CN115228262A - 实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其包括如下步骤：S1、空间净化：根据实验室密闭空间的大小均匀设置不同数量的空气抽吸点，在空气抽吸点将实验室密闭空间内的空气抽吸至核酸清除剂内，控制空气在核酸清除剂内至少滞留3s，使空气与核酸清除剂接触混合之后再排出至实验室内；S2、空间净化效果验证；S3、表面净化；S4、表面净化效果验证；S5、立体净化效果验证。通过本发明方法可达到实验室密闭空间内核酸污染的立体净化效果，以避免实验室由于核酸污染而导致检测假阳性或实验失败的情况发生。

Description

实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法
技术领域
本发明属于涉及一种核酸的清除方法，具体涉及一种实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法。
背景技术
核酸污染在密闭空间中主要存在两种形成方式，一是核酸会与空气中气溶胶结合而形成核酸气溶胶，即核酸在空气中的污染通常是以核酸气溶胶的形式存在；二是核酸直接附着于密闭空间内的作业面，如实验操作台、地面、仪器设备表面等，即核酸会直接污染作业面。
气溶胶是悬浮于气体介质中粒径一般为1nm～1mm的固体、液体微小粒子形成的胶体分散体系。核酸气溶胶与核酸扩增过程相伴相生，空气与液体面摩擦、离心机离心、剧烈地摇动反应管、PCR开盖、移液器的反复吸样、污染物的外泄等过程，都会产生核酸气溶胶污染。核酸气溶胶一旦形成，不仅会长时间悬浮于气体介质中，而且会伴随空气的循环而部分沉降于实验室桌面、仪器、耗材、地面等固相表面上。因此，在密闭空间内，核酸的污染是动态变化的，通过常规净化手段难以确保密闭空间内的核酸被清除净化彻底。
分子实验室作为科研和临床检验场所，PCR使用频率较高，且样本和扩增目标经常出现多批次重复处理的情况，核酸污染在实验区域内不断累积，污染风险不断增加。随着PCR等技术扩增效率灵敏度的不断提高，产生的核酸污染会导致检测结果假阳性的发生频率也越来越高。假阳性意味着实验结果的不可信，并且直接造成实验室经济损失。更严重的是，一旦形成核酸污染，则可引起整个PCR实验室的污染，且短时间内难以彻底清除，必要时甚至需要关闭实验室停用一段时间。
发明内容
由于核酸会直接附着于作业面而导致作业面的核酸污染，同时核酸会以核酸气溶胶的形式污染空气，另外，核酸气溶胶又会自然沉降至作业面，而作业面的核酸气溶胶或核酸污染也会扩散至空气中形成核酸气溶胶污染，因此在密闭空间内的核酸污染始终是一个动态的复杂过程；目前，实验室密闭空间的消杀通常针对于细菌、病毒等有较好的效果，而对于核酸污染则没有***的方法能确保密闭空间内的核酸被彻底净化；针对上述问题，本发明提供了一种实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其可确保实验室密闭空间内核酸污染的立体净化效果，以避免实验室由于核酸污染而导致检测假阳性或实验失败的情况发生。
本发明通过下述技术方案实现。
实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、空间净化：根据实验室密闭空间的大小均匀设置不同数量的空气抽吸点，在空气抽吸点将实验室密闭空间内的空气抽吸至核酸清除剂内，控制空气在核酸清除剂内至少滞留3s，使空气与核酸清除剂接触混合之后再排出至实验室内；
该步骤中，通过将实验室密闭空间内不同空气抽吸点的空气抽吸至核酸清除剂内，使携带有核酸气溶胶污染的的空气与核酸清除剂充分接触、混合和反应，进而使核酸降解，从而可排出净化空气，以达到对实验室密闭空间净化的作用；
S2、空间净化效果验证：在步骤S1空间净化完成后，分别检测密闭空间内每个空气抽吸点空气中的残留核酸含量，若检测结果均为阴性，则进入步骤S3，若有阳性结果检出，则重复循环步骤S1和步骤S2，直至步骤S2所有空气抽吸点的检测结果均为阴性；
由于空气中的核酸气溶胶长时间悬浮在空气中后，可能重量和粒径不断增大，最终会有部分核酸气溶胶持续、缓慢沉降至作业面上，从而使作业面污染；而对于核酸气溶胶的沉降污染，似乎无法进行控制，而只有通过步骤S1空间净化，将空气中核酸气溶胶污染净化彻底后，才能避免后续空间至作业面的核酸气溶胶沉降污染；否则，若空间净化不彻底，那么步骤S3表面净化彻底后，空间中的核酸气溶胶仍然会沉降污染表面；因此，在步骤S1空间净化完成后，需要检测密闭空间内每个空气抽吸点空气中的残留核酸含量，以确保步骤S1空间净化的效果；
S3、表面净化：将核酸清除剂以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使核酸清除剂均匀润湿作业面，待核酸清除剂在作业面上自然晾干即可；
在实验操作过程中，核酸有可能直接沾染作业面，或者是悬浮在空气中的核酸气溶胶沉降污染作业面，这样均会导致实验室密闭空间内的作业面被核酸气溶胶所污染；通过将核酸清除剂以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，可在降低核酸清除剂使用量的情况下，使核酸清除剂有效的与作业面接触，从而使作业面上沉降的核酸气溶胶被降解；
S4、表面净化效果验证：在步骤S3表面净化处理之后，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若检测结果均为阴性，则进入步骤S5，若有阳性结果检出，则重复循环步骤S3和步骤S4，直至步骤S4检测结果均为阴性；
在表面净化完毕后，需要立即采样验证步骤S3表面净化是否彻底；若步骤S3表面净化不彻底，即有可能某些作业面的核酸污染仍然存在，而在后续的检测或实验操作过程中，随着人员的活动以及不可避免的对作业面进行触碰，如此仍然会有一定风险使作业面上残留的核酸污染随空气的流动而重新悬浮于空气中，从而不能实现实验室密闭空间的立体净化，因此需要通过步骤S4以验证表面净化是否彻底；
S5、立体净化效果验证：在步骤S4表面净化效果验证中检测结果均为阴性之后2～4h，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为20～30，且该20～30个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若所有检测结果均为阴性，则表示密闭空间内核酸污染的立体净化完成；若有阳性结果检出，则重复步骤S1至步骤S5，直至步骤S5的检测结果均为阴性。
由于上述步骤S1至步骤S4是依次完成的，然而空气中残留的核酸气溶胶必然会沉降污染作业面，而作业面上所残留的核酸气溶胶或核酸污染又有一定风险会随人员活动或与作业面的触碰而污染空气，那么可能存在下述情况：在步骤S3表面净化时，由于人员需要进行必要的操作及触碰作业面，作业面上的核酸污染在表面净化过程中会伴随空气的流动而重新悬浮于空气中，且短时间内难以全部沉降至作业面，这样后续步骤S4表面净化效果验证的结果均为阴性，亦即是说虽然步骤S2空间净化效果验证结果和步骤S4表面净化效果验证的验证结果均为阴性，也仍然不能保证实验室密闭空间内核酸污染的立体净化彻底，即有可能存在假阴性净化结果的情况；对此，申请人通过在步骤S3表面净化最后一次循环处理2～4h之后，取样检测不同抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，若步骤S4表面净化时再次污染空气，则在步骤S4检测结果均为阴性之后2～4h后对工作面取样，由于核酸气溶胶的沉降污染，步骤S5中必然会有阳性结果检出；若步骤S5中的检测结果均为阴性，则表明实验室密闭空间内核酸污染已立体净化彻底；
另外，对步骤S5立体净化效果验证的条件和时机，申请人有以下考虑：若步骤S4表面净化效果验证中有阳性结果检出，则表明实验室密闭空间内的表面净化不彻底，即某些作业面的核酸污染仍然存在，那么为了省去不必要的实验环节和节约净化时间，则没必要进行步骤S5；而仅当步骤S4表面净化效果验证中检测结果均为阴性时，则需要通过步骤S5验证是否存在前述假阴性净化结果的情况。而对于检测时机，为了判断空气中是否存在核酸气溶胶污染，本发明在步骤S2中是采用核酸气溶胶自然沉降法采样，即将空白培养皿置于待检测的空间内一段时间，利用核酸气溶胶自然沉降至培养皿内从而收集到核酸气溶胶进而进行检测，本发明在实施例中探讨了沉降时间(培养皿放置时间)的优选范围，结果显示沉降时间为15～20min即可保证空气中核酸气溶胶污染可检出；然而，由于步骤S5的验证目的是判断是否存在假阴性净化结果，那么对于假阴性净化结果，由于其是“作业面上的核酸污染在表面净化过程中会伴随空气的流动而重新悬浮于空气中，且短时间内难以全部沉降至作业面”导致，那么可能空气中核酸气溶胶的污染量较小，因此若同样采用自然沉降收集核酸气溶胶进行检测，则应当增加沉降时间，使扩散至空气中的核酸气溶胶有足够的沉降时间以沉降至作业面。对此，申请人综合考虑以上因素，选择在步骤S4检测结果均为阴性之后2～4h对作业面进行采样，即此时，若空气中存在核酸气溶胶污染，则核酸气溶胶已沉降2～4h(远大于15～20min)，从而有利于从作业面上采集到有效的核酸污染；并且，申请人在步骤S5中也增加了采样点的数量，控制每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为20～30，以保证可检出假阴性净化结果下空气中的核酸污染。
优先的，所述步骤S1中，核酸清除剂为全能核酸酶溶液(UNC酶溶液)或次氯酸溶液；所述步骤S3中，核酸清除剂为全能核酸酶溶液(UNC酶溶液)或次氯酸溶液。
优选的，所述步骤S2中，每个空气抽吸点的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同空间位置。
优选的，所述步骤S2中，采样点的采样方式如下：通过在采样点放置空白培养皿，使空气中的核酸气溶胶自然沉降15～20min至空白培养皿内，进而通过培养皿中是否有核酸污染检出表征空气中是否存在核酸污染。
优选的，所述步骤S2中，每个空气抽吸点的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的空间位置。
优先的，所述步骤S1中，所述空气抽吸点采用相同的空气抽吸速率对实验室密闭空间内的空气进行同步抽吸，从而可使空间内的空气能均匀、有效的被抽吸并与核酸清除剂接触混合，以提高空间净化的效率。
优先的，所述步骤S1中，实验室密闭空间内每40～100m3设置一个空气抽吸点。
优先的，所述步骤S1中，控制空气的总抽吸量为实验室密闭空间的2～5倍。
优先的，所述步骤S1中，核酸清除剂的使用体积与实验室密闭空间的体积比为1～5:100L/m3。
优先的，所述步骤S2中，作业面为实验室密闭空间内进行实验操作所使用的设施、设备、器皿的外表面以及操作人员的服装外表面。
优先的，所述步骤S4和步骤S5中，采用棉签擦拭标准取样法对作业面的高污染区进行取样，以检测作业面所残留的核酸含量。
优先的，所述步骤S2中，作业面的高污染区的取样面积为3～8cm×3～8cm；作业面的高污染区包括实验操作台面，仪器设备，试管架，移液器手机壳，冰箱，超净工作台，门把手，凳子，地面和照明开关的外表面。
优先的，所述核酸含量采用荧光定量PCR检测。
本发明有益效果如下：
1)本发明中通过空间净化可对实验室密闭空间内空气中的核酸污染进行有效净化，而通过表面净化可对实验室内工作面的核酸污染进行有效净化，从而实现了实验室内空间与表面的立体净化。
2)由于空气中的核酸气溶胶发生沉降污染不可避免，因此空气中的核酸气溶胶再次污染工作面的风险较高；而表面扩散污染仅有一定概率发生，其扩散污染空气的风险较低。因此，针对核酸气溶胶即有高风险的空中沉降污染，又存在低风险的表面扩散污染的特点，本发明先通过空间净化，以消除高风险的核酸气溶胶沉降污染，并进行效果验证，之后再进行表面净化，以消除低风险的核酸扩散污染，同时进行效果验证，通过上述净化和验证步骤的科学控制，循序渐进，最后再通过立体净化效果验证，可确保实验室密闭空间内核酸污染的立体净化彻底，以避免实验室由于核酸污染而导致检测假阳性或实验失败的情况发生。
附图说明
图1为本发明方法的流程图。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，请参阅图1，包括如下步骤：
S1、空间净化
根据实验室密闭空间的大小均匀设置不同数量的空气抽吸点，在空气抽吸点将实验室密闭空间内的空气抽吸至核酸清除剂内，控制空气在核酸清除剂内至少滞留3s，使空气与核酸清除剂接触混合之后再排出至实验室内；
S2、空间净化效果验证
在步骤S1空间净化完成后，分别检测密闭空间内每个空气抽吸点空气中的残留核酸含量，若检测结果均为阴性，则进入步骤S3，若有阳性结果检出，则重复循环步骤S1和步骤S2，直至步骤S2所有空气抽吸点的检测结果均为阴性；
S3、表面净化
将核酸清除剂以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使核酸清除剂均匀润湿作业面，待核酸清除剂在作业面上自然晾干即可；
S4、表面净化效果验证
在步骤S3表面净化处理之后，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若检测结果均为阴性，则进入步骤S5，若有阳性结果检出，则重复循环步骤S3和步骤S4，直至步骤S4检测结果均为阴性；
S5、立体净化效果验证
在步骤S4中检测结果均为阴性之后2～4h，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为20～30，且该20～30个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若所有检测结果均为阴性，则表示密闭空间内核酸污染的立体净化完成；若有阳性结果检出，则重复步骤S1至步骤S5，直至步骤S5的检测结果均为阴性。
实施例2
实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，请参阅图1，包括如下步骤：
S1、空间净化
根据实验室密闭空间的大小均匀设置不同数量的空气抽吸点，在空气抽吸点将实验室密闭空间内的空气抽吸至核酸清除剂内，控制空气在核酸清除剂内至少滞留3s，使空气与核酸清除剂接触混合之后再排出至实验室内；其中，根据实验室密闭空间的大小均匀设置不同数量的空气抽吸点，即实验室密闭空间内每40～100m3设置一个空气抽吸点，在不同的所述空气抽吸点采用相同的空气抽吸速率对实验室密闭空间内的空气进行同步抽吸，控制空气的总抽吸量为实验室密闭空间的2～5倍，核酸清除剂的使用体积与实验室密闭空间的体积比为1～5:100L/m3；核酸清除剂为UNC酶溶液或次氯酸溶液；使用UNC酶溶液作为核酸清除剂时，UNC酶浓度优先为3～4ug/mL；使用次氯酸溶液作为核酸清除剂时，次氯酸溶液的推荐使用浓度为400～600ppm；
S2、空间净化效果验证
在步骤S1空间净化完成后，采用荧光定量PCR分别检测密闭空间内每个空气抽吸点空气中的残留核酸含量，若检测结果均为阴性，则进入步骤S3，若有阳性结果检出，则重复循环步骤S1和步骤S2，直至步骤S2的检测结果均为阴性；其中，每个空气抽吸点的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同空间位置；通过在采样点放置空白培养皿，使空气中的核酸气溶胶自然沉降15～20min至空白培养皿内，进而通过培养皿中核酸含量表征空气中是否存在核酸污染；
S3、表面净化
若使用UNC酶溶液作为核酸清除剂，UNC酶浓度优先为3～4ug/mL，则将UNC酶溶液以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使UNC酶溶液均匀润湿作业面，并在作业面上形成一层水膜，待UNC酶溶液在作业面上自然晾干即可；
若使用次氯酸溶液作为核酸清除剂，次氯酸溶液的推荐使用浓度为400～600ppm，则将次氯酸溶液以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使次氯酸溶液均匀润湿作业面，待次氯酸溶液在作业面上自然晾干后，需用纯水擦拭作业面，以及时擦去次氯酸溶液残留物，从而防止次氯酸溶液长时间残留腐蚀和污染作业面；
其中，作业面为实验室密闭空间内进行实验操作所使用的设施、设备、器皿的外表面以及操作人员的服装外表面；
S4、表面净化效果验证
在步骤S3表面净化处理之后，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若检测结果均为阴性，则进入步骤S5，若有阳性结果检出，则重复循环步骤S3和步骤S4，直至步骤S4检测结果均为阴性；其中，采用棉签擦拭标准取样法对每个空气抽吸点附近作业面的高污染区进行取样，以检测作业面所残留的核酸含量，作业面的高污染区的取样面积为3～8cm×3～8cm，作业面的高污染区包括实验操作台面，仪器设备，试管架，移液器，手机壳，冰箱，超净工作台，门把手，凳子，地面和照明开关的外表面；
S5、立体净化效果验证
在步骤S4中检测结果均为阴性之后2～4h，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为20～30，且该20～30个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若所有检测结果均为阴性，则表示密闭空间内核酸污染的立体净化完成；若有阳性结果检出，则重复步骤S1至步骤S5，直至步骤S5的检测结果均为阴性；其中，采用棉签擦拭标准取样法对每个空气抽吸点附近作业面的高污染区进行取样，以检测作业面所残留的核酸含量，作业面的高污染区的取样面积为3～8cm×3～8cm，作业面的高污染区包括实验操作台面，仪器设备，试管架，移液器，手机壳，冰箱，超净工作台，门把手，凳子，地面和照明开关的外表面。
实施例3
不同沉降时间对核酸气溶胶自然沉降法采样的检测结果的影响。
1、核酸气溶胶自然沉降法原理：利用空气中核酸气溶胶持续自然沉降的特性，通过置于空气中一段时间(沉降时间)的空白培养皿收集从空气沉降至培养皿的核酸，进而通过培养皿中是否有核酸检出来表征空气中是否存在核酸气溶胶污染，若空白培养皿中有核酸检出，则表明空气中存在核酸污染，反之则表明空气中不存在核酸污染。
2、检测方法：用CN61气溶胶发生器将配制的Ct值为20.6的300mL的PCR片段试验液在空间大小均为79m3左右的密闭实验室进行喷雾处理，之后在密闭实验室内随机同时放置9个空白培养皿(培养皿规格为150mm，培养皿经过严格消毒无核酸污染)，依次放置15min、20min、30min后分别从9个培养皿中取出任意3个培养皿立即用棉签采集样品并于1mL无菌水中洗脱，取洗脱液进行荧光定量PCR检测，以探讨不同沉降时间下培养皿中所检测出的核酸含量的变化，结果如表1所示；本发明中，CN61气溶胶发生器的厂家为美国Collison公司；实时荧光定量PCR仪的型号为全自动医用PCR分析***SLAN-96S；
表1空气中核酸残留的检测结果
Figure BDA0003808911190000091
由表1可知，将核酸污染源喷到密闭空间后待其自然沉降，利用培养皿收集沉降的核酸，不同沉降时间下的检测结果表明，沉降时间越长，Ct值越小，则检测到的核酸含量越高。其中，沉降15min与沉降20min相比，虽然Ct值降低，但是降低幅度不大，而沉降20min与沉降30min的结果无显著性差异，但沉降15min～30min均能在培养皿中检出核酸，因此为了节约检测时间，同时保证空气中的核酸污染可检出，可选择15min～20min作为沉降时长来检测空气中的核酸污染。
实施例4
本发明方法中空间净化的效果验证。
一、核酸污染空间的模型建立
选取两间空间大小均为79m3左右的密闭实验室作为处理对象，将配制的Ct值约为20的两瓶300mL的PCR片段试验液用CN61气溶胶发生器以喷雾的形式分别同时喷雾至两间实验室的密闭空间内和设备设施表面，两间实验室其中一间作为对比组，另外一间作为实验组；
二、核酸的空间净化
实验组采用本发明方法中步骤S1进行空间净化，而对比组不采取任何措施；具体的，空间净化的方法为：
先将3L核酸清除剂(核酸清除剂为UNC酶溶液，UNC酶溶液中UNC酶浓度为3.4ug/mL，使用25mm Tris-HCl(pH＝8.2)，10mm NaCl，2mm MgCl2浓度的缓冲液进行配置)置于容器内，所选容器应口窄底深，以保证抽吸的空气与核酸清除剂有充足的接触时间；由于实验组的实验室密闭空间的体积为79m3左右，因此仅设置一个空气抽吸点即可，该空气抽吸点应尽量位于实验组实验室密闭空间的中部位置；之后在该空气抽吸点利用泵体将空气泵入容器的底部，使泵入的空气在核酸清除剂内至少滞留3s，之后自动排出；为了尽可能保证实验组实验室密闭空间内的污染空气均能被泵入容器内，应控制空气的总抽吸量为实验室密闭空间的3倍，在泵体的抽气效率和实验组实验室密闭空间的体积确定的情况下，只需要合理的控制抽气时间即可，本实施例设置的空间净化时间为60min。
三、结果测定
在实验组空间净化完成后，采用荧光定量PCR检测实验组空气抽吸点空气中的残留核酸含量，与此同时采用荧光定量PCR检测对比组空气中的残留核酸含量，具体过程如下：
对于实验组，在实验组的空间净化完成后，立即在抽吸点附近的实验操作台上、地面上一共随机放置10个空白培养皿(培养皿规格为150mm，培养皿经过严格消毒无核酸污染)，使采样点分布在空气抽吸点不同的空间位置，待培养皿静置20min后，取出培养皿用棉签采集样品并于1mL无菌水中洗脱，取洗脱液进行荧光定量PCR检测，结果如表2所示；
对于对比组，采用与上述实验组同样的采样方法、采样时间和检测方式，结果如表2所示；
表2空间净化的效果检测
Figure BDA0003808911190000111
由表2可知，实验组在经过空间净化后，空白培养皿中均无法检测出PCR片段，由此可见通过本发明中通过空间净化可彻底对实验组实验室密闭空间内空气中核酸污染进行净化。通常，在一般情况下，本发明通过步骤S1空间净化可对实验室密闭空间内空气中核酸污染进行有效净化，但是需要在设定的参数条件下由实验人员通过规范操作来完成，那么不可避免的会存在人为原因或意外的客观因素导致空间净化不彻底的情况发生，因此在进行步骤S1空间净化后需要进行步骤S2空间净化效果验证，以判断空气中的核酸是否净化彻底。
实施例5
本发明方法中表面净化的效果验证。
一、核酸污染表面的模型建立
在实验室内的不同工作面上，包括地面、冰箱、门把手、ep管架、实验操作台的外表面，在上述不同工作面上选取5cm×5cm的面积喷100uL的PCR片段试验液(Ct值约为20)，待其自然晾干，之后用无菌棉签擦拭整个表面取样于1mL无菌水中洗脱，洗脱液进行荧光PCR检测，测定净化前表面的核酸污染情况，结果见表2；
二、核酸的表面净化
采用次氯酸溶液作为核酸清除剂，次氯酸溶液的使用浓度为500ppm，按本发明步骤S3的方法，即将0.4mL次氯酸溶液以喷雾的形式喷雾至上述不同作业面的5cm×5cm的面积区域，使次氯酸溶液均匀润湿作业面，待次氯酸溶液在作业面上自然晾干即可(控制喷雾后的晾干时间均为30min)，之后用无菌棉签擦拭整个表面取样于1mL无菌水中洗脱，洗脱液进行荧光PCR检测，测定净化后表面的核酸污染情况，结果见表3；
三、结果测定
表3表面净化的效果检测
取样点 净化前Ct值 净化后Ct值
地面 29.07 NoCt
冰箱 28.10 NoCt
门把手 30.22 NoCt
ep管架 31.18 NoCt
凳子 31.59 NoCt
实验操作台 28.53 NoCt
由表3结果可知，通过采用本发明方法进行表面净化后，工作面的抽样检测结果均为阴性，表明此方法对固体表面的核酸污染具较好的清除效果。但是，本发明步骤S3表面净化需要在设定的参数条件下由实验人员通过规范操作来完成，那么不可避免的会存在人为原因或意外的客观因素导致空间净化不彻底的情况发生，如作业面喷雾不均匀，亦或是某些作业面并未进行喷雾，因此在进行步骤S3表面净化后需要进行步骤S4表面净化效果验证，以判断作业面的核酸污染是否净化彻底。
实施例6
选取空间大小为79m3左右的实验室作为处理对象，将配制的Ct值约为20的300mL的PCR片段试验液用CN61气溶胶发生器以喷雾的形式喷雾至实验室的密闭空间内和作业面上，从而使实验室形成核酸污染，之后采用本发明方法对实验组的实验室进行立体净化，请参阅图1，具体过程如下：
S1、空间净化
核酸清除剂为UNC酶溶液，UNC酶溶液中UNC酶浓度为3.4ug/mL，使用25mm Tris-HCl(pH＝8.2)，10mm NaCl，2mm MgCl2浓度的缓冲液进行配置；先将3L核酸清除剂置于容器内，所选容器应为口窄底深，以保证抽吸的空气与核酸清除剂有充足的接触时间；由于实验组的实验室密闭空间的体积为79m3左右，因此仅设置一个空气抽吸点即可，该空气抽吸点应尽量位于实验组实验室密闭空间的中部位置；之后在该空气抽吸点利用泵体将空气泵入容器的底部，使泵入的空气在核酸清除剂内至少滞留3s，之后自动排出；在空气泵入至排出过程中，空气中携带的核酸气溶胶会与核酸清除剂接触、混合和反应，进而使其中的核酸被降解，最终可排出净化空气，以达到对实验组实验室密闭空间净化的作用；为了尽可能保证实验组实验室密闭空间内的污染空气均能被泵入容器内，应控制空气的总抽吸量为实验室密闭空间的2～5倍，在泵体的抽气效率和实验组实验室密闭空间的体积确定的情况下，只需要合理的控制抽气时间即可，本实施例设置空间净化时间为60min。
S2、空间净化效果验证
在步骤S1空间净化完成后，采用荧光定量PCR检测该空气抽吸点空气中的残留核酸含量，具体过程如下：
在步骤S1空间净化完成后，立即在抽吸点附近的实验操作台、地面、凳子上一共放置10个空白培养皿(培养皿规格为150mm，培养皿经过严格消毒无核酸污染，10个空白培养皿中桌子上放置4个，编号为1～4；地面放置4个，编号为5～8；凳子上放置2个，编号为9～10)，使采样点分布在空气抽吸点附近不同空间位置，待培养皿静置20min后，取出培养皿用棉签采集样于1mL无菌水中洗脱，取洗脱液进行荧光定量PCR检测，结果如表4所示；
表4空间净化后实验室内空气中核酸残留的检测结果
Figure BDA0003808911190000131
由表4可知，经过步骤S1空间净化后，在沉降20min的空白培养皿中均无法检测出PCR片段，由此可见通过步骤S1已经彻底完成了实验组实验室密闭空间内空气中核酸污染的净化，可进入步骤S3。
S3、表面净化
核酸清除剂为UNC酶溶液，UNC酶溶液中UNC酶浓度为3.4ug/mL，使用25mm Tris-HCl(pH＝8.2)，10mm NaCl，2mm MgCl2浓度的缓冲液进行配置；将核酸清除剂以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使核酸清除剂均匀润湿作业面，并在作业面上形成一层水膜，待核酸清除剂在作业面上自然晾干即可；其中，作业面为实验室密闭空间内进行实验操作所使用的设施、设备、器皿的外表面以及操作人员的服装外表面；
S4、表面净化效果验证
在步骤S3表面净化处理之后，立即采用荧光定量PCR取样检测该空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中该空气抽吸点附近作业面的采样点数量为10个，且该10个采样点分布在该空气抽吸点附近的下述6个作业面上：地面(3个采样点)、冰箱(2个采样点)、门把手(1个采样点)、ep管架(1个采样点)、凳子(1个采样点)和实验操作台(2个采样点)；对于上述采样点，采样时采用棉签擦拭标准取样法，即用无菌棉签擦拭面积为5cm×5cm的表面于1mL无菌水中洗脱，将洗脱液进行荧光PCR检测，检测结果如下：
表5表面净化后实验室内作业面上核酸残留的检测结果
序号 取样点 实验组，Ct值
1 地面1 NoCt
2 地面2 NoCt
3 地面3 NoCt
4 冰箱1 NoCt
5 冰箱2 NoCt
6 门把手 NoCt
7 ep管架 NoCt
8 凳子 NoCt
9 实验操作台1 NoCt
10 实验操作台2 NoCt
由表5可知，6个不同作业面的10个采样点的检测结果均为阴性，则进入步骤S5进行立体净化效果验证；
S5、立体净化效果验证
在步骤S4检测结果均为阴性之后2h，立即取样采用荧光定量PCR检测该空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中该空气抽吸点附近作业面的采样点数量为20个，且该20个采样点分布在该空气抽吸点附近的下述6个作业面上：地面(8个采样点)、冰箱(2个采样点)、门把手(1个采样点)、ep管架(1个采样点)、凳子(2个采样点)和实验操作台(6个采样点)；对于上述采样点，采样时采用棉签擦拭标准取样法，即用无菌棉签擦拭面积为5cm×5cm作业面的表面于1mL无菌水中洗脱，将洗脱液进行荧光PCR检测，检测结果如下：
表6立体净化效果验证的检测结果
Figure BDA0003808911190000141
Figure BDA0003808911190000151
由表6可知，6个不同作业面，共20个采样点的检测结果均为阴性，则说明不存在假阴性净化结果，实验室密闭空间内的核酸污染已经净化彻底。
实施例7
选取空间大小为150m3左右、长方形户型的实验室作为处理对象，将配制的Ct值约为20的800mL的PCR片段试验液用CN61气溶胶发生器以喷雾的形式喷雾至实验室的密闭空间内和作业面上，从而使实验室形成核酸污染，之后采用本发明方法对实验组的实验室进行立体净化，请参阅图1，具体过程如下：
S1、空间净化
核酸清除剂为UNC酶溶液，UNC酶溶液中UNC酶浓度为3.4ug/mL，使用25mm Tris-HCl(pH＝8.2)，10mm NaCl，2mm MgCl2浓度的缓冲液进行配置；将8L核酸清除剂均分成两份，分别置于两个独立的容器内，所选容器应为口窄底深，以保证抽吸的空气与核酸清除剂有充足的接触时间；由于实验组的实验室密闭空间的体积为150m3左右，因此仅设置两个空气抽吸点即1号空气抽吸点和2号空气抽吸点，该两个空气抽吸点分别位于实验组实验室密闭空间左右两边的中部位置；之后在该两个空气抽吸点分别利用两个泵体将空气泵入装有4L核酸清除剂容器的底部，使泵入的空气在核酸清除剂内至少滞留3s，之后自动排出；在空气泵入至排出过程中，空气中携带的核酸气溶胶会与核酸清除剂接触、混合和反应，进而使其中的核酸被降解，最终可排出净化空气，以达到对实验组实验室密闭空间净化的作用；为了尽可能保证实验组实验室密闭空间内的污染空气均能被泵入容器内，应控制空气的总抽吸量为实验室密闭空间的2～5倍，在泵体的抽气效率和实验组实验室密闭空间的体积确定的情况下，只需要合理的控制抽气时间即可，本实施例设置空间净化时间为60min。
S2、空间净化效果验证
在步骤S1空间净化完成后，采用荧光定量PCR检测该空气抽吸点空气中的残留核酸含量，具体过程如下：
在步骤S1空间净化完成后，立即在1号空气抽吸点和2号空气抽吸点附近的实验操作台、地面、凳子上各放置10个空白培养皿(培养皿规格为150mm，培养皿经过严格消毒无核酸污染)，使采样点分布在空气抽吸点附近不同空间位置；其中，1号空气抽吸点的10个空白培养皿中桌子上放置4个，编号为1～4；地面放置4个，编号为5～8；凳子上放置2个，编号为9～10；同样2号空气抽吸点的10个空白培养皿中桌子上放置4个，编号为11～14；地面放置4个，编号为15～18；凳子上放置2个，编号为19～20；上述空白培养皿静置20min后，取出培养皿；之后对上述取出的空白培养皿用棉签采集样于1mL无菌水中洗脱，取洗脱液进行荧光定量PCR检测，结果如表7所示；
表7空间净化后实验室内空气中核酸残留的检测结果
Figure BDA0003808911190000161
由表7可知，经过空间净化60min、120min后，在空气抽吸点2检出了PCR片段，即有阳性检出，由此可见步骤S1并未实现该实验室密闭空间内空气中核酸的彻底净化，因此需要再次重复步骤S1进行空间净化。重复净化后的空间净化效果验证方法，此处不再赘述，仅列出验证结果，具体如下表：
表8空间净化后实验室内空气中核酸残留的检测结果
Figure BDA0003808911190000171
由表8可知，经过重复步骤S1后，即进行第二次空间净化后，空白培养皿中均无法检测出PCR片段，因此已经彻底完成了实验组实验室密闭空间内空气中核酸污染的净化，可进入步骤S3。
S3、表面净化
使用次氯酸溶液作为核酸清除剂，次氯酸溶液的推荐使用浓度为500ppm，将次氯酸溶液以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使次氯酸溶液均匀润湿作业面，待次氯酸溶液在作业面上自然晾干后，需用纯水擦拭作业面，以及时擦去次氯酸溶液残留物，从而防止次氯酸溶液长时间残留腐蚀和污染作业面；
S4、表面净化效果验证
在步骤S3表面净化处理之后，立即采用荧光定量PCR取样检测1号空气抽吸点和2号空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量；其中，1号空气抽吸点和2号空气抽吸点附近作业面的采样点数量均为10个，且该10个采样点分布在各空气抽吸点附近的下述3个作业面上：地面(5个采样点)、凳子(2个采样点)和实验操作台(3个采样点)；对于上述采样点，采样时采用棉签擦拭标准取样法，即用无菌棉签擦拭面积为5cm×5cm的表面于1mL无菌水中洗脱，将洗脱液进行荧光PCR检测，检测结果如下：
表9表面净化后实验室内作业面上核酸残留的检测结果
Figure BDA0003808911190000172
Figure BDA0003808911190000181
由表9可知，在两个空气抽吸点附近，6个不同作业面的20个采样点的检测结果均为阴性，这表面步骤S3的表面净化彻底，则可进入步骤S5进行立体净化效果验证；
S5、立体净化效果验证
在步骤S4检测结果均为阴性之后2h，立即取样采用荧光定量PCR检测1号空气抽吸点和2号空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中1号空气抽吸点和2号空气抽吸点附近作业面的采样点数量各为20个，且该20个采样点分布在各空气抽吸点附近的下述3个作业面上：地面(12个采样点)、凳子(4个采样点)和实验操作台(6个采样点)；对于上述采样点，采样时采用棉签擦拭标准取样法，即用无菌棉签擦拭面积为5cm×5cm作业面的表面于1mL无菌水中洗脱，将洗脱液进行荧光PCR检测，检测结果如下：
表10立体净化效果验证的检测结果
Figure BDA0003808911190000182
Figure BDA0003808911190000191
由表10可知，在两个空气抽吸点附近，6个不同作业面的40个采样点的检测结果均为阴性，则说明不存在假阴性净化结果，实验室密闭空间内的核酸污染已经净化彻底。

Claims (10)

1.实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、空间净化：根据实验室密闭空间的大小均匀设置不同数量的空气抽吸点，在空气抽吸点将实验室密闭空间内的空气抽吸至核酸清除剂内，控制空气在核酸清除剂内至少滞留3s，使空气与核酸清除剂接触混合之后再排出至实验室内；
S2、空间净化效果验证：在步骤S1空间净化完成后，分别检测密闭空间内每个空气抽吸点空气中的残留核酸含量，若检测结果均为阴性，则进入步骤S3；若有阳性结果检出，则重复循环步骤S1和步骤S2，直至步骤S2所有空气抽吸点的检测结果均为阴性；
S3、表面净化：将核酸清除剂以喷雾的形式喷雾至实验室密闭空间内的作业面，使核酸清除剂均匀润湿作业面，待核酸清除剂在作业面上自然晾干即可；
S4、表面净化效果验证：在步骤S3表面净化处理之后，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为10～15个，且该10～15个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若检测结果均为阴性，则进入步骤S5；若有阳性结果检出，则重复循环步骤S3和步骤S4，直至步骤S4检测结果均为阴性；
S5、立体净化效果验证：在步骤S4中检测结果均为阴性之后2～4h，立即取样检测每个空气抽吸点附近作业面所残留的核酸含量，其中每个空气抽吸点附近作业面的采样点数量为20～30，且该20～30个采样点应分布在该空气抽吸点附近的至少3个不同的作业面上；若所有检测结果均为阴性，则表示密闭空间内核酸污染的立体净化完成；若有阳性结果检出，则重复步骤S1至步骤S5，直至步骤S5的检测结果均为阴性。
2.如权利要求1所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S1中，核酸清除剂为全能核酸酶溶液或次氯酸溶液；所述步骤S3中，核酸清除剂为全能核酸酶溶液或次氯酸溶液。
3.如权利要求1所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述空气抽吸点采用相同的空气抽吸速率对实验室密闭空间内的空气进行同步抽吸。
4.如权利要求3所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S1中，实验室密闭空间内每40～100m3设置一个空气抽吸点。
5.如权利要求3所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S1中，控制空气的总抽吸量为实验室密闭空间的2～5倍。
6.如权利要求3所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S1中，核酸清除剂的使用体积与实验室密闭空间的体积比为1～5:100L/m3。
7.如权利要求1所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S2中，作业面为实验室密闭空间内进行实验操作所使用的设施、设备、器皿的外表面以及操作人员的服装外表面。
8.如权利要求1所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S4和步骤S5中，采用棉签擦拭标准取样法对每个空气抽吸点附近作业面的高污染区进行取样，以检测作业面所残留的核酸含量。
9.如权利要求9所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述步骤S2中，作业面的高污染区的取样面积为3～8cm×3～8cm；作业面的高污染区包括实验操作台面，仪器设备，试管架，移液器，冰箱，超净工作台，门把手，凳子，地面和照明开关的外表面。
10.如权利要求1～9任一所述的实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法，其特征在于，所述核酸含量采用荧光定量PCR检测。
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