IC50值为2.24±0.24μM，熔点为265.8-267.2℃。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.53–7.48(m,1H),7.42(dt,J＝7.3,2.0Hz,1H),6.94(t,J＝7.5Hz,1H),6.87(dq,J＝7.9,1.9Hz,1H),6.83–6.75(m,2H),6.65(ddt,J＝7.6,2.1,1.1Hz,1H),6.47(s,1H),6.42(dt,J＝15.1,1.0Hz,1H),6.23(dt,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.06(s,1H),3.89(d,J＝10.1Hz,6H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝7.7Hz,2H),2.68–2.59(m,4H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,159.49,148.98,147.79,139.49,131.92,130.89,129.73,129.24,129.04,127.31,126.03,122.45,120.71,112.04,111.83,88.20,56.03,55.95,40.53,39.04,34.26,30.03.
实施例7
(E)-2-((5-(3-(4-羟基苯基)烯丙基)-6-羟基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-基)硫代)-N-(3,4-二甲氧基苯乙基)乙酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
淡黄色固体，产率43％，IC50值为1.74±0.54μM，熔点为320.4-322.4℃。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.24–7.17(m,2H),6.80(d,J＝7.5Hz,1H),6.77(dt,J＝2.1,1.0Hz,1H),6.75–6.68(m,2H),6.65(ddt,J＝7.5,2.0,1.1Hz,1H),6.47–6.36(m,1H),6.15(dt,J＝15.2,6.2Hz,1H),5.85(s,1H),5.12(s,1H),3.89(d,J＝10.1Hz,6H),3.76(s,2H),3.33(t,J＝5.4Hz,2H),2.67–2.61(m,4H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.17,165.45,162.83,159.87,159.49,148.98,147.79,131.92,129.78,128.80,127.52,126.97,120.71,116.05,112.04,111.83,88.20,56.03,55.95,40.53,39.04,34.26,30.03.
本发明抑制剂结构新颖，实验表明具有良好的神经氨酸酶抑制活性，可用于制备抑制神经氨酸酶活性的药物。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种嘧啶类神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，该抑制剂具有式(I)所示的化学结构式：
其中，R1选自如下结构式中的任意一种：
X＝F、Cl、Br或I、/>
R2选自如下结构式中的任意一种：
X＝F、Cl、Br或I。
2.根据权利要求1所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，R1选自如下结构式中的任意一种：
R2选自如下结构式中的任意一种：
3.根据权利要求1所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂具有如下化学结构式中的一种：
4.一种如权利要求1～3任一项所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将取代的苯甲醛、乙醛和有机溶剂形成反应体系，反应后经后处理得到式(II)中间体；
(2)取步骤(1)得到的式(II)中间体溶于有机溶剂中和锌粉形成反应体系，反应后得到式(III)中间体；
(3)取步骤(2)得到的式(III)中间体溶于有机溶剂中加入三溴化磷形成反应体系，反应后经后处理得到式(IV)所示的中间体；
(4)将取代的苯乙胺、氯乙酰氯、三乙胺在有机溶剂中形成反应体系，反应后经后处理得到式(V)中间体；
(5)取步骤(4)得到的式(V)中间体在碱性条件下与4,6-二羟基-2-巯基嘧啶反应后经后处理得到式(VI)所示的中间体；
(6)取步骤(5)得到的式(VI)中间体在弱碱性条件下与步骤(3)得到的式(IV)中间体形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂；
所述制备方法的方程式如下所示：
5.根据权利要求4所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应的温度为25-60℃，反应的时间为8-16h，采用无水K2CO3作为催化剂，所述有机溶剂采用吡啶；
所述取代的苯甲醛、乙醛、无水K2CO3和有机溶剂的添加量比为(20-30)mmoL:(40-100)mmoL:(30-45)mmoL:(20-60)mL。
6.根据权利要求5所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，后处理的过程具体为：在反应体系中加入蒸馏水，用浓盐酸调节pH，再向反应液中加入乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(II)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(II)中间体。
7.根据权利要求4所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应的温度为0-40℃，反应的时间为9.5-24h，采用锌粉和氯化铵体系进行还原，所述有机溶剂采用甲醇；
所述式(II)中间体、锌粉、氯化铵和有机溶剂的添加量比为(10-30)mmoL:(10-30)mmoL：(10-100)mmoL：(20-40)mL；
步骤(3)中，反应的温度为0-30℃，反应的时间为9-17.5h，所述有机溶剂采用***、乙腈、甲苯、四氢呋喃或二氯甲烷；
所述式(III)中间体、三溴化磷和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(1-5)mmoL：(10-20)mL。
8.根据权利要求4所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，反应的温度为0-35℃，反应的时间为0.5-2h，有机溶剂采用丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃或二氯甲烷；
所述取代的苯乙胺、氯乙酰氯、三乙胺和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(20-50)mL。
9.根据权利要求4所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，反应的温度为25-65℃，反应的时间为8-12h，碱采用氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、甲醇钠或叔丁醇钾，溶剂采用乙酸乙酯、甲醇、乙醇或蒸馏水；
所述式(V)中间体、4,6-二羟基-2-巯基嘧啶、碱和溶剂的添加量比为(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(5-10)mmoL：(10-50)mL；
步骤(6)中，反应的温度为25-65℃，反应的时间为10-20h，碱采用三乙胺、二乙胺、碳酸氢钠、碳酸铯、碳酸钾或碳酸钠，溶剂采用乙酸乙酯、甲醇、乙醇或DMF；
所述式(VI)中间体、式(IV)中间体、碱和有机溶剂的添加量比为(5-5.5)mmoL：(5-5.5)mmoL：(7.5-15)mmoL：(10-30)mL。
10.一种如权利要求1～3任一项所述的嘧啶类神经氨酸酶抑制剂的应用，其特征在于，将所述的抑制剂用于制备能够抑制神经氨酸酶活性的药物。
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