CN115219429A - 一种内标辅助花瓣状sers纳米探针及其制备方法、应用 - Google Patents

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CN115219429A CN202211023571.8A CN202211023571A CN115219429A CN 115219429 A CN115219429 A CN 115219429A CN 202211023571 A CN202211023571 A CN 202211023571A CN 115219429 A CN115219429 A CN 115219429A
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范嘉怡
张文婷
张书胜
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Abstract

本发明公开了一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针及其制备方法、应用，其中，本发明的内标辅助花瓣状SERS纳米探针是由金纳米球内核、内标修饰分子、花瓣状金纳米外壳和识别分子4‑硝基苯硫酚构成的核‑分子‑壳结构的金纳米花探针；内标修饰分子是具有腈基、炔基或叠氮官能团的拉曼信号分子。本发明以拉曼信号分子作为内标修饰分子修饰在金纳米球内核上，校正后的工作曲线重现性好，误差小，提高了检测结果的可靠性；通过内标修饰分子的分子层上生长一层花瓣状金纳米外壳提高了SERS基底内部和外部的SERS活性，并且花瓣状外壳增加了SERS基底的表面积。另外，本发明的识别分子能够实现硫化氢的比率拉曼检测，有效降低背景信号的干扰，提高了检测灵敏度。

Description

一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及H2S的检测领域，尤其是涉及一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针，还涉及一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，还涉及内标辅助花瓣状SERS纳米探针的应用。
背景技术
H2S是继NO、CO之后、被确定为生物体内的第三个具有生物活性的气体信号分子。H2S广泛分布于全身各处，哺乳动物中的内源性H2S通常由L-半胱氨酸通过3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）、胱硫醚-β-合成酶（CBS）和胱硫醚-γ-解酶（CSE）的酶催化反应生成。研究表明，生物体内H2S参与一系列的生理过程，包括调节血管张力、心肌收缩、神经传导、胰岛素分泌等；另外，异常浓度水平的H2S也与一系列恶性疾病密切相关，如阿尔茨海默症、唐氏综合症、糖尿病和急性肾脏损伤等。因而，H2S的定量检测对临床具有重要意义。
近年来，气相色谱法、电化学法、化学发光法和荧光法等，已被开发用于检测H2S。然而，这些方法大多需要复杂的样品前处理，在前处理过程中甚至会造成样品破坏，进而严重影响影响检测结果。
SERS具有实时、快速、无创、灵敏性高、无自发荧光、不受光漂白影响等特点，已经成为检测生物分子和生物成像的最有效工具之一。对H2S的检测来说，开发出具有灵敏度高、特异性强、稳定性好和抗干扰能力强的SERS纳米探针是将SERS技术用于H2S的实时、高灵敏度、特异性检测的关键技术。
目前，基于H2S引起的一些特殊化学反应（如叠氮基团的还原、Ag和H2S的反应等），一些SERS纳米探针已经被开发出来用于检测活细胞中的H2S。
Li等人报道了第一个用于检测H2S的SERS纳米探针——4-乙酰氨基苯磺酰叠氮功能化的金纳米粒子（记为AuNPs/4-AA）。该探针基于叠氮基团被H2S还原成氨基，通过SERS光谱变化快速响应H2S，并以高灵敏度监测活体胶质瘤细胞中内源产生的H2S。然而，虽然叠氮化物可以快速重新反应，但叠氮化物衍生物往往是不稳定的，在激光照射下容易会产生不想要的副产品，存在假阳性信号，影响检测结果的可靠性，在一定程度上限制了该探针的进一步应用。
Wang等人设计了一种近红外激活的SERS纳米探针，该探针根据H2S与Ag反应导致的纳米探针SERS光谱变化来监测H2S在细胞和斑马鱼胚胎中的分布。然而，尽管该纳米探针显示出对H2S的高灵敏度，但Ag外壳也很容易被细胞中的活性氧破坏，导致该探针的选择性较差，影响检测结果的可靠性。
另外，申请人在科研过程中还发现，现有SERS纳米探针大多是以单一绝对信号强度进行H2S的定量检测，由于环境条件中存在诸多引起信号强度波动的干扰因素，导致该检测方法的可靠性较低，误差较大。
综上，如何设计一种既对H2S表现出很好的选择性，又具有很好的检测灵敏度，还能尽可能地减少外界干扰因素对信号的干扰以提高检测结果可靠性的SERS纳米探针对生物体内H2S的研究至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一目的在于提供了一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针，提高了H2S的检测灵敏度，具有良好的激光稳定性和选择性。
本发明的第二个目的在于提供了一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，该方法提高了SERS基底的内部和外部的SERS活性，为识别分子提供更多的结合位点，进一步提高了检测灵敏度。
本发明的第三个目的在于提供内标辅助花瓣状SERS纳米探针在检测样本中H2S的应用，及在以非疾病诊断为目的的活细胞内H2S成像中的应用。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针，是由金纳米球内核、内标修饰分子、花瓣状金纳米外壳和识别分子构成的核-分子-壳结构的金纳米花探针；其中，所述内标修饰分子是具有腈基、炔基或叠氮官能团的拉曼信号分子；所述识别分子为4-硝基苯硫酚。
在本发明中，本发明将拉曼信号分子作为内标修饰分子修饰在金纳米球内核上，校正后的工作曲线重现性好，误差小，提高了检测结果的可靠性；
在内标修饰分子的分子层上生长一层花瓣状金纳米外壳，一方面具有大量的“热点”，进而提高了SERS基底内部和外部的SERS活性；另一方面，花瓣状外壳也增加了SERS基底的表面积，为识别分子提供更多的结合位点；
本发明以4-硝基苯硫酚（即4-NTP）作为H2S的灵敏识别分子，4-NTP中的硝基作为识别基团提高了探针的检测灵敏度、选择性和检测速度，可实现环境样本或生物样品中H2S的快速定量检测。
更优选地，所述内标修饰分子为4-巯基苯甲腈。以4-巯基苯甲腈为内标，利用硫化氢和4-硝基苯硫酚的还原反应，实现硫化氢的比率拉曼检测，有效降低背景信号的干扰，提高了检测灵敏度。
更优选地，所述金纳米球内核的粒径为20～40 nm；所述花瓣状金纳米外壳的厚度为30～50 nm。
本发明还提供了一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，，所述制备方法包括以下步骤：
第一步，制备具有表面等离激元共振效应的金纳米球内核AuNPs；
第二步，在金纳米球内核AuNPs上修饰一层内标修饰分子，所述内标修饰分子为拉曼信号的小分子且具有腈基、炔基或叠氮官能团；
第三步，在内标修饰分子的分子层外生长一层花瓣状金纳米外壳，获得含有内标修饰分子掺杂的金纳米花作为SERS基底；
第四步，在SERS基底表面修饰一层4-硝基苯硫酚，得到核-分子-壳结构的内标辅助花瓣状SERS纳米探针，其中4-硝基苯硫酚用于识别H2S。
在上述制备方法中，所述第二步中的内标修饰分子为4-巯基苯甲腈，修饰时将AuNPs溶液的pH调节至9.0，加入4-巯基苯甲腈的乙醇溶液，恒温搅拌3 h，离心去除未键合的4-巯基苯甲腈，用去离子水将沉淀分散得到4-巯基苯甲腈修饰的AuNPs。
上述制备方法中的所述第三步具体包括以下内容：将第二步获得的4-巯基苯甲腈修饰的AuNPs与十六烷基三甲基氯化铵溶液混合，然后依次加入HAuCl4·3H2O和抗坏血酸，反应结束后得到深蓝色的SERS基底——Au@MPBN@Au NFs溶液。
上述制备方法中的第四步包括以下具体内容：将Au@MPBN@Au NFs溶液离心，用去离子水洗涤沉淀；洗涤后加入对硝基苯硫酚，室温下搅拌反应，反应结束后离心，将沉淀分散于HEPES缓冲液即得4-NTP修饰的内标辅助花瓣状SERS纳米探针——Au@MPBN@Au@4-NTP。
本发明还涉及内标辅助花瓣状SERS探针在检测样本中H2S的检测应用，可用于生物样本（特别是细胞）中微量H2S的半定量检测。
本发明还提供了一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针在以非疾病诊断为目的活细胞内H2S成像中的应用。结果表明，本发明的SERS纳米探针具有良好的细胞摄取能力和细胞内稳定性，将细胞和SERS纳米探针孵育后能够观察到H2S的SERS 信号，可以用于检测活细胞中的H2S或内源性H2S。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首先在金纳米球上修饰了一层4-巯基苯甲腈，并合成了具有高等离子体共振活性的核-分子-壳金纳米花Au@MPBN@Au NFs作为内标嵌入式的SERS基底，将4-NTP共价键合在Au@MPBN@Au NFs的表面作为H2S识别分子，利用H2S和4-硝基苯硫酚的还原反应，实现硫化氢的比率拉曼检测，有效降低背景信号的干扰，提高了检测灵敏度和抗干扰性；以4-硝基苯硫酚作为识别分子，提高了探针对H2S的选择性。
本发明的纳米探针中的4-巯基苯甲腈在2223 cm-1的腈拉伸振动带始终保持不变，以H2S的拉曼特征峰（即1139 cm-1）或H2S存在下峰强度变化较大的拉曼特征峰（即1329 cm-1处）与4-巯基苯甲腈的特征峰（即2223 cm-1）的比率为基础，实现样本中H2S的精准检测。结果表明，与基于绝对峰强度技术的H2S定量检测相比，本发明经4-硝基苯硫酚内标校正后的标准曲线具有很好的重现性，误差小，准确性高，提高了检测结果的可靠性。
本发明的内标辅助花瓣状SERS纳米探针可用于细胞内外源性和内源性H2S的检测，对深入研究硫化氢在生物体内的产生、输送等动力学机理，以及进一步了解硫化氢的生理和毒理作用具有重要的意义。
附图说明
图1是本发明所述内标辅助花瓣状SERS纳米探针的合成路线图。
图2是实施例1中内标辅助花瓣状SERS纳米探针的TEM图。
图3是实施例1中内标辅助花瓣状SERS纳米探针的高角度环形暗场扫描TEM和元素分析谱图。
图4是实施例1中Au@MPBN@Au NFs溶液和Au@MPBN@Au@4-NTP的紫外吸收光谱谱图。
图5是实施例1中Au@MPBN@Au NFs和Au@MPBN@Au@4-NTP分别进行拉曼表征谱图。
图6是本发明内标辅助花瓣状SERS纳米探针的选择性分析直方图。
图中：灰色填充的直方图表示NaHS、以及干扰物质分别与探针孵育后的SERS强度比值（纵坐标为I1139/I2223）；斜线填充的直方图表示含有NaHS的干扰物质分别与探针孵育后的拉曼强度比值的直方图（纵坐标为I1139/I2223）。
图7是本发明内标辅助花瓣状SERS纳米探针和NaHS孵育后的拉曼光谱图。
图8是本发明所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的标准曲线（以相对峰强度为纵坐标，以I1139/I2223或I1329/I2223为纵坐标）。
图9是本发明内标辅助花瓣状SERS纳米探针的标准曲线（以I1139或I1329的绝对峰强度为纵坐标）。
图10是本发明所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针在HepG2细胞内H2S中的成像图。
图11是本发明所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针对HepG2细胞内H2S的传感示意图。
图12是本发明所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针对A549细胞内不同浓度H2S的拉曼检成像图和拉曼谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的试剂均为常规试剂，采用的仪器和方法也为本领域常规仪器和方法。
实施例1 本发明所述的内标辅助花瓣状探针Au@MPBN@Au@4-NTP
一、内标辅助花瓣状SERS纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP的制备
本实施例以金纳米粒子作为内核，以4-巯基苯甲腈（MPBN）作为内标物，合成具有MPBN修饰的金纳米花Au@MPBN@Au NFs，最后通过Au@MPBN@Au NFs上修饰4-硝基苯硫酚（即4-NTP）即可得到本发明的内标辅助花瓣状SERS探针——Au@MPBN@Au@4-NTP，其合成路线见图1。
结合图1可知，本发明的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备金纳米内核AuNPs（粒径为30nm）
S11，利用经典柠檬酸钠还原法制备金种子：将50 mL H2O和2.5 mL HAuCl4·3H2O（0.2% w/v）加热至沸腾后，快速加入2 mL柠檬酸三钠水溶液（1% w/v，含0.02%柠檬酸（w/v）），然后保持沸腾10 min得到金种子溶液，金种子的粒径约为13nm；
S12，采用种子生长法制备金纳米内核AuNPs：将2 ml HAuCl4·3H2O（0.2% w/v）稀释至10 mL，得到前体溶液A；
将0.5 mL抗坏血酸（1% w / v）和0.25 mL柠檬酸三钠（1% w / v，含0.02% 柠檬酸）的混合液稀释至10 mL，得到还原液B；
向烧瓶内加入3 mL金种子溶液和20 mL H2O，在室温剧烈搅拌下向烧瓶中缓慢加入前体溶液A和还原液B，加样时间为60 min；
加样完成后，将上述混合体系快速加热至沸腾并保持30 min，得到酒红色的AuNPs溶液，AuNPs溶液中AuNPs的粒径约为30 nm；
第二步，合成4-巯基苯甲腈修饰的AuNPs（即Au@MPBN NPs）
取18 mL AuNPs溶液，用NaOH调节其pH = 9；然后加入90 μL 20 mM 4-巯基苯甲腈（即MPBN）的乙醇溶液，30℃恒温搅拌3 h，4-巯基苯甲腈通过Au-S共价键修饰在AuNPs表面；反应结束后，离心得沉淀（即Au@MPBN NPs），去离子水洗涤2次，将沉淀重新分散在去离子水中得到Au@MPBN NPs溶液，待用；
第三步，合成内标MPBN掺杂的金纳米花Au@MPBN@Au NFs
向烧瓶中加入4 mL Au@MPBN NPs溶液和8mL、50 mM的十六烷基三甲基氯化铵溶液，在超声条件下加入900 μL HAuCl4·3H2O（0.2% w/v），混合2 min后快速加入334 μL抗坏血酸（1% w/v），反应体系的颜色由玫红色迅速变为浅蓝色，持续反应10 min，得到深蓝色的Au@MPBN@Au NFs溶液，避光保存于4℃冰箱；
第四步，合成内标辅助花瓣状SERS探针——Au@MPBN@Au@4-NTP
取24 mL Au@MPBN@Au NFs溶液8000 rpm离心6 min，离心后用去离子水洗涤2～4次；洗涤后加入新鲜配制的对硝基苯硫酚（即4-NTP，其终浓度为3 μM），室温下搅拌3 h；反应结后于8000 rpm离心6 min，得沉淀；
将沉淀用去离子水洗涤，再将沉淀分散于HEPES缓冲液（20 mM，pH = 7.4）中，得到内标辅助花瓣状SERS纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP，纳米探针的浓度为1.0 mg/ml。
二、对本实施例中的内标辅助花瓣状SERS纳米探针进行表征
1、采用透射电镜（即TEM）观察Au@MPBN@Au@4-NTP的尺寸和外貌。其中，Au@MPBN@Au@4-NTP纳米探针粒径约为70 nm，且金纳米球的外周为花瓣状壳层结构，具体如图2所示。
2、采用高角度环形暗场扫描TEM和能量色散X射线光谱仪分别对Au@MPBN@Au@4-NTP进行表征，具体见图3。
由图3可知，Au和S的元素图谱与HAADF-STEM图像中的亮区匹配良好，表明Au@MPBN@Au@4-NTP中Au和S元素的存在。
3、采用紫外吸收光谱仪对本实施例中Au@MPBN@Au NFs溶液和Au@MPBN@Au@4-NTP分别进行表征，结果如图4所示。
Au@MPBN@Au NFs和Au@MPBN@Au@4-NTP的颜色均为深蓝色，修饰前后并未发生变化。结合图4可知：Au@MPBN@Au NFs的紫外吸收峰位于620nm处；Au@MPBN@Au@4-NTP探针的吸收峰位移至621nm。
4、对本发明的Au@MPBN@Au NFs和Au@MPBN@Au@4-NTP分别进行拉曼表征（拉曼谱图见图5）。由图5可知，在细胞拉曼沉默区2223 cm-1处存在MPBN分子的腈基振动；在1329 cm-1拉曼位移处有一个很强的SERS峰，该SERS峰为4-NTP分子中硝基的伸缩振动峰，表明4-NTP分子成功修饰在Au@MPBN@Au NFs纳米基底表面。
实施例2 本发明的纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP的选择性
S1，用去离子水配制浓度为40 µM的NaHS母液；用去离子水分别配制GSH、L-AA（即L-抗坏血酸）、Na2SO3、NaNO2、NaN3、NaCO3、NaClO、KSCN、NaSO4、KNO3、NaHSO3、NaH2PO4和H2O2等干扰物质的溶液，其中：GSH、L-AA和H2O2的浓度为2 mM的母液，其它干扰物质的浓度均为400µM；
S2，取50 µL NaHS母液、干扰物质分别与150 µL Au@MPBN@Au@4-NTP孵育30 min，其中，Au@MPBN@Au@4-NTP的最终浓度为0.1 mg/mL，NaHS母液的最终浓度为10 µM，GSH、L-AA和H2O2的最终浓度为500 µM，其它干扰物质的最终浓度为100 µM；
孵育结束后，将各混合探针滴加到铝箔纸上进行SERS表征（拉曼参数如下：激发波长633 nm、倍镜50×、功率0.73 mW、曝光时间10 s、采集范围500-2500 cm-1），结果见图6中的灰色填充直方图；
向50 µL各干扰物质中加入50 µL NaHS母液，然后再将含有NaHS的干扰物分别与100 µL的Au@MPBN@Au@4-NTP恒温孵育30 min；其中：每个混合探针溶液中NaHS母液的最终浓度为10 µM，探针的最终浓度为0.1 mg/mL，GSH、L-AA和H2O2的最终浓度为500 µM，其它干扰物质的最终浓度为100 µM；
孵育结束后，将混合探针滴加到铝箔纸上进行SERS表征（拉曼参数如下：激发波长633 nm、倍镜50×、功率0.73 mW、曝光时间10 s、采集范围500-2500 cm-1），各干扰物质的拉曼峰强度比（I1139/I2223）见图6中的斜线填充的直方图。
由图6可知，将NaHS和Au@MPBN@Au@4-NTP孵育后，拉曼峰强度比（I1139/I2223）相对Au@MPBN@Au@4-NTP明显增强，而干扰物质GSH、L-AA、Na2SO3、NaNO2、NaN3、NaCO3、NaClO、KSCN、NaSO4、KNO3、NaHSO3、NaH2PO4、H2O2分别与Au@MPBN@Au@4-NTP孵育后的拉曼峰强度比（I1139/I2223）没有明显变化，表明只有硫化氢在1139 cm-1处引起强烈的 SERS 信号响应，其它干扰物质在 1139 cm-1处未触发明显的响应，表明纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP对硫化氢检测具有很高的选择性；
当将NaHS与干扰物质混合后再与本发明的Au@MPBN@Au@4-NTP共同孵育，发现添加NaHS后的每个干扰物质中I1139/I2223的比率峰强度明显增加，表明其它生物干扰物不影响H2S的检测。
综上，本发明的Au@MPBN@Au@4-NTP对干扰物GSH、L-AA、Na2SO3、NaNO2、NaN3、NaCO3、NaClO、KSCN、NaSO4、KNO3、NaHSO3、NaH2PO4、H2O2基本不响应，说明本发明的纳米探针对H2S具有很好的选择性。
实施例3 本发明所述探针的准确性分析
为更好的说明本发明的以4-巯基苯甲腈为内标修饰分子的探针的准确度，申请人以NaHS溶液作为H2S的供体，考察4-巯基苯甲腈对探针检测准确度的影响。具体包括以下内容：
第一步，用去离子水配制不同浓度的NaHS母液，NaHS母液的浓度依次为：0、1 μM、2μM、4 μM、8 μM、20 μM、40 μM和80 μM；
第二步，将150μL Au@MPBN@Au@4-NTP）分别与上述不同浓度的50μL NaHS母液混合，其中探针的最终浓度为0.1 mg/mL，NaHS母液的最终浓度依次为：0、0.25 μM、0.5 μM、1μM、2 μM、5 μM、10 μM和20 μM；
将混合液37℃恒温孵育30 min，孵育结束后将探针滴加在锡箔纸上进行拉曼表征；其中，拉曼光谱参数如下：激发波长633 nm、倍镜50×、功率0.73 mW、曝光时间10 s、采集范围500-2500 cm-1；
Au@MPBN@Au@4-NTP与NaHS混合孵育后的拉曼谱图见图7。从图7可知：本发明的纳米探针与H2S混合后，在1139 cm-1、1387 cm-1和1433 cm-1处出现了三个新的特征缝，而在1329 cm-1处的拉曼特征峰下降，表明探针对硫化氢具有良好的识别性能。
为确保检测结果的可靠性，NaHS溶液的每个浓度平行测试3次，以每个浓度下的平均值和相对偏差值、以及浓度的对数值绘制标准曲线：
由于探针在1139 cm-1处的特征峰信号随H2S加入增加明显，1329 cm-1处的拉曼特征峰下降明显，2223 cm-1处的内标峰因不受外部环境干扰，强度基本保持不变。故本发明在检测时以I1139 / I2223或I1329 / I2223的相对峰强度为纵坐标，矫正探针检测时信号的波动，以尽可能地减少误差，提高检测结果的可靠性。
以NaHS浓度的对数值为横坐，I1139 / I2223为纵坐标绘制标准曲线，得到的拟合方程为Y＝0.168X+0.683，R 2 =0.995，结果见图8；
以NaHS浓度的对数值为横坐，以I1329 / I2223为纵坐标绘制标准曲线，得到的拟合方程为Y＝-0.402X+0.537，R 2 =0.973，最低检出限可达0.2 μM，结果见图8。
申请人同时拟合了不用内标修饰分子时的标准曲线。具体地：以NaHS浓度的对数值为横坐，分别以1139 cm-1和1329 cm-1处特征峰的绝对强度作为纵坐标进行线性拟合，得到的拟合方程对应为：Y＝1268.230 X+5042.117，R 2 =0.979；Y= -4011.367X-405.240，R 2 = 0.925，结果见图9。
以I1329处的特征峰对应的标准曲线为例：采用内标修饰分子4-巯基苯甲腈校正后的工作曲线的R 2 为0.973；而未经内标物质校正的工作曲线的R 2 仅为0.925，说明本发明中的以MPBN作为内标修饰的探针在检测H2S时具有很好的重现性，误差小，准确度高。
实施例4 Au@MPBN@Au@4-NTP在活细胞内H2S成像中的应用
本实施例以HepG2细胞（细胞来源于中国科学院细胞库，中国上海）内H2S的SERS传感与成像为例，对本发明作出更加详细的说明。具体内容为：
第一步，细胞样品的前处理
对照样本：将HepG2细胞消化后接种在6 cm共聚焦小皿，采用DMEM作为培养基，加入Au@MPBN@Au@4-NTP（最终浓度为0.05 mg/mL），37℃恒温孵育4 h；
外源性H2S成像样本：将贴壁生长24 h后的HepG2细胞（未消化）接种到DMEM培养基中，加入100 μM NaHS，37℃恒温孵育60 min；孵育结束后用PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤3次；将洗涤后的HepG2细胞接种到DMEM培养基中，加入Au@MPBN@Au@4-NTP（最终浓度为0.05 mg/mL），37℃恒温孵育4 h；
内源性H2S成像样本：将贴壁生长24 h后的HepG2细胞（未消化）接种到DMEM培养基中，加入100 μM 硝普钠（SNP，一氧化氮供体，即NO供体，可以上调H2S相关酶（胱硫醚γ-裂解酶等）的活性，刺激 HepG2细胞中内源性H2S的产生），37℃恒温孵育60 min，用SNP刺激内源性H2S的产生；然后用PBS缓冲液（pH= 7.4）洗涤3次；洗涤后将HepG2细胞接种至DMEM培养基中，加入纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP（最终浓度为0.05 mg/mL），37℃恒温孵育4 h；
第二步，将第一步孵育得到的细胞样品分别置于载物台上，室温下采集拉曼信号（拉曼测试参数为：激发波长633 nm、倍镜50×、光斑直径1.54 μm、步长0.8 μm、曝光时间1s），得到上述三种样本的成像图片，具体见图10-11。
从图10中的对照组可知：当HepG2细胞仅与Au@MPBN@Au@4-NTP孵育4 h时，在2223cm-1通道发现明显的拉曼散射信号，表明本发明的纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP具有良好的细胞摄取能力和细胞内稳定性。
由图10中NaHS处理后的细胞成像图和图11可知：将HepG2 细胞与NaHS一起孵育后再用Au@MPBN@Au@4-NTP处理，可在1139 cm-1处观察到新的SERS信号。结果表明，本发明的纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP 可以检测细胞中的外源性H2S。
由图10中SNP处理后的细胞成像图和图11可知：用SNP刺激HepG2 细胞内源性H2S的产生，再用Au@MPBN@Au@4-NTP处理后也可在1139 cm-1处观察到新的SERS信号。结果表明，本发明的Au@MPBN@Au@4-NTP 可以感知细胞中的内源性H2S，以实现细胞内源性H2S的检测。
实施例5 Au@MPBN@Au@4-NTP在半定量检测细胞内H2S中的应用
本发明进一步研究了Au@MPBN@Au@4-NTP作为拉曼探针，通过比率拉曼成像定量检测细胞中的H2S。下面以A549 细胞为例，具体进行说明：
将贴壁生长24 h后的A549细胞（细胞来源于中国科学院细胞库，中国上海）接种至DMEM培养基中，向A549细胞中加入不同浓度的NaHS（0、 20 μM、50 μM、100 μM，浓度为0时作为对照组），共同孵育60min；
孵育结束后用PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤3次；将洗涤后的A549细胞接种到DMEM培养基中，加入Au@MPBN@Au@4-NTP（最终浓度为0.05 mg/mL），37℃恒温孵育4 h；
将孵育后的A549细胞样品分别进行拉曼检测，拉曼测试参数为：激发波长633 nm、倍镜50×、光斑直径1.54 μm、步长0.8 μm、曝光时间1 s，结果见图12。
从图12中的A和B可知，随着 NaHS 浓度的增加，观察到 1139 cm-1通道的拉曼信号明显增加，并且2223 cm-1处的SERS信号几乎不受外界环境影响。从图12中的C可知，随着NaHS 浓度的增加，A549细胞拉曼成像中的比率信号I1139/I2223明显上升，A549细胞+ 20 μMNaHS、A549细胞+ 50 μM NaHS、A549细胞 + 100 μM NaHS）的SERS强度比（I1139/I2223）分别是对照组的2.90倍、4.01倍和6.33倍，显示出显着差异 (p < 0.005)。
结果表明，本发明的纳米探针Au@MPBN@Au@4-NTP可以通过比率拉曼成像技术，实现细胞内H2S 的半定量检测。

Claims (8)

1.一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针，其特征在于：所述探针是由金纳米球内核、内标修饰分子、花瓣状金纳米外壳和识别分子构成的核-分子-壳结构的金纳米花探针；其中，所述内标修饰分子是具有腈基、炔基或叠氮官能团的拉曼信号分子；所述识别分子为4-硝基苯硫酚。
2.根据权利要求1所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针，其特征在于：所述内标修饰分子为4-巯基苯甲腈。
3.根据权利要求1所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针，其特征在于：所述金纳米球内核的粒径为20～40 nm；所述花瓣状金纳米外壳的厚度为30～50 nm。
4.一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步，制备具有表面等离激元共振效应的金纳米球内核AuNPs；
第二步，在金纳米球内核AuNPs上修饰一层内标修饰分子，所述内标修饰分子为拉曼信号分子且具有腈基、炔基或叠氮官能团；
第三步，在内标修饰分子的分子层外生长一层花瓣状金纳米外壳，获得含有内标修饰分子掺杂的金纳米花，将其作为SERS基底；
第四步，在SERS基底表面修饰一层用于识别H2S的4-硝基苯硫酚，得到核-分子-壳结构的内标辅助花瓣状SERS纳米探针。
5.根据权利要求4所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于：所述第二步中的内标修饰分子为4-巯基苯甲腈，其修饰方法如下：
将AuNPs溶液的pH调节至9.0，加入4-巯基苯甲腈的乙醇溶液，恒温搅拌3 h，离心去除未键合的4-巯基苯甲腈，用去离子水将沉淀重新分散得到4-巯基苯甲腈修饰的AuNPs溶液。
6.根据权利要求5所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于：所述第三步具体包括：将第二步获得的4-巯基苯甲腈修饰的AuNPs与十六烷基三甲基氯化铵溶液混合，然后依次加入HAuCl4·3H2O和抗坏血酸，反应结束后得到深蓝色的SERS基底——Au@MPBN@Au NFs溶液。
7.根据权利要求6所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于：所述第四步包括以下具体内容：将Au@MPBN@Au NFs溶液离心，用去离子水洗涤沉淀；洗涤后加入对4-硝基苯硫酚，室温下搅拌反应，反应结束后离心，将沉淀分散于HEPES缓冲液即得4-NTP修饰的内标辅助花瓣状SERS纳米探针——Au@MPBN@Au@4-NTP。
8.权利要求1-3任一项所述的内标辅助花瓣状SERS探针在检测样本中H2S和/或在以非疾病诊断为目的的活细胞内H2S成像中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024087668A1 (zh) * 2022-10-25 2024-05-02 上海交通大学 基于安全照射剂量的近红外二区表面增强共振拉曼探针

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