CN115216486B - 一种负链rna病毒载体及无需转化的植物基因组编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用负链RNA病毒载体对植物遗传物质进行定点修饰的方法及病毒载体***。本发明提供了对植物基因组目的DNA进行定点编辑的方法，无需对待修饰的植物进行稳定的遗传转化，包括如下步骤：利用番茄斑萎病毒载体侵染植物并瞬时表达序列特异性的核酸修饰酶，所述序列特异性核酸修饰酶靶向所述被侵染植物基因组靶位点并切割或修饰靶位点，植物的DNA修复机制完成对所述靶位点的定向修饰。本发明利用RNA病毒载体递送序列特异性核酸修饰酶，不仅提高了对靶位点的编辑效率，而且可获得非转基因的编辑植株。

Description

一种负链RNA病毒载体及无需转化的植物基因组编辑方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种无需稳定遗传转化的植物基因编辑的方法。具体而言，本发明涉及利用工程化的植物负链RNA病毒载体***向植物体内递送CRISPR核酸修饰酶，并对植物基因组进行遗传修饰的方法，以及通过所述方法产生的遗传物质被修饰的植物及其后代。
背景技术
序列特异性的核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)技术的发展使定向基因组编辑(Targeted genome editing)成为可能。SSN由序列特异性的DNA结合元件(DNAbinging domain)和非特异性的DNA切割结构域(DNA cleavage domain)组合，导入细胞后靶向基因组特定位点，产生DNA 双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)，从而激活细胞非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)机制修复DSBs，该过程易产生碱基***或缺失，导致目标序列产生突变；此外，当细胞内存在同源DNA序列时，体内同源重组(Homologous recombination,HR)机器可利用同源模板进行DSBs修复，从而对目标序列进行基因修饰、等位基因替换或外源基因定向***等遗传操作。此外，将无法产生DSB的SSN突变体与不同效应蛋白融合，如转录调节蛋白、胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶、逆转录酶等，可以实现靶向的基因转录调控、碱基编辑、单个或多个碱基的***或删除。
常用的SSN主要包括锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白***(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated proteins,CRISPR/Cas)。其中CRISPR/Cas技术仅需在细胞中导入Cas核酸酶和靶位点特异的向导RNA，具有操作简单、效率高等优势，在动植物基因组编辑中均得到广泛应用。
基因组编辑技术的关键环节之一是SSNs试剂的递送，即将SSNs导入受体细胞的方法和手段。植物细胞的刚性细胞壁成分阻碍了SSNs分子的直接转染导入，因而通常依赖农杆菌转化或基因枪轰击等方法将SSN以转基因形式递送至植物细胞，即遗传转化。该方法应用于作物遗传改良中存在若干问题，如：1)多数作物物种或品种转化效率较低；2)编辑植株后代中SSN转基因分离依赖于有性杂交，其过程费时费力，尤其是对于倍性复杂、育种周期长或无性繁殖的植物更是如此；3)稳定遗传转化过程易造成植物染色体DNA发生不可预测的改变和损害；4)涉及遗传转化过程的产品在部分国家仍可能被纳入转基因植物范畴进行监管。
病毒载体是一种天然的生物大分子递送工具，广泛应用于向植物中引入和瞬时表达异源基因(例如Donson等，Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:7204-7208；Wang等，PLoSPathog,2015,11:e1005223)。尤其RNA病毒载体，由于其复制过程不涉及DNA阶段，不存在外源核酸整合到寄主基因组的风险。利用植物病毒感染植株比转基因稳定转化更加快速和简便，且病毒复制可以产生外源基因的大量表达。此外，侵染性病毒载体可以实现外源基因向植物体内(in planta)直接递送，而无需分离特定的受体细胞或组织。目前已有多种植物病毒被改造为载体，用于向植物体内递送核酸分子或表达外源蛋白(Gleba等，Curr OpinPlant Biol,2004,7:182-188；Cody和Scholthof，Annu Rev Phytopathol,2019,57:211-230)。
在植物基因编辑中，由于CRISPR/Cas核酸酶基因分子量较大，如普遍使用的Cas9和Cas12a核酸酶基因长达4千碱基对(kb)左右，加上顺式调控元件可达5-7kb，对病毒载体的包装能力提出了极大的挑战。由于包装能力的局限，部分侵染性植物病毒载体被用于递送较小的CRISPR向导RNA(gRNA)，如基因组为单链DNA的甘蓝曲叶病毒(Yin等，Sci Rep,2015,5:14926)，以及基因组为正义RNA的烟草脆裂病毒(Ali 等，Mol Plant,2015,8:1288-1291；专利WO 2015189693；专利WO 2016084084)、烟草花叶病毒(Cody等，Plant Physiol,2017,175:23-35)、豌豆早枯病毒(Ali等，Virus Res,2018,244:333-337)、甜菜坏死黄脉病毒(Jiang等，Plant Biotechnol J,2019,17:1302-1315)、虎尾草花叶病毒(Mei等，PlantDirect,2019,3:1–16)等。这类病毒载体递送的向导RNA需与转基因表达的Cas9共同作用才能实现基因组定点编辑。另外一些包装能力相对较大的正义RNA植物病毒载体被用于递送其它核酸酶组份。如烟草脆裂病毒用于递送长度约为1kb的归巢核酸酶(Honig等，Molplant,2015,8:1292-1294)或约2kb的锌指核酸酶(Marton等，Plant Physiol,2010,154:1079-1087；专利WO 2009130695)、以及***的CRISPR/Cas核酸酶组份(美国专利申请US20190359993)。
病毒复制子(replicon)***是一类可以复制但无法***侵染的载体，具有较大的外源片段包容能力。论文(Baltes等人，Plant Cell,2014,151-163)和专利(WO 2018081081和US 20210054388)公开了利用双生病毒科菜豆黄矮病毒复制子载体递送CRISPR/Cas核酸酶和同源重组DNA模板；论文(Wang等人，Mol Plant,2017,10:1007-1010)和中国专利CN109880846 A公开了利用双生病毒科小麦矮缩病毒复制子载体***递送CRISPR/Cas核酸酶及同源重组DNA模板；论文(Ariga等，Plant Cell Physiol,2020,61:1946–1953)和美国专利(US 20190359993)公开了马铃薯X病毒和番茄花叶病毒载体递送CRISPR/Cas核酸酶基因的方法；论文(Gao等，New Phytol,2019,223:2120-2133)和中国专利(CN 110511955 A)公开了一种大麦黄条点花叶病毒载体在植物单细胞内递送CRISPR/Cas核酸酶的方法。上述复制子病毒载体无法***侵染植物，需借助于农杆菌转化或基因枪轰击等方式将含有病毒载体DNA导入细胞，可在接种细胞内表达完整的CRISPR/Cas核酸酶并实现基因编辑。
植物负链RNA病毒主要包括不分节段负链RNA病毒目弹状病毒科病毒和分节段的布尼亚病毒目病毒，目前关于这类病毒载体的报道较少。论文(Ma等人，Nature Plants,2020,6:773-339)公开了一种利用苦苣菜黄网弹状病毒载体在本氏烟植株体内***递送CRISPR/Cas核酸酶并实现无DNA的基因编辑的方法，但由于病毒寄主范围的限制，目前尚未报道在不同作物中递送CRISPR/Cas核酸酶。论文(Feng等，Proc Natl Acad Sci USA,2020,117:1181-1190)报道了一种布尼亚病毒目番茄斑萎病毒遗传操作和病毒拯救的方法。
发明内容
为克服当前利用植物病毒载体对植物进行无转基因的基因组定点修饰的技术难题，本发明利用番茄斑萎病毒向植物中递送序列特异性核酸修饰酶，所述序列特异性核酸修饰酶可靶向植物基因组特定核酸序列，并切割或修饰靶位点，经过植物内源DNA修复机制完成对所述靶位点的定点修饰，进一步的，所述的番茄斑萎病毒具有***侵染能力，可对序列特异性核酸修饰酶在植物体内进行***递送，并获得不含外源核酸序列整合的定点编辑植物部分，进一步的，不含外源序列整合的定点编辑植物部分(如植物细胞)，经再生后，可获得非转基因的可稳定遗传的定点编辑植物。更进一步的，不含外源序列整合的定点编辑植物部分(如植物细胞)在再生过程中经抗病毒药物处理，可获得不含病毒、非转基因的可稳定遗传的定点编辑植物。
首先，在本发明的第一方面，提供一种对植物细胞遗传物质进行修饰的方法，所述方法无需在待修饰的细胞基因组引入外源遗传物质，其步骤包括：
a)提供至少一个遗传物质待修饰的植物细胞；
b)提供一种番茄斑萎病毒属病毒载体；所述病毒载体***包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶的多核苷酸序列；
c)将所述的病毒载体引入所述的植物细胞，瞬时表达所述的核酸修饰酶；
d)所述序列特异性核酸修饰酶靶向并切割或修饰所述植物细胞基因组特定位点，通过所述植物细胞内源DNA修复机器完成对所述植物细胞遗传物质的修饰。
另一方面，本发明还提供一种产生遗传物质被修饰的植物的方法，所述方法无需在被修饰的细胞基因组引入外源遗传物质，其步骤包括：
a)提供至少一个遗传物质待修饰的植物细胞；
b)提供一种番茄斑萎病毒属病毒载体；所述病毒载体包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶的异源多核苷酸序列；
c)将所述的病毒载体引入所述的植物细胞，瞬时表达所述的核酸修饰酶；
d)所述序列特异性核酸修饰酶靶向并切割或修饰所述植物细胞基因组特定位点，通过所述植物细胞内源DNA修复机器完成对所述植物细胞遗传物质的修饰；
e)从所述植物细胞获得遗传物质被修饰的植物。
在一些实施方案中，所述的方法包括选择所述遗传物质被修饰的植物细胞或植物；优选地，所述的选择过程无需利用选择性标记。
在一些实施方案中，所述的修饰包括在植物细胞靶标基因位点缺失、***或置换一个或多个核苷酸，或上述修饰方式的组合。
在一些实施方案中，所述编码序列特异性核酸修饰酶的异源多核苷酸序列为任何能实现基因组编辑的核酸酶、其突变形式或其衍生物；优选地，所述序列特异性核酸修饰酶选自CRISPR/Cas核酸酶、TALEN核酸酶、锌指核酸酶、归巢核酸酶；更优选为CRISPR/Cas核酸酶；进一步优选为来源于化脓链球菌的CRISPR/SpCas9或来源于毛螺旋菌的CRISPR/LbCas12a(LbCpf1)核酸酶。
在另一些实施方案中，所述的编码序列特异性核酸修饰酶的异源多核苷酸序列为编码任何能实现基因组碱基编辑的多核苷酸序列，如Cas多肽与腺嘌呤脱氨酶(adeninedeaminase)融合形成的腺嘌呤碱基编辑器，或Cas多肽与胞嘧啶脱氨酶(cytidinedeaminase)融合形成的胞嘧啶碱基编辑器。优选地，所述的Cas多肽为来源于化脓链球菌的SpCas9缺口酶(nikase)变体，所述的腺嘌呤脱氨酶为经过人工进化的大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶A(ecTadA)变体(TadA8e V106W)，所述的胞嘧啶脱氨酶是人源载脂蛋白B信使RNA胞嘧啶脱氨酶催化亚基3A(hAPOBEC3A；hA3A)。
在一些实施方案中，所述重组病毒载体***中，病毒载体为番茄斑萎病毒载体；优选地，所述番茄斑萎病毒的三条基因组片段S、M和L多核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同源性。
本发明提供的番茄斑萎病毒载体含有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)外源基因***位点。在一些实施例中，重组番茄斑萎病毒载体S基因组携带一个报告基因，M基因组携带另一个报告基因，报告基因被可操作地连接于病毒mRNA转录相关的顺式元件。优选地，所述的报告基因为绿色荧光蛋白基因(GFP)和红色荧光蛋白基因(RFP)。重组核酸构建体导入植物细胞后，重组病毒的复制和***侵染被报告基因的表达所示踪。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体S基因组片段包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件；优选地，所述的特异性核酸修饰酶组份为嵌合体CRISPR向导RNA多聚核苷酸分子。
在具体的实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体S基因组中编码非结构蛋白NSs的多核苷酸序列的部分或全部被编码所述的序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列或其与其他异源序列融合的序列置换；优选地，其他异源序列为编码荧光报告基因的序列；更优选地，为编码荧光报告基因的序列。
在一些实施方案中，所述编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列为编码向导RNA的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码一个向导RNA。
在一些实施方案中，所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码两个或多个向导RNA。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体M基因组片段包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件；优选地，所述的特异性核酸修饰酶组份为Cas多肽；更优选地，为来源于毛螺旋菌的LbCas12a多肽、或化脓链球菌的SpCas9、或SpCas9变体与碱基脱氨酶融合的腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器。
在优选的实施方案中，所述的编码SpCas9、LbCas12a、腺嘌呤碱基编辑器和胞嘧啶碱基编辑器多肽的序列为植物密码子优化的序列；优选地，所述密码子优化的序列分别如SEQ ID NO:10、11、84、85所示。
在具体的实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体M基因组中编码病毒糖蛋白(GP)多核苷酸序列的部分或全部被所述编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列替换。
在一些实施方案中，所述的番茄斑萎病毒载体L基因组片段的多核苷酸序列为嵌合体序列，其编码病毒聚合酶(RdRp)的多核苷酸序列被密码子优化的RdRp序列替换；优选地，所述密码子优化的RdRp序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体为NSs基因缺失的弱毒型侵染性病毒载体；在另一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体为GP基因缺失而无法被介体昆虫传播的侵染性病毒载体。
进一步，本发明提供了向植物细胞引入侵染性番茄斑萎病毒载体，表达核酸修饰酶，修饰被侵染的植物细胞内遗传物质的方法。在一些实施方案中，所述的核酸修饰酶为CRISPR/LbCas12a核酸酶；在一些实施方案中，所述的核酸修饰酶为CRISPR/SpCas9核酸酶；在一些实施方案中，所述的核酸修饰酶为腺嘌呤碱基编辑器；在一些实施方案中，所述的核酸修饰酶为胞嘧啶碱基编辑器。
在一些实施方案中，所述病毒载体引入植物细胞的方法为将包含病毒载体多核苷酸序列的核酸构建体在足以实现重组病毒产生的条件下引入植物细胞。
在优选的实施方案中，所述方法中使用的重组病毒载体或核酸构建体为农杆菌双元质粒，含有可调控转录的启动子及终止子；所述的引入植物细胞的方法为农杆菌侵染法。
在一些实施方案中，所述的引入植物细胞的核酸构建体还包括编码一个或多个RNA沉默抑制子(VSR)的辅助表达载体；优选地，其中所述沉默抑制子选自番茄丛矮病毒p19、烟草蚀纹病毒HcPro、大麦条纹花叶病毒γb或番茄斑萎病毒NSs的一种或多种组合。
在一些实施方案中，所述包含病毒载体序列的核酸构建体导入植物细胞后，转录产生番茄斑萎病毒嵌合的S、M和L基因组正义链或负义链RNA；优选地，产生正义链RNA。
在优选的实施方案中，含有番茄斑萎病毒S、M和L嵌合体基因组片段的核酸构建体的浓度比为1-2:2-10:1-2；优选为1:10:2。进一步地，所述核酸构建体为农杆菌双元质粒；所述的浓度比为农杆菌菌液混合物中携带不同双元质粒的农杆菌株系的浓度比。
在一些实施方案中，所述病毒载体引入植物细胞的方法为利用重组病毒粒子接种植物，包括机械摩擦、高压喷雾、嫁接接种。
在优选的实施方案中，所述遗传物质待修饰的植物为番茄斑萎病毒属病毒可以***或局部侵染的天然或实验寄主植物；进一步地，所述的寄主植物包括但不局限于，本氏烟(Nicotiana benthamiana)、普通烟(N.tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、甜椒(Capsicum annuum)、红辣椒(C.frutescens)、中华辣椒(C.Chinense)、花生(Arachishypogaea)、马铃薯(Solanum tuberosum)、灯笼果(Physalis alkekengi)、茄子(Solanummelongena)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)、莴苣(Lactuca sativa)、菠菜(Spinacia oleracea)、西瓜(Citrullus lanatus)、黄瓜(Cucumis sativus)、蚕豆(Vicia faba)、黑绿豆(Vigna mungo)、绿豆(Vigna radiata)或豇豆(Vignaunguiculata)。
在一些实施方案中，所述遗传物质待修饰的植物包括番茄斑萎病毒属病毒寄主植物的不同品种或基因型。在优选的实施方案中包括但不限于多个花生品种，如花育25、花育32、花育39、花育48、花育9616、丰油68、红花1号、大白沙、四粒红、硕丰518。在另一些优选的实施方案中包含但不限于甜椒的多个品种，如皱辣2号、皱辣3号、皱辣4号、福湘秀丽、博辣5号、博辣7、博辣15、兴蔬201、兴蔬301、兴蔬归燕。
在一些实施方案中，引入植物细胞的侵染性番茄斑萎病毒载体表达LbCas12a多肽和单个向导RNA，形成的核酸酶复合体靶向本氏烟crFucT靶点序列(SEQ ID NO:86)和crDCL2靶点序列(SEQ ID NO:87)、或本氏烟和普通烟保守的crPDS1靶点序列(SEQ ID NO:12)、或番茄crPDS2靶点序列(SEQ ID NO:13)、或辣椒的crPDS3靶点序列(SEQ ID NO:14)和crPDS6靶点序列(SEQ ID NO:99)、或花生和大豆的crPDS4靶点序列(SEQ ID NO:15)、或花生crPDS5靶点序列(SEQ ID NO:98)、或灯笼果crER靶点序列(SEQ ID NO:88)。
在一些实施方案中，引入植物细胞的侵染性番茄斑萎病毒载体表达LbCas12a多肽和多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)串联的向导RNA，形成多个核酸酶复合体靶向多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)靶点序列。在优选的实施例中，串联表达两个向导RNA分别靶向本氏烟crPDS1和crFucT靶点，或串联表达3个向导RNA分别crPDS1、crFucT和crDCL2靶点。
在一些实施方案中，引入植物细胞的侵染性番茄斑萎病毒载体表达SpCas9多肽和单个向导RNA，形成的核酸酶复合体靶向本氏烟GFP转基因的gGFP靶点序列(SEQ ID NO:16)、或本氏烟内源基因的gPDS2靶点序列(SEQ ID NO:89)、gRDR6靶点序列(SEQ ID NO:90)、或gSGS3靶点序列(SEQ ID NO:91)、或自本氏烟和普通烟保守的gPDS1靶点序列(SEQID NO:17)。
在一些实施方案中，引入植物细胞的侵染性番茄斑萎病毒载体表达SpCas9多肽和多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)串联的向导RNA，形成的多个核酸酶复合体靶向多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)靶点序列。在优选的实施例中，串联表达两个向导RNA分别靶向本氏烟gPDS2和gRDR6靶点，或串联表达3个向导RNA分别gPDS2、gRDR6和gSGS3靶点。
在一些实施方案中，引入植物细胞的侵染性番茄斑萎病毒载体表达腺嘌呤碱基编辑器多肽和向导RNA，形成的碱基修饰酶复合体靶向本氏烟gPDSa靶点序列(SEQ ID NO:92)、或gFucTa1靶点序列(SEQ ID NO:93)、或gBBLd靶点序列(SEQ ID NO:97)。
在一些实施方案中，引入植物细胞的侵染性番茄斑萎病毒载体表达胞嘧啶碱基编辑器多肽和向导RNA，形成的碱基修饰酶复合体靶向本氏烟gFucTa2靶点序列(SEQ ID NO:94)、或gRDR6a1靶点序列(SEQ ID NO:95)、或gRDR6a2靶点序列(SEQ ID NO:96)。
进一步，本发明还提供了从病毒载体侵染的、遗传物质被修饰的植物细胞获得植物，以及选择遗传物质被修饰的植物的方法。
本发明中的植物细胞可以为完整植株上的细胞，也可以为离体植物细胞，如愈伤组织、悬浮细胞、原生质体。在本发明的一些优选实施方式中，所述的细胞为被完整植株上的细胞。
在本发明的一些实施方式中，将病毒侵染的植物细胞或组织作为外植体(explant)，在无选择标记(如抗生素、除草剂等)的培养基上进行组织培养和植株再生，获得遗传物质被修饰的植物。
进一步，该方法还包含从再生植株中选择遗传物质被修饰的植物，所述的选择过程无需通过选择标记(如抗生素、除草剂等)选择。本发明另一些实施例中，选择遗传物质被修饰的植株的方法无需利用选择标记基因，采用的鉴定方法为限制性内切酶保护分析、Sanger测序分析和高通量测序分析的一种或都多种组合。
在本发明的一些优选实施方式中，番茄斑萎病毒核酸酶递送载体侵染的本氏烟叶片细胞被用于组织培养，获得了没有外源核酸***的、遗传物质被修饰的植株。
在本发明的一些优选实施方式中，番茄斑萎病毒核酸酶递送载体侵染的普通烟叶片细胞被用于组织培养，获得了没有外源核酸***的、遗传物质被修饰的植株。
在本发明的一些优选实施方式中，番茄斑萎病毒核酸酶递送载体侵染的番茄叶片细胞被用于进行组织培养，获得了没有外源核酸***的、遗传物质被修饰的植株。
本发明进一步比较了含有或不含NSs基因的番茄斑萎病毒载体的侵染对植物细胞的分化和再生影响，发现NSs的存在抑制植物再生。因此，本发明的一些优选实施方式中，被缺失NSs的番茄斑萎病毒载体侵染的植物细胞被用来组织培养再生遗传物质被修饰的植株。
在本发明的另一方面，提供了一种从被番茄斑萎病毒属病毒感染的细胞通过组织培养获得无病毒植株的方法，其步骤包括：
a)提供至少一个被番茄斑萎病毒属病毒感染的植物细胞；
b)将所述植物细胞在含有抗病毒化合物的培养基上进行组织培养和植株再生；
c)获得并鉴定脱除病毒的再生植株。
在一些实施方案中，所述的抗病毒化合物为利巴韦林，100％的再生植株脱除了病毒，而无抗病毒药物对照中仅4.4％的再生植株脱除病毒。
在一些实施方案中，所述的抗病毒化合物为法匹拉韦，66.7％的再生植株脱除了病毒。
在一些实施方案中，所述的抗病毒化合物为瑞德西韦，15.6％的再生植株脱除了病毒。
本发明的另一方面提供一种重组病毒载体***，其包含一个或多个重组病毒载体，包含：
a)番茄斑萎病毒属病毒载体的多核苷酸序列，以及
b)编码至少一个序列特异性核酸修饰酶的异源多核苷酸序列，且所述异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒转录顺式元件；
所述的病毒载体***导入植物细胞后复制并表达所述的序列特异性核酸修饰酶，所述的序列特异性核酸修饰酶靶向并切割或修饰所述的植物细胞基因组特定靶标位点。
所述的序列特异性核酸修饰酶为任何能实现基因组修饰的核酸酶、其突变形式或其衍生物；优选地，所述序列特异性核酸修饰酶选自CRISPR/Cas核酸酶；更优选为来源于化脓链球菌的CRISPR/SpCas9、或来源于毛螺旋菌的CRISPR/LbCas12a(LbCpf1)核酸酶、或基于CRISPR/SpCas9核酸酶变体构建的腺嘌呤碱基编辑器和胞嘧啶碱基编辑器。
在一些实施方案中，其中所述病毒载体来自番茄斑萎病毒；优选地，所述番茄斑萎病毒的三条基因组片段S、M和L多核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同源性。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体S基因组片段包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件；优选地，所述的特异性核酸修饰酶组份为嵌合体CRISPR向导RNA多聚核苷酸分子。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体S基因组中编码非结构蛋白NSs的多核苷酸序列的部分或全部被编码所述的序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列或其与其他异源序列融合的序列置换；优选地，其他序列为编码荧光报告基因的序列。
在一些实施方案中，所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码一个向导RNA。
在一些实施方案中，所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码两个或多个向导RNA。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体M基因组片段包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件；优选地，所述的特异性核酸修饰酶组份为Cas多肽；更优选地，为来源于化脓链球菌的SpCas9、或毛螺旋菌的LbCas12a多肽、或SpCas9变体与碱基脱氨酶融合的腺嘌呤碱基编辑器和胞嘧啶碱基编辑器。
在优选的实施方案中，所述的编码SpCas9或LbCas12a、腺嘌呤碱基编辑器和胞嘧啶碱基编辑器多肽的序列为植物密码子优化的序列；优选地，所述密码子优化的序列如SEQID NO:10、11、84、85所示。
在优选的实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体M基因组中编码病毒糖蛋白(GP)多核苷酸序列的部分或全部被所述编码序列特异性核酸修饰酶组份的异源多核苷酸序列替换。
在一些实施方案中，所述番茄斑萎病毒载体L基因组片段的多核苷酸序列为嵌合体序列，其编码病毒聚合酶(RdRp)的多核苷酸序列被密码子优化的RdRp序列替换；优选地，所述密码子优化的RdRp序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方案中，所述病毒载体为包含病毒载体多核苷酸序列的核酸构建体；其中，所述核酸构建体引入植物细胞后能够形成侵染性重组病毒载体；优选地，所述核酸构建体为农杆菌双元质粒，含有可调控转录的启动子及终止子；所述引入植物细胞的方法为农杆菌侵染法。
在优选的实施方案中，共同引入植物细胞的核酸构建体还包括编码一个或多个RNA沉默抑制子(VSR)的辅助表达载体；优选地，其中所述沉默抑制子选自番茄丛矮病毒p19、烟草蚀纹病毒HcPro、大麦条纹花叶病毒γb或番茄斑萎病毒NSs中的一种或多种。
进一步地，所述包含病毒载体序列的核酸构建体导入植物细胞后，转录产生番茄斑萎病毒嵌合的S、M和L基因组正义链或负义链RNA；优选地，产生正义链RNA。
在优选的实施方案中，含有番茄斑萎病毒S、M和L嵌合体基因组片段的核酸构建体的浓度比为1-2:2-10:1-2；优选为1:10:2。
在优选的实施方案中，其中所述的核酸构建体为农杆菌双元质粒；所述的浓度比为农杆菌菌液混合物中携带不同双元质粒的农杆菌株系的浓度比。
在一些实施方案中，所述病毒载体引入植物细胞的方法为利用重组病毒粒子侵染，包括机械摩擦、高压喷雾、嫁接接种。
在一些实施方案中，所述病毒载体为NSs基因缺失的弱毒型侵染性病毒载体。
在一些实施方案中，所述病毒载体为GP基因缺失而无法被介体昆虫传播的侵染性病毒载体。
在本发明的另一方面，还提供了包含上文所述重组病毒载体***的细菌菌株或重组病毒粒子；优选地，所述细菌为大肠杆菌或农杆菌。
另一方面，本发明还提供了所述重组病毒载体***的试剂盒，其中含有所述病毒载体的试剂可以单独提供，也可以组合提供，包括：
a)包含番茄斑萎病毒S、M和L基因组片段的核酸构建体组合物，所述的基因组片段包含至少一个编码序列特异性核酸修饰酶的异源多核苷酸序列；
b)编码一个或多个RNA沉默抑制子(VSR)的辅助表达载体；优选地，其中所述沉默抑制子选自番茄丛矮病毒p19、烟草蚀纹病毒HcPro、大麦条纹花叶病毒γb或番茄斑萎病毒NSs中的一种或多种。
进一步地，所述试剂盒还包含使用手册或说明书。
在另一方面，本发明还涉及了上文所述的重组病毒载体***、菌株或重组病毒、试剂盒或方法在植物基因组编辑中的应用。
在另一方面，本发明还提供了根据上文所述的重组病毒载体***侵染产生的或根据上文所述的方法产生的、遗传物质被修饰的植物及子代植物。
附图说明
图1：番茄斑萎病毒(TSWV)载体递送CRISPR/Cas核酸酶进行植物基因编辑的方法。将携带核酸酶序列的重组病毒载体农杆菌浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)下部叶片，病毒载体***侵染植株，含有重组病毒粒子的植株汁液可进一步接种其他病毒寄主植物，病毒载体在侵染的植株细胞内表达核酸酶并产生基因编辑。以病毒侵染的植物组织作为外植体，经组织培养获得再生植株。PCR扩增靶标序列，通过限制性内切酶保护试验和Sanger测序选择被编辑的再生植株及后代。
图2：TSWV病毒粒子形态和基因组结构。(2A)显示TSWV近球形病毒粒子，表面有一层脂膜包裹，脂膜上锚定着病毒编码的Gn和Gc糖蛋白突起。病毒粒子内部包含核衣壳蛋白(N)包裹的三条单链负义RNA基因组，并结合有少量拷贝的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。(2B)示意TSWV基因组结构。根据分子量大小不同而命名的三条基因组，L及其负义编码的RdRp；M及其双义编码的运动蛋白NSm、糖蛋白前体GP；S链及其双义编码的外壳蛋白N和NSs蛋白。
图3：质粒载体图谱。(3A)示意pCB301-2μ-HDV质粒图谱，用于构建病毒基因组cDNA克隆。上图的质粒包含2×35S为35S启动子(SEQ ID NO:9)、丁型肝炎病毒核酶序列(HDV-Rz)、NOS终止子、双元载体T-DNA左臂(LB)和右臂(RB)、酵母复制原点(2μori)、酵母TRP1营养自养标记、细菌复制原点(oriV)、卡那霉素抗性基因(KanR)、以及复制酶基因trfA。下方示意病毒cDNA序列可***于StuI和SmaI消化的载体，以转录产生末端序列忠实的病毒RNA。(3B)示意构建瞬时表达载体所使用的pGD农杆菌双元载体图谱。
图4：可同时表达两个报告基因的TSWV载体构建示意图。(4A)为L反基因组cDNA克隆载体pL(+)，以及其中RdRp编码序列(SEQ ID NO:4)被密码子优化的序列替换(SEQ ID NO:5)的载体pL(+)opt。(4B)为M基因组cDNA克隆载体pM(-)，以及GP编码序列(SEQ ID NO:6)被红色荧光蛋白(RFP)基因替换的基因组cDNA克隆载体(pM(-)RFP)和反基因组cDNA克隆载体(pM(+)RFP)。(4C)为S反基因组cDNA克隆载体pS(+)，以及NSs编码序列被绿色荧光蛋白基因(GFP)替换衍生载体pS(+)GFP。2×35S：双35S启动子；Rz：丁型肝炎病毒核酶；NOS：NOS终止子；5’和3’：病毒基因组5’非编码区和3’非编码区(5’UTR和3’UTR)；IGR：基因间隔区。
图5：同时表达两个荧光报告基因的TSWV载体。(5A)示意含有不同核酸构建体的农杆菌接种混合物组合。(5B)为不同农杆菌组合物的浸润本氏烟叶片5天后浸润叶和10天后***叶内GFP和RFP的荧光图像。(5C)为接种10天后重组病毒侵染本氏烟所产生的症状及荧光成像图片。Mock：接种组合物中不含pL(+)opt的阴性对照。(5D)Western blot检测TSWV结构蛋白N、GFP、RFP蛋白在病毒侵染的***叶片中的表达。
图6：不同RNA沉默抑制子(VSR)对TSWV载体拯救的作用。(6A)示意含有一个或多个VSRs和TWSV载体核酸构建体的农杆菌混合物组合。(6B)为表达单个或组合的VSR时TSWV载体的拯救效率的图表。
图7：TSWV-Cas12a-crRNA载体构建示意。pL(+)opt为含有密码子优化RdRp的L反基因组链(正义)cDNA克隆；pM(-)Cas12a和pM(+)Cas12a分别为GP基因被Cas12a编码序列替换的M基因组(负义)和反基因组链(正义)cDNA克隆；pS(+)crRNA:GFP为NSs基因被GFP基因替换且5’***crRNA序列的S反基因组cDNA克隆。2×35S：双35S启动子；Rz：丁型肝炎病毒核酶；NOS：NOS终止子；5’和3’UTR：5’和3’非编码区；IGR：基因间隔区；m7G：mRNA帽子；DR：crRNA直接重复区(direct repeat)；guide：crRNA向导序列。
图8：TSWV-Cas12a-crRNA载体的拯救体系。(8A)显示不同农杆菌浸润混合物组合浸润本氏烟叶片5天后，重组TSWV S基因组表达的GFP荧光。(8B)为从pM(-)Cas12a和pM(+)Cas12a载体获得的TSWV载体诱导的症状。Mock：接种组合物中不含pL(+)opt构建体的阴性对照。(8C)为Western blot图片显示***侵染组织中病毒N蛋白、GFP和Cas12a的表达。(8D)为RT-PCR检测重组病毒M基因组中Cas12a基因的完整性。上图示意NSm与Cas12a基因PCR检测引物的设计，下图为PCR产物的凝胶电泳图。(8E)为Sanger测序峰图，显示pM(-)Cas12a(组4)拯救的TSWV载体M基因组中Cas12a大部分序列丢失，仅保留5’和3’少量编码区。
图9：TSWV-Cas12a-crRNA载体侵染本氏烟并产生靶向基因编辑。(9A)本氏烟PDS基因结构图及靶点序列。其中，PDSa和PDSb代表异源四倍体本氏烟的两个PDS拷贝，所选crPDS1靶点在PDSa和PDSb基因中保守。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(9B)重组病毒接种本氏烟所产生的症状及表达的GFP荧光。(9C)Western blot检测TSWV N蛋白和GFP、Cas12a蛋白表达。(9D)PCR/RE法检测crPDS1靶点编辑频率。Mock/U：健康本氏烟PCR产物未被限制性内切酶消化，Mock/D：健康本氏烟PCR产物被限制性内切酶消化。Indel(％)代表不能被HinfI酶切的PCR产物占总PCR产物的百分比。
图10：TSWV-Cas12a-crRNA病毒粒子机械接种侵染多种植物并产生基因编辑。(10A)为试验流程示意图。通过农杆菌浸润接种在本氏烟植株中拯救重组病毒载体，以含有病毒粒子的本氏烟汁液为毒源摩擦或高压喷雾接种其它植物，待植物被侵染后检测靶标位点的基因编辑。(10B)显示重组病毒粒子摩擦接种本氏烟、马铃薯、灯笼果、生菜和棉花植株并表达GFP荧光。(10C)为Western blot检测被侵染本氏烟***叶片内病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(10D)为PCR/RE分析摩擦接种的本氏烟内PDS靶点的基因编辑。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。
图11：TSWV-Cas12a-crRNA粒子侵染普通烟并产生基因编辑。(11A)示意普通烟PDS基因结构图和靶点序列。PDSa和PDSb代表异源四倍体普通烟的两个PDS拷贝，所选crPDS1在普通烟PDSa和PDSb中保守。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(11B)为TSWV-Cas12a-crRNA粒子摩擦接种普通烟5天后产生的症状及***叶荧光图片。上图为Mock对照，下图为TSWV-Cas12a-crRNA粒子接种的植物。(11C)为Western blot分析病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(11D)为PCR/RE分析摩擦普通烟PDS靶点的基因编辑。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。
图12：TSWV-Cas12a-crRNA病毒粒子侵染番茄并产生基因编辑。(12A)示意番茄PDS基因结构图和靶点序列。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(12B)为TSWV-Cas12a-crRNA粒子摩擦接种番茄产生的症状及***叶荧光图片。Mock：接种缓冲液对照。(12C)为Western blot分析病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(12D)为PCR/RE分析摩擦番茄PDS靶点的基因编辑。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。
图13：TSWV-Cas12a-crRNA病毒粒子侵染辣椒并产生基因编辑。(13A)示意辣椒PDS基因结构图和靶点序列，该靶点在红辣椒、甜椒、中华辣椒中均保守。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(13B)为病毒粒子摩擦接种红辣椒(C.frutescens)、甜椒(C.annuum)和中华辣椒(C.chinense)产生的症状及***叶荧光图片。上图为健康对照，下图为病毒侵染植株。(13C)为Western blot分析病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(13D)为PCR/RE分析病毒侵染的红辣椒(C.frutescens)组织中PDS靶点的基因编辑。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。(13E)为高通量测序分析病毒侵染的红辣椒、甜椒和中华辣椒组织内的靶基因突变频率。
图14：TSWV-Cas12a-crRNA侵染灯笼果并产生基因编辑。(14A)为TSWV-Cas12a-crRNA粒子摩擦接种灯笼果产生的症状及***叶荧光图片。Mock：接种缓冲液对照。(14B)为Western blot分析病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(14C)显示病毒载体***侵染灯笼果的效率和***侵染的组织中ER靶点的基因编辑效率。
图15：TSWV-Cas12a-crRNA粒子侵染花生并产生基因编辑。(15A)示意花生PDS基因结构图和靶点序列。PDSa和PDSb代表异源四倍体花生的两个PDS拷贝，crPDS4在花生两个PDS拷贝中保守。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，其中(G)为紧邻靶点的旁侧序列，与相邻的靶标序列组成NdeI酶切位点。粗体字母代表PAM序列。(15B)为病毒粒子摩擦接种普通烟5天后产生的症状及***叶荧光图片。左图为Mock对照，右图为病毒粒子接种的植物。(15C)为Western blot分析病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(15D)为PCR/RE分析摩擦花生PDS靶点的基因编辑。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。图16：TSWV-Cas12a-crRNA病毒粒子侵染大豆并产生基因编辑。(16A)示意大豆PDS基因结构图和靶点序列。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(16B)为病毒粒子注射大豆子叶4天和8天后的荧光图片。(16C)为Western blot分析病毒N蛋白、GFP和Cas12a蛋白的表达。(16D)为PCR/RE分析摩擦大豆PDS靶点的基因编辑。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。
图17：TSWV编辑载体对不同甜椒品种的侵染和编辑效率。(17A)为Western blot检测侵染植株组织中的TSWV N蛋白和GFP、Cas12a蛋白的表达。(17B显示TSWV载体对不同甜椒品种的***侵染效率以及靶标基因编辑效率。每个品种有三个生物学重复。
图18：TSWV编辑载体对不同花生品种的侵染和编辑效率。(18A)显示TSWV载体侵染各个花生品种产生的症状。(18B)为Western blot检测侵染植株组织中TSWV N蛋白和GFP、Cas12a蛋白表达。(18C)显示TSWV载体对不同花生品种的***侵染效率以及靶标基因编辑效率。每个品种有三个生物学重复。
图19：TSWV-Cas12a-crRNA多靶标编辑载体同时编辑多个靶标基因。(19A)显示多靶标载体表达多个crRNA的示意图。S1，S2，S3为Spacer(间隔序列)1，Spacer 2和Spacer 3序列；DR为direct repeat(直接重复序列)；UTR为病毒非编码区。红色箭头示意Cas12a切割位点，产生一个或多个成熟的crRNA。(19B)为TSWV单靶标和多靶标编辑载体侵染本氏烟产生的症状。(19C)显示了多靶标编辑载体在各个靶点产生的编辑效率与单靶标载体在各自位点上的编辑效率相似。ns，无限制性差异(n＝6生物学重复，two-tailed Student’s t-test)。
图20：TSWV-Cas9-gRNA表达载体构建示意图。pL(+)opt为含有密码子优化RdRp(SEQID NO:5)的L反基因组链(正义)cDNA克隆pM(-)Cas9和pM(+)Cas9分别为GP基因被Cas9编码序列替换的M基因组(负义)和反基因组(正义)cDNA克隆；pS(+)RFP:gRNA为NSs基因被RFP基因替换且5’***gRNA序列的S反基因组cDNA克隆。病毒复制转录时，S基因组中RFP和gRNA融合序列被转录为mRNA，M基因组中表达的Cas9蛋白结合gRNA序列，而植物内源的RNA酶加工去除两端额外序列。2×35S：双35S启动子；Rz：丁型肝炎病毒核酶；NOS：NOS终止子；5’和3’UTR：5’和3’非编码区；IGR：基因间隔区；m7G：mRNA帽子；scaffold：gRNA骨架序列(crRNA与tracrRNA)；guide：gRNA向导序列。
图21：pM(-)Cas9和pM(+)Cas9构建体拯救重组TSWV-CRISPR/Cas9载体的效率比较。
图22：TSWV-Cas9-gRNA载体编辑本氏烟GFP转基因。(22A)显示重组病毒侵染本氏烟16C植株产生的症状及荧光成像图。(22B)为Western blot检测TSWV N蛋白、RFP、GFP、Cas9表达。(22C)显示PCR/RE法检测GFP基因靶点的编辑效率。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。(22D)显示Sanger测序验证靶标序列的编辑。wt：野生型；d#：缺失#个碱基；×#：#个克隆。
图23：TSWV-Cas9-gRNA载体编辑本氏烟PDS靶点。(23A)本氏烟PDS基因结构图及靶点序列。PDSa和PDSb代表异源四倍体本氏烟的两个PDS拷贝，所选gPDS1在PDSa和PDSb中保守。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(23B)为重组病毒接种本氏烟所产生的症状图。(23C)为Westernblot检测TSWV结构蛋白N和Cas9蛋白的表达。(23D)PCR/RE法检测PDS靶点编辑频率。Mock/U：健康本氏烟PCR产物未被限制性内切酶消化，Mock/D：健康本氏烟PCR产物被限制性内切酶消化。
图24：TSWV-Cas9-gRNA病毒粒子侵染普通烟并产生基因编辑。(24A)示意普通烟PDS基因结构图和靶点序列。所选gPDS1在异源四倍体普通烟的PDSa和PDSb两个拷贝中保守。红色竖线代表靶标序列所在位置，下划线代表靶标序列中包含的限制性内切酶识别序列，粗体字母代表PAM序列。(24B)为TSWV-Cas9-gRNA粒子摩擦接种普通烟产生的照片。(24C)为Western blot分析病毒N蛋白和Cas9蛋白的表达。(24D)为PCR/RE分析摩擦普通烟PDS靶点的基因编辑效率。Indel(％)代表靶标基因编辑频率。
图25：TSWV-Cas9-gRNA多靶标编辑载体同时编辑多个靶标基因。(25A)显示多靶标编辑载体表达多个sgRNA的示意图。S1，S2，S3为Spacer1，Spacer2和Spacer3序列；Scaffold为sgRNA骨架序列；UTR为病毒非编码区。包埋在病毒mRNA中gRNA的加工依赖于Cas9蛋白的结合以及植物内源的RNA酶加工去除两端额外的序列。(25B)为TSWV-Cas9-gRNA单靶标和多靶标编辑载体侵染本氏烟产生的症状。(25C)的柱状图显示了多靶标编辑载体在各个靶点产生的编辑效率与单靶标载体在各自位点上的编辑效率相似。ns，无限制性差异(n＝3-6个生物学重复，two-tailed Student’s t-test)。
图26：TSWV-ABE-gRNA表达载体构建示意图。pL(+)opt为含有密码子优化RdRp(SEQID NO:5)的L反基因组链(正义)cDNA克隆；pM(+)ABE为GP基因被ABE编码序列替换的M反基因组链(正义)cDNA克隆；pS(+)GFP:gRNA为NSs基因被GFP基因替换且3’***gRNA序列的S反基因组cDNA克隆。2×35S：双35S启动子；Rz：丁型肝炎病毒核酶；NOS：NOS终止子。
图27：TSWV-ABE-gRNA载体编辑本氏烟内源基因靶点。(27A)为重组病毒侵染本氏烟所产生的症状图及表达的GFP荧光。(27B)为Western blot检测TSWV结构蛋白N、GFP和碱基编辑器的表达。(27C)的柱状图显示高通量测序检测PDSa、FucTa和BBLd靶点碱基编辑频率。(27D)的柱状图显示高通量测序检测靶点碱基编辑窗口内碱基A向G(或T向C)的替换频率。
图28：TSWV-CBE-gRNA表达载体构建示意图。pM(+)CBE为GP基因被CBE编码序列替换的M反基因组链(正义)cDNA克隆。2×35S：双35S启动子；Rz：丁型肝炎病毒核酶；NOS：NOS终止子。
图29：TSWV-CBE-gRNA载体编辑本氏烟内源基因靶点。(29A)为重组病毒接种本氏烟所产生的症状图及表达的GFP荧光。(29B)为Western blot检测TSWV结构蛋白N、GFP和碱基编辑器的表达。(29C)的柱状图显示高通量测序检测RDR6a和FucTa靶点碱基编辑频率。(29D)的柱状图显示靶点碱基编辑窗口内碱基C向T(或G向A)的替换频率。
图30：从TSWV-Cas12a-crRNA侵染的本氏烟细胞组培再生突变体植物。(30A)选取TSWV-Cas12a-crRNA侵染的本氏烟上部叶片作为外植体进行组织培养，经脱分化和生根后得到再生苗。红色圆圈示意一株PDS失去功能的白化苗。(30B)和(30C)显示PCR/RE法和Sanger测序检测3株(M0-1/-2/-3)再生植株PDS靶点的基因编辑。其中M0-3为白化苗。wt：野生型；d#：缺失#个碱基。
图31：从TSWV-Cas9-gRNA载体侵染的转基因本氏烟细胞组培再生突变体植物。(31A)显示3株再生植株及GFP荧光成像。(31B)显示Sanger测序确定3株再生植株gGFP位点基因型。斜体字母示意碱基***；“-”表示碱基缺失；粗体字母表示PAM序列。i1：***一个碱基；d1：缺失1个碱基。
图32：从TSWV-Cas12a-crRNA侵染的番茄细胞组培再生突变体植株。(32A)显示组织培养三周后离体叶片已经诱导出愈伤并且分化成芽(红色圆圈示意)。(32B)显示白化的愈伤组织(上图)和诱导生根的再生植株(下图)。(32C)显示PCR/RE分析5株再生苗的PDS靶点的基因编辑。(32D)显示Sanger测序鉴定5株(M0-1/-2/-3/-4/-5)再生植株PDS靶点的基因型。wt：野生型；d#：缺失#个碱基。
图33：抗病毒药物处理促进再生植株脱除病毒的实验流程图。
图34：抗病毒药物对再生苗的病毒清除作用。(34A)为再生植株中病毒RT-PCR检测结果。采用TSWV N的特异性引物对病毒的存在进行检测而本氏烟内源Actin引物作为内参。(34B)的柱状图显示各种药物处理后病毒清除率。
图35：抗病毒药物处理对再生苗的编辑效率的影响。(35A)实现本氏烟再生苗的表现。部分再生苗因PDS四个等位基因(本氏烟为异源四倍体)敲除出现白化表型。(35B)的柱状图显示不同药物处理后再生苗中各类突变类型所占的百分比。通过对PDS-A和PDS-B基因靶位点区域序列的PCR扩增子进行高通量测序，以确定靶基因突变类型。使用以下定义来指定本氏烟的PDS-A和PDS-B的基因型：编辑效率(indels％)在0-10.0％的为野生型(Wildtype,WT)；10％<indels％≤35.0％为嵌合突变(Chimeric,Chi)；35.0％<indels％≤80.0％为杂合突变(Heterozygote,He),即一个等位基因靶位点处发生了编辑但另一等位基因为野生型；编辑效率在80.0％和100.0％之间的，若两个等位基因均发生了同样类型的编辑则为纯合突变(Homozygous,Ho)，若两个等位基因产生了两种不同的编辑类型则为双等位突变(Biallelic,Bi)。
图36：再生植株后代表型分离遗传分析。(36A)显示两个含有PDS基因突变的再生植株后代表型分离比例。RB-#54(-20/wt；-10/wt)绿色苗：百化苗的分离比符合15:1，而RD-#76(-11/-12；-11/-14)的分离比符合3:1。(36B)的表格显示再生M0株系的M1后代植株的表型分离比和统计分析。M0植株PDS-A和PDS-B基因均有突变，但因为等位基因中存在至少一个野生型等位基因或非移码突变(-6，-9，-12；蓝色字母标注)而导致植株仍然表现为绿色。这些M0经自交后产生的M1代植株性状分离产生白化苗。χ2P值通过卡方统计得出，P值>0.5表示实际分离比与理论分离比非常吻合。
图37：从TSWV-Cas12a-crRNA侵染的普通烟细胞组培再生突变体植株。(37A)显示在生根培养基上的普通烟再生苗。(37B)各组含有编辑的植株占各组总数的比值。通过包含NtPDS-A和NtPDS-B同源物中靶位点区域序列的PCR扩增子的HTS对植株进行编辑分析。indels<＝10％认定为野生型，indels>10％认定为编辑植株。(37C)每组M0植株中各突变基因型的占比。
图38：含有NSs基因的TSWV-Cas9-gRNA载体拯救效率下降以及干扰植株再生。(38A)示意M基因组含有gRNA***，且NSs基因保留(pS(+)NSs:gPDS1)或被RFP置换(pS(+)RFP:gPDS1)的构建体。(38B)显示含有或不含NSs基因TSWV-Cas9-gRNA侵染本氏烟表现出相似的症状，以及(38C)在***侵染组织中的产生相当的靶标基因编辑频率。(38D)表明NSs基因的存在使重组病毒载体拯救效率显著下降。(38E)表明含有或不含NSs的重组TSWV粒子摩擦接种本氏烟具有类似的侵染率。(38F)显示保留NSs基因的TSWV-Cas9-gRNA载体侵染的本氏烟细胞无法再生。含有NSs的编辑载体侵染的本氏烟叶片组织在组培再生时出现坏死，而去除NSs的病毒载体则不影响再生。
具体实施方式
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明并不必要将其应用限定在以下说明书所示的或由实施例例证的详述中。本发明可有其它实施方案或可以各种方式实施或完成。此外，还应当理解本文所使用的词组和术语是为了描述的目的，并且不能理解为限制。
提供以下定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员以实施本发明。除非特别指出，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、病毒学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Michael R.Green和Joseph Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(4th edition)；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，2012。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
定义
术语“包含”、“包括”、“含有”“具有”以及它们的同义词的意思是“包括但不限于”。这一术语的范围包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”的范围。
短语“基本上由……组成”的意思是该组合物和方法可包括其它的成分和/或步骤，只要该其它的成分和/或步骤不会实质上地改变所要求的组合物或方法的基础和新颖特征。
如本文所使用的单数形式“一”和“该”包括复数个指代物，除非上下文清楚地以其它方式表明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括复数种化合物，包括其混合物。
本发明中，术语“植物”包括整个植物和任何后代、以及组成植物的植物部分等，植物部分包括但不限于植物细胞，植物细胞培养物，植物组织，植物组织培养物，植物插条，植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎和相关外植体)，植物种子(例如，成熟种子、不成熟的种子、没有种皮的未成熟胚)等。植物细胞可以是处于分离的单个细胞或细胞聚集体的形式(例如，愈伤组织和培养的细胞)，也可以是原生质体、产生配子的细胞，或者是能够再生成为完整植物的细胞或细胞的集合。植物细胞培养物或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学或形态学特征的植物，并能够再生出具有该植物具有基本上相同基因型的植物。植物细胞培养物或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
术语“植物细胞”是植物的结构和生理单元。如本文所使用的，植物细胞包括原生质体和具有部分细胞壁的原生质体。植物细胞可以处于分离的单个细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散愈伤组织和培养的细胞)，并且可以是更高级组织单元(例如，植物组织、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞，或者能够再生成完整植物的细胞或细胞的集合。因此，在本文的实施方案中，包含多个植物细胞并能够再生成为整株植物的种子被认为是一种“植物部分”。植物“后代”包括植物的任何后续世代。
植物“品种(variety)”、“品系(line)”、“栽培种(cultivar)”、“种质(germplasm)”和“基因型(genotype)”在本发明中可互换使用，指分类上属于同一物种(species)内部的植物种类，其基因组合和表型具有可区别于其它植物种类的稳定特征。
“基因”：是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。
术语“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，是指单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“I”表示肌苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，并且“N”表示任何核苷酸。
术语“遗传物质”为亲代与子代之间传递遗传信息的DNA。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以是DNA或RNA；可以是直链的、环状的或支链的，并且可以是单链或双链的。
术语“表达”是指序列信息转变成相应表达产物，包括直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。表达产物也包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化等方法进行修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化以及糖基化进行修饰的蛋白质。
术语“编码”指DNA多核苷酸序列可转录为翻译蛋白质的RNA(mRNA)；或DNA多核苷酸序列可转录为不翻译蛋白质的RNA(tRNA、rRNA等非编码RNA)；或可翻译成蛋白质的RNA多核苷酸序列。
术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。
“融合蛋白”是指将编码两个或以上多肽的基因连接在一起表达产生的多肽链，多肽链之间可以由特定的连接多肽(linker peptide)连接。
“密码子优化”是指将编码序列中的一个或多个密码子用同义密码子(synonymouscodon)替换，以提高目标蛋白在特定宿主细胞内的表达水平。每种生物都显出某种程度的密码子利用差异或偏爱，为提高基因在目的生物中的表达水平，不改变氨基酸的情况下，利用目标生物偏爱的密码子替换目的基因中利用率低的或稀有的密码子。此外，密码子优化的还包括失活可疑的多聚腺苷酸化位点、外显子-内含子剪切位点、可形成二级结构的序列、以及平衡GC含量等，在转录水平提高基因表达水平。“密码子优化”是一种常规的基因设计手段，本领域已有公开专利和计算机程序，用于优化拟在特定植物物种中表达的基因密码子，例如，多个核酸合成商业化公司提供的密码子优化软件、www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)、美国专利881,224,7(Method forachieving improved polypeptide expression)和8224578(Method and device foroptimizing a nucleotide sequence for the purpose of expression of a protein)，文献Murray等人(Nucleic Acids Res 1989,17:477-497)和，Nakamura等人(NucleicAcids Res,2000,28:292)。
“一致性”或“同一性”百分比描述多核苷酸或多肽区段在序列(例如核苷酸序列或氨基酸序列)的比对中相同的程度。序列的比对通过以下生成：手动比对两个序列，例如作为参考的如本文提供的所示序列和另一序列，以产生最高数目的匹配要素，例如个别核苷酸或氨基酸，同时允许将缺口引入任一序列。与参考序列比对的序列的“一致性分数”是匹配要素的数目，除以参考序列的全长，不包括由比对过程引入参考序列的缺口。如本文所使用，“百分比同一性”(“％同一性”)是同一性分数乘以100。
本文所使用的“重组”核酸意指非天然存在的核酸，例如通过人工干预将两个本来分开的核酸片段连接在一起以产生具有目的功能的组合核酸片段。此人工组合常常通过化学合成手段或通过人工操作核酸的分开的区段(例如通过基因工程化技术)来完成。
如本文所使用适用于核酸或多肽的术语“嵌合序列”是指不同来源的两段及以上序列通过人工干预组合成一段重组序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
术语“异源”和“外源”在本文中可以互换使用，是指不存在于天然核酸或蛋白质中的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可连接至天然存在的核酸序列(或其变体)(例如通过基因工程手段)以产生嵌合核酸序列。
术语“载体”指在基因工程技术中将外源核酸片段转移至受体细胞的一种能自我复制的核酸分子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒。
术语“核酸构建体”和“重组载体”、“重组核酸构建体”或“重组表达载体”在本文中可交换使用，是指包含载体和至少一个***的DNA分子，还包括这些构建体通过转录产生的功能性RNA分子，或根据核酸构建体序列通过化学合成的RNA等同物。核酸构建体通常是为了表达和/或繁殖***物或为了构建其它重组核酸序列而产生的重组表达载体。***的DNA分子可以或可以不可操作地连接至启动子序列并且可以或可以不可操作地连接至DNA调节序列。
术语“调控序列”是指存在于编码序列内部或旁侧(5’或3’端)序列中调节转录、RNA加工或稳定性、翻译的特异性核酸序列。调控序列包括，但不限于，启动子、增强子、内含子、转录调控元件、多聚腺苷酸化信号、RNA加工信号、翻译增强元件等。
术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录和翻译被所述调控元件控制和调节。
本发明所使用“启动子”是能够结合RNA聚合酶并且启动下游(3’方向)编码或者非编码序列的转录的DNA调节区，指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够在植物细胞中控制下游基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞还是病毒。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。
“导入”或“引入”植物是指将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质通过包括但不限于农杆菌转化、基因枪轰击、电穿孔、PEG转化等在内的方法转化至植物细胞，使得所述核酸或蛋白质在植物细胞中能够发挥功能。
“农杆菌浸润(agroinfiltration)”是指植物生物学中的一种在植物内诱导基因表达的方法，该方法将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)悬浮液注射植物叶片，存在于细胞间隙的农杆菌将位于双元质粒转移DNA(T-DNA)内部的目标基因转移至植物细胞内部并得到瞬时表达。农杆菌浸润法适用于多种植物，但在本氏烟(Nicotianabenthamiana)和普通烟(Nicotiana tobacum)中最为有效。
“农杆菌侵染(agroinfection)”或“农杆菌接种(agroinoculation)”是指一种利用根癌农杆菌将侵染因子(如病毒或类病毒)接种植物的方法。(类)病毒DNA或cDNA序列被克隆于农杆菌双元质粒的T-DNA区，通过农杆菌侵染转移至植物细胞内，(类)病毒在细胞内复制通常导致***侵染和症状的产生。
术语“瞬时表达”，指利用农杆菌浸润、基因枪轰击、病毒载体感染、PEG介导的原生质体转化等方法将外源核酸序列导入植物细胞、组织、器官或个体，外源核酸序列可以整合或不整合在植物染色体，外源核酸片段可以在导入位置维持一段时间的表达。
“病毒侵染性克隆”是指含有病毒序列的核酸构建体或质粒，其包含的病毒序列导入合适的宿主细胞后能拯救出具有活性的重组病毒。
术语“病毒拯救”是指将病毒侵染性DNA克隆或cDNA克隆导入合适的宿主细胞并产生侵染性病毒的过程。
在本文中，“重组病毒”指利用重组DNA技术产生的病毒。区别于天然存在的野生型病毒，重组病毒的序列可以通过重组DNA技术进行人为地修改。
本文所用“病毒载体”、“重组病毒载体”、“重组病毒表达载体”、“重组病毒载体***”在本文中可交互使用，是指在实验环境中经遗传工程修饰的病毒，目的是为了将异源源核酸序列导入宿主细胞、组织、器官或个体。
在一些实施方案中，病毒载体***可以为一个或多个重组核酸构建体或重组病毒载体的组合物，当导入宿主细胞后可以复制、转录和表达异源序列；在一些实施方案中，所述***可以是分别包含不同核酸构建体或病毒载体的菌株的组合，优选地，所述菌株为农杆菌；在另一些实施方案中，所述病毒载体***还可以为经遗传工程修饰的病毒颗粒。
术语“病毒粒子(virion)”指一种具有侵染活性的病毒结构形式，包含基因组核酸内核和蛋白衣壳，还可以包含或不包含外层的囊膜(envelope)。在本文中，“病毒粒子”包括无包膜结构的、具有侵染活性的病毒核衣壳(nucleocapsid)颗粒。
病毒“正义链”RNA和“负义链”RNA是相对于信使RNA(mRNA)的极性而言的，与mRNA同义的为“正义链”RNA，互补的则为“负义链”RNA。对于负链RNA病毒而言，顾名思义其病毒粒子包裹的基因组RNA(genomic RNA)为负义链RNA，也称为病毒粒子RNA(virion RNA，vRNA)；反之，互补的正义链RNA称为互补RNA(complementary RNA，cRNA)或反基因组RNA(antigenomic RNA，agRNA)。
在本发明中，“遗传修饰”、“基因修饰”、“核酸修饰”、“基因编辑”指通过生物工程的手段对生物体的基因组进行修饰，以改变基因组序列的结构或组成，例如改变基因的序列，包括单个或多个脱氧核苷酸缺失、取代、***，或者以上几种方式的组合；产生可遗传的表观修饰，如DNA甲基化、组蛋白修饰等。
“经遗传修饰的植物”为通过基因工程手段修饰的植物，包括在其基因组内引入单个或多个脱氧核苷酸***、缺失、替换、或者以上几种方式的组合，并且经修饰的遗传序列可以稳定地遗传。
“核酸修饰酶”在本文中指可特异性地靶向并改变细胞内核酸序列的结构或组成的酶类，例如改变基因的序列，包括单个或多个脱氧核苷酸缺失、取代、***，或者以上几种方式的组合；产生可遗传的表观修饰，如DNA甲基化、组蛋白修饰等。
“序列特异性核酸内切酶(sequence-specific endonuclease)”、“核酸内切酶(endonuclease)”、“核酸酶(nuclease)”和“核酸修饰酶(nucleic acid modifyingenzyme)”在本文中可以互换使用，意指具有用于核酸裂解或修饰的活性的酶。
“Cas核酸酶”、“CRISPR核酸酶”、“CRISPR/Cas蛋白”、“Cas蛋白”和“Cas效应蛋白”在本文中可互换使用，指的是包括Cas蛋白或其片段(例如包含Cas的活性DNA切割结构域和/或Cas的向导RNA结合结构域的蛋白)，是一种RNA指导的核酸酶。Cas蛋白是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关***)基因组编辑***的蛋白组份，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链或单链断裂。
“向导RNA”、“gRNA”和“sgRNA”在本文中可互换使用，指结合并引导核酸酶靶向基因组特定位点的RNA分子。向导RNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交的核苷酸序列，以及与Cas蛋白结合形成CRISPR/Cas复合体的核苷酸序列。在CRISPR/Cas9核酸酶***中，向导RNA通常为可部分互补的CRISPR RNA(crRNA)和trans-acting CRISPR RNA(tracrRNA)杂交形成的RNA二元复合体分子，或将该两个RNA分子人为连接形成的一个gRNA分子。在CRISPR/Cas12a核酸酶***中向导RNA仅由crRNA组成，无需tracrRNA分子。
“碱基编辑”是一种对细胞内核酸分子的特定碱基进行编辑的技术，如利用序列特异性核酸修饰酶对细胞内靶标DNA或RNA分子的单个或多个碱基进行脱氨反应，细胞内源DNA复制和修复途径将被脱氨修饰的碱基转变为其它碱基，如胞嘧啶转变为胸腺嘧啶或鸟嘌呤、或腺嘌呤转变为鸟嘌呤。
“碱基编辑器”是一种能够特异性地靶向并修饰核苷酸(例如，DNA或RNA)碱基(例如，A、C、G、T或U)并导致被修饰的碱基发生转变的试剂，根据其修饰碱基的不同可分腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，ABE)、胞嘧啶碱基编辑器(cytosine editor，CBE)等。“碱基编辑器”通常由Cas9切口酶(Cas9 nikase,nCas9)或无核酸酶活性的Cas9(nucleasedead Cas9,dCas9)与碱基脱氨酶及其他的效应蛋白组成的融合蛋白，可在向导RNA的引导下靶向特定核酸序列并催化碱基脱氨反应，脱氨的碱基被细胞内源DNA复制和修复途径转变为其它碱基。
术语“原间隔序列临近基序(Protospacer adjacent motif sequence，PAM)”是指DNA靶标序列区域的一段核酸序列，能够被相应的Cas核酸酶识别，并对于向导RNA引导的Cas核酸酶切割靶DNA起至关重要的作用。
如本文所使用的“靶DNA”为包含“靶位点”或“靶序列”的DNA多核苷酸。术语“靶位点”、“靶序列”、“原间隔序列(protospacer)DNA”在本文中可互换使用，在本发明中指基因组中一段靶DNA片段包含可与向导RNA结合的核酸序列。
植物基因组编辑***
本发明公开了一种利用广寄主谱的植物RNA病毒载体递送序列特异性核酸修饰酶用于植物基因编辑的方法，更具体地包括，但不限于，该病毒载体***用于递送基因编辑元件及修饰植物遗传物质的方法。工程化的侵染性病毒载体被用来携带序列特异性核酸修饰酶核酸序列，该病毒载体侵染植物后在细胞内表达序列特异性核酸修饰酶。所述的核酸修饰酶靶向并切割或修饰植物基因组特定位点产生DNA双链断裂或碱基修饰，细胞内源DNA修复机器完成对所述植物细胞遗传物质的修饰，产生碱基的删除、***、置换突变中的某一种或多种类型的组合。
常用于基因编辑的序列特异性核酸酶包括归巢核酸内切酶(meganuclease)、锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶、以及CRISPR/Cas核酸酶。归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶***通过核酸酶蛋白的DNA结合结构域特异性靶定DNA位点，而CRISPR/Cas核酸酶***依赖一段短的向导RNA引导Cas蛋白识别靶标序列，因此省去了组装多个DNA结合单元的步骤，仅需在细胞内导入Cas蛋白和向导RNA即可实现对靶位点的切割，是应用最广泛的基因组定点编辑***。
根据Cas基因的数目和功能将CRISPR/Cas***分为了2大类5种类型(I～V)，其中容易被工程化为基因编辑工具种类的为第2类的II和V型***，仅需单一Cas效应蛋白。II型CRISPR***包括CRISPR/Cas9***，如来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9和金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SaCas9***，该***包括Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA。crRNA与tracrRNA一部分互补序列杂交形成双链RNA，该结构被细胞内源双链RNA酶切割，帮助crRNA的加工成熟；同时，crRNA与tracrRNA杂交形成二元复合体与Cas9蛋白结合，并引导后者靶向与crRNA原间隔序列(protospacer)配对的靶标DNA序列。工程化的基因编辑CRISPR/Cas9核酸酶***将crRNA与tracrRNA连接在一起形成单一的向导RNA (single guide RNA，sgRNA或gRNA)，向导RNA含有与Cas9结合的序列结构，以及与靶标DNA配对的原间隔序列。Ⅴ型CRISPR/Cas***包括CRISPR/Cas12a(或称Cpf1)，如来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、毛螺科菌属(Lachnospiraceae)和弗朗西斯氏菌属(Franisella novicida)的AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a等，这些同源蛋白都具有RNA 引导的DNA 内切酶的活性。CRISPR/Cas12a核酸酶***仅需单个向导RNA，即crRNA，不需要tracrRNA的参与。crRNA含有与Cas12a结合的序列，以及与靶标DNA配对的原间隔序列。此外，Cas12a具有自身cRNA加工活性，可将含有多个crRNA 排列的转录本切割产生多个引导RNA，更容易实现crRNA的精确加工以及同时表达多个crRNA进行多靶标编辑(Fonfara等，Nature,2016,532:517-521；Zetsche等，Nat Biotechnol,2017,35:31-34)。
设计CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a核酸酶进行基因编辑的方法已在文献中公开(Jinek等，Science,337:816-821；Cong等，Science,2013,339:819-823；Zetsche等，Cell,2015,63:759-771)，SpCas9和LbCas12a氨基酸序列可在SwissProt数据库检索得到(登录号Q99ZW2和5ID6_A)。简而言之，向导RNA序列决定了靶向特异性，因此只需改变gRNA上的靶向序列(原间隔序列)即可改变Cas核酸酶的基因靶标。通常Cas蛋白一端或两端融合有一个或多个特定的蛋白定位信号，如细胞核定位信号NLS，该信号足以将Cas蛋白和向导RNA复合体转运至特定的细胞器内(如细胞核)发挥其功能。当将Cas蛋白和工程化的向导RNA共同导入或在细胞内共表达时，Cas蛋白和向导RNA形成复合体，并由向导RNA引导结合至基因组靶位点，而Cas蛋白切割靶标序列的一条或两条DNA链。断裂的DNA链可被细胞内非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机器进行损伤修复，直接将双股裂断的末端重新连接，但该修复机制容易在接口产生碱基的缺失、***或置换。
如果向发生双链DNA断裂的细胞内提供一个外源DNA重组模板，用于指导断裂的DNA末端通过同源重组(homologous recombination，HR)的机制进行修复，可将设计的序列改变通过修复模板引入基因组中。重组模板可以是线性或环形的单链或双链DNA，其含有与被核酸酶切割的基因组靶标序列两侧同源的序列(同源臂)，同源臂的长度可为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个核苷酸或更长。当核酸酶切割基因组靶标基因产生的DNA断裂，游离的DNA末端可在同源序列的介导下以外源提供的DNA为模板进行DNA合成，从而在目标位点掺入预设定的外源序列。
在一些实施例中，本发明采用CRISPR/LbCas12a核酸酶进行植物基因编辑；在另一些实施例中采用CRISPR/SpCas9核酸酶进行植物基因编辑。
此外，Cas融合蛋白还可以包含一个至多个异源效应蛋白结构域，理想情况下，两个结构域之间通过一段连接肽序列连接。可以与Cas蛋白融合的蛋白结构域包括，但不限于，抗原表位标签(如HA、His、Flag、myc)、报告蛋白(绿色荧光蛋白、β-葡萄糖苷酸酶、荧光素酶)、DNA甲基化酶、转录激活结构域、转录抑制结构域、组蛋白修饰酶类、DNA拓扑异构酶、DNA重组酶、胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子、腺嘌呤脱氨酶、DNA聚合酶、逆转录酶等。Cas蛋白DNA内切酶结构域可以被突变失活，却仍然维持与向导RNA形成复合体的能力，并靶定基因组特异DNA序列。例如，当将Cas9蛋白的RuvC结构域或HNH结构域活性位点引入氨基酸突变，如第十位天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)，或第840位组氨酸突变为丙氨酸(H840A)或854位天冬酰胺突变为丙氨酸(N854A)或863位天冬酰胺突变为丙氨酸或(N863A)，产生nCas9突变蛋白仅能切割一条链，即变成切口酶(nickase)；如果将RuvC和HNH结构域活性位点同时突变，则产生的dCas9突变体将失去切割DNA的能力。dCas9或nCas9蛋白可以与上述特定的效应蛋白结构域融合，在向导RNA的引导下进行基因组序列定位、DNA修饰(胞嘧啶甲基化、腺嘌呤碱基编辑、胞嘧啶碱基编辑等)、转录调控(激活、抑制、组蛋白修饰等)、DNA重组、DNA合成等应用(Anzalone等，Nat Biotechnol,2020,38:824-844)。
碱基编辑器包含核酸酶失活的Cas蛋白(如Cas9和Cpf1等)和DNA依赖的碱基脱氨酶，如胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶。胞嘧啶脱氨酶是天然存在的或工程化改造的脱氨酶，如载脂蛋白B人胞嘧啶脱氨酶3A(human APOBEC3A,hA3A)。天然存在的腺嘌呤脱氨酶同常以RNA为底物，通过脱氨作用将单链RNA上的腺苷转变成肌苷(I)。最近，通过定向进化的方法，已经基于大肠杆菌的tRNA腺嘌呤脱氨酶A(ecTadA)获得了能够以单链DNA为底物，将单链DNA上的脱氧鸟苷转变为肌苷(I)的DNA依赖型腺嘌呤脱氨酶(Gaudelli等，Nature，2017，551:464-471)。胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)蛋白在向导RNA引导下可特异性靶向细胞内核酸分子，在不形成双链DNA断裂(DSB)的情况下对位于靶位点内的胞嘧啶碱基(C)或腺嘌呤碱基(A)进行脱氨反应，经过DNA复制和修复后，分别被替换为胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)，从而形成C向T(胞嘧啶碱基编辑)或A向G(腺嘌呤碱基编辑)的定向替换。
设计ABE和CBE***中向导RNA的进行碱基修饰的方法已在文献中公开(Komor等，Nature,2016，533:420-424；Gaudelli等，Nature,2017，551:464-471)。简而言之，向导RNA序列决定了靶向特异性，因此只需改变gRNA上的靶向序列(原间隔序列)即可改变碱基编辑器的基因靶标。当把碱基编辑器和向导RNA共同导入细胞内后，碱基编辑器蛋白可在靶标序列的活性窗口内产生碱基转换。
在一些实施例中，本发明采用CBE进行植物基因组碱基编辑；在另一些实施例中采用ABE进行植物基因组碱基编辑。
基于病毒载体的核酸酶递送***
如上所述，本发明提供了向植物细胞递送CRISPR/Cas元件的病毒载体***和方法。
病毒载体被用于在植物细胞内表达一个或多个CRISPR元件。例如，一个Cas核酸酶核酸序列，一个或多个gRNA核酸序列被***于不同病毒载体，并可操作地连接于病毒转录调控序列；优选地，两个或多个CRISPR/Cas元件被***同一个病毒载体，并可操作地连接于一个或多个转录调控序列。Cas核酸酶和一个或多个gRNA核酸序列可***于病毒基因组上同一个位点，由同一个调控序列控制表达；Cas核酸酶和一个或多个gRNA核酸序列可***于病毒基因组不同位点，由不同调控序列控制表达。
更具体地，考虑到大多数植物DNA病毒载体和正链RNA病毒载体仅能包装有限长度的外源片段，难以表达分子量较大CRISPR/Cas核酸酶基因(大于4kb)，本发明工程化了一个分节段的植物负链RNA番茄斑萎病毒属病毒载体***，并利用番茄斑萎病毒(Tomatospotted wilt virus，TSWV)载体作为优选实施例。在本发明的实施例中，TSWV载体可以包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)***位点，所述的***位点处于病毒转录调控元件的上游和/或下游。在本发明的优选方案中，重组TSWV载体一条基因组内包含的Cas蛋白编码序列与病毒转录调控序列被可操作地连接，另一条基因组内包含的一个或多个gRNA编码序列与病毒转录调控序列被可操作地连接。在TSWV侵染的细胞内，病毒转录调控序列驱动Cas蛋白和gRNA的表达，gRNA引导Cas核酸酶靶向基因组特定DNA位点，Cas核酸酶切割靶序列的一条或两条链。
番茄斑萎病毒属病毒(tospoviruses)，也称为正番茄斑萎病毒属病毒(orthotospoviruses)，指分类上属于负义RNA病毒门(Negarnaviricota)布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)的病毒种类。该属病毒包括花生芽坏死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV)、花生环斑病毒(Groundnut ringspot virus,GRSV)、花生黄斑病毒(Groundnut yellow spot virus,GYSV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)、番茄褪绿斑点病毒(Tomato chlorotic spotvirus,TCSV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、西瓜银色斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)、小西葫芦致死褪绿病毒(Zucchini lethalchlorosis virus,ZLCV)、花生褪绿扇型斑点病毒(Groundnut chlorotic fan-spotvirus,GCFSV)、西瓜芽枯病毒(Watermelon bud necrosis virus,WBNV)、甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)、鸢尾花黄斑病毒(Iris yellow spot virus,IYSV)菊花茎坏死病毒(Chrysanthemum stem necrosis virus,CSNV)等。
番茄斑萎病毒属病毒具有保守的形态学、生物学和分子生物学特征。病毒粒子为近球形，直径约为80-110纳米(nm)，表面有一层膜包裹，膜外层由约5nm的糖蛋白突起组成。病毒粒子内包裹有三条长度不一的单链负义基因组RNA，分别为L、M和S基因组片段，基因组总长度约为16600碱基(nt)。各个基因组片段3’末端具有高度保守的9个碱基并且与5’末端区域互补形成锅柄状(panhandle)结构，使每个基因组片段呈伪环状，且该结构在病毒转录和复制过程中发挥重要作用(图2)。L基因组为负义编码策略，其反基因组链编码一个大小约为330kDa的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，是病毒复制转录所必需。M和S基因组均采用双义编码策略，正义链和负义链各含有一个开放阅读框，中间被基因间隔区分开，基因间隔区内包含负责转录终止的顺式元件。M基因组链编码非结构运动蛋白NSm，在病毒胞间运动和长距离运动扮演重要角色，而反基因组链编码糖蛋白前体蛋白(GP)，GP加工成熟为糖蛋白GN和GC，糖蛋白是锚定在病毒粒子上的蛋白凸起，是病毒粒子成熟和介体昆虫传播所必需的。S基因组链编码的非结构蛋白NSs为RNA沉默抑制子，而反基因组链编码的核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)，N蛋白是病毒结构蛋白，包裹病毒基因组形成核衣壳。负链病毒的最小侵染单元为核衣壳(nucleocapsid)，即病毒基因组RNA被N蛋白和RdRp蛋白包装形成的核糖核蛋白复合体(ribonucleprotein complex)。
番茄斑萎病毒属病毒自然条件下通过蓟马(thrips)传播，可侵染多种粮食作物、经济作物、蔬菜、花卉等植物，在实验室条件下容易通过机械摩擦和嫁接等手段接种侵染其天然或实验寄主植物。番茄斑萎病毒属病毒大都具有广泛的寄主范围，其中番茄斑萎病毒(TSWV)寄主范围尤其广泛，包括茄科、葫芦科、菊科、豆科和十字花科等85科以上超过1090种单子叶和双子叶植物(Parrella等，J Plant Pathol,2003,85:227-264)，如秋葵(Abelmoschus esculentus)、熊耳草(Ageratum houstonianum)、洋葱(Allium cepa)、老枪谷(Amaranthus caudatus)、小苋(Amaranthus hybridus)、反枝苋(Amaranthusretroflexus)、美花苋(Amaranthus inosus)、皱果苋(Amaranthus viridis)、孤挺花属(Amaryllis sp.)、凤梨(Ananas comosus)、Anemone、甜芹(Apium graveolens vardulce)、普通耧斗菜(Aquilegia vulgaris)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)、牛蒡(Arctium lappa)、黑疆南星(Arum palaestinum)、秋海棠属(Begonia sp.)、射干(Belamcanda chinensis)、甜菜(Beta vulgaris)、三叶鬼针草(Bidens pilosa)、野油菜(Brassica campestris)、花椰菜(Brassica oleracea varbotrytis)、大白菜(Brassica pekinensis)、菜心(Brassica rapa ssp.Chinensis)、Calceolaria herbeohybrida、金盏花(Calendula officinalis)、翠菊(Callistephuschinensis)、丛生风铃草(Campanula glomerata)、意大利风铃草(Campanula isophylla)、Campanula latiloba、Campan ula pyramidalis、刀豆(Canavalia gladiata)、海刀豆(Canavalia obtusifolia)、西方刀豆(Canavalia occidentalis)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、甜辣(Capsicum annuum)、红辣椒(Capsicum frutescens)、中华辣椒(CapsicumChinense)、浆果辣椒(Capsicum Baccatum)、茸毛辣椒(Capsicum Pubescens)、番木瓜(Carica papaya)、望江南(Cassia occidentalis)、决明(Cassia tora)、长春花(Catharanthus roseus)、矢车菊(Centaurea cyanus)、桂竹香(Cheiranthus cheiri)、藜(Chenopodium album)、土荆芥(Chenopodium ambrosioides)、苋色藜(Chenopodiumamaranticolor)、墙生藜(Chenopodium murale)、茼蒿(Chrysanthemun coronarium)、野菊(Chrysanthemun indicum)、春白菊(Chrysanthemun leucanthemum)、菊(Chrysanthemunmorifolium)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、苣荬菜(Cichorium endiva)、菊苣(Cichoriumintybus)、瓜叶菊属(Cineraria)、西瓜(Citrullus lanatus)、小粒咖啡(Coffeaarabica)、田旋花(Convolvulus arvensis)、香丝草(Conyza bonariensis)、铁树(Cordyline fruticose)(异名Cordyline terminalis)、芫荽(Coriandrum sativum)、金鸡菊(Coreopsis drummondii)、臭荠(Coronopus didymus)、黄鹌菜(Crepis japonica)(异名Youngia japonica)、光叶猪屎豆(Crotalaria incana)、菽麻(Crotalaria juncea)、猪屎豆(Crotalaria pallida)(异名Crotalaria mucronata)、甜瓜(Cucumis melo)、黄瓜(Cucumis sativus)、笋瓜(Cucurbita maxima)、南瓜(Cucurbita moschata)、西葫芦(Cucurbita pepo)、仙客来(Cyclamen indicum)(异名Cyclamen persicum)、洋蓟(Cynarascolymus)、大丽花(Dahlia pinnata)、Dahlia variabilis、曼陀罗(Datura stramonium)、翠雀属(Delphinium sp.)、三点金草(Desmodium triflorum)、Desmodium unicinatum、雷氏澳茄(Duboisia leichhardtii)、一点红(Emilia sonchifolia)、茴香(Foeniculumvulgare)、欧洲草莓(Fragaria vesca)、辣子草(Galinsoga parviflora)、四芒牛藤菊(Galinsoga quadriradiata)、唐菖蒲属(Gladiolus sp.)、大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycine soja)、千日红(Gomphrena globosa)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、向日葵(Helianthus annuus)、黄槿(Hibiscus tiliaceus)、朱顶红(Hippeastrum hybridum)、短筒朱顶红(Hippeastrum reginae)、Hippeastrumrutilum、球兰(Hoya carnosa)、绣球(Hydrangea macrophylla)、天仙子(Hyoscyamusniger)、霍尔斯特氏凤仙花(Impatiens holsii)、苏丹凤仙花(Impatiens sultanii)、瓦氏凤仙花(Impatiens wallerana)、甘薯(Ipomea batatas)、莴苣(Lactuca sativa)、香豌豆(Lathyrus odoratus)、荆芥叶狮尾草(Leonotis nepetaefolia)、宽叶补血草(Limoniumlatifolium)、白叶羽扇豆(Lupinus leucophyllus)、南美羽扇豆(Lupinus mutabilis)、多叶羽扇豆(Lupinus polyphyllus)、枸杞属(Lycium procissimum)、番茄(Lycopersiconesculentum)、野生多毛番茄(Lycopersicon hirsutum)、醋栗番茄(Lycopersiconpimpinellifolium)、小花锦葵(Malva parviflora)、紫罗兰(Matthiola incana)、南苜蓿(Medicago polymorpha)、黄香草木樨(Melilotus officinalis)、欧洲夹竹桃(Neriumoleander)、假酸浆(Nicandra physaloides)、Nicotiana acuminata、Nicotianabigelovii、克里夫兰烟(Nicotiana clevelandii)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、Nicotiana sylvestris、烟草(Nicotiana tabacum)、冰岛罂粟(Papaver nudicaule)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、矮牵牛(Petunia hybrida)、赤豆(Phaseolus angularis)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、福禄考(Phlox drummondii)、毛苦(Physalis angulata)(异名Physalis minima)、灯笼果(Physalis spp)、紫花豌豆(Pisumarvense)、豌豆(Pisum sativum)、大车前(Plantago major)、黑籽车前(Plantagorugelii)、荞麦蔓(Polygonumconvolvulus)、马齿苋(Portulaca oleracea)、报春花属(Primula sp.)、锦葵状报春(Primula malacoides)、藏报春花(Primula sinensis)、毛茛属(Ranunculus sp.)、覆盆子(Rubus idaeus)、抱茎金光菊(Rudbeckia amplexicaulis)、非洲紫苣薹(Saintpaulia ionantha)、Salpiglossis、Scabiosa、蛾蝶花属(Schizanthus)、佛手瓜(Sechium edule)、瓜叶菊(Senecio cruentus)、新疆千里光(Senecio jacobea)、芝麻(Sesamum indicum)大岩桐(Sinningia eciosa)、毛叶冬珊瑚(Solanum capsicastrum)、美洲野茄(Solanum carolinense)、裂叶茄(Solanum laciniatum)、乳茄(Solanummammosum)、茄(Solanum melongena)、龙葵(Solanum nigrum)、节花茄(Solanumnodiflorum)、海茄(Solanum seaforthianum)、裂叶茄(Solanum triflorum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、菠菜(Spinacia oleracea)、田野水苏(Stachys arvensis)、Stapellia、繁缕(Stellaria media)、Streptosolen jamesonii、万寿菊(Tagetes patula)、Taraxacum、灰毛豆(Tephrosia purpurea)、蒺藜(Tribulusterrestris)、白三叶草(Trifolium repens)、地三叶草(Trifolium subterraneum)、旱金莲(Tropaeolum majus)、Vallota、巴西马鞭草(Verbena brasilliensis)、滨海马鞭草(Verbena litoralis)、无耳多苞菊(Verbesina enceloides)、蚕豆(Vicia faba)、黑绿豆(Vigna mungo)、绿豆(Vigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、Xanthiumsaccharatum、马蹄莲(Zantedeschia aethopica)、银星马蹄莲(Zantedeschia albo-maculata)、黄花马蹄莲(Zantedeschia elliottiana)、黑喉马蹄莲(Zantedeschiamelanoleuca)、红花马蹄莲(Zantedeschia rehmannii)、百日菊(Zinnia elegans)等。
如上所述，本发明的一方面提供了一种番茄斑萎病毒表达载体***。生物技术领域工作人员所能理解的，病毒基因组的遗传操作和病毒载体开发的前提是病毒侵染性克隆构建，即导入合适宿主细胞后可产生重组病毒的病毒DNA克隆，即实现病毒拯救，进而在宿主细胞内表达病毒所携带的病毒或非病毒的序列。
植物负链RNA病毒侵染性cDNA克隆和病毒表达载体构建方法与应用已在相关的文章或专利公布，如植物弹状病毒苦苣菜黄网病毒(SYNV)的相关论文(Wang等，PLoS Pathog,2015,11:e 1005223)和专利CN 105039388 B，植物弹状病毒大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)的相关论文(Gao等，New Phytol,2019,223:2120-2133)和专利CN 110511955 A，番茄斑萎病毒侵染性克隆***(Feng等，PNAS,2020,117:1181-1190)等。从克隆的DNA拯救重组负链RNA病毒的流程包括：1)构建可转录产生病毒基因组或反基因组RNA的核酸构建体以及表达病毒核心蛋白的核酸构建体；2)上述核酸构建体以环状质粒、或线性DNA片段、或体外转录产生的核酸片段等形式共同导入合适宿主细胞；3)细胞内表达病毒RNA和蛋白，包装形成侵染性单元，产生重组病毒。上述导入方法为本领域所已知的方法，如农杆菌转化法、基因枪法、核酸(质粒DNA或体外转录RNA)摩擦法、PEG介导法、电击法、显微注射法、脂质体转化法、或纳米颗粒介导的转化法引入合适的真核细胞。
上述核酸构建体导入合适的植物宿主细胞后，植物RNA沉默反应是阻碍其高效表达和随后重组病毒产生的重要限制因素。作为一种抵御外源核酸入侵的重要机制，植物RNA沉默反应一方面抑制核酸构建体的瞬时表达(Johansen等，Plant Physiol 2001,126:930-938)，另一方面限制新生重组病毒的复制和侵染(Kasschau等，Virology 2001,285:71-81)。为了提高瞬时表达效率和重组植物负链RNA病毒拯救效率，本领域所知的解决方案是通过共表达病毒编码的RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing)(Wang等，PLoS Pathog,2015,11:e 1005223；Ma&Li,Viruses 2020,12:1459)。目前已知的病毒RNA沉默抑制子数量众多，包括番茄丛矮病毒p19、烟草蚀纹病毒HcPro，大麦条纹花叶病毒γb、番茄斑萎病毒NSs、芜菁皱缩病毒p38、禽兽棚病毒B2、流感病毒NS1、埃博拉病毒VP35等。这些沉默抑制子具体的作用机制不同，共同表达时对促进重组负链病毒拯救具有协同效应(Ganesan等，J Virol2013,87:10598-10611；Ma&Li,Viruses 2020,12:1459)。
本发明相关实施例中公开了TSWV病毒载体***的构建方法和重组病毒拯救技术方案。所述的TSWV基因组序列，即其S基因组、M基因组、L基因组序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示。本领域中应该理解，所述病毒基因组序列不需要与所公开的序列SEQ ID NO:1、2、3达到100％同一性。所述病毒基因组序列与本发明公开的全基因组序列有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％同一性；或其编码的RdRp蛋白氨基酸序列与本发明公开的RdRp基因(SEQ ID NO:4)编码的蛋白氨基酸序列有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％一致性。
为了构建可转录产生病毒基因组RNA的核酸构建体，在本发明相关实施例中，TSWVS、M和L基因组核酸序列被***植物表达载体内，且被可操作地连接于启动子序列下游。众多适合的植物表达载体为本领域普通技术人员所知并且为商业上可获得的，比如pCambia、pGreen、pCASS、PBin19、pGD、pCB301等。适合的启动子包括来源于植物内源基因或植物病毒的组成型或诱导型启动子，如肌动蛋白(Actin)启动子、泛素(Ubiquitin)启动子或花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子等。本发明实施例中采用CaMV 35S启动子的一种版本(SEQ IDNO:9)，该启动子可以产生5’末端忠实的病毒RNA。
在上述TSWV基因组核酸构建体中，病毒序列3’末端被可操作地连接于可自我剪切的丁型肝炎病毒核酶序列，转录产生的病毒RNA可被核酶剪切产生3’末端忠实的病毒末端序列。丁型肝炎病毒核酶的设计在论文(Sharmeen等，1998,J.Virol.62,2674-2679；Feng等，Proc Natl Acad Sci U S A,2020,2:1181-1190)和美国专利522,533,7(Ribozymecompositions and methods for use)公开，为本领域技术人员所知晓的知识。
本发明的实施例中，TSWV L基因组核酸构建体包含L反基因组(antigenomic RNA)cDNA序列被可操作地连接35S启动子，以转录产生正义链的L反基因组RNA；M基因组核酸构建体包含M基因组或反基因组cDNA序列被可操作地连接35S启动子，以转录产生M基因组(负义)或反基因组(正义)RNA；S基因组核酸构建体包含S反基因组cDNA序列被可操作地连接35S启动子，以转录产生正义链的S反基因组RNA。
如前所述，负链病毒的拯救需要在细胞内共表达病毒核心蛋白和病毒RNA，以转配产生病毒侵染性单元。在本发明的实施中，L和S反基因组RNA转录本(正义)可作为翻译模板分别表达病毒核衣壳核心蛋白RdRp(或称L)和N，进而与N和RdRp蛋白包装形成病毒核衣壳，作为病毒复制的模板产生子代病毒基因组。
本领域的人员应当理解，L和S核酸构建体也可以为包含L和S基因组cDNA序列被可操作地连接35S启动子，但此时L和S基因组RNA转录本(负义)无法表达病毒核心蛋白，因此需要在细胞内额外提供RdRp和N辅助表达载体，以翻译产生病毒核心蛋白包装病毒基因组，起始重组病毒复制和侵染。
在本发明的实施例中还进一步修饰了TSWV L基因组核酸构建体，将L基因组中编码RdRp的序列(SEQ ID NO:4)利用密码子优化的编码序列置换。优选地，优化后的RdRp序列如SEQ ID NO:5所示。可以理解的是，基因序列优化是生物技术常规操作，同样的基因根据不同的优化方式可以获得不同的优化后序列，本发明所提供的密码子优化序列仅为其中示例。可以设想，其它经过合适优化的序列也可提高TSWV RdRp在植物细胞中高效稳定表达，帮助重组病毒产生。
在本发明的一些实施例中，TSWV M基因组片段可以通过重组DNA技术进行操作，例如，异源核酸序列的***或将GP基因序列(SEQ ID NO:6)进行部分或完全缺失或替换。在一些优选的实施例中，GP基因的全部或部分序列被异源报告基因核酸序列替换。
在本发明的一些实施例中，TSWV S基因组片段可以通过重组DNA技术进行操作，例如，异源核酸序列***于NSs基因(SEQ ID NO:7)编码序列上游或下游，或将NSs基因进行部分或完全缺失或替换。在一些优选实施例中，NSs基因的全部或部分序列被异源报告基因核酸序列替换。
在本发明的实施例中，TSWV M和S基因组中包含的异源核酸序列被可操作地连接于病毒转录顺式元件，如M和S基因组非编码区内负责mRNA转录的启动子元件，以及病毒基因间隔区内负责转录终止的顺式元件。
进一步，上述重组TSWV S、M和L基因组核酸构建体被导入到合适的植物细胞中，所述的导入是在足以实现重组病毒拯救的条件下实施的。在本发明相关实施例中，为了促进重组病毒的产生，共同导入细胞的辅助核酸构建体还包括编码一个或多个RNA沉默抑制子的序列被可操作地连接至启动子。本方面的一些实施例中，优选地，所述的RNA沉默抑制子为番茄丛矮病毒p19、烟草蚀纹病毒Hc-Pro，大麦条纹花叶病毒γb、番茄斑萎病毒NSs单个或多个的组合，所述的启动子为35S启动子。如果需要，共同导入细胞的核酸构建体还可以包括TSWV N和RdRp蛋白辅助表达载体。
本方面的实施例导入植物细胞的核酸构建体组合物包括：a)包含TSWV S、M和L重组基因组序列的核酸构建体；b)编码一种或者多种病毒沉默抑制子的辅助表达构建体；如需要还包括，c)编码TSWV N和L蛋白的一种或多种辅助表达构建体。
本方面所述“导入植物细胞”的方法为本领域常规方法，如通过农杆菌转化法、基因枪轰击法、花粉导入法、PEG介导融合法、电击法、显微注射法、超声波转化法、脂质体转化法、或纳米颗粒介导的转化等方法，将包含病毒核酸序列的环状质粒、或线性DNA片段、或体外转录的RNA等引入合适的真核生物细胞。
在本发明一些实施例中，所述的导入植物细胞的方法是农杆菌侵染法，即采用农杆菌浸润将所述一个或多个核酸构建体转化至合适植物细胞。所述的核酸构建体为适合农杆菌转化的质粒载体，即双元质粒载体，其包含农杆菌侵染植物过程中被转移至植物细胞的转移DNA(T-DNA)区。核酸构建体也可以通过其他方式导入细胞，如基因枪轰击法、叶片摩擦法、PEG融合法等。在这种情况下，核酸构建体可以为DNA、RNA或核糖核蛋白复合体的形式导入细胞。
在本发明的优选例中，采用了农杆菌浸润本氏烟叶片组织，将农杆菌双元质粒内的转移DNA片段导入本氏烟细胞，并进行转录、表达和重组病毒拯救。本氏烟是最适合农杆菌转化的植物之一，但其它多种植物对农杆菌转化也具有不同程度的敏感性。
在本发明的一些实施例中，GP基因被完全或部分缺失的重组TSWV在植物中具有侵染性，但是该重组病毒不能被介体昆虫蓟马获毒，也不能通过介体昆虫向其他植物传播。因而本发明所提供的重组病毒和方法具有较高的生物安全性。
在本发明的一些实施例中，NSs基因被完全或部分缺失的重组TSWV在植物中具有侵染性，且比野生型病毒具有较弱的毒力。
TSWV载体可以包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)***位点，所述的***位点处于病毒转录调控元件的上游和/或下游。在一些实施例中，重组TSWV载体M基因组携带一个报告基因，S基因组携带另一个报告基因，报告基因被可操作地连接于病毒转录调控序列。优选地，所述的报告基因为绿色荧光蛋白基因(GFP)和红色荧光蛋白基因(RFP)。重组核酸构建体导入植物细胞后，重组病毒的复制和***侵染被报告基因的表达所示踪。
在另一方面，本发明公开了一种向植物体内递送序列特异性核酸修饰酶的TSWV表达载体***及其构建方法。
在本发明的一些实施例中，重组TSWV载体M基因组内包含核酸修饰酶一个组份的编码序列与病毒转录调控序列被可操作地连接，而S基因组内包含核酸修饰酶另一个组份与病毒转录调控序列被可操作地连接。在TSWV侵染的细胞内，病毒转录调控序列驱动核酸修饰酶组份的共表达，形成的复合体靶向基因组特定DNA位点并产生修饰。
如上所述，TSWV载体含有多个***位点，M和/或S基因组分别或同时含有外源核酸序列的重组病毒可以***侵染植物并表达一个或多个外源序列。因此，本发明实施例提供了可表达序列特异性核酸修饰酶的病毒表达载体***，更具体地，编码CRISPR/Cas核酸修饰酶组份的至少两个多核苷酸序列被***于重组TSWV基因组中，并可操作地连接于病毒转录顺式元件。当重组TSWV载体导入植物细胞后，核酸修饰酶得以表达。
在本发明的一些实施例中，所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶为来源于自毛螺旋菌的CRISPR/LbCas12a***。
在本发明的一些实施例中，CRISPR/Cas核酸修饰酶为来源于和化脓链球菌的CRISPR/SpCas9***。
在本发明的一些实施例中，所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶为基于CRISPR/SpCas9***的ABE。
在本发明的另一些实施例中，所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶为基于CRISPR/SpCas9***的CBE。
为了提高Cas效应蛋白在植物细胞内的表达效率，在本发明的一些实施例中，提供的是水稻密码子优化的LbCas12a编码序列(如SEQ ID NO:10所示)、本氏烟密码子优化的SpCas9蛋白的序列(如SEQ ID NO:11所示)、本氏烟密码子优化的腺嘌呤编辑器蛋白编码序列(如SEQ ID NO：84所示)和本氏烟密码子优化的胞嘧啶编辑器蛋白编码序列(如SEQ IDNO:85所示)。本领域技术人员可以理解的是，针对具体宿主物种进行密码子优化的方法是可行的且已知的。
如上述序列所示，本发明的Cas效应蛋白为融合蛋白，其N端和/或C端还包含核定位序列，以便在植物细胞核中实现足够的CRISPR/Cas复合体的积聚。此外，根据所需要编辑的DNA位置，本发明的Cas融合蛋白还可以包括其他的定位序列，例如细胞质定位序列、叶绿体定位序列、线粒体定位序列等。在本发明一些实施例中，编码Cas12a蛋白的序列替换M基因组GP编码序列，Cas12a蛋白的表达由M基因组顺式元件控制。编码Cas12a的向导RNA(crRNA)的外源核酸分子***于S基因组NSs编码框上游或下游，向导RNA的表达由S基因组顺式元件控制。优选地，S基因组NSs编码框同时被报告基因框替换，该重组病毒侵染可被报告基因所示踪。在该方面的实施例中，向导RNA转录本被Cas12a核酸酶加工剪除了来源于病毒的末端多核苷酸。
在本发明另一些实施例中，编码Cas9蛋白的序列替换M基因组GP编码序列，Cas9蛋白的表达由M基因组顺式元件控制。编码Cas9向导RNA的外源核酸分子***于S基因组NSs编码框上游或下游，向导RNA的表达由S基因组顺式元件控制。优选地，NSs编码框被报告基因替换。在该方面的实施例中，向导RNA转录本被Cas9核酸酶和内源RNA加工机器剪除了来源于病毒的末端多核苷酸。
在本发明的一些实施例中，ABE蛋白的编码序列替换M基因组GP编码序列，其表达由M基因组顺式元件控制；编码向导RNA的外源核酸分子***于S基因组NSs编码框上游或下游，向导RNA的表达由S基因组顺式元件控制。优选地，NSs编码框被荧光报告基因替换。
在本发明的一些实施例中，CBE蛋白的编码序列替换M基因组GP编码序列，其表达由M基因组顺式元件控制。编码向导RNA的外源核酸分子***于S基因组NSs编码框上游或下游，向导RNA的表达由S基因组顺式元件控制。优选地，NSs编码框被荧光报告基因替换。
在上述实施方案中，编码Cas效应蛋白和向导RNA(crRNA或gRNA)元件的两个核酸序列分别***于重组TSWV载体M和S基因组中。本领域已有的技术方案表明，编码Cas效应蛋白和gRNA(或crRNA)元件的核酸序列可以串联于单个RNA转录本进行表达(Campa等，NatMethods,2019,16:887-893；Tang等，Plant Biotechnol J,2019,17:1431-1445)。因此可以设想，编码Cas蛋白和gRNA元件的两个核酸序列可以连接为一条核酸序列***于TSWV一条基因组中得以表达，例如M基因组、S基因组或L基因组。
进一步，在本发明一些实施例中，利用上述重组TSWV载体在植物细胞内表达CRISPR/Cas核酸修饰酶。上述包含TSWV重组基因组片段的核酸构建体以及辅助表达构建体被导入到合适的植物细胞中，所述的导入是在足以实现重组病毒拯救的条件下实施的。
本发明相关实施例中，导入植物细胞的核酸构建体组合物包括：a)包含重组TSWVS、M和L基因组序列的核酸构建体，其中S基因组包含一个或多个编码CRISPR向导RNA的异源核酸序列，M基因组包含一个或多个编码Cas核酸酶组份的异源核酸序列，L基因组包含密码子优化的病毒RdRp序列(SEQ ID NO:5)；b)编码一种或者多种病毒沉默抑制子的辅助表达构建体；如需要还包括，c)编码TSWV N和L蛋白的辅助表达构建体。
本发明所述“导入植物细胞”的方法为本领域常规方法，如将包含病毒核酸序列的环状质粒、线性DNA片段、或体外转录的RNA等通过农杆菌转化法、基因枪轰击法、花粉管导入法、PEG介导融合法、电击诱导法、显微注射法、激光转化法、超声波转化法、脂质体转化法、或纳米颗粒介导的转化等方法引入合适的真核生物细胞。本发明一些实施例中所述的导入植物细胞的方法是农杆菌侵染法，即将携带上述核酸构建体(双元质粒载体)的农杆菌浸润本氏烟叶片组织，将双元质粒内转移DNA片段导入本氏烟细胞，并进行转录、表达和重组病毒产生。
TSWV为分节段的负链RNA病毒，当从克隆的DNA拯救重组病毒时，需要在同一个细胞内同时获得S、M和L三个重组基因组才能转配成有活性的侵染单元，起始重组病毒侵染。容易理解的是，由于S、M和L三条基因组长度差异较大，它们的表达和装配效率可存在差异。此外，大片段的异源序列的***，如3.9kb的LbCas12a编码序列、或4.2kb的SpCas9编码序列、或4.9kb的ABE编码序列、或5.2kb的CBE编码序列，可进一步影响重组基因组片段的拯救效率。本发明的相关的技术方案表明，有效产生重组病毒需要对核酸构建体中重组基因组cDNA的极性(正义或负义)以及三条基因组核酸构建的比例进行优化调整。
在相关的实施例中，重组L和S基因组片段以反基因组cDNA方向可操作地连接至35S启动子下游，转录产生的正义链病毒RNA可作为N和L蛋白翻译的模板，同时也作为基因组复制的模板。
在一些实施例中，包含LbCas12a编码序列的重组M基因组片段以反基因组cDNA方向与35S启动子可操作地连接，以转录产生重组M基因组的正义链RNA。
在另一些实施例中，包含SpCas9编码序列的重组M基因组片段以反基因组或基因组cDNA方向，优选地，以基因组cDNA方向与35S启动子可操作地连接，以转录产生重组M基因组的负义链RNA。
在另一些实施例中，包含ABE或CBE异源编码序列的重组M基因组片段以反基因组cDNA方向与35S启动子可操作地连接，以转录产生重组M基因组的正义链RNA。
当采用农杆菌浸润导入病毒表达载体时，可以通过调整农杆菌菌液的浓度(以OD600值表示)来改变导入植物的各重组基因组构建体的比例，从而实现三条重组基因组的协调表达和有效装配。可以理解的是，在一定的范围内调整重组构建体的比例均可以实现从克隆的病毒cDNA拯救出重组病毒。
在一些实施例中，包含crRNA的重组S基因组构建体、包含LbCas12a的重组M基因组构建体、重组L基因组构建体的农杆菌浓度比例为2:2:1、或1:2:1、或1:10:2时可实现重组病毒的拯救。优选地，当S重组基因组构建体的浓度最低，其次为L基因组，再次为M基因组时，如S:M:L比例为1:10:2时，重组病毒拯救效率最高。
在一些实施例中，包含gRNA的重组S基因组构建体、包含SpCas9的重组M基因组构建体、重组L基因组构建体的农杆菌浓度比例为1:10:2时可实现重组病毒的高效拯救。
在一些实施例中，包含gRNA的重组S基因组构建体、包含碱基编辑器的重组M基因组构建体、重组L基因组构建体的农杆菌浓度比例为1:10:2时可实现重组病毒的高效拯救。
包装能力的局限性是重组病毒载体递送特异性序列核酸酶最大的阻碍，本发明的一些实施例表明，TSWV载体基因组具有多个***位点和不同寻常的外源片段装载能力，携带长度超过5kb的CRISPR/Cas核酸酶片段的重组病毒能够***侵染植物并且表达外源序列。可以理解，TSWV可以表达的核酸酶还包括但不限于：其它分子量相似或更小的CRISPR/Cas核酸酶，如SaCas9、STl1Cas9、STl2Cas9、St3Cas9、NmCas9、AsCas12a、FnCas12a、CasX、CasY、CasΦ核酸酶***，以及CRISPR核酸酶的部分氨基酸的突变体或衍生物，如高保真Cas核酸酶espCas9、HFCas9、Cas9切口酶(nCas9)、Cas9失活酶(dCas9)、引导编辑器等；还包括其它分子量较小的核酸酶类型，如归巢核酸内切酶(meganuclease)(～1kb)、锌指核酸酶(～2kb)、类转录激活因子效应物核酸酶(～3kb)。
本发明实施例中采用的病毒载体为番茄斑萎病毒属典型种番茄斑萎病毒(TSWV)，可以理解的，可以根据本发明教导实施的还包括具有相似的基因组结构和生物学特性的番茄斑萎病毒属病毒及其它分节段植物负链RNA病毒，包括但不限于，花生芽坏死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV)、花生环斑病毒(Groundnut ringspot virus,GRSV)、花生黄斑病毒(Groundnut yellow spot virus,GYSV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)、番茄褪绿斑点病毒(Tomato chlorotic spotvirus,TCSV)、西瓜银色斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)、小西葫芦致死褪绿病毒(Zucchini lethal chlorosis virus,ZLCV)、花生褪绿扇型斑病毒(Groundnutchlorotic fan-spot virus,GCFSV)、西瓜芽枯病毒(Watermelon bud necrosis virus,WBNV)、甜瓜黄斑点病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)、鸢尾花黄斑病毒(Iris yellowspot virus,IYSV)菊花茎坏死病毒(Chrysanthemum stem necrosis virus,CSNV)。
基于病毒递送***的植物基因编辑
在另一方面，本发明提供了一种修饰植物遗传物质的方法，该方法利用本发明的TSWV载体向植物细胞递送CRISPR/Cas核酸修饰酶复合体，其中Cas效应蛋白在向导RNA的引导下靶向植物基因组特定序列，产生DNA切割或碱基修饰，细胞内源DNA修复机器完成对所述植物细胞遗传物质的修饰，产生碱基的删除、***、置换突变中的某一种或多种类型的组合。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的核酸酶为CRISPR/LbCas12a核酸酶，在另一些实施例中为CRISPR/SpCas9核酸酶。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的碱基编辑器为ABE，在另一些实施例中为CBE。
根据给定的靶序列设计和构建合适的CRISPR向导RNA的方法属于本领域普通技术人员已知的知识，例如，LbCas12a crRNA的设计可参考文献Fonfara等(Nature,2016,532:517-521)。一般而言，LbCas12a crRNA包含与靶序列互补的大约23个核苷酸的原间隔序列(向导序列)，以及与LbCas12a蛋白结合形成复合体的直接重复(DR)序列，其中DR序列负责与Cas12a结合形成复合体，而间隔序列靶向互补的靶标DNA。所述靶序列具有以下结构：5’-TTTN-NX-3’；其中N为A、G、C或T任意一个碱基，Nx表示X个连续的核苷酸，X为15≤X≤30的整数，TTTN为LbCas12a的原间隔序列临近基序(PAM)序列。在本发明的一些具体的实施方案中，X为23。
此外，Cas12a具有自身cRNA加工活性，可将含有多个crRNA排列的转录本切割产生多个引导RNA，更容易实现crRNA的精确加工以及同时表达多个crRNA进行多靶标编辑。(Fonfara等，Nature,2016,532:517-521；Zetsche等，Nat Biotechnol,2017,35:31-34)。
在本发明一些实施方式中，所述Cas12a的向导RNA是单个crRNA，其结构为“直接重复区(direct repeat,DR)—间隔序列(Spacer)—直接重复区(direct repeat,DR)”。在该方面的实施例中，TSWV表达“DR-Spacer-DR”向导RNA初始转录本，其两端包含病毒来源的序列，Cas12a蛋白结合DR序列后可通过其核酸酶活性加工剪除来源于病毒的末端多核苷酸，形成含有“DR-Spacer”结构的成熟crRNA。
在本发明另一些实施方式中，所述Cas12a的向导RNA是多个crRNA的串联，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个crRNA序列。具体的，所述crRNA串联表达方式为“DR-Spacer 1-DR-Spacer2-DR…”结构。在该方面的实施例中，TSWV表达含有串联crRNA的初始转录本，其两端包含病毒来源的序列，Cas12a蛋白结合DR序列后可通过其核酸酶活性加工释放两个及以上成熟的crRNA分子。其产生的靶基因编辑效率与相应的递送单个crRNA的TSWV载体相似。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的LbCas12a和crRNA复合体的靶点选自本氏烟和普通烟八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因中保守的crPDS1靶点序列5’-TTTCTGCCGTTAATTTGAGAGTCCAAG-3’(SEQ ID NO:12)(粗体字母为PAM序列，下同)；在另一些实施例中选自番茄PDS基因的crPDS2靶点序列5’-TTTCTGCTGTTAACTTGAGAGTCCAAG-3’(SEQID NO:13)，在另一些实施例中选自辣椒PDS基因的crPDS3靶点序列5’-TTTCTGCTGTCAACTTGAGAGTCCAAG-3’(SEQ ID NO:14)，在另一些实施例中选自花生和大豆PDS基因中保守的crPDS4靶点序列5’-TTTGACAGAAAACTGAAGAACACATAT-3’(SEQ ID NO:15)。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的LbCas12a和crRNA复合体的靶点选自本氏烟FucT基因中保守的靶点序列5'-TTTGGAACAGATTCCAATAAGAAGCCT-3'(crFucT，SEQ IDNO:86)，或DCL2靶点序列5'-TTTGAGAAGCTATGCTTATCTTCTTCG-3'(crDCL2，SEQ ID NO:87)，在另一些实施例中选自灯笼果ER基因的靶点序列5'-TTTAATGTTAAACCTTTAGTGTCCTTT-3'(crER，SEQ ID NO:88)，在一些实施例中选自花生PDS基因保守的靶点序列5'-AATGCAATGTATATTGATTGCCTTAAA-3'(crPDS5，SEQ ID NO:98)，在一些实施例中选自辣椒PDS基因保守的靶点序列5'-TTTCTGCTGTCAACTTGAGAGTCCAAG-3'(crPDS6，SEQ ID NO:99)。
在本发明的另一些实施例中，TSWV载体递送的LbCas12a和多个串联的crRNA，形成多个LbCas12a/crRNA复合体，可以同时靶向多个基因进行多重编辑，如串联表达两个crRNA(crPDS1&crFucT；SEQ ID NO:135)分别靶向本氏烟crPDS1和crFucT位点，或串联表达3个crRNA(crPDS1&FucT&crDCL2；SEQ ID NO:136)分别靶向本氏烟crPDS、crFucT和crDCL2位点，且多靶标载体产生的编辑效率与相应的递送单个gRNA的TSWV载体相似。
SpCas9 gRNA的设计可参考文献Ran等(Nat Protoc,2013,11:2281-2308)。SpCas9gRNA包含与靶序列互补的大约20个核苷酸的原间隔序列，以及与SpCas9蛋白结合形成复合体的序列，且其3’末端含有紧邻原间隔序列临近基序NGG。所述靶序列具有以下结构：5'-NX-NGG-3’。其中N为A、G、C或T任意一个碱基，Nx表示X个连续的核苷酸，X为14≤X≤30的整数，NGG为SpCas9的原间隔序列临近基序(PAM)序列。在本发明的一些具体的实施方案中，X为20。
当利用RNA病毒载体表达gRNA时，gRNA初始转录本两端通常含有病毒来源的序列。当与Cas9蛋白共表达时，gRNA序列被Cas9蛋白结合，未结合的病毒来源序列被内源RNA加工酶剪切，释放出一个或多个成熟的gRNA分子(Mikami等，Plant Cell Physiol,2017,58:1857-1867；Ellison等，Nat Plants,2020,6:620-624)。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的SpCa9和gRNA复合体的靶点选自本氏烟GFP转基因gGFP靶点序列5’-GATACCCAGATCATATGAAGCGG-3’(SEQ ID NO:16)，在另一些实施例中选自本氏烟和普通烟PDS基因中保守的gPDS1靶点序列5’-GGACTCTTGCCAGCAATGCTTGG-3’(SEQ ID NO:17)。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的SpCas12a和gRNA复合体的靶点选自本氏烟PDS基因中保守的靶点序列5'-TTGGTAGTAGCGACTCCATGGGG-3'(gPDS2，SEQ ID NO:89)，或RDR6靶点序列5'-CCCCTCCTGACTCTTACCCAACT-3'(gRDR6，SEQ ID NO:90)，或SGS3靶点序列5'-ACAAGAGTGGAAGCAGTGCTGGG-3'(gSGS3，SEQ ID NO:91)。
在本发明的另一些实施例中，TSWV载体递送的SpCas9和多个串联的gRNA，形成多个SpCas9/gRNA复合体，可以同时靶向多个基因进行多重编辑，如串联表达两个gRNA(gPDS2&gRDR6；SEQ ID NO:137)分别靶向gPDS2和gRDR6位点，或串联表达三个gRNA(gPDS2&gRDR6&gSGS3；SEQ ID NO:138)分别靶向gPDS2、gRDR6和gSGS3位点，且多靶标载体产生的靶基因编辑效率与相应的递送单个gRNA的TSWV载体相似。
碱基编辑器(ABE和CBE等)的gRNA设计与SpCas9核酸酶设计原则相似。在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的ABE和gRNA复合体的靶点选自本氏烟PDSa基因的靶点序列5’-TGCAAATTGAGTTGGGAGTGAGG-3’(gPDSa，SEQ ID NO:92),一些实施例中选自本氏烟FucTa基因的靶点序列5’-CCTCTTGAGAATGTTGCTATTGG-3’(gFucTa1，SEQ ID NO:93)，或选自本氏烟黄连素桥酶样核酸(BBL)d基因的靶点序列5’-GAAATCAGAGTAAGGTGCGGAGG-3’(gBBLd，SEQID NO:97)。
在本发明的一些实施例中，TSWV载体递送的CBE和gRNA复合体的靶点选自本氏烟α-1,3-岩藻糖转移酶a基因(FucT a)的靶点序列5’-CACACCTTCCTCCAGGAGATAGG-3’(gFucTa2，SEQ ID NO:94)、RNA依赖的RNA聚合酶6a基因(RDR6a)的靶点1序列5’-CCAATATCTAGGCGTGAGGGATT-3’(gRDR6a1，SEQ ID NO:95)和靶点2序列5’-CCCGACTTCATGGGGAAGGAGGA-3’(gRDR6a2，SEQ ID NO:96)。
上述的向导RNA可以靶向单个基因或多个基因，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个及以上等等。在本发明的一些实施例中，所述的向导RNA靶向单个基因，如Cas12a crRNA靶向的番茄PDS基因、辣椒PDS基因、大豆PDS基因，以及Cas9 gRNA靶向的GFP转基因；在另一些实施例中，所述的向导RNA靶向两个基因，如Cas12a crRNA靶向的本氏烟和普通烟PDSa和PDSb基因、花生PDSa和PDSb基因，以及Cas9 gRNA靶向的本氏烟和普通烟PDSa和PDSb基因。
为了实现植物细胞遗传物质的修饰，上述含有Cas效应蛋白和靶向不同靶点向导RNA的TSWV病毒载体可被本领域所知的任何方法导入植物细胞、组织或器官。例如，将包含重组病毒载体核酸序列的环状质粒、线性DNA片段、或体外转录的RNA等通过农杆菌侵染法、基因枪轰击法、花粉管导入法、PEG介导融合法、电击法、显微注射法、超声波转化法、脂质体转化法、或纳米颗粒介导的转化等方法引入合适的植物细胞。本发明一些实施例中，所述的导入植物细胞的方法是农杆菌侵染法，即将携带上述核酸构建体(双元质粒载体)的农杆菌浸润本氏烟叶片组织。导入本氏烟细胞的病毒核酸序列指导重组病毒的产生，在植物接种叶和***叶表达CRISPR核酸酶复合体，后者靶向并切割或修饰靶序列并诱导遗传物质的修饰。
TSWV病毒载体也可以通过病毒粒子侵染植物的方法导入植物细胞。例如，将含有侵染性重组病毒粒子的植物汁液通过机械摩擦、高压喷雾、针刺法、注射器注射、真空浸润、基因枪轰击等方法侵染植物，或将已侵染的植株与待侵染植株进行同种或异种嫁接进行病毒接种。在本发明一些实施例中，所述的侵染方法是将含有重组病毒粒子的本氏烟汁液以摩擦接种和高压喷雾的方法接种本氏烟、普通烟、番茄、甜椒、红辣椒、中华辣椒、马铃薯、灯笼果、生菜、花生、大豆、棉花。导入植株细胞的重组病毒粒子起始病毒的复制和侵染，在接种叶和/或***叶表达CRISPR核酸酶复合体，后者切割或修饰靶序列并诱导遗传物质的修饰。
植物被病毒载体侵染后，任何本领域已知的方法可以用于鉴定靶序列是否发生修饰。例如报告基因表达的失活或激活等功能性测定，或利用聚合酶链式反应扩增靶标DNA序列进行Surveyor和T7EI核酸酶测定、限制性内切酶保护分析、Sanger测序分析、或高通量测序分析。
本发明一些实施例中，采用的鉴定方法为限制性内切酶保护分析和Sanger测序分析。根据靶序列的不同，本发明中病毒载体表达的核酸酶产生的靶基因编辑频率可高达45％-98％不等。
本发明另一些实施例中，采用的鉴定方法为高通量测序分析。高通量测序是以植物总DNA为模板以带有接头的特异性引物扩增包括靶标在内的一段序列，将该段序列的扩增子进行二次扩增添加barcode后进行高通量测序，之后将测序结果与野生型序列进行比对分析，计算靶标处发生预期突变的reads数占总reads的比例，该比值即为靶基因编辑频率。
在本发明的方法中，只需导入侵染性重组TSWV病毒载体即可在植物组织中局部地或***地瞬时表达CRISPR核酸修饰酶，实现对植物细胞基因组靶序列的修饰，而无需将所述核酸酶编码基因稳定转化植物，避免了外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
在本发明中，待修饰的靶序列可以位于基因组的任何位置，例如位于功能基因如蛋白编码基因外显子或内含子，或者可以位于基因表达调控区如启动子区或增强子区，从而实现对所述基因功能修饰或对基因表达的修饰。在本发明的一些实施方式中，所述靶序列修饰包括一个或多个碱基的删除、***、置换突变中的某一种或多种类型的组合，可导致靶基因的开放阅读框的移码和预成熟终止、氨基酸取代或缺失。
可以设想，在重组TSWV病毒载体侵染的植物细胞内，如果同时提供一个外源DNA重组模板，可用于指导DNA同源重组。当病毒载体表达的核酸酶切割基因组靶标基因产生的DNA断裂，游离的DNA末端可在同源序列的介导下以外源提供的DNA为模板进行DNA合成，从而在目标基因位点掺入预设的外源序列。
可以通过本发明提供的方法进行遗传物质修饰的植物包括可被病毒载体侵染的天然或实验寄主，例如秋葵(Abelmoschus esculentus)、熊耳草(Ageratumhoustonianum)、洋葱(Allium cepa)、老枪谷(Amaranthus caudatus)、小苋(Amaranthushybridus)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、美花苋(Amaranthus inosus)、皱果苋(Amaranthus viridis)、孤挺花属(Amaryllis sp.)、凤梨(Ananas comosus)、Anemone、甜芹(Apium graveolens var dulce)、普通耧斗菜(Aquilegia vulgaris)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)、牛蒡(Arctium lappa)、黑疆南星(Arum palaestinum)、秋海棠属(Begonia sp.)、射干(Belamcanda chinensis)、甜菜(Betavulgaris)、三叶鬼针草(Bidens pilosa)、野油菜(Brassica campestris)、花椰菜(Brassica oleracea var botrytis)、大白菜(Brassica pekinensis)、菜心(Brassicarapa ssp.Chinensis)、Calceolaria herbeohybrida、金盏花(Calendula officinalis)、翠菊(Callistephus chinensis)、丛生风铃草(Campanula glomerata)、意大利风铃草(Campanula isophylla)、Campanula latiloba、Campan ula pyramidalis、刀豆(Canavalia gladiata)、海刀豆(Canavalia obtusifolia)、西方刀豆(Canavaliaoccidentalis)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、甜椒(Capsicum annuum)、红辣椒(Capsicum frutescens)、中华辣椒(Capsicum Chinense)、浆果辣椒(CapsicumBaccatum)、茸毛辣椒(Capsicum Pubescens)、番木瓜(Carica papaya)、望江南(Cassiaoccidentalis)、决明(Cassia tora)、长春花(Catharanthus roseus)、矢车菊(Centaureacyanus)、桂竹香(Cheiranthus cheiri)、藜(Chenopodium album)、土荆芥(Chenopodiumambrosioides)、苋色藜(Chenopodium amaranticolor)、墙生藜(Chenopodium murale)、茼蒿(Chrysanthemun coronarium)、野菊(Chrysanthemun indicum)、春白菊(Chrysanthemunleucanthemum)、菊(Chrysanthemun morifolium)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、苣荬菜(Cichorium endiva)、菊苣(Cichorium intybus)、瓜叶菊属(Cineraria)、西瓜(Citrulluslanatus)、小粒咖啡(Coffea arabica)、田旋花(Convolvulus arvensis)、香丝草(Conyzabonariensis)、铁树(Cordyline fruticose)(异名Cordyline terminalis)、芫荽(Coriandrum sativum)、金鸡菊(Coreopsis drummondii)、臭荠(Coronopus didymus)、黄鹌菜(Crepis japonica)(异名Youngia japonica)、光叶猪屎豆(Crotalaria incana)、菽麻(Crotalaria juncea)、猪屎豆(Crotalaria pallida)(异名Crotalaria mucronata)、甜瓜(Cucumis melo)、黄瓜(Cucumis sativus)、笋瓜(Cucurbita maxima)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫芦(Cucurbita pepo)、仙客来(Cyclamen indicum)(异名Cyclamenpersicum)、洋蓟(Cynara scolymus)、大丽花(Dahlia pinnata)、Dahlia variabilis、曼陀罗(Datura stramonium)、翠雀属(Delphinium sp.)、三点金草(Desmodium triflorum)、Desmodium unicinatum、雷氏澳茄(Duboisia leichhardtii)、一点红(Emiliasonchifolia)、茴香(Foeniculum vulgare)、欧洲草莓(Fragaria vesca)、辣子草(Galinsoga parviflora)、四芒牛藤菊(Galinsoga quadriradiata)、唐菖蒲属(Gladiolussp.)、大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycine soja)、千日红(Gomphrena globosa)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、向日葵(Helianthusannuus)、黄槿(Hibiscus tiliaceus)、朱顶红(Hippeastrum hybridum)、短筒朱顶红(Hippeastrum reginae)、Hippeastrum rutilum、球兰(Hoya carnosa)、绣球(Hydrangeamacrophylla)、天仙子(Hyoscyamus niger)、霍尔斯特氏凤仙花(Impatiens holsii)、苏丹凤仙花(Impatiens sultanii)、瓦氏凤仙花(Impatiens wallerana)、甘薯(Ipomeabatatas)、莴苣(Lactuca sativa)、香豌豆(Lathyrus odoratus)、荆芥叶狮尾草(Leonotisnepetaefolia)、宽叶补血草(Limonium latifolium)、白叶羽扇豆(Lupinusleucophyllus)、南美羽扇豆(Lupinus mutabilis)、多叶羽扇豆(Lupinus polyphyllus)、枸杞属(Lycium procissimum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、野生多毛番茄(Lycopersicon hirsutum)、醋栗番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)、小花锦葵(Malva parviflora)、紫罗兰(Matthiola incana)、南苜蓿(Medicago polymorpha)、黄香草木樨(Melilotus officinalis)、欧洲夹竹桃(Nerium oleander)、假酸浆(Nicandraphysaloides)、Nicotiana acuminata、Nicotiana bigelovii、克里夫兰烟(Nicotianaclevelandii)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、Nicotiana sylvestris、烟草(Nicotiana tabacum)、冰岛罂粟(Papaver nudicaule)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、矮牵牛(Petunia hybrida)、赤豆(Phaseolus angularis)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、福禄考(Phlox drummondii)、毛苦(Physalis angulata)(异名Physalis minima)、灯笼果(Physalis spp)、紫花豌豆(Pisum arvense)、豌豆(Pisumsativum)、大车前(Plantago major)、黑籽车前(Plantago rugelii)、荞麦蔓(Polygonumconvolvulus)、马齿苋(Portulaca oleracea)、报春花属(Primula sp.)、锦葵状报春(Primula malacoides)、藏报春花(Primula sinensis)、毛茛属(Ranunculus sp.)、覆盆子(Rubus idaeus)、抱茎金光菊(Rudbeckia amplexicaulis)、非洲紫苣薹(Saintpauliaionantha)、Salpiglossis、Scabiosa、蛾蝶花属(Schizanthus)、佛手瓜(Sechium edule)、瓜叶菊(Senecio cruentus)、新疆千里光(Senecio jacobea)、芝麻(Sesamum indicum)、大岩桐(Sinningia eciosa)、毛叶冬珊瑚(Solanum capsicastrum)、美洲野茄(Solanumcarolinense)、裂叶茄(Solanum laciniatum)、乳茄(Solanum mammosum)、茄(Solanummelongena)、龙葵(Solanum nigrum)、节花茄(Solanum nodiflorum)、海茄(Solanumseaforthianum)、裂叶茄(Solanum triflorum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、菠菜(Spinacia oleracea)、田野水苏(Stachys arvensis)、Stapellia、繁缕(Stellaria media)、Streptosolen jamesonii、万寿菊(Tagetespatula)、Taraxacum、灰毛豆(Tephrosia purpurea)、蒺藜(Tribulus terrestris)、白三叶草(Trifolium repens)、地三叶草(Trifolium subterraneum)、旱金莲(Tropaeolummajus)、Vallota、巴西马鞭草(Verbena brasilliensis)、滨海马鞭草(Verbenalitoralis)、无耳多苞菊(Verbesina enceloides)、蚕豆(Vicia faba)、黑绿豆(Vignamungo)、绿豆(Vigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、Xanthium saccharatum、马蹄莲(Zantedeschia aethopica)、银星马蹄莲(Zantedeschia albo-maculata)、黄花马蹄莲(Zantedeschia elliottiana)、黑喉马蹄莲(Zantedeschia melanoleuca)、红花马蹄莲(Zantedeschia rehmannii)、百日菊(Zinnia elegans)等。
在本发明一些实施例中，优选的植物包括本氏烟、普通烟、番茄、甜椒、红辣椒、中华辣椒、灯笼果、马铃薯、生菜、花生、大豆、棉花。
众所周知，植物尤其是栽培作物，包含不同的品种(variety)，或称为品系(line)、栽培种(cultivar)、种质(germplasm)和基因型(genotype)等。本发明发现，TSWV核酸酶递送载体可有效侵染同一物种(species)内不同品种并表达核酸修饰酶，产生相似的靶标基因定向修饰效率。
在本发明的一些优选实施方案中，TSWV核酸酶递送载体侵染10种花生品种产生了相似的靶标基因定向修饰效率，包括花育25、花育32、花育39、花育48、花育9616、丰油68、红花1号、大白沙、四粒红、硕丰518品种。
在本发明的另一些优选实施方案中，TSWV核酸酶递送载体侵染10种甜椒品种产生了相似的靶标基因定向修饰效率，包括皱辣2号、皱辣3号、皱辣4号、福湘秀丽、博辣5号、博辣7、博辣15、兴蔬201、兴蔬301、兴蔬归燕品种。
通常认为，病毒对寄主植物的侵染不依赖于植物的基因型。可以设想，TSWV核酸酶递送载体可以有效侵染其它寄主植物的不同品种(variety)、品系(line)、栽培种(cultivar)、种质(germplasm)或基因型(genotype)，并修饰其遗传物质。
产生经遗传修饰的植物的方法
进一步，本发明还公开了从所述的遗传物质被修饰植物细胞获得植物，以及选择遗传物质被修饰的植物的方法。
本发明中的植物细胞可以为被病毒侵染的完整植株上的细胞，也可以为离体植物细胞，如愈伤组织、悬浮细胞、原生质体。
从植物细胞获得植物器官或完整植株的方法包括通过种子繁殖，如植物细胞被自然地或人为地诱导发育为成体胚胎干细胞，进而发育为生殖细胞，经有性生殖后产生种子。植物细胞还可以通过微繁殖(micropropagation)方法获得完整的植株，即利用植物组织培养技术，在离体条件下对植物细胞进行无性繁殖。
在本发明的一些实施方式中，获得遗传物质被修饰的植株的方法为微繁殖。该方法包括将病毒侵染的植物细胞或组织作为外植体(explant)，在无选择标记的培养基上进行组织培养和植株再生，即在组织培养过程中不使用选择剂(如抗生素、除草剂等)。进一步，该方法包含从再生植株中选择遗传物质被修饰的植物，所述的选择过程无需通过选择标记选择，而是利用限制性内切酶分析或DNA测序分析靶标基因序列进行筛选。
本发明进一步比较了含有或不含NSs基因的TSWV病毒载体的侵染对植物细胞的分化和再生影响，发现NSs的存在抑制植物再生。因此，本发明的一些优选实施方式中，被缺失NSs的TSWV载体侵染的植物细胞被用来组织培养再生遗传物质被修饰的植株。
植物植株培养和再生的方法为本领域技术人员所知晓，不同植物细胞对培养基成分和激素浓度和比例的要求存在差异。
在本发明的一些优选实施方式中，TSWV核酸酶递送载体侵染的本氏烟叶片细胞被用于组织培养，获得了没有外源核酸***的、遗传物质被修饰的植株。
在本发明的一些优选实施方式中，TSWV核酸酶递送载体侵染的普通烟叶片细胞被用于组织培养，获得了没有外源核酸***的、遗传物质被修饰的植株。
在本发明的一些优选实施方式中，TSWV核酸酶递送载体侵染的番茄叶片细胞被用于进行组织培养，获得了没有外源核酸***的、遗传物质被修饰的植株。
当利用病毒侵染的体细胞组织进行组培时，病毒常常继续存在于再生植株中。病毒载体的感染将在再生植株中持续表达核酸修饰酶，修饰体细胞内靶标基因，产生不可遗传编辑，或修饰非靶标基因，产生脱靶(off-target)修饰。此外，病毒的持续感染可干扰植物生理和表型，甚至对开花和结实率产生不利影响。因此，在植株再生时去除病毒载体可避免上述不利影响。
某些化合物可在体内和体外有效抑制人或动物RNA病毒复制，比如一些核苷或核苷酸类似物，如利巴韦林(ribavirin)、法匹拉韦(favipiravir)、瑞德西韦(remdesivir)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、奥昔嘌醇(oxypurinol)、吉西他滨(gemcitabine)、galidesivir(BCV4430)、咪唑立宾(mizoribine)、莫努匹韦(molnupiravir)、索非布韦(sofosbuvir)、泰诺福韦(tenofovir)等(Geraghty等，Viruses，2021，13:667；Borbone等，Molecules，2021，26：986)。这些核苷或核苷酸类似物靶向病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)，在病毒复制时被RdRp错误地掺入到新生的病毒RNA链中，导致病毒RNA复制终止或引起病毒基因组积累大量有害突变。不同化合物对不同的动物RNA病毒RdRP的亲和性具有显著差别，其抗病毒效果也不尽相同。本发明人意外地发现，当利用TSWV侵染的体细胞组织进行组培时，培养基内加入某些核苷或核苷酸类似物大大提高了再生植株中病毒脱除效率，并且显著增加了再生植株中含有遗传修饰的比例。
本发明的一些实施例中，当TSWV CRISPR/Cas12a递送载体侵染的叶片组织在含有40mg/L的利巴韦林的培养基上再生时，100％的再生植株脱除了病毒，在crPDS1靶点上产生四等位(tetra-allelic)突变的频率为28.9％；而无抗病毒药物对照中仅4.4％的再生植株脱除病毒，15.6％含有双等位突变。
本发明的一些实施例中，当TSWV CRISPR/Cas12a递送载体侵染的叶片组织在含有40mg/L的法匹拉韦的培养基上再生时，66.7％的再生植株脱除了病毒。
本发明的一些实施例中，当TSWV CRISPR/Cas12a递送载体侵染的叶片组织在含有1.2mg/L的瑞德西韦的培养基上再生时，15.6％的再生植株脱除了病毒。
在另一方面，本发明还提供上述重组TSWV粒子，所述的病毒粒子包裹的病毒嵌合基因组中包含异源序列特异性核酸修饰酶的编码序列。所述的重组TSWV病毒粒子被本领域的常规方法，如汁液摩擦接种、高压喷雾等接种至分离的植物细胞，或完整植株的特定器官或组织，如叶片、叶脉、根等。病毒粒子侵染植物细胞后表达核酸修饰酶，切割或修饰植物基因组靶序列并诱导遗传物质发生修饰。
在另一方面，本发明进一步提供了试剂盒，该试剂盒含有上述方法和组合体中提及的病毒载体元件。试剂盒可以包含一个病毒载体***及其使用手册，包括：a)包含重组TSWV S、M和L嵌合基因组序列的核酸构建体，其中S基因组包含一个或多个编码CRISPR向导RNA组份的异源核酸序列，M基因组包含一个或多个编码Cas核酸修饰酶组份的异源核酸序列；L基因组包含密码子优化的病毒RdRp序列(SEQ ID NO:5)；b)编码一种或者多种病毒沉默抑制子的辅助表达构建体；所述的病毒载体导入细胞后产生重组病毒，瞬时表达CRISPR/Cas核酸修饰酶，并对细胞基因组遗传物质产生修饰。所述的病毒载体试剂可以单独提供，也可以组合提供；可以置于合适的容器内，如管子、瓶子、或药瓶。
本发明公开的基于病毒载体递送***的编辑技术与现有技术相比，其有益效果为：
(1)该病毒载体具有较大的外源片段包装能力，遗传稳定性好，可用于递送分子量大的Cas核酸酶基因，而待修饰的植物细胞内无需转基因表达的核酸酶组份；
(2)该病毒载体在植物中具有完全侵染性病毒，可以在完整植株体内(in planta)多个器官和组织递送和表达核酸酶；
(3)该类病毒具有广泛的寄主范围，重组病毒粒子可摩擦接种侵染寄主植物，可应用于多种重要作物；
(4)该病毒载体为无包膜的缺失突变体，不能被昆虫传播，具有较高的生物安全性；
(5)病毒载体复制可大量表达序列特异性核酸酶，有助于获得较高的基因编辑效率；
(6)RNA病毒复制过程不涉及DNA阶段，无外源DNA整合风险，获得编辑植株不含有外源遗传物质；
(7)病毒载体介导瞬时表达通常不依赖于寄主植物的基因型，可应用于不同作物品种，而传统的农杆菌介导的稳定转化常常仅能在少数物种或特定品种上可行。
(8)病毒载体可在植株再生时通过抗病毒药物高效去除，获得无病毒的突变体植株。
实施例
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，该实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。在不偏离本发明基础上所做的修改或改进，均属于本发明的保护范围。
如无特殊说明，下述实施例所使用的实验方法，均为常规方法，如无特殊说明，所使用的试剂、材料均可从商业途径得到。
以下实施例中描述重组番茄斑萎病毒(TSWV)载体时采用TSWV-X-Y命名方式(或简称V-X-Y)，其中X指代M基因组上所携带的异源核酸序列，Y指代S基因组上***的外源核酸序列。当某条基因组包含两个串联的异源核酸元件时用分号连接，如TSWV-X-Y:Z。例如，TSWV-Cas12a-crPDS1:GFP为M基因组携带异源的Cas12a序列、S基因组携带异源的crRNA和GFP序列的重组TSWV载体。当描述包含TSWV S、M和L基因组cDNA序列的质粒构建体时采用pS/M/L(-/+)X形式，其中(-)表示以基因组cDNA方向***构建体内启动子的下游，导入细胞后转录产生病毒负义链RNA，(+)表示以反基因组cDNA方向***构建体内启动子的下游，导入细胞后转录产生病毒正义链RNA，X表示基因组中所携带的异源核酸序列。例如pM(+)cas12a为包含异源的Cas12a序列的TSWV M反基因组cDNA载体。
农杆菌双元载体pCB301-2μ-HDV(图3A)在文献“Sun K,Zhao D,Liu Y,Huang C,Zhang W,Li Z.Rapid construction of complex plant RNA virus infectious cDNAclones for agroinfection using a yeast-E.coli-Agrobacterium shuttlevector.Viruses.2017,9(11).pii:E332”中公开过。
农杆菌双元载体pGD(图3B)，以及pGD-GFP和pGD-RFP载体在文献“Goodin MM,Dietzgen RG,Schichnes D,et al.,pGD vectors:versatile tools for the expressionof green and red fluorescent protein fusions in agroinfiltrated plantleaves.Plant J,2002,31:375-83”中公开过。
RNA沉默抑制子(VSR)蛋白表达载体pGD-HcPro、pGD-p19、pGD-γb在文献“GanesanU,Bragg JN,Deng M,et al.,Construction of a sonchus yellow net virusminireplicon:a step toward reverse genetic analysis of plant negative-strandRNA viruses.J Virol.2013,87:10598-10611”中公开过。
本氏烟密码子优化的SpCas9序列在文献“Yin K,Han T,Liu G,et al.,Geminivirus-based guide RNA delivery system for CRISPR/Cas9 mediated plantgenome editing.Scientific Reports,2015,5:14926”中公开过。
包含水稻密码子优化的LbCas12a序列的质粒pYQ230在文献“Tang,X.,Lowder,L.G.,Zhang,T.,et al.A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing andtranscriptional repression in plants.Nature Plants,2017,3:17018”中公开过。
本氏烟(Nicotiana benthamiana)LAB品种和16C转基因系在文献“Ruiz MT,Voinnet O,Baulcombe DC.Initiation and maintenance ofvirus-induced genesilencing.Plant Cell,1998,10:937–46”中公开过；普通烟(N.tabacum cv.K326)、番茄(Solanum lycopersicum cv.Hongbaoshi)、马铃薯(S.tuberosum)、甜椒(Capsicumannuum)、红辣椒(C.frutescens)、中华辣椒(C.Chinense)、灯笼果(Physalis grisea)、生菜(Lactuca sativa)、陆地棉(Gossypium hirsutum cv.Junmian No.1)、花生(Arachishypogaea)、大豆(Glycine max cv.William 82)为常规植物实验材料，公众可从浙江大学生物技术研究所获得。
茄科植物(本氏烟、普通烟、番茄、马铃薯和辣椒)靶标基因序列从茄科基因组数据库(https://solgenomics.net/)检索得到，而豆科植物(花生和大豆)靶标基因序列可从豆科基因组信息***LIS数据库(https://legumeinfo.org/)检索获得。Cas12a靶位点的选择根据CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/)在线软件设计，Cas9和Cas9衍生的碱基编辑器靶位点的选择根据CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线软件设计。
实施例1：TSWV双报告基因表达载体的构建
TSWV侵染的植物样品总RNA提取：
取0.1g本实验室保存的TSWV毒源，液氮中快速研磨至粉末；利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取样品总RNA，仅异丙醇沉淀后溶解于50μL DEPC处理的纯水中，立即用于后续实验或者分装保存于-80℃冰箱。
反转录获得病毒基因组cDNA
操作参照TaKaRa公司AMV反转录酶说明书，具体步骤如下：
1)混合反应如下体系：
反转录使用的引物为包括：
2)PCR仪中进行如下反应：42℃1h；50℃30min；95℃5min；4℃10min；产物可以直接稀释后用作PCR模板或者-20℃保存备用。
重组TSWV载体和病毒蛋白瞬时表达载体构建
TSWV基因组包含三个片段，从小到大依次为S、M和L基因组(图2)，序列如SEQ IDNO:1、2、3所示。三条病毒基因组cDNA分别构建体于双元载体pCB301-2μ-HDV。如图3A所示，StuI/SmaI酶切的pCB301-2μ-HDV得到平末端线性化载体，外源病毒序列***后，35S启动子(SEQ ID NO:9)从***序列的5’-端第一个碱基起始转录，而丁型肝炎核酶序列(HDV-RZ)可以保证病毒RNA转录本含有忠实的3’-末端序列。病毒蛋白瞬时表达载体克隆于双元载体pGD(图3B)。本发明载体构建的所涉及的引物序列在表1列出。引物和基因片段均于金斯瑞公司(南京)合成。
1)pL(+)和pL(+)opt载体构建
pL(+)为TSWV L反基因组cDNA载体(图4A)。以上述反转录获得的L cDNA作为模板，利用特异性引物L(+)/F和L(+)/R(表1)扩增L全长反基因组cDNA(SEQ ID NO:3)。利用限制性内切酶StuI和SmaI消化pCB301-2μ-HDV酵母-农杆菌-大肠杆菌穿梭载体获得线性化的质粒DNA片段，并与L cDNA片段共同转化，参照Sun等(Viruses.2017,9.pii:E332.)文献，通过酵母同源重组克隆方法获得环形质粒。挑取缺色氨酸的酵母平板上的酵母菌落提取质粒，转化大肠杆菌后提质粒进行酶切验证，对酶切无误的阳性酵母质粒克隆进一步通过Sanger测序进行验证，即获得pL(+)。
pL(+)opt来源于pL(+)，其中RdRp编码序列(SEQ ID NO:4)被密码子优化的序列(SEQID NO:5)替换(图4A)。根据本氏烟密码子偏好性对RdRp密码子进行优化，并利用软件Alternative Splice Site Predictor(ASSP)(http://wangcomputing.com/assp/)对野生型RdRp序列进行潜在的内含子-外显子剪切位点(intron splicing sites)预测，去除预测的剪切位点，获得密码子优化的RdRp序列(SEQ ID NO:5)。以pL(+)质粒为模板，利用引物Lopt 5’UTR/F和Lopt 3’UTR/R进行扩增获得去除RdRp编码序列的载体片段，并与化学合成的密码子优化的RdRp片段共同转化酵母细胞组装重组克隆pL(+)opt。
2)pM(-)、pM(-)RFP和pM(+)RFP载体构建
pM(-)为TSWV M基因组cDNA载体(图4B)。以上述反转录获得的M cDNA作为模板，利用引物M 5’UTR/F和M 3’UTR/R扩增得到M全长基因组全长cDNA(SEQ ID NO:2)。该对引物两侧包含与StuI和SmaI线性化的pCB301-2μ-HDV载体两侧同源的15bp序列。利用In-Fusion克隆试剂(Invitrogen)将M全长基因组cDNA片段***线性化的pCB301-2μ-HDV，即获得pM(-)质粒。
pM(-)RFP为pM(-)质粒内GP基因被RFP基因置换的载体(图4B)。分别利用引物对MIGR/ScaI/F和M IGR/R，RFP/M 3’UTR/F和pCB-PmeI/R以pM(-)为模板，扩增获得包含完整的M基因间隔区(IGR)序列的ScaI-IGR片段，以及包括M的3’UTR至pCB301载体PmeI酶切位点处的3’UTR-PmeI片段。此外，利用引物RFP/F和RFP/R从pGD-RFP质粒扩增RFP片段，利用限制性内切酶ScaI和PmeI消化pM(-)载体后回收载体片段。将上述四个片段通过In-Fusion克隆试剂连接，即获得pM(-)RFP。
pM(+)RFP与pM(-)RFP具有相同的***序列，但以相反的方向***载体，以转录产生M反基因组RNA(图4B)。利用引物35S/M 3’UTR/F/和HDV/M 5’UTR/R以pM(-)RFP为模板，扩增包含RFP的病毒M基因组cDNA，并与SmaI/StuI消化的pCB301-2μ-HDV经In-Fusion克隆进行连接。
3)pS(+)和pS(+)GFP载体构建
pS(+)为TSWV S反基因组cDNA载体(图4C)。以上述反转录获得S cDNA作为模板，利用引物35S/S 3’UTR/F和HDV/S 5’UTR/R扩增获得S反基因组全长cDNA片段(SEQ ID NO:1)，并与StuI/SmaI双酶切的pCB301-2μ-HDV载体片段通过In-Fusion克隆进行连接。
pS(+)GFP为pS(+)质粒内NSs基因被GFP基因置换的载体(图4C)。以pS(+)载体为模板，利用引物S 5’UTR/F和S IGR/R扩增得到去除NSs序列的DNA片段；利用引物GFP/5’UTR/F和GFP/IGR/R引物以pGD-GFP质粒作为模板扩增得到GFP片段。上述两个片段通过In-Fusion无缝连接得到pS(+)GFP。
4)pGD-NSs和pGD-NSm表达载体构建
以上述反转录获得S和M cDNA为模板，分别利用引物对BamHI/NSs/F和SalI/NSs/R、BamHI/NSm/F和SalI/NSm/扩增NSs(SEQ ID NO:7)和NSm(SEQ ID NO:8)编码区cDNA片段。将BamHI和SalI消化的上述PCR产物分别和pGD载体连接，获得瞬时表达载体pGD-NSs和pGD-NSm。
实施例2：TSWV载体同时表达两个荧光报告蛋白
农杆菌浸润接种本氏烟
将上述pL(+)opt、pM(-)RFP、pM(+)RFP、pS(+)GFP、pS(+)病毒基因组cDNA双元质粒电击转化农杆菌菌株EHA105，同时将TSWV运动蛋白NSm表达载体pGD-NSm、TSWV沉默抑制子蛋白NSs表达载体pGD-NSs、以及异源病毒RNA沉默抑制子(VSR)表达载体，如pGD-p19(番茄丛矮病毒p19蛋白)、pGD-HcPro(烟草蚀纹病毒HcPro蛋白)、pGD-γb(大麦条纹花叶病毒γb蛋白)分别电击转化农杆菌菌株EHA105。挑取农杆菌单菌落接种至4mL含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的YEP液体培养基(牛肉浸膏10g/L，酵母提取液10g/L，NaCl5g/L，PH 7.0)，28℃、220rpm培养过夜至OD600为0.8-1.2，经5,500rpm离心10分钟收集菌液沉淀，利用浸润缓冲液(10mM MgCl2，10mM MES，200mM乙酰丁香酮)重新悬浮菌体，调整OD600为1.0左右，静置2-3小时。
为了拯救携带两个报告基因的重组病毒，以及测试M基因组极性(正义或负义)以及NSm蛋白的共表达对重组病毒拯救效率的影响，按照以下三个组合配制农杆菌混合物浸润本氏烟叶片，进行重组病毒拯救。
实验组1：pL(+)opt，pM(-)RFP，pS(+)GFP，pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs
实验组2：pL(+)opt，pM(+)RFP，pS(+)GFP，pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs
实验组3：pL(+)opt，pM(+)RFP，pS(+)GFP，pGD-NSm，pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs
在混合物中，含有S、M、L基因组质粒的菌液终浓度分别调至OD600＝0.1，包含各RNA抑制子质粒的菌液等比例混合后终浓度调至OD600＝0.05，包含pGD-NSm表达载体的菌液终浓度为OD600＝0.1。如图5A所示的方法，将以上三个实验组浸润5-7叶期本氏烟下部三片叶片，接种后植株置于25℃防虫温室培养。
报告基因表达分析
浸润5天后，三个组合浸润的本氏烟叶片均可见GFP和RFP的表达，其中表达GFP的叶片组织相对RFP的组织更为局限，尤其以实验组3为甚(图5B)。
浸润7天后，实验组1和2的上部非浸润叶均开始出现绿色和红色荧光，到10天时***叶出现大范围的荧光扩散。相比之下，实验组1浸润的本氏烟***叶荧光的出现有所延迟，到第10天时尚见零星红色和绿色荧光团块(图5B)。
浸润6-8天后，实验组1和2中所有接种植株陆续出现病毒侵染症状，如幼叶卷曲皱缩、褪绿等，而实验组3中植株***侵染推迟了2-3天。***侵染的植株在UV等下均可见荧光蛋白的表达(图5C)。提取上部叶片总蛋白，分别用TSWV N多克隆抗体、GFP多克隆抗体、mCherry多克隆抗体进行Western blot分析，三个实验组叶片总蛋白中可以均检测到病毒N蛋白、GFP蛋白条带及RFP蛋白条带，而不含有L基因组质粒的对照组没有检测到对应条带(图5D)。
以上结果表明：i)L和S反基因组cDNA载体转录产生病毒RNA可以直接翻译产生足够的RdRp和N蛋白用于包装病毒基因组，形成核衣壳侵染单元；ii)对于M基因组而言，无论是基因组cDNA载体(实验组1)还是反基因组cDNA载体(实验组2和3)均能支持重组病毒的产生；iii)额外提供病毒运动蛋白瞬时表达载体并不能促进重组病毒拯救，反而延迟病毒拯救(比较实验组2和3)；iv)缺失了NSs和GP基因的重组可以***侵染本氏烟，且可以同时表达报告基因GFP和RFP。
实施例3：RNA沉默抑制子组合对于重组病毒拯救的作用
实施例2中农杆菌浸润混合物中包含了四个RNA沉默抑制子(VSR)表达载体，即pGD-p19、pGD-HcPro、pGD-γb、pGD-NSs。本实施进一步测试了表达单个或多个病毒沉默抑制子组合对于重组TSWV拯救的作用。在农杆菌混合物中，包含pL(+)opt，pM(-)RFP，pS(+)GFP质粒的菌液终浓度分别调至OD600＝0.1，下面各VSR质粒的菌液的终浓度调至OD600＝0.05。
实验组1：pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs(pGD-VSRs)
实验组2：pGD-p19
实验组3：pGD-HcPro
实验组4：pGD-γb
实验组5：pGD-NSs
实验组6：pGD-p19，pGD-HcPro
实验组7：pGD(空载体对照)
接种第8天后，实验组1(VSRs)、2(p19)、6(p19+HcPro)中20株浸润植株均16-18株植株出现了***侵染症状，即拯救效率为80-90％。实验组3(HcPro)、4(γb)和5(NSs)分别有7、12和2株出现***侵染。根据植株出现了***侵染的时间和比例，效率从高到低依次为实验组2、1、6、4、3、5。直到接种后20天，实验组7中20株浸润植株均未发生了***侵染(图6)。以上结果表明，共表达沉默抑制子对重组TSWV载体的拯救均有不同程度的促进作用，其中p19的作用最为显著，而NSs蛋白效率则较低。
实施例4：TSWV-Cas12a-crRNA编辑载体设计和构建
CRISPR/Cas12a核酸酶***包含Cas12a蛋白和与靶标结合的向导RNA(crRNA)。如图7所示，TSWV-Cas12a-crRNA载体构建策略为：i)将编码Cas12a的序列替换TSWV M基因组中的GP序列，分别构建了基因组cDNA载体pM(-)Cas12a和反基因组cDNA载体pM(+)Cas12a；ii)将crRNA序列***于pS(+)GFP载体中紧邻GFP编码框起始密码子5’位点，构建pS(+)crRNA:GFP载体。***的crRNA序列的结构为“直接重复区(Direct Repeat)-向导序列(guide)-直接重复区(Direct Repeat)”，其中两个直接重复区的设计是为了使M基因组表达的Cas12a蛋白对S基因组产生的crRNA初始转录本进行加工，剪除旁侧的病毒来源序列，释放精确的crRNA序列。以下详述具体构建的方法。
1)pM(-)Cas12a和pM(+)Cas12a载体构建
以包含水稻密码子优化的Cas12a序列且两侧含有核定位信号和3×Flag抗原表位序列(SEQ ID NO:10)的质粒(来源于pYQ230)为模板，利用引物M UTR/Cas12a/F和Cas12a/R(表1)扩增获得3×Flag-NLS-Cas12a-NLS片段；利用引物M 3’UTR/F和Cas12a/M IGR/R从pM(-)质粒扩增得到缺失GP序列的M载体片段。将以上两个片段利用In-Fusion克隆试剂连接产生pM(-)Cas12a载体。
以pM(-)Cas12a为模板，利用引物35S/M 3’UTR/F和HDV/M 5’UTR/R扩增获得重组M基因组cDNA片段，并与StuI和SmaI限制性内切酶消化处理的pCB301-2μ-HDV载体片段通过In-Fusion克隆方法连接，使其以反基因组cDNA方向***载体，产生pM(+)Cas12a载体。
2)pS(+)crRNA:GFP系列载体构建
为了便于crRNA***，在pS(+)GFP质粒GFP起始密码子5’***一个SpeI酶切位点。利用pS(+)GFP载体中位于IGR序列中的PacI以及NOS序列中的PvuI单酶切位点，以引物对SpeI/GFP/F和IGR PacI/R、NOS PvuI/F和S 5’UTR/R分别从pS(+)GFP载体扩增得到PacI-IGR-GFP-SpeI和SpeI-5’UTR-HDV-NOS片段。将上述片段***PacI和PvuI消化的pS(+)GFP载体，获得引入SpeI酶切位点的pS(+)SpeI:GFP中间载体。
根据CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/)在线设计软件，选择本氏烟和普通烟八氢番茄红色脱氢酶基因(PDS)靶位点 (粗体字母为PAM序列，下同)、番茄PDS靶位点/> 辣椒PDS的靶位点/> 花生和大豆PDS的靶位点可靶向上述靶位点的crRNA序列(分别如SEQ ID NO:18-21所示)，其结构为“直接重复区-向导序列-直接重复区”，两侧含有SpeI酶切位点。分别将上述crRNA序列片段***pS(+)SpeI:GFP载体SpeI位点，产生pS(+)crPDS1:GFP、pS(+)crPDS2:GFP、pS(+)crPDS3:GFP、pS(+)crPDS4:GFP载体。
实施例5：重组TSWV-Cas12a-crRNA拯救体系的建立
实施例2建立了TSWV-RFP-GFP载体的拯救条件，发现M基因组和反基因组cDNA载体均可用于成功拯救重组病毒。本实施例的前期预实验表明，M基因组中***了近4kb Cas12a基因显著影响TSWV-Cas12a-crRNA载体的产生。因此，本实施例***地探索了产生TSWV-Cas12a-crRNA载体所需的实验条件，包括M基因组的极性(正义或负义)以及各基因组组份的相对比例。按照如下所示八个组合配制不同浓度(OD600)的农杆菌混合物，各组合中均包含L、M和S cDNA载体，以及四个VSR载体，即pGD-p19+pGD-HcPro+pGD-γb+pGD-NSs。其中组1-4中含有M基因组cDNA载体pM(-)Cas12a，而组5-8中含有M反基因组cDNA载体pM(+)Cas12a，组合5-7包含pGD-NSm表达载体。
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将上述农杆菌组合物浸润本氏烟叶片进行重组病毒拯救。如图8A所示，5天后各组均可观察到GFP荧光在浸润叶片中广泛分布。浸润9天后部分组合浸润植株开始出现***侵染症状，但组1、2、3所有植株始终未出现重组病毒***侵染，组4的50株接种植株中仅有2株(4％)最终形成重组病毒***侵染。如上表所示，表达M反基因组RNA的组5-8的侵染侵染比例依次为10％、28％、60、83％，显著高于M基因组RNA的组1-4。组5-8中携带M质粒和S质粒的农杆菌比例分别为1:1、2:1、10:1、10:1，表明高效的重组病毒拯救需要相对高浓度的M反基因组cDNA质粒。
上述组合中***侵染的植株表现出典型的TSWV症状(图8B)。提取组4中两株***侵染植株的上部叶片总蛋白样品，以及组8中任选的两株侵染植株的总蛋白，分别利用TSWVN多克隆抗体、GFP多克隆抗体、Flag单克隆抗体(检测Cas12a蛋白)进行Western blot分析，这些样品中均可以检测到病毒N蛋白和GFP蛋白的表达，但仅组8中两个样品存在Cas12a蛋白条带，而组4两个样品均无Cas12的表达(图8C)。为了进一步明确组4植株无Cas12a表达的原因，提取上述四株植株***叶片总RNA样品，利用扩增NSm特异性引物NSm/F(5’-ATGTTGACTTTTTTTGGTAATAAGGG-3’)(SEQ ID NO:24)和NSm/R(5’-CTATATTTCATCAAAAGATAACTGAGC-3’)(SEQ ID NO:25)以及Cas12a旁侧引物对IGR/F(5’-TACTTTTAATACCACTTATTTAAGCTT-3’)(SEQ ID NO:26)和M UTR/R(5’-AGAGCAATCAGTGCAAACAAAAAC-3’)(SEQ ID NO:27)对上述四个样品中重组病毒M基因组的NSm基因和Cas12a***片段进行逆转录PCR(RT-PCR)检测。如图8D所示，四个样品中均检测到预期大小的NSm基因的存在，在组8的两个植株样品中检测到了～4.3kb大小的目标Cas12a条带，但组4的两个样品仅检测到了0.5-0.7kb左右的小片段。上述缺失片段经克隆和Sanger测序分析表明，组4重组病毒中Cas12***片段大部分被丢失，仅保留了Cas12a基因5’和3’部分序列(图8E)。
从以上结果可知，与TSWV-RFP-GFP载体拯救体系不同，含有M基因组cDNA载体pM(-)Cas12a的农杆菌混合物要么无法用于拯救TSWV-Cas12a-crRNA，要么拯救的重组病毒丢失大部分Cas12a***序列，而M反基因组cDNA载体pM(+)Cas12a则可用于产生完整的TSWV-Cas12a-crRNA载体。当携带L基因组载体、M基因组载体和S基因组载体的农杆菌比例为2:10:1时重组病毒拯救最为高效(组8)，而瞬时表达NSm蛋白对重组病毒载体的拯救没有促进作用(比较组7和8)。因此，在下述相关的实施例中均采用组8中的农杆菌组合和浓度进行重组病毒拯救。
实施例6：TSWV-Cas12a-crRNA载体编辑本氏烟PDS基因
本氏烟植株为异源四倍体，PDS基因靶点crPDS1序列(粗体字母为PAM；下划线碱基为HinfI酶切位点)在来源于两个祖先亲本基因组的PDSa和PDSb基因种中保守(图9A)。如实施例4所述，pS(+)crPDS1:GFP载体含有可靶向crPDS1位点的crRNA序列。根据实施例5中组8试验体系混合携带各载体的农杆菌浸组份(实验组)，同时以不含有crRNA的pS(+)GFP载体代替pS(+)crPDS1:GFP载体作为阴性对照组，如下所示：
实验组：pL(+)opt，pM(+)Cas12a，pS(+)crPDS1:GFP，pGD-p19+pGD-HcPro+pGD-γb+pGD-NSs
对照组：pL(+)opt，pM(+)Cas12a，pS(+)GFP，pGD-p19+pGD-HcPro+pGD-γb+pGD-NSs
将两组农杆菌混合物分别浸润接种本氏烟叶片，接种后10天左右均产生了叶片卷曲皱缩以及褪绿斑驳等TSWV症状，并且在***叶表达了GFP蛋白(图9B)。采集植株***侵染叶片组织提取总蛋白，分别利用特异性抗体可检测到TSWV N、GFP和Cas12a蛋白(图9C)。
为了验证病毒载体侵染的细胞是否在靶标基因位点产生编辑，采用聚合酶链式反应/限制性内切酶保护法(Polymerase Chain Reaction/Restriction digestion，PCR/RE)检测靶标位点基因编辑，如果该靶位点发生编辑，则与Cas12a切割位点部分重叠的限制性内切酶位点被破坏，靶标DNA PCR片段无法被相应的内切酶消化。具体方法为：
1)利用 Quick Gel Extraction Kit(Invitrogen)提取植物上部叶片组织基因组DNA；
2)利用表2中靶标序列两侧的特异性引物PCR扩增包含靶标crPDS1的基因组DNA片段；
3)利用限制性内切酶消化PCR产物，一般的酶切体系如下：
10×Fastdigest Buffer 2μl
限制性内切酶 1μl
PCR产物 0.2μg
ddH2O 补充至总体积20μl
PCR/RE分析表明，TSWV-Cas12a-crPDS1:GFP侵染的植株PDS靶点突变频率约为50％，而对照组V-Cas12a-GFP侵染的组织不存在靶标位点的编辑(图9D)。以上结果表明，TSWV载体可以在本氏烟体内***递送Cas12a/crRNA复合体，并在靶标位点高效地产生定点编辑。
实施例7：TSWV-Cas12a-crRNA病毒粒子的机械传播及稳定性分析
实施例6采用农杆菌浸润接种的方式在本氏烟植株中起始TSWV-Cas12a-crPDS1:GFP载体侵染，但多数植物对农杆菌转化的敏感性显著低于模式植物本氏烟。为了验证其他病毒接种方式的可行性，本实施例探索了重组病毒粒子通过机械接种其它植物的可行性，试验流程如下(图10A)：
1)农杆菌浸润本氏烟，产生TSWV-Cas12a-crPDS1:GFP重组病毒；
2)采集***侵染的本氏烟上部叶片，于接种缓冲液(0.01mM亚硫酸钠，0.01mM磷酸钾，pH 7.0)研磨获得病毒汁液；
3)在待接种的植株叶片先均匀撒布600目金刚砂；
4)用指腹蘸取病毒汁液轻轻摩擦叶片接种，或将病毒汁液经台式离心机12,000rpm转速离心10min，取上清加入表面活性剂silwet70至终浓度0.1％(v/v)，装入高压喷射枪，调节喷枪气压泵待气压稳定在40PSI后，将喷枪口对准撒有金刚砂的叶片，距离3-5cm喷射病毒汁液；
5)接种完成后喷洒无菌水冲去叶片上残留的金刚砂；
6)通过症状观察、荧光成像、Western blot和RT-PCR等方法检测重组病毒侵染；利用PCR/RE和/或Sanger测序法检测靶标位点基因编辑。
按照上述机械接种方法将TSWV-Cas12a-crPDS1:GFP汁液分别接种健康本氏烟、马铃薯、灯笼果、棉花和生菜幼苗。接种8-16天后，利用摩擦和高压喷雾方法接种的本氏烟、马铃薯、灯笼果和生菜植株均表现出病毒侵染症状，并在荧光显微镜下可检测到侵染植株组织内绿色荧光信号(图10B)。以***侵染的本氏烟植株为例，Western blot分析表明，***侵染的本氏烟植株组织内可检测到TSWV N蛋白以及Cas12a和GFP蛋白(图10C)。采用实施例6中所述的PCR/RE法检测本氏烟PDS基因的靶标序列的编辑效率，随机选取摩擦接种和高压喷雾的各2株接种植株中，PDS靶位点的突变频率为47-71％(图10D)，与通过农杆菌接种的植株编辑频率(43-55％；实施例6)相当。
由于crPDS1靶点在本氏烟和普通烟PDS基因的两个拷贝中均保守(图11A)，因此将上述重组病毒汁液作为毒源也摩擦接种了普通烟植株。接种约8天后，植株***叶可观察到绿色荧光，并表现出褪绿斑、叶脉黄化、叶片皱缩等症状(图11B)，并可检测到TSWV N、Cas12a和GFP蛋白的表达(图11C)。利用普通烟靶标位点特异性引物扩增基因组DNA(表2)，PCR/RE分析表明重组病毒侵染的组织中PDS靶标位点的突变频率可达56％(图11D)。
以上结果表明，含有重组病毒粒子的汁液可以经机械接种有效侵染多种植物，且后代病毒稳定表达了异源核酸酶和报告蛋白，并产生靶向编辑。
实施例8：TSWV-Cas12a-crRNA载体在番茄和辣椒基因编辑中的应用
番茄PDS基因靶点(粗体字母为PAM；下划线碱基为HinfI酶切位点)，如图12A所示，实施例4中描述的pS(+)crPDS2:GFP载体含有可靶向该位点的crRNA序列。将携带pL(+)opt，pM(+)Cas12a，pS(+)crPDS2:GFP，pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs各载体的农杆菌按适合的比例混合，浸润接种本氏烟叶片进行重组病毒拯救，待接种植株出现***侵染症状3天后，取上部幼叶作为毒源摩擦接种4-6片真叶期的番茄植株，同时以健康本氏烟汁液摩擦番茄作为阴性对照。TSWV-Cas12a-crRNA病毒汁液摩擦的番茄植株在接种后12天左右开始出现褪绿、环斑、皱缩等症状，且在荧光显微镜下***叶可观察到GFP的表达(图12B)。接种后15天，提取上述植株***叶总蛋白进行Western blot分析，均可以检测到TSWV N、Cas12a和GFP蛋白的表达(图12C)。随机选取的6棵侵染的番茄植株叶片，利用番茄靶标位点特异性引物扩增基因组DNA(表2)，PCR/RE分析表明重组病毒侵染的组织中PDS靶标位点的突变频率为53-89％不等(图12D)。
俗名为辣椒的植物包括辣椒属(Capsicum)内的数个物种，包括甜椒(C.annuum)、红辣椒(C.frutescens)、中华辣椒(C.Chinense)。进一步，选择上述辣椒植物中均保守的PDS基因靶点 (粗体字母为PAM；下划线碱基为HinfI酶切位点)(图13A)。按实施例6所述方法，将可靶向该位点的pS(+)crPDS3:GFP载体，以及pL(+)opt，pM(+)Cas12a，pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs载体通过农杆菌浸润法导入本氏烟叶片，获得的重组病毒摩擦接种4-6叶期的辣椒幼苗。12天左右这些辣椒植株***叶出现轻微的褪绿黄化，并呈现GFP的表达(图13B)。Western blot分析证实上述症状是由于重组病毒侵染辣椒所造成的(图13C)，PCR/RE分析(引物如表2所示)表明重组病毒侵染的甜椒组织中PDS靶标位点的突变频率为87-94％不等(图13D)。PCR扩增(引物于表2中显示)这些辣椒植株靶位点序列后进行高通量测序，红椒、甜椒和中华辣椒中PDS基因靶位点突变频率分别为51.5％、64.0％和49.3％。
以上实验结果证明，重组TSWV-Cas12a-crRNA载体可以通过摩擦接种侵染多种茄科作物并产生靶向基因编辑。
实施例9：TSWV-Cas-crRNA载体在灯笼果基因组编辑中的应用。
灯笼果(Physalis alkekengi L.)是茄科酸浆属的植物，从谱系关系上与番茄很近。有研究表明在番茄和酸浆中突变ER基因均会导致植株节间缩短(Kwon等人，Rapidcustomization of Solanaceae fruit crops for urban agriculture.Nat Biotechnol,2020,38:182-188)。选择灯笼果ER基因靶点 (粗体字母为PAM，SEQ ID NO:88)按照实施例4中描述的方法构建pS(+)crER:GFP。按实施例6中所描述的方法，将可靶向该位点的pS(+)crER:GFP载体，以及pL(+)opt，pM(+)Cas12a，pGD-p19，pGD-HcPro，pGD-γb，pGD-NSs载体通过农杆菌浸润法导入本氏烟叶片，获得的重组病毒摩擦接种2片真叶期的灯笼果幼苗。10天后植株***叶出现褪绿黄化以及轻微卷曲，并有GFP的表达(图14A)。Western blot分析证实重组病毒侵染的灯笼果组织内可检测到病毒N蛋白、GFP蛋白和Cas12a蛋白(图14B)，对靶标及附近序列的扩增子进行高通量检测表明重组病毒侵染的组织中PDS靶标位点的突变频率为52.9％左右(图14C)。
以上实验结果证明，重组TSWV-Cas12a-crRNA载体可以通过摩擦接种侵染灯笼果并产生靶向基因编辑。
实施例10：TSWV-Cas12a-crRNA载体在花生和大豆基因编辑中的应用
花生(Arachis hypogaea)为异源四倍体，基因组来源于两个祖先野生种Arachisduranensis和Arachis ipaensis。所设计的靶标序列 (粗体字母为PAM；与下划线的靶标碱基序列与靶标旁侧(G)碱基构成NdeI酶切位点)，在花生内源两个PDS基因拷贝中保守(图15A)。按照上述实施例的方法，首先通过农杆菌浸润接种本氏烟植株获得携带针对该靶点的Cas12a核酸酶序列的重组病毒，以含有病毒的本氏烟汁液摩擦接种四叶期的花生幼苗。由于花生叶片具有较厚的蜡质层，在接种缓冲液中额外加入0.01M的β-巯基乙醇以提高接种液的渗透性。摩擦接种后第10天起，部分花生植株***叶片组织可观察到绿色荧光，并出现褪绿、黄化和植株矮化等症状(图15B)，同时***组织内可检测到TSWV N、Cas12a和GFP蛋白的表达(图15C)。采用PCR/RE法检测PDS靶标位点编辑，在随机选取的3棵被侵染的花生植株***叶片组织中，靶向编辑频率为48-59％不等(图15D)。
由于crPDS4靶位点在大豆PDS基因中也保守(图16A)，上述重组病毒也被用于机械接种大豆植株。将重组病毒侵染的本氏烟***叶片在接种缓冲液中匀浆，经台式离心机中12,000rpm离心1min后收取上清液，利用带有针头的1-mL注射器穿刺注射接种萌发后4天的大豆子叶。接种后第4天可观察到子叶穿刺创口附近有明显的绿色荧光，接种后第8天荧光向周围组织扩展，而健康植物汁液注射的大豆子叶仅有红色的背景荧光(图16B)。上述接种子叶组织总蛋白样品中可检测到TSWV N、Cas12a和GFP蛋白的表达(16C)，同时利用表2引物扩增总DNA样品包含靶标位点的序列，PCR/RE保护试验表明，在三株植株子叶样品中靶标基因突变频率为27-46％(图16D)。
以上实验结果表明，重组TSWV编辑载体可通过机械接种侵染分类上属于多种科属的植物寄主，并高效产生靶向DNA编辑。
实施例11：TSWV基因编辑载体对甜椒基因组的编辑不受品种限制
选取在10个甜椒(C.annuum)品种PDS基因中均保守的靶标 (粗体为PAM序列，SEQ ID NO:99)，按照实施例4所述的方法构建pS(+)crPDS6:GFP载体，实施例8所描述的方法接种10个甜椒品种的植株。接种后约7天即可在上部非接种叶观察到斑驳皱缩的症状。提取***侵染叶片组织总蛋白，Western blot分析检测到了病毒N蛋白以及表达的Cas12a和GFP(图17A)。不同品种均能被病毒载体有效***侵染，但侵染效率存在一定差异(图17B)。取幼嫩的***侵染叶组织提取总DNA，扩增靶标位点区域的DNA序列并进行深度测序，测序结果表明不同品种间编辑效率在50.7-64.4％范围内，不存在显著性差异(图17B)。以上结果显示，重组TSWV基因编辑载体可有效侵染不同甜椒品种并产生靶向基因组编辑，无品种基因型依赖性。
实施例12：TSWV基因编辑载体对花生基因组的编辑不受品种限制
选取在10个花生品种的内源PDS基因拷贝中均保守的靶标 (粗体为PAM序列，SEQ ID NO:98)，按照实施例4所述的方法构建pS(+)crPDS5:GFP载体，实施例10所描述的方法接种10个花生品种的植株。接种后约7天即可在非接种叶观察到斑驳黄化的症状(图18A)，并在***侵染的叶片组织中可以检测到病毒N蛋白以及Cas12a和GFP的表达(图18B)。不同花生品种均能被病毒载体有效***侵染，尽管侵染效率存在一定的差异(图18C)。提取幼嫩的叶片总DNA，扩增靶标位点区域的DNA序列并进行高通量测序，不同品种间编辑效率在59.4-73.1％之间，无显著性差异(图18C)。这些结果表明重组TSWV基因编辑载体可有效侵染不同花生品种并产生靶向基因组编辑，无品种基因型依赖性。
实施例13：TSWV-Cas12a-crRNA多重编辑载体同时编辑本氏烟多个内源基因。
上述实施例6-12表明TSWV-Cas12a-crRNA可以递送Cas12a和单个crRNA，本实施例提供了利用该载体递送Cas12a和多个crRNA进行多重基因编辑的方法。选取实施例6中的本氏烟crPDS1靶点，以及新的靶点和/> (表3)，根据实施例4中描述的方法，分别构建TSWV S基因组含有单靶点的质粒pS(+)crPDS1:GFP、pS(+)crFucT:GFP和pS(+)crDCL2:GFP。同时，化学合成可同时靶向crPDS1和crFucT靶点的2个crRNA串联的序列(SEQ ID NO:135)，其结构为“DR–Spacer 1–DR–Spacer 2–DR”以及可同时靶向crPDS1、crFucT和crDCL2靶点的3个crRNA串联的序列(SEQ ID NO:136)，其结构为“DR–Spacer 1–DR–Spacer 2–DR–Spacer3–DR”(图19A)。将合成的序列克隆至pS(+)GFP质粒的SpeI酶切位点，产生pS(+)crPDS1&FucT:GFP和pS(+)crPDS1&FucT&DCL2:GFP质粒。当病毒复制时，S基因组转录产生的crRNA转录本前体内包含crRNA序列，M基因组表达的Cas12a蛋白切割加工前体RNA释放一个或多个成熟的crRNA分子(图19A)。
将上述质粒分别与pL(+)opt，pM(+)Cas12a,VSRs转化农杆菌菌株EHA105，按实施例6浸润接种本氏烟。接种后第7天植株陆续被***侵染，呈现叶片卷曲皱缩、褪绿斑驳症状(图19B)。随机提取侵染植株***叶片总DNA，扩增靶标序列基因组DNA序列，利用高通量测序方法测定病毒侵染组织中靶基因编辑效率。结果显示，多重编辑载体对于各个靶标的编辑效率与对应的单靶标编辑载体一致(图19C)。上述结果表明，采用该串联表达方式可以有效表达多个crRNA，形成多个CRISPR/Cas12a复合体，对植物基因组多靶标进行编辑。
实施例14：TSWV-Cas9-gRNA基因编辑载体的设计和构建
CRISPR/Cas9核酸酶***包含Cas9蛋白和与靶标结合的向导RNA(gRNA)。如图20所示，TSWV-Cas9-gRNA载体构建策略为：i)将编码SpCas9的序列替换TSWV M基因组中的GP序列，分别构建了基因组cDNA载体pM(-)Cas9和反基因组cDNA载体pM(+)Ca9；ii)将把含RFP编码框和gRNA的序列***pS(+)载体置换NSs编码框，构建pS(+)RFP:crRNA载体。在这个设计中，S基因组转录产生的RFP mRNA序列3’非编码区中包含gRNA序列。以往的研究表明，gRNA序列可被同源的Cas9蛋白结合，并被内源RNA加工酶剪切末端碱基，释放成熟的gRNA分子(Mikami等，Plant Cell Physiol,2017,58:1857-1867；Ma等，Nat Plants,2020,6:773-779)。以下详述具体构建的方法。
1)pM(-)Cas9和pM(+)Cas9载体构建
以包含本氏烟密码子优化的Cas9序列的质粒(Yin等，Scientific Reports,2015,5:14926)为模板，该Cas9序列两侧还包含核定位信号和3×Flag抗原表位序列(SEQ ID NO:11)，利用引物Cas9/F和Cas9/R扩增获得3×Flag-NLS-Cas9-NLS片段；以pM(-)载体作为模板，利用引物M 3’UTR/F和Cas9/M IGR/R扩增获得去除GP序列片段。以上两个片段末端具有15bp的同源序列，利用In-Fusion试剂连接产生pMR(-)Cas9载体。
以pMR(-)Cas9为模板，利用引物35S/M 3’UTR/F和HDV/M 5’UTR/R扩增获得重组M基因组cDNA片段，并与StuI和SmaI限制性内切酶消化处理的pCB301-2μ-HDV载体片段通过In-Fusion克隆方法连接，使其以基因组链cDNA方向***载体，产生pMR(+)Cas9载体。
2)pS(+)RFP:gRNA系列载体构建
首先构建了S反基因组cDNA载体pS(+)RFP:gGFP，该载体可表达靶向本氏烟mGFP5转基因靶点 (粗体序列为PAM)的gRNA分子。以pS(+)GFP质粒为模板，利用S 5’UTR/F和S IGR/R扩增获得去除GFP基因的片段；以pGD-RFP载体为模板，用引物S 5’UTR/RFP/F和RFP/R扩增RFP片段；化学合成针对gGFP靶点的gRNA序列(SEQ ID NO:22)，该gRNA序列两侧还包含SpeI和BamHI酶切位点以及用于In-Fusion克隆的15nt同源序列。将上述三个DNA片段通过In-Fusion克隆试剂连接产生pS(+)RFP:gGFP。该载体的gRNA序列两侧含有SpeI和BamHI酶切位点，便于gRNA序列的更换。
根据CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线软件选择在多种茄科植物PDS基因中保守的靶点gPDS1(5’-GGACTCTTGCCAGCAATGCTTGG-3’)(SEQ IDNO:17)，合成针对该靶点的gRNA(SEQ ID NO:23)，利用SpeI和BamHI双酶切位点***pS(+)RFP:gGFP载体，即获得pS(+)RFP:gPDS1。
实施例15：TSWV-Cas9-gRNA载体编辑本氏烟mGFP5转基因
实施例4的结果表明，由于较大的Cas编码序列的***影响了M基因组的包装，高效的重组病毒拯救需要相对高浓度的M反基因组cDNA质粒。因此，将携带pL(+)opt载体、pM(-)Cas9或pM(+)Cas9载体、pS(+)RFP:gGFP载体的农杆菌EHA105菌株比例设置为2:10:1，另1份体积的携带VSR表达载体(pGD-p19+pGD-HcPro+pGD-γb+pGD-NSs)的农杆菌，按照如下所示配制农杆菌接种混合物。
OD600 pL(+)opt pM(-)Cas9 pM(+)Cas9 pS(+)RFP:gGFP VSRs
组1 0.1 0.5 - 0.05 0.05
组2 0.1 - 0.5 0.05 0.05
接种后10天左右，组1和组2浸润植株均开始出现病毒***侵染植株，表现叶片斑驳退绿、卷曲等TSWV症状。对浸润植株进行连续20天的统计，发现组1发病效率略高于组2(图21)。
在荧光显微镜下，重组病毒侵染的本氏烟16c植株***叶片可见红色荧光的表达，而健康对照植株中则无红色荧光。相应地，表达RFP的叶片组织中转基因GFP的表达明显被消除(图22A)。Western blot分析表明，组1和组2中病毒侵染的组织中含有高水平的N、Cas9和RFP的表达，而GFP蛋白的积累则显著低于对照植株(图22B)，暗示重组病毒表达的Cas9/gRNA复合体干扰了靶标基因表达。
为了验证mGFP5的靶标位点的基因编辑，利用表2中特异性引物PCR扩增gGFP靶点(5’-GATACCCAGATCATATGAAGCGG-3’(SEQ ID NO:16)，下划线为NdeI酶切位点)两侧的基因组DNA片段，采用PCR/RE检测靶标位点基因编辑效率。PCR/RE分析表明，TSWV-Cas9-RFP:gGFP侵染的植株PDS靶点突变频率约为56-60％，而健康对照植株组织不存在靶标位点的编辑(图22C)。上述PCR扩增产物Sanger测序分析表明，所产生的编辑类型多为1-12个碱基的缺失(图22D)。
以上结果表明，表达M基因组和反基因组RNA均能支持重组病毒拯救并表达Cas9蛋白，S基因组内***的RFP:gRNA融合序列不仅可以表达荧光报告基因示踪病毒侵染，且融合表达的RNA产生量有功能的该RNA的加工成熟，并与Cas9蛋白共同作用于靶标序列产生基因编辑。
实施例16：TSWV-Cas9-gRNA载体编辑本氏烟和普通烟内源PDS基因
如图23A所示，gPDS1靶点序列(粗体字母为PAM；下划线为BsrDI酶切位点)在本氏烟PDSa和PDSb拷贝中保守。按照实施例15中的方法，利用农杆菌浸润方法在本氏烟叶片内导入pL(+)opt，pM(-)Cas9，pS(+)RFP:gPDS1，VSRs(pGD-p19+pGD-Hc-Pro+pGD-γb+pGD-NSs)载体进行重组病毒拯救。浸润后10天左右，本氏烟上部幼叶表现叶片卷曲、褪绿黄化等症状(图23B)，并可检测到病毒N蛋白和Cas9蛋白的表达(图23C)。采用表2中的引物扩增靶位点序列，该对引物可同时扩增PDSa和PDSb序列。PCR的BsrDI酶切保护试验表明，四株植株组织中PDS靶点编辑频率高达74-98％(图23D)。
上述gPDS1靶点在普通烟PDSa和PDSb两个拷贝中保守(图24A)。将本氏烟中产生的重组病毒通过汁液摩擦接种普通烟，大约8天形成***侵染，***叶出现褪绿斑，叶脉黄化，叶片皱缩等症状(图24B)。Western blot分析表明，上述侵染植株均表达了N和Cas9蛋白(图24C)。利用普通烟gPDS靶点引物(表2)进行PCR扩增和BsrDI酶切分析发现，随机选取的3棵植株中靶向编辑频率为84-94％(图24D)，与本氏烟的效率相当。以上实验结果证实，TSWV-Cas9-gRNA载体可通过农杆菌浸润或机械摩擦侵染不同寄主，并高效产生靶标基因编辑。
实施例17：TSWV-Cas9-gRNA多重编辑载体同时编辑本氏烟多个内源基因。
上述实施例14-16表明TSWV-Cas9-gRNA可以递送Cas9和单个gRNA，本实施例提供了利用该载体递送Cas9蛋白和多个gRNA进行多重基因编辑的方法。选取本氏烟gPDS2靶点 gRDR6靶点/> 和gSGS3靶点/> (表3)，根据实施例14中描述的方法，分别构建TSWV S基因组含有单靶点的质粒pS(+)gPDS2:GFP、pS(+)gRDR6:GFP和pS(+)gSGS3:GFP。同时，化学合成可同时靶向gPDS2和gRDR6靶点的2个gRNA串联的序列(SEQ ID NO:137)，以及可同时靶向gPDS2、gRDR6和gSGS3靶点的3个gRNA串联的序列(SEQ ID NO:138)(图25A)。将合成的序列克隆至pS(+)GFP质粒的SpeI酶切位点，产生pS(+)gNbPDS2&RDR6:GFP和pS(+)gNbPDS2&RDR6&SGS3-1:GFP质粒。当病毒复制时，S基因组转录产生的gRNA转录本前体内包含gRNA序列，M基因组表达的Cas9蛋白结合gRNA序列，植物内源核酸酶切割加工去除两端序列，释放一个或多个成熟的gRNA分子(图25A)。
将上述质粒分别与pL(+)opt、pM(+)Cas9,VSRs转化农杆菌菌株EHA105，按实施例14浸润接种本氏烟。接种后第7天植株陆续被***侵染，呈现叶片卷曲皱缩、褪绿斑驳症状(图25B)。随机提取侵染植株***叶片总DNA，扩增靶标序列基因组DNA序列，利用高通量测序方法测定病毒侵染组织中靶基因编辑效率。结果显示，多重编辑载体对于各个靶标的编辑效率与对应的单靶标编辑载体一致(图25C)。这些结果表明，采用该串联表达方式可以有效表达多个gRNA，转配形成多个CRISPR/Cas9复合体，对植物基因组进行多靶标编辑。
实施例18：TSWV-ABE-gRNA碱基编辑载体的设计和构建
腺嘌呤碱基编辑***包含腺嘌呤碱基编辑器(ABE)融合蛋白和结合靶标的向导RNA(gRNA)。如图26所示，用于递送ABE的病毒载体TSWV-ABE-gRNA的构建策略为：i)将编码ABE的序列替换TSWV M基因组中的GP序列，构建了反基因组cDNA载体pM(+)ABE；ii)将把含GFP编码序列和gRNA的融合序列***pS(+)载体置换NSs编码框，构建pS(+)gRNA:GFP载体。在这个设计中，S基因组转录产生的GFP mRNA序列3’非编码区中包含gRNA序列。以往的研究表明，gRNA序列可被同源的Cas9蛋白结合，并被内源RNA加工酶剪切末端碱基，释放成熟的gRNA分子(Mikami等，Plant Cell Physiol,2017,58:1857-1867；Ma等，Nat Plants,2020,6:773-779)。以下详述具体构建的方法(图26)。
1)pM(+)ABE载体构建
化学合成本氏烟密码子优化的TadA8e(V106W)序列与nCas9融合相连形成的ABE核苷酸序列(SEQ ID NO:84)，该融合序列N端还包含NLS和3×Flag抗原表位序列，C端还包含3xSV40 NLS序列。利用引物SpeI/Flag/F(SEQ ID NO:124)和ABE/R(SEQ ID NO:125)扩增获得NLS-3×Flag-TadA8e(V106W)-nCas9-3xNLS片段，以pMR(+)Cas9载体作为模板，利用引物M3’UTR/F(SEQ ID NO:65)和Cas9/M IGR/R(SEQ ID NO:66)扩增获得去除Cas9序列片段。以上两个片段末端具有15bp的同源序列，利用In-Fusion试剂连接产生pMR(+)ABE载体。
2)pS(+)GFP:gRNA系列载体构建
根据CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线软件选择本氏烟PDSa基因的靶点序列α-1,3-岩藻糖转移酶a(FucTa)基因的靶点序列黄连素桥酶样核酸d(BBLd)基因的靶点序列/> 分别将上述gRNA序列片段***pS(+)SpeI:GFP载体SpeI位点，产生pS(+)gPDSa:GFP、pS(+)gFucTa1:GFP、pS(+)gBBLd:GFP载体。
实施例19：TSWV-ABE-gRNA载体编辑本氏烟多个内源基因靶点
实施例18中描述的pS(+)gPDSa:GFP、pS(+)gFucTa1:GFP和pS(+)gBBLd:GFP载体含有可分别靶向gPDSa、gFucTa1和gBBLd这三个位点的sgRNA序列。所选gPDSa只靶向本氏烟PDSa拷贝；本氏烟含有4个FucT基因，所选gFucTa1只靶向FucTa；本氏烟含有5个BBL基因，所选gBBLd在5个基因中均保守，本发明只分析了BBLd基因靶点的碱基编辑效率。参照实施例15所述的方法，将含有上述三个质粒的农杆菌菌株分别与携带pL(+)opt、pM(+)ABE、pGD-p19、pGD-HcPro、pGD-γb和pGD-NSs各载体的农杆菌按适合的比例混合，浸润接种本氏烟叶片进行重组病毒拯救。浸润后10天左右，本氏烟上部幼叶表现叶片卷曲、褪绿黄化等症状(图27A)，并可检测到病毒N蛋白、GFP和碱基编辑融合蛋白的表达(图27B)。分别采用表2中的引物(SEQ ID NO:112和115，SEQ ID NO:122和123)扩增靶位点序列，高通量测序和Sanger测序分析表明，TSWV-ABE-gRNA载体在gPDSa、gFucTa1和gBBLd三个靶点上的碱基编辑频率约为28％-39％不等(图27C)，且在靶序列碱基编辑活性窗口(第4到第9个碱基)内产生了A到G(或T到C)的定向碱基转换(图27D)。以上实验结果证实，TSWV载体可向植物体内递送腺嘌呤碱基编辑器，并在侵染的植株组织内高效产生靶标基因碱基编辑。
实施例20：TSWV-CBE-gRNA碱基编辑载体的设计和构建
胞嘧啶碱基编辑***包含胞嘧啶碱基编辑器(CBE)融合蛋白和结合靶标的向导RNA(gRNA)。如图28所示，用于递送CBE的病毒载体TSWV-CBE-gRNA的构建策略为：i)将编码CBE的序列替换TSWV M基因组中的GP序列，构建了反基因组cDNA载体pM(+)CBE；ii)将含GFP编码序列和gRNA的融合序列***pS(+)载体置换NSs编码框，构建pS(+)gRNA:GFP载体。以下详述具体构建的方法。
1)pM(+)CBE载体构建
化学合成本氏烟密码子优化的hA3A序列与nCas9序列和UGI序列连接形成的CBE核苷酸序列(SEQ ID NO:85)，该hA3A序列N端还包含NLS和3×Flag抗原表位序列，该UGI序列C端还包含NLS。利用引物SpeI/Flag/F(SEQ ID NO:124)和CBE/R(SEQ ID NO:126)扩增获得NLS-3×Flag-hA3A-nCas9-UGI-NLS片段，以pMR(+)Cas9载体作为模板，利用引物M 3’UTR/F和Cas9/M IGR/R扩增获得去除Cas9序列片段。以上两个片段末端具有15bp的同源序列，利用In-Fusion试剂连接产生pMR(+)CBE载体。
2)pS(+)GFP:gRNA系列载体构建
根据CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线软件选择RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6a)基因的靶点1序列和靶点2序列α-1,3-岩藻糖转移酶a基因(FucTa)的靶点序列/>分别将上述sgRNA序列片段***pS(+)SpeI:GFP载体SpeI位点，产生pS(+)gRDR6a1:GFP、pS(+)gRDR6a2:GFP、pS(+)gFucTa2:GFP载体。
实施例21：TSWV-CBE-gRNA载体编辑本氏烟多个内源基因靶点
实施例20中描述的pS(+)gRDR6a1:GFP、pS(+)gRDR6a2:GFP和pS(+)gFucTa2:GFP载体分别含有可靶向一个靶位点的gRNA序列。所选gRDR6a1和gRDR6a2只靶向本氏烟RDR6a基因；本氏烟含有4个FucT基因，所选gFucTa2只靶向FucTa。参照实施例15所述的方法，将含有上述三个质粒的农杆菌菌株分别与携带pL(+)opt、pM(+)CBE、pGD-p19、pGD-HcPro、pGD-γb和pGD-NSs各载体的农杆菌按适合的比例混合，浸润接种本氏烟叶片进行重组病毒拯救。浸润后10天左右，本氏烟上部幼叶表现叶片卷曲、褪绿黄化等症状(图29A)，并可检测到病毒N蛋白、GFP和碱基编辑融合蛋白的表达(图29B)。分别采用表2中的引物(SEQ ID NO:116-121)扩增靶位点序列，高通量测序和Sanger测序分析表明，TSWV-CBE-gRNA载体在gRDR6a1、gRDR6a2和gFucTa2三个靶点上的碱基编辑频率高达55％-82％不等(图29C)，且在靶序列碱基编辑活性窗口内(第2到第13个碱基)产生了C到T(或G到A)的定向碱基转换(图29D)。以上实验结果证实，TSWV-CBE-gRNA载体可向植物体内递送胞嘧啶碱基编辑器，并在侵染的植株组织内高效产生靶标基因组碱基编辑。
实施例22：从TSWV基因编辑载体侵染的本氏烟叶片组织再生突变体植株
为了明确TSWV-Cas12a-crRNA病毒载体侵染的组织是否可以再生获得突变体植株，采集实施例6中重组TSWV-Cas12a-crPDS1:GFP载体侵染的本氏烟***叶进行组织培养的植株再生，具体实验流程如下：
1)将叶片依次用无菌水冲洗干净，70％乙醇表面消毒15s，0.1％升汞(v/v)表面消毒8min，无菌水冲洗3遍以上；
2)切成1cm2大小的叶片外植体置于无抗生素的MS分化培养基(4.4g/L MS[Duchefa Biochemie]、30g/L蔗糖、1mg/L的细胞***素6-BA，4g/L琼脂，pH 5.8)，放置于25℃培养室，12小时光照/12小时黑暗培养2-3周左右；
3)待分化的芽长至合适大小，转移至MS生根培养基(4.4g/L MS，3g/L蔗糖，7g/L葡萄糖，4g/L琼脂，pH 5.8)中继续培养3周左右；
4)待小苗长出健壮的根系后，培养瓶中加入无菌双蒸水(ddH2O)炼苗4-5天，移至土壤中。
病毒侵染的叶片分化培养基培养10天后，一些外植体出现愈伤组织的分化，并随着时间的推移进一步分化出叶片和芽。再生植株呈现白化苗和绿苗两种表型，绿苗可正常生根并被移栽至土壤，而白化苗则无法生根(图30A)。选取两株绿苗(M0-1/-2)和一株白化苗(M0-3)提取基因组DNA进行PCR/RE分析。与表型相符，白化苗植株靶标序列的PCR产物无法被HinfI消化，表明其四个PDS等位基因的HinfI酶切位点均被破坏。从两株绿色苗扩增的PCR产物可被HinfI不完全消化，表明存在部分突变的PDS等位基因(图30B)。对PCR产物进行Sanger测序基因分型分析进一步证实，白化苗(M0-3)四个PDS等位基因均存在碱基缺失造成PDS编码框移码，而绿苗M0-1和M0-2分别存在一个和两个突变PDS等位基因(图30C)。这些结果表明，TSWV-Cas12a-crRNA侵染的本氏烟体细胞可通过组培再生获得突变体植株。
同样地，为了明确TSWV-Cas9-gRNA载体侵染的细胞是否可以再生获得突变体植株，采集实施例15中重组TSWV-Cas9-RFP:gGFP侵染的本氏烟***叶片，按照上述组织培养方法进行植株再生。荧光成像表明，选择的3株再生植株均无mGFP5转基因的表达(图31A)。对扩增的再生植株靶序进行Sanger测序分析，M0-1和M0-2的mGFP5靶点基因型为***一个碱基的纯合体，M0-3为缺失一个碱基的纯合体(图31B)。
实施例23：从TSWV基因编辑载体侵染的番茄叶片组织再生突变体植株
采集实施例8中重组病毒V-Cas12a-crPDS2:GFP摩擦接种后侵染的番茄***叶，无菌水冲洗干净后，依次用70％乙醇表面消毒15s，转入0.1％升汞(v/v)溶液中表面消毒8min，用无菌水冲洗3-5遍。取出消毒过的叶片，用无菌滤纸吸干水分，切去明显的主脉及叶边缘后，将叶片切成0.5cm2大小后置于无抗生素的MS分化培养基上25℃暗培养7天，再转移至光照12小时/黑暗12小时培养，分别测试如下所示的四种组合的植物激素的浓度。
生长素(IAA) 细胞***素(6-BA)
实验组1 0.1mg/L 2mg/L
实验组2 0.2mg/L 2mg/L
实验组3 0.1mg/L 3mg/L
实验组4 0.2mg/L 3mg/L
培养22天左右，实验组1和实验组2培养基上的外植体开始出现芽和叶分化，而实验组3和实验组4叶片边缘出现了膨大的愈伤组织但没有芽和叶的分化(图32A)，部分愈伤组织出现白化表型，表明PDS基因被编辑后失活(图32B，上图)。将分化芽转移至MS生根培养基(含0.1mg/L的IAA)中继续培养，2-3周后均分化出了健壮的根系(图32B下图)。
随机挑选5株再生番茄苗提取基因组DNA，PCR/RE检测PDS靶位点的编辑。M0-1和M0-4植株PCR产物对HinfI酶切具有部分保护，表明含有发生编辑的PDS基因有；M0-2植株PCR产物对HinfI酶切具有完全保护，表明一对PDS等位基因均被编辑；M0-3和M0-5植株PCR产物对HinfI酶切敏感，说明靶标基因未发生编辑(图32C)。
实施例24：抗病毒药物处理提高了获得无病毒的再生突变体植株的效率
利用病毒编辑载体侵染的组织作为外植体进行组织培养，获得的再生植株通常不能有效脱除病毒。本实施例以TSWV-Cas12a-crRNA载体为例，该载体crRNA靶向本氏烟crPDS1靶点，探索了植株再生过程中抗病毒药物处理对脱毒效率和突变体植株获得的影响。如图33所示，以该病毒载体***侵染的本氏烟植株叶片作为外植体，按照实施例22中描述的方法，置于含有40mg/L的利巴韦林，或40mg/L的法匹拉韦，或1.2mg/L的瑞德西韦，或不含抗病毒药剂(Mock)的培养基上培养诱导再生苗。诱导培养35天后将各组外植体及所诱导的愈伤等全部转移至不含抗病毒药剂的诱导培养基，继续诱导培养至55天时将再生苗转移至生根培养基。每组设置三个独立生物学重复，在每组的每个生物学中随机选择30棵植株进行后续分析。提取各组M0再生苗的总RNA，使用TSWV N的特异性引物N/F(CTATGGATTACCTCTTGATGATGC；SEQ ID NO:131)和N/R(TTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTG；SEQ IDNO:132)进行RT-PCR检测各再生苗的带毒情况，以本氏烟Actin引物Nb/actin/F(CAATCCAGACACCTGTACTTTCTCTC；SEQ ID NO:133)和Nb/actin/R(AAGCTGCAGGTATCCATGAGACTA；SEQ ID NO:134)作为内参。结果显示，Ribavirin处理的所有再生植株均未检测到TSWV重组病毒，即脱毒效率为100％；相比之下，Mock处理仅有4.4％的无病毒再生植株。Remdesivir和Favipiravir处理组分别有15.6％和28.9％的无病毒再生植株(图34A和B)。
组培过程中可以观察到每个组均可诱导产生不同数量的白化表型的本氏烟植株(图35A)，表明在这些植株中PDS基因的四个等位基因(本氏烟为异源四倍体)均被编辑失活。为了进一步明确药物处理对获得的再生植株靶标基因编辑的影响，PCR扩增了包含靶标位点的序列(扩增引物为SEQ ID NO:70和71)，对扩增子进行高通量测序，分析每棵植株的突变类型并统计各组的编辑效率。采用以下定义来指定本氏烟的两个亚基因组基因型：编辑效率(indels％)在0-10.0％的为野生型(Wild-type,WT)；10％<indels％≤35.0％为嵌合(Chimeric,Chi)；35.0％<indels％≤80.0％为杂合突变(Heterozygous,He),即一个等位基因靶位点处发生了编辑但另一等位基因为野生型；编辑效率在80.0％和100.0％之间的，若两个等位基因均发生了同样类型的编辑则为纯合突变(Homozygous,Ho)，若两个等位基因产生了两种不同的编辑类型则为双等位突变(Biallelic,Bi)。对各组M0植株PDSa和PDSb的突变基因型统计分析显示，具有靶标处突变的植株比例最高的是Ribavirin处理组，Remdesivir处理组相较于Mock组仅有微弱优势，Favipiravir组具有最低的突变效率。并且进一步分析发现，相较于Mock组，Ribavirin组中Ho/Bi类型占比在两个拷贝中均有提高，Chi类型占比均有减少。Remdesivir组与Mock组相比总编辑效率相当，但是Ho/Bi类型占比在PDSb基因的靶点略有提高，Chi类型占比在两个拷贝中均有减少。虽然Favipiravir组总的编辑效率低于Mock组，但是所有突变基因型中Ho/Bi类型占比均明显高于Mock组(图35B)。
进一步对M0代植株中各类突变基因型在传递至M1代时的遗传特征进行了分析，选取涵盖了上述四种基因型的19棵M0植株，并获得了其自花授粉产生的种子。每个M0株系随机选择14-16株M1幼苗，采用高通量测序分析了其PDSa和PDSb基因各自靶标位点的突变基因型。结果统计如表4所示，对于基因型为WT和Chi(0<indels％≤35.0％)的M0植株，其M1后代植株均为野生型；M0植株基因型为杂合(He)时，其后代含有突变与野生型的比例为3:1，符合孟德尔遗传定律；M0植株基因型为Bi/Ho时，其M1后代植株均为含有相同突变类型的植株。这些结果表明，M0植株中He和Ho/Bi的突变类型可稳定遗传至后代，而Chi突变则不可遗传。
此外，选取10个PDSa和PDSa均为He基因型或Ho/Bi基因型的M0植株收取种子，播种出苗后统计后代的表型。部分株系M1的绿苗：白苗约等于3:1，例如RB-#54；还有部分株系的后代绿苗：白苗约为15:1，如RD-#76(图36A)。各组表型经卡方拟合优度检验发现均符合孟德尔遗传定率(图36B)。综上所述，在组培过程中添加抗病毒药物可以显著提高获得无病毒且具有突变的再生植株的效率。
实施例25：从TSWV基因编辑载体侵染的普通烟叶片组织再生突变体植株
本实施进一步研究了TSWV载体侵染的普通烟组织用于组培再生时，抗病毒药物处理对脱毒效率和突变体植株获得的影响。还是以实施例24中重组TSWV-Cas12a-crRNA载体为例，该载体可同时靶向普通烟PDS基因的crPDS1靶点。以该病毒载体侵染的***叶为外植体进行组织培养和植株再生，具体实验流程如实施例24所述。病毒侵染的叶片分化培养基培养10天后，一些外植体出现愈伤组织的分化，并随着时间的推移进一步分化出叶片和芽。再生植株呈现白化苗和绿苗两种表型，绿苗可正常生根并被移栽至土壤，而白化苗则无法生根(图37A)。高通量测序分析各个药物处理组中再生植株含有靶向编辑的比例，结果如图37B所示，Ribavirin处理组中再生植株含有靶向编辑的比例明显高于对照处理和其他药物处理。进一步分析了各个药物处理组再生植株的突变基因型分布，发现ribavirin提高了各种突变类型的比例(图37C)。对再生植株进行病毒检测发现，与本氏烟结果类似，Ribavirin处理使100％的再生植株均脱除了病毒。这些结果表明，TSWV-Cas12a-crRNA侵染的普通烟体细胞可通过组培再生获得突变体植株，并且经利巴韦林处理可以大大促进病毒的去除，且提高获得具有突变的再生植株的效率。
实施例26：含有NSs基因的TSWV载体对重组病毒拯救和侵染细胞再生的不利影响
TSWV NSs基因编码一个RNA沉默抑制子(Takeda等，FEBS Lett,2002,532:75-79)，在以上实施例中，重组TSWV载体的NSs基因被报告基因替换。为了探索NSs基因对于重组病毒拯救效率、毒力和基因编辑能力的影响，本实施例测试了包含NSs基因重组病毒载体TSWV-Cas9-NSs:gPDS1。该载体与TSWV-Cas9-RFP:gPDS1类似，但在crPDS1 gRNA序列上游保留了病毒NSs基因而非RFP报告基因(图38A)。
为此，构建了S反基因组载体pS(+)NSs:gPDS1。具体构建方法为，利用引物gPDS1/NSs/F和S IGR/R，将pS(+)质粒进行PCR扩增获得线性化质粒片段；利用引物gPDS1/F和IGR/scaffold/R扩增包含gPDS1gRNA序列(SEQ ID NO:23)的片段；将上述两个片段通过In-Fusion试剂连接获得pS(+)NSs:gPDS1载体。
按照实施例11所描述农杆菌浸润方法将以下农杆菌混合物浸润本氏烟：
TSWV-Cas9-RFP:gPDS1拯救混合物：pL(+)opt，pM(-)Cas9，pS(+)RFP:gPDS1，pGD-p19+pGD-HcPro+pGD-γb+pGD-NSs
TSWV-Cas9-NSs:gPDS1拯救混合物：pL(+)opt，pM(-)Cas9，pS(+)NSs:gPDS1，pGD-p19+pGD-HcPro+pGD-γb
由于TSWV-Cas9-NSs:gPDS1病毒S链可以表达NSs，所以浸润时VSR组合中不含有额外的pGD-NSs瞬时表达载体。浸润后第8天，重组TSWV-Cas9-RFP:gPDS1开始出现***侵染，而TSWV-Cas9-NSs:gPDS1在第10天开始出现***侵染，两者产生的症状没有明显差异(图38B)。到浸润后20天时，所有浸润植株均被TSWV-Cas9-RFP:gPDS1侵染，而仅有50％的植株获得了重组TSWV-Cas9-NSs:gPDS1的拯救(图38D)。以发病植株叶片作为毒源摩擦健康本氏烟，两种重组病毒***侵染发生时间和侵染效率无显著区别(图38E)。PCR/RE分析表明，两种重组病毒在侵染植株叶片中的靶向基因编辑效率相当(图38C)。
采集TSWV-Cas9-NSs:gPDS1和TSWV-Cas9-RFP:gPDS1载体侵染的组织，采用实施例13的方法进行组织培养。培养7天后，TSWV-Cas9-NSs:gPDS1侵染的叶片外植体出现严重的坏死，至第10天基本已经完全坏死。相反，TSWV-Cas9-RFP:gPDS1侵染的叶片无严重的坏死，在第10天时已开始出现愈伤组织的初步分化(图38F)。
以上结果说明，保留NSs毒力因子基因的TSWV基因编辑载体拯救效率有所降低，且在组织培养过程中导致侵染的细胞出现严重坏死而阻碍植株再生。
实施例27：缺失GP基因的重组病毒载体不能经蓟马传播
TSWV糖蛋白(GP)在包膜粒子的形态建成以及介体昆虫传播起不可或缺的作用(Sin等，Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:5168-5173)。在本发明的实施例中GP基因被异源序列替换，为了验证重组病毒载体确实无法被昆虫介体传播，将实施例15获得的重组TSWV-Cas9-NSs:gPDS1和野生型TSWV(TSWV-WT)病毒摩擦接种甜椒。将蓟马若虫置于已被***侵染的甜椒植株上获毒，取食24小时后，将5头蓟马一组置于一株健康的甜椒植株饲喂20天。提取蓟马和甜椒植株总RNA，利用NSm/F和NSm/R引物(表1)检测蓟马带毒率(带毒蓟马头数/总蓟马头数)以及蓟马传毒率(侵染的甜椒株数/饲喂接种的辣椒总株数)。如下所示，在野生型病毒侵染的甜椒植株上蓟马获毒率为53％，传毒率为65％，而重组TSWV-Cas9-NSs:gPDS1无法被蓟马获毒和传播。
病毒 蓟马带毒率 蓟马传毒率
TSWV-WT 53％(21/40) 65％(13/20)
TSWV-Cas9-NSs:gPDS1 0％(0/40) 0％(0/20)
表1 DNA克隆相关引物序列及信息
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表2靶标基因DNA片段扩增引物
表3靶标详情
表4 TSWV诱导的突变从M0代到M1代的遗传率总结表
表4(续)
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Claims (43)

1.一种对植物细胞遗传物质进行修饰的方法，其特征在于，所述方法无需在待修饰的细胞基因组引入外源遗传物质，其步骤包括：
a)提供至少一个遗传物质待修饰的植物细胞；
b)提供一种番茄斑萎病毒属病毒载体；所述病毒载体包含至少一个编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的多核苷酸序列，其中病毒糖蛋白(GP)基因的部分或全部被所述编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的多核苷酸序列替换；
c)将所述的病毒载体侵染所述的植物细胞，瞬时表达所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶；
d)所述CRISPR/Cas核酸修饰酶靶向并切割或修饰所述植物细胞基因组特定位点，通过所述植物细胞内源DNA修复机器完成对所述植物细胞遗传物质的修饰。
2.一种产生遗传物质被修饰的植物的方法，其特征在于，所述方法无需在被修饰的细胞基因组引入外源遗传物质，其步骤包括：
a)提供至少一个遗传物质待修饰的植物细胞；
b)提供一种番茄斑萎病毒属病毒载体；所述病毒载体包含至少一个编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的多核苷酸序列，其中病毒糖蛋白(GP)基因的部分或全部被所述编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的多核苷酸序列替换；
c)将所述的病毒载体侵染所述的植物细胞，瞬时表达所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶；
d)所述CRISPR/Cas核酸修饰酶靶向并切割或修饰所述植物细胞基因组特定位点，通过所述植物细胞内源DNA修复机器完成对所述植物细胞遗传物质的修饰；
e)从所述植物细胞获得遗传物质被修饰的植物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括选择所述遗传物质被修饰的植物细胞或植物的步骤，所述选择过程无需利用选择性标记；所述的修饰包括在植物细胞靶标基因位点缺失、***或置换一个或多个核苷酸，或上述修饰方式的组合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶为来源于化脓链球菌的CRISPR/SpCas9核酸酶、或来源于毛螺旋菌的CRISPR/LbCas12a(LbCpf1)核酸酶、或CRISPR/Cas核酸酶变体与碱基脱氨酶融合的腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器。
5.根据权利要求1或2所述的方法，所述番茄斑萎病毒属病毒载体来自番茄斑萎病毒，所述番茄斑萎病毒的三条基因组片段S、M和L多核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3具有至少70％同源性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述番茄斑萎病毒载体S基因组片段包含至少一个编码CRISPR向导RNA的异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述番茄斑萎病毒载体S基因组中编码非结构蛋白NSs的多核苷酸序列部分或全部被编码CRISPR向导RNA或其与荧光报告蛋白的嵌合异源多核苷酸序列置换。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码一个向导RNA。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码两个或多个向导RNA。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述番茄斑萎病毒载体M基因组片段包含至少一个异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件；其中，所述的异源多核苷酸序列编码化脓链球菌的SpCas9多肽、或毛螺旋菌的LbCas12a多肽、或Cas核酸酶变体与碱基脱氨酶融合的腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器多肽。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述番茄斑萎病毒载体L基因组片段的多核苷酸序列为嵌合体序列，其编码病毒聚合酶(RdRp)的多核苷酸序列被密码子优化的RdRp序列替换。
12.根据权利要求1或2所述的方法，所述病毒载体侵染植物细胞的方法为利用农杆菌侵染法将包含病毒载体多核苷酸序列的核酸构建体引入植物组织，产生的重组病毒侵染非浸润组织的植物细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，所述的引入植物组织的核酸构建体还包括编码一个或多个RNA沉默抑制子(VSR)的辅助表达载体。
14.根据权利要求12所述的方法，所述包含病毒载体序列的核酸构建体引入植物组织后，转录产生番茄斑萎病毒嵌合的S、M和L基因组的正义链或负义链RNA。
15.根据权利要求12所述的方法，其中含有番茄斑萎病毒S、M和L嵌合体基因组片段的核酸构建体的浓度比为1-2:2-10:1-2。
16.根据权利要求15所述的方法，所述的核酸构建体为农杆菌双元质粒；所述的浓度比为农杆菌菌液混合物中携带不同双元质粒的农杆菌株系的浓度比。
17.根据权利要求1或2所述的方法，所述病毒载体侵染植物细胞的方法为利用重组病毒粒子侵染，包括机械摩擦、高压喷雾、嫁接接种中的一种或多种。
18.根据权利要求1或2所述的方法，所述遗传物质待修饰的植物为番茄斑萎病毒属病毒可以***或局部侵染的天然或实验寄主植物。
19.根据权利要求18所述的方法，所述的寄主植物选自本氏烟(Nicotianabenthamiana)、普通烟(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、甜椒(C.annuum)、红辣椒(C.frutescens)、中华辣椒(C.Chinense)、花生(Arachis hypogaea)、马铃薯(Solanum tuberosum)、灯笼果(Physalis alkekengi)、茄子(Solanum melongena)、大豆(Glycine max)、莴苣(Lactuca sativa)、棉花(Gossypium hirsutum)、菠菜(Spinaciaoleracea)、西瓜(Citrullus lanatus)、黄瓜(Cucumis sativus)、蚕豆(Vicia faba)、黑绿豆(Vigna mungo)、绿豆(Vigna radiata)或豇豆(Vigna unguiculata)中的一种或多种。
20.根据权利要求18所述的方法，所述遗传物质待修饰的植物还包括番茄斑萎病毒属病毒寄主植物的不同品种或基因型。
21.根据权利要求1或2所述的方法，进一步还包括遗传被修饰的细胞内脱除番茄斑萎病毒属病毒的方法，其步骤包括：
a)提供至少一个被番茄斑萎病毒属病毒感染的植物细胞；
b)将所述植物细胞在含有抗病毒化合物的培养基上进行组织培养和植株再生；
c)获得并鉴定脱除病毒的再生植株。
22.根据权利要求21所述的方法，所述的抗病毒化合物为利巴韦林。
23.根据权利要求21所述的方法，所述的抗病毒化合物为法匹拉韦。
24.根据权利要求21所述的方法，所述的抗病毒化合物为瑞德西韦。
25.一种重组病毒载体***，其特征在于，包含：
a)番茄斑萎病毒属病毒载体的多核苷酸序列，以及
b)编码至少一个CRISPR/Cas核酸修饰酶的多核苷酸序列被可操作地连接至病毒转录顺式元件，其中所述编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的多核苷酸序列替换所述病毒载体糖蛋白(GP)基因的部分或全部；
所述的病毒载体***侵染植物细胞并表达所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶，所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶靶向并切割或修饰所述的植物细胞基因组的遗传物质，所述的切割或修饰过程无需在待修饰的细胞基因组引入外源遗传物质。
26.根据权利要求25所述的重组病毒载体***，所述的CRISPR/Cas核酸修饰酶为来源于化脓链球菌的CRISPR/SpCas9核酸酶、或来源于毛螺旋菌的CRISPR/LbCas12a(LbCpf1)核酸酶、或Cas核酸酶变体与碱基脱氨酶融合的腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器。
27.根据权利要求25所述的重组病毒载体***，所述番茄斑萎病毒属病毒载体来自番茄斑萎病毒，所述番茄斑萎病毒的三条基因组片段S、M和L多核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3具有至少70％同源性。
28.根据权利要求25所述的重组病毒载体***，其中所述番茄斑萎病毒载体S基因组片段包含至少一个编码CRISPR向导RNA的异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件。
29.根据权利要求28所述的重组病毒载体***，其中所述番茄斑萎病毒载体S基因组中编码非结构蛋白NSs的多核苷酸序列的部分或全部被编码CRISPR向导RNA或其与荧光报告蛋白的嵌合异源多核苷酸序列置换。
30.根据权利要求28所述的重组病毒载体***，其中所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码一个向导RNA。
31.根据权利要求28所述的重组病毒载体***，其中所述***S基因组中的异源多核苷酸序列编码两个或多个向导RNA。
32.根据权利要求25所述的重组病毒载体***，其中所述番茄斑萎病毒载体M基因组片段包含至少一个异源多核苷酸序列被可操作地连接至病毒mRNA转录相关的顺式元件；其中，所述的异源多核苷酸序列编码化脓链球菌的SpCas9多肽、或毛螺旋菌的LbCas12a多肽、或Cas核酸酶变体与碱基脱氨酶融合的腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器多肽。
33.根据权利要求25所述的重组病毒载体***，其中所述番茄斑萎病毒载体L基因组片段的多核苷酸序列为嵌合体序列，其编码病毒聚合酶(RdRp)的多核苷酸序列被密码子优化的RdRp序列替换。
34.根据权利要求25所述的重组病毒载体***，所述病毒载体为包含病毒载体多核苷酸序列的核酸构建体；其中，所述核酸构建体引入植物组织后形成侵染性重组病毒载体。
35.根据权利要求34所述的重组病毒载体***，共同引入植物组织的核酸构建体还包括编码一个或多个RNA沉默抑制子(VSR)的辅助表达载体。
36.根据权利要求34所述的重组病毒载体***，所述包含病毒载体序列的核酸构建体引入植物组织后，转录产生番茄斑萎病毒嵌合的S、M和L基因组正义链或负义链RNA。
37.根据权利要求34所述的重组病毒载体***，其中含有番茄斑萎病毒S、M和L嵌合体基因组片段的核酸构建体的浓度比为1-2:2-10:1-2。
38.根据权利要求34-37任一项所述的重组病毒载体***，其中所述的核酸构建体为农杆菌双元质粒；所述的浓度比为农杆菌菌液混合物中携带不同双元质粒的农杆菌株系的浓度比。
39.根据权利要求25或27所述的重组病毒载体***，所述病毒载体侵染植物细胞的方法为利用重组病毒粒子接种植物，包括机械摩擦、高压喷雾或嫁接接种中的一种或多种。
40.包含权利要求25-39任一项所述重组病毒载体***的细菌菌株或重组病毒粒子。
41.包含权利要求25-39任一项所述重组病毒载体***的试剂盒，其中含有所述病毒载体的试剂可以单独提供，也可以组合提供，其特征在于，该试剂盒包括：
a)包含番茄斑萎病毒S、M和L基因组片段的核酸构建体组合物，所述的基因组片段包含至少一个编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的异源多核苷酸序列，其中所述编码CRISPR/Cas核酸修饰酶的异源多核苷酸序列替换所述M基因组片段中糖蛋白(GP)基因的部分或全部；
b)编码一个或多个RNA沉默抑制子(VSR)的辅助表达载体。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其进一步包含使用手册或说明书。
43.权利要求25-39任一项所述的重组病毒载体***、权利要求40所述的细菌菌株或重组病毒粒子、权利要求41或42所述的试剂盒或权利要求1-24任一项所述的方法在植物基因组编辑中的应用。
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