CN115216430A - 一种链霉菌生防菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术的微生物领域，具体涉及一种用于水稻稻瘟病的生物防治的链霉菌（Streptomycessp.QJK‑30）。该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019376。本发明通过实验表明：链霉菌（Streptomycessp.QJK‑30 CCTCC NO：M2019376）发酵液对水稻稻瘟病具有良好的生防作用，相对防治效果为70.9%。

Description

一种链霉菌生防菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术的微生物领域，具体涉及一种高效防治水稻稻瘟病的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）生防菌株及其应用。
背景技术
稻瘟病是一种毁灭性的水稻真菌病害，每年造成水稻产量损失10％-30％，严重时产量损失可达到50％，甚至绝收，全世界每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人。稻瘟病在水稻3-4叶期、分蘖盛期和始穗期容易发生。病原为稻瘟菌（Magnaporthe oryzae），生理小种繁多，高度可变，且受地理和气候影响影响较大，因而治理难度较大。
目前，水稻稻瘟病的防治方法主要包括：抗病品种选育与利用、农业栽培管理以及化学农药施用。抗病品种选育难度大，周期长。传统的农业在栽培措施防治稻瘟病，需要大量的人力物力，而且为了追求水稻的高产，采用了高产、多蘖良种以及推广抛秧、高密度、施用高氮肥的栽培技术，为病原菌创造了适宜的生长环境，致使农业栽培措施防治困难重重。化学农药高残留，对人畜有害，污染环境，具有环境风险，且长期使用导致抗药性。利用拮抗微生物防治植物病害，因选择性好、易降解和对环境友好等特点，在植物病害绿色防控方面越来越受到重视。研究表明，根际有益微生物对植物具有较好的亲和性，施用后易在植物体表或体内存活、定殖，防治效果持久稳定。虽然目前已发现了一些对稻瘟病菌的拮抗菌株或潜在的生防菌株，如假单胞菌（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）和某些链霉菌（Streptomyces sp.），但不同的拮抗微生物作用机理及使用方法不同。不同的生产应用需求不同的生防菌株，因此筛选更多更有效的生防菌非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）生防菌株，可以用作生物农药，防治水稻稻瘟病。
本发明的链霉菌（Streptomycessp. QJK-30）是从水稻根际土壤中采用土壤连续梯度稀释法，并结合室内对峙试验分离筛选获得。该链霉菌保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏单位简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2019376，保藏日期为2019年5月20日。其具有以下的微生物学特性：革兰氏阳性菌，孢子链呈紧密的螺旋形，液化明胶，牛奶胨化阳性，接触酶阳性，氧化酶阳性，酯酶阳性，淀粉水解阳性，纤维素水解阴性，不产生H2S；能利用D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、蜜二糖、D-木糖、D-棉子糖、L-鼠李糖等碳源，不能利用甘油、肌醇、L-树胶醛糖、D-甘露醇、D-半乳糖和α-乳糖；氮源利用广泛（除D-丝氨酸和L-精氨酸不能利用以外）。在NA培养基上培养7d后，菌落圆滑，基内菌丝体黄褐的橄榄色，气生菌丝体丰富，白色，无可溶性色素。在NB液体培养基中培养3d，发酵液呈金黄色，澄清透明，菌体生长旺盛，菌球细小。
本发明的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）的培养方法（或繁殖方法）、检测存活性条件：（1）营养琼脂（NA）培养基，10 g蛋白胨，5 g氯化钠，5 g牛肉膏，15 g琼脂粉，1L蒸馏水，pH 7.2-7.4，28℃下培养。实验室液体培养采用营养肉汤（NB）培养基。（2）大量发酵培养基为小米培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨3 g、2.5 g NaCl、CaCO32 g ，小米10g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4 。
该微生物制剂可以作为生物农药，防治水稻稻瘟病，防治效果可达70.9%。
本发明的有益效果：
（1）本发明的链霉菌QJK-30为植物根际有益放线菌，能在植物体表和体内定殖，防治效果持久稳定。
（2）本发明的链霉菌QJK-30对环境友好。
（3）本发明的链霉菌QJK-30对稻瘟病的防治效果显著。
（4）本发明的链霉菌QJK-30培养条件简单，易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用潜力。
附图说明：
图1 本发明实施例的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）在高氏一号培养基上的单菌落形态；
图2本发明实施例的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）的***进化树（基于16SrDNA序列）；
图3 本发明实施例的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用。
具体实施方式：
下面结合具体实验实例及附图对本发明作进一步详细的描述。
实施例1：链霉菌QJK-30的分离筛选。
本发明的链霉菌，其属名为Streptomyces，种名为Streptomyces sp.，株名为QJK-30，从湖南省娄底市娄星区水稻种植区水稻根际土壤中分离，通过土壤连续梯度稀释法和平板对峙试验筛选获得，所述筛选方法属于本领域常规实验方法。
具体方法及过程描述如下：取根际土样（距土表层约10 cm深）1 g于99 mL无菌水中制成10-2的土壤悬液，28℃，180 rpm摇瓶30 min，静置30 min后取上清液，连续梯度稀释后，涂布在高氏一号培养基平板上，置于28℃培养。挑取单菌落，在高氏一号培养基平板上进行划线培养，获得一株链霉菌，编号为QJK-30。
所述高氏一号培养基配方为：20 g可溶性淀粉，1 g KNO3，0.5 g NaCl，0.5 gK2HPO4·3H2O，0.5 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，16 g琼脂，蒸馏水1000 mL，pH7.4-7.6。
实施例2：链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）的鉴定
1、形态学鉴定
QJK-30菌株在高氏一号培养基上28℃恒温培养7d后，菌落圆形，质地紧致，气生菌丝白色，如图1显示。
2、生理生化鉴定
QJK-30菌株革兰氏染色、氧化酶、接触酶、酯酶、脲酶和硝酸盐还原试验阳性；甲基红试验、V-P试验和吲哚产生试验阴性，不产生H2S；能液化明胶、使牛奶胨化、水解酪素、水解淀粉、利用柠檬酸盐，不能水解纤维素，如表1所示。
表1 链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）的生理生化特性
革兰氏染色 + 纤维素分解 -
糖发酵能力 不产酸 硝酸盐还原 +
明胶液化 + 氧化酶 +
牛奶胨化 + 接触酶 +
淀粉水解 + MR试验 -
酯酶 + V-P试验 -
吲哚产生 - H<sub>2</sub>S产生 -
柠檬酸盐利用 + 尿素酶 +
酪素水解 +
3、分子鉴定
取上述QJK-30菌株单菌落在高氏一号液体培养基中振荡培养5d （28℃，150rpm），12000 rpm离心1 min，弃上清液，收集菌体。采用细菌基因组DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）按说明书进行操作。根据原核微生物16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），以QJK-30菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。100 μl PCR 反应体系：10×PCR缓冲液10 μl（含 MgCl2），10mmol/L dNTP 2 μl，10 μmol/L 27F引物 5 μl，10 μmol/L 1492R引物 5 μl ，5 μl模板DNA(200 ng)，2.5U Taq聚合酶，加双蒸水至终体积混匀后，在PCR仪上进行扩增：95℃变性4min后，进入 PCR循环，每个循环为94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；然后72℃延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳（1%为琼脂糖的质量百分数）检测分析PCR扩增结果。应用回收试剂盒将 PCR产物回收，送往生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。对测序结果进行拼接处理，得到QJK-30菌株的16S rRNA基因序列，长度为1402bp，NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）登录号为MK791670。
以Mycobacterium. tuberculosis的16S rRNA序列为外群，构建***发育树，结果显示，QJK-30菌株与模式菌株Streptomyces albospinus NBRC 13848(T)、Streptomyces kasugaensis BCRC 12349(T)、Streptomyces cellulofavus NRRC B-2493(T)处于同一小的分枝下，结合菌体形态、菌落特征和生理生化特征，初步鉴定为链霉菌属。
实施例3：链霉菌QJK-30对稻瘟病菌的体外抑菌活性测定实验。
以稻瘟病R01-1菌株（由本申请人实验室保存）为供试菌，采用平板对峙法测定。将QJK-30菌株和稻瘟病菌R01-1菌株重新活化，用无菌打孔器（7 mm）打孔，用无菌镊子夹取稻瘟病菌R01-1琼脂块置于PDA平板中央，距离平板中心3 cm处放置QJK-30菌株琼脂块，以接种无菌琼脂块作对照，28℃培养至病原菌长满整个平板，观察抑菌效果并计算抑菌率。
抑菌率（%）=（Rp-Rt）/Rp×100%
其中，Rp表示对照组菌丝生长半径，Rt表示处理组菌丝生长半径（靠拮抗菌一侧），菌丝生长半径按测量平均值减去菌饼半径（3.5 mm）计算。
所述PDA培养基配方为：200 g土豆，20 g葡萄糖，16 g琼脂，1000 mL蒸馏水，自然pH。
如图3所示，链霉菌QJK-30对稻瘟病菌R01-1菌株的菌丝生长有显著的抑制作用，抑制率为78.8%。
实施例4：链霉菌QJK-30防治稻瘟病的田间试验。
田间试验地点在湖南省湘乡市月山镇金坪村进行，该地点常年自然发生稻瘟病。水稻品种为杂交中稻隆两优华占。将田块分为4×5 m的小区，随机区组试验，秧苗移栽后20d和40d，对稻苗喷雾，分4种处理，3次重复：（1）清水对照，750L/ha；（2）链霉菌QJK-30发酵悬液（1×108cfu/mL），750L/ha；（3）三环唑（75%可湿性粉剂），施用量300 g/ha，兑水750L/ha。在第二次喷雾处理后40d，按稻瘟病测报调查规范（GB/T 15790-1995）计算防治效果（防效）。病情指数＝Σ[各级病叶数×各级相对病级值]/[调查总叶数]×最高病级值。防效（%）＝（对照病情指数―处理病情指数）/对照病情指数×100。
试验结果表明，链霉菌QJK-30菌株对稻瘟病的防效达70.9%，与三环唑的防效（72.4%）无显著差异（P＞0.05）（表2）。
表2 链霉菌QJK-30对稻瘟菌的田间防效
处理 病情指数 防效(%)
对照 13.4 -
QJK-30 3.9 70.9
三环唑 3.7 72.4

Claims (5)

1.一种链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）生防菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M M2019376。
2.如权利要求1所述的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）生防菌株，其特征是，所述链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）是从水稻根际土壤中采用土壤连续梯度稀释法，并结合室内对峙试验分离筛选获得。
3.如权利要求1所述的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）生防菌株，其特征是，所述链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）具有以下的微生物学特性：革兰氏阳性菌，孢子链呈紧密的螺旋形，液化明胶，牛奶胨化阳性，接触酶阳性，氧化酶阳性，酯酶阳性，淀粉水解阳性，纤维素水解阴性，不产生H2S；能利用D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、蜜二糖、D-木糖、D-棉子糖、L-鼠李糖等碳源，不能利用甘油、肌醇、L-树胶醛糖、D-甘露醇、D-半乳糖和α-乳糖；氮源利用广泛（除D-丝氨酸和L-精氨酸不能利用以外）；在NA培养基上培养7d后，菌落圆滑，基内菌丝体黄褐的橄榄色，气生菌丝体丰富，白色，无可溶性色素；在NB液体培养基中培养3d，发酵液呈金黄色，澄清透明，菌体生长旺盛，菌球细小。
4.如权利要求1所述的链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）生防菌株，其特征是，所述链霉菌（Streptomyces sp. QJK-30）的培养方法及检测存活性条件：（1）营养琼脂（NA）培养基，10 g蛋白胨，5 g氯化钠，5 g牛肉膏，15 g琼脂粉，1L蒸馏水，pH 7.2-7.4，28℃下培养；实验室液体培养采用营养肉汤（NB）培养基；（2）大量发酵培养基为小米培养基：葡萄糖10g、蛋白胨3 g、2.5 g NaCl、CaCO32 g，小米10g，蒸馏水1000 mL，pH值7.2-7.4 。
5.如权利要求1所述的链霉菌生防菌株在防治水稻稻瘟病方面的应用。
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