CN115215953B - 自组装氧化还原聚合物、传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种自组装氧化还原聚合物、传感器及其制备方法。所述自组装氧化还原聚合物，具有以下结构：其中，R1和R2各自独立的表示连接键，且R1和R2相同或不同；M表示过渡金属；L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地表示配体，所述配体为杂环，并且通过所述杂环的杂原子与M配位结合；X表示自组装基团；Y表示阴离子，a表示整数；b表示阴离子的个数，为自然数；其中，b>a+1；n、m以及r表示自然数，且n、m以及r之和为20以上；e、g以及f表示整数。本发明的自组装氧化还原聚合物能够在未引入交联剂的前提下制备传感器的传感层。

Description

自组装氧化还原聚合物、传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种自组装氧化还原聚合物、传感器及其制备方法，属于医疗诊断技术领域。
背景技术
随着生活水平的日益提高，糖尿病的患者也是逐年增加，早期诊断、及时治疗、以及持续控制对于确保患者的生活质量以及对于避免由糖尿病引发的循环***问题(如肾衰竭、心脏疾病和失明)而言是至关紧要的。酶生物传感器是将分析物的生化反应信号转化为可测量的物理信号，比如光电信号，其中研究最多的生物传感器是电流型葡萄糖传感器。
第一代生物传感技术是通过电化学方法检测葡萄糖氧化过程中生成的过氧化氢或消耗的氧气来间接地对葡萄糖进行监测。例如美敦力的Guardian和iPro2和德康的Dexcom G5和G6都是基于第一代生物传感技术开发出来的，它们通过电化学方法检测葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化过程中生成的过氧化氢来对葡萄糖进行监测。由于电化学方法检测过氧化氢对电极的要求非常苛刻只有铀和铀合金等极少数几种材料能用于这类葡萄糖生物传感器的制作，这就大大地增加了植入式持续葡萄糖监测***的传感器的成本。另外，过氧化氢的电化学检测要求较高的检测电位，因而大大地降低了植入式持续葡萄糖监测***的抗干扰能力，特别是对常用的退烧药如乙酰氨基酚的抗干扰能力。
第二代生物传感技术是通过在葡萄糖生物传感器中引入氧化还原媒介体来实现对葡萄糖进行直接的电化学检测。与普通的蛋白质分子不同，葡萄糖氧化酶的分子量很大(160KDa)，其分子结构特别是催化活性中心的立体结构非常复杂，而且位于葡萄糖氧化酶的内部，并被各种肤链深深地包裹着。因此葡萄糖氧化酶不能直接与电极进行电子交换。Heller等人(Acc.Chem.Res.23(1990)128-134)发现在葡萄糖生物传感器中引入氧化还原物质氧化还原媒介体(氧化还原小分子如铁氟化物或氧化还原高分子)，葡萄糖氧化酶可以通过这些媒介体实现与电极进行电子交换。但由于氧化还原媒介体为小分子或高分子材料，使其制备难于得到精确的控制，同时也存在氧化还原媒介体从植入式葡萄糖生物传感器中渗出的可能性，给植入式持续葡萄糖监测***的性能带来较多的不确定性。
当前市面上主要的连续血糖监测(CGM)中传感器的酶层都需要交联剂固化，比如戊二醛、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)等，但是该方法存在交联固化慢，引入易泄露的有毒小分子，导致未反应完全的交联剂有泄漏的风险。
引用文献1公开一种提高电化学活性的氧化还原酶及含有该氧化还原酶的生物传感器，其使用化学交联的方法，并认为经过化学交联的葡萄糖氧化酶仍然保持着它们的直接电化学活性，例如戊二醛化学交联的含有经过修饰的葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器在电极上呈现出良好的电化学性能，而且是一个典型的表面电化学现象。但是，其并没有考虑交联固化慢、戊二醛等化学交联剂的泄露风险。
引用文献2公开一种用于测量生物信号的包含碳纳米管的电化学生物传感器及其制造方法。该电化学生物传感器用于连续葡萄糖监测的电化学生物传感器包括电极，包含氧化还原酶、电子传递介质和交联剂的感测膜与碳纳米管一起固定至该电极，其中氧化还原酶氧化目标物质，并且在氧化过程中因此产生的电子通过电子传递介质和碳纳米管传递。该电化学生物传感器同样没有考虑交联固化慢、戊二醛等化学交联剂的泄露风险。
引用文献：
引用文献1：CN114152656A
引用文献2：CN114269246A
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在技术问题，例如：交联固化慢，引入易泄露的有毒小分子，导致未反应完全的交联剂有泄漏的风险等，本发明首先提供一种自组装氧化还原聚合物及其制备方法，该自组装氧化还原聚合物能够在未引入交联剂的前提下制备传感器的传感层。
本发明还提供一种传感器，该传感器具备更加优良的电化学性能，能够响应葡萄糖浓度，促使生物传感器的检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好。
进一步地，本发明还提供一种传感器的制备方法，该制备方法简单易行，原料易于获取，且制备的传感层不需引入额外的小分子交联剂，易操作，可以避免交联剂泄露的问题。
用于解决问题的方案
本发明首先提供一种自组装氧化还原聚合物，其具有以下结构：
其中，R1和R2各自独立的表示连接键，且R1和R2相同或不同；
M表示过渡金属；
L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地表示配体，所述配体为杂环，并且通过所述杂环的杂原子与M配位结合；
X表示自组装基团；
Y表示阴离子，
a表示整数；b表示阴离子的个数，为自然数；其中，b>a+1；
n、m以及r表示自然数，且n、m以及r之和为20以上；
e、g以及f表示整数。
根据本发明的自组装氧化还原聚合物，其中，所述自组装基团选自取代基取代或未取代的如下基团中的一种：
其中，c和d是1-16的整数。
根据本发明的自组装氧化还原聚合物，其中，所述自组装基团的取代基选自苄溴基、苄氯基、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-COOH、-SO3H、-NH2、-OH、碳原子数为1-6的烷氧基或碳原子数为1-6的烷基中的一种。
根据本发明的自组装氧化还原聚合物，其中，所述自组装氧化还原聚合物的切割分子量为1000Da以上。
本发明还提供一种根据本发明所述的自组装氧化还原聚合物的制备方法，其包括在氧化还原聚合物上接枝自组装基团制备得到，优选地，所述接枝的方式包括亲电反应、亲核反应、缩合反应中的一种或两种以上的组合。
本发明还提供一种传感器，其包括：柔性电极，所述柔性电极包括基材、工作电极、对电极以及参比电极，其中，
所述工作电极和所述对电极分别设置于所述基材的两侧，所述对电极的远离所述基材的一侧设置有电介质层；
所述工作电极的远离所述基材一侧设置有参比电极，所述工作电极与所述参比电极之间设有电介质层，所述参比电极的远离所述工作电极的一侧设置有电介质层，并且，
所述工作电极的表面具有未设置电介质层和参比电极的裸露部，在所述裸露部的表面负载有自组装传感层，所述自组装传感层源自前述的自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶。
根据本发明所述的传感器，其中，所述自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶的质量比为1:0.5至1:2。
根据本发明所述的传感器，其中，所述柔性电极的表面具有阳离子聚合物；优选地，所述阳离子聚合物的重均分子量为1000-50000Da。
根据本发明所述的传感器，其中，在所述具有自组装传感层的柔性电极的表面还设置有限制扩散膜，优选地，所述限制扩散膜源自于含氮杂环基团的聚合物和交联剂；更优选地，所述含氮杂环基团的聚合物经亲水基团修饰。
本发明还提供一种根据本发明所述的传感器的制备方法，其包括以下步骤：
制备柔性电极的步骤，其中，所述柔性电极包括基材、工作电极、对电极以及参比电极；
将自组装传感层负载于所述工作电极的未设置电介质层和参比电极的裸露部的步骤。
根据本发明所述的制备方法，其中，将自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶混合后，负载在所述工作电极的未设置电介质层和参比电极的裸露部的表面，得到具有所述自组装传感层的柔性电极。
根据本发明所述的制备方法，其中，在负载所述自组装传感层之前，在所述柔性电极的表面，利用等离子体引发接枝所述阳离子聚合物，得到接枝阳离子聚合物的柔性电极。
根据本发明所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括：将含氮杂环基团的聚合物和交联剂在溶剂中混合后，浸涂在所述具有自组装传感层的柔性电极的表面，得到具有限制扩散膜的传感器。
发明的效果
本发明的自组装氧化还原聚合物能够在未引入交联剂的前提下制备传感器的传感层。
本发明的传感器的自组装传感层中尽管未引入交联剂，但本发明的传感器依然具备优良的电化学性能，能够响应葡萄糖浓度，促使生物传感器的检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好。
进一步地，本发明的传感器的制备方法简单易行，原料易于获取，且制备的传感层不需引入额外的小分子交联剂，易操作，可以避免交联剂泄露的问题。
附图说明
图1示出了柔性电极基本结构的剖面图。
图2示出了传感器基本结构的剖面图。
图3示出了本发明实施例2的含有自组装传感层的传感器电流信号随时间变化的曲线；
图4示出了本发明对比例1的非自组装传感器电流信号随时间变化的曲线；
图5示出了本发明实施例3的含有自组装传感层的传感器的线性图谱；
图6示出了本发明对比例1的非自组装传感器线性图谱。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，如没有特殊声明，则“多”、“多种”、“多个”等中的“多”表示2或以上的数值。
本说明书中，所述“基本上”、“大体上”或“实质上”表示于相关的完美标准或理论标准相比，误差在5％以下，或3％以下或1％以下。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明的第一方面提供一种自组装氧化还原聚合物，其具有以下结构：
其中，R1和R2各自独立的表示连接键，且R1和R2相同或不同；
M表示过渡金属；
L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地表示配体，所述配体为杂环，并且通过所述杂环的杂原子与M配位结合；
X表示自组装基团；
Y表示阴离子，
a表示整数；b表示阴离子的个数，为自然数；其中，b>a+1；
n、m以及r表示自然数，且n、m以及r之和为20以上，例如40以上；
e、g以及f表示整数，例如：三者均可以0-20的整数；
本发明通过使用自组装氧化还原聚合物在未引入交联剂的前提下制备传感器的传感层。
在一些具体的实施方案中，对于R1或R2，其可以选自-(CRiRs)-、-O-、-S-、-C(O)O-、-S(O)2NRk-、-OC(O)NRm-、-OC(S)NRn-、-C(O)NRt-、-NRu-、-CRv＝N-O-、-CRw＝NNRx-以及SiRyRz中的一种，其中，Ri和Rs各自独立地为氢、氯、氟、取代或未取代的碳原子数为1-6的烷基、碳原子数为1-6的烷氧基、碳原子数为2-6的烯基或者碳原子数为2-6的炔基；Rk、Rm、Rn、Rt、Ru、Rv、Rw、Rx、Ry和Rz各自独立地为氢，或取代或未取代的碳原子数为1-6的烷基。通过亲电反应、亲核反应或缩合反应中的一种或两种以上的组合的接枝方式，将自组装基团接枝在氧化还原聚合物上，形成自组装氧化还原聚合物。
对于M，本发明不作特别限定，其可以是任意可行的过渡金属。具体地，所述过渡金属可以是锇、钌、钒、钴或铁。
对于L1、L2、L3、L4、L5和L6，L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地为单齿配体，或者，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的一个与L1、L2、L3、L4、L5或L6中的其他配体结合形成多齿配体。在一些具体的实施方案中，L1的杂环为含氮杂环，通过杂环的氮原子与M配位键合。优选地，所述含氮杂环包括取代基取代或未取代的吡啶、取代基取代或未取代的咪唑、取代基取代或未取代的2,2'-联吡啶、取代基取代或未取代的2-(2-吡啶基)咪唑或2,2'-联咪唑。
对于上述含氮杂环上的取代基，本发明不作特别限定，可以是本领域任何可行的一些取代基，例如：其可以是无机物基团或碳原子数1～10的有机基团，优选碳原子数为1-5的有机基团。优选地，对于无机物基团，其可以是卤素、氨基、羟基、磷酸基、膦酸基、偏磷酸基、硝基、硫酸基、磺酸基、氰基、硫氰基、巯基、碳酸基、膦基等；对于有机基团，其可以是烷基、烷氧基、羧基、羧基烷氧基、碳酸酯基、烷基醚基、烷基酯基、硫醚基、硫酯基、缩醛基、氨基甲酸酯基、脲基、酰胺基、酰亚胺基、环烷基、杂环基等。其中的烷基均可以是碳原子数为1～10的直链烷基或支链烷基，其中的烷氧基均可以是碳原子数为1～10的直链烷氧基或支链烷氧基，其中的环烷基可以是碳原子数为3～10的环烷基。优选地，所述卤素可以为F、Cl或Br原子。
进一步，在一些具体的实施方案中，L2、L3、L4、L5和L6中的至少三个杂环为上述含氮杂环。优选地，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的每一个杂环均为上述含氮杂环。
进一步，在一些具体的实施方案中，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少两个杂环结合以形成至少一个多齿配体。优选地，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少四个杂环进行结合以形成至少两个多齿配体。
具体地，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的至少四个结合以形成至少两个选自取代基取代和未取代的2,2'联吡啶、取代基取代和未取代的2-(2-吡啶基)咪唑和取代基取代和未取代的2,2'-联咪唑的多齿配体。对于取代基，本发明不作特别限定，可以是本领域任何可行的一些取代基，例如：其可以是无机物基团或碳原子数1～10的有机基团，优选碳原子数为1-5的有机基团。优选地，对于无机物基团，其可以是卤素、氨基、羟基、磷酸基、膦酸基、偏磷酸基、硝基、硫酸基、磺酸基、氰基、硫氰基、巯基、碳酸基、膦基等；对于有机基团，其可以是烷基、烷氧基、羧基、羧基烷氧基、碳酸酯基、烷基醚基、烷基酯基、硫醚基、硫酯基、缩醛基、氨基甲酸酯基、脲基、酰胺基、酰亚胺基、环烷基、杂环基等。其中的烷基均可以是碳原子数为1～10的直链烷基或支链烷基，其中的烷氧基均可以是碳原子数为1～10的直链烷氧基或支链烷氧基，其中的环烷基可以是碳原子数为3～10的环烷基。优选地，所述卤素可以为F、Cl或Br原子。
在一些具体的实施方案中，所述自组装基团选自取代基取代的如下基团中的一种：
其中，c和d是1-16的整数。
具体地，所述自组装基团的取代基可以选自苄溴基、苄氯基、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-COOH、-SO3H、-NH2、-OH、碳原子数为1-6的烷氧基或碳原子数为1-6的烷基中的一种。
对于Y，本发明不作特别限定，可以是本领域任何可行的阴离子，例如：卤素阴离子，Cl-、I-、F-、Br–等。
进一步，在本发明中，所述自组装氧化还原聚合物的切割分子量为1000Da以上。
本发明通过在氧化还原聚合物上接枝自组装基团，从而获得一种自组装氧化还原聚合物，该自组装氧化还原聚合物含有与葡萄糖响应酶的氨基酸残基共价结合的基团，且自组装氧化还原聚合物中的电子中介体可以自由的摆动。本发明自组装氧化还原聚合物制备得到的传感器的传感层能够实现无需交联剂即可实现与葡萄糖响应酶的自动结合。
<第二方面>
本发明的第二方面提供一种根据本发明第一方面所述的自组装氧化还原聚合物的制备方法，其包括在氧化还原聚合物上接枝自组装基团制备得到，优选地，所述接枝的方式包括亲电反应、亲核反应、缩合反应中的一种或两种以上的组合。
具体地，所述自组装氧化还原聚合物的制备方法包括以下步骤：
获取氧化还原聚合物和提供自组装基团的化合物，
将氧化还原聚合物和提供自组装基团的化合物在溶剂中混合，得到混合产物，
使所述混合产物进行接枝反应，得到反应产物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述混合产物中，氧化还原聚合物的浓度为1mg/mL-100mg/mL，例如：10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL等，提供自组装基团的化合物的浓度为1mg/mL-50mg/mL，例如：10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL等。对于混合的时间，本发明不作特别限定，可以根据需要进行设置，例如：12-24小时，例如：14小时、16小时、18小时、20小时、22小时等。
对于溶剂，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的溶剂，优选为有机溶剂，例如：N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、甲醇、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种以上的组合。
在一些具体的实施方案中，所述接枝的方式包括亲电反应、亲核反应、缩合反应中的一种或两种以上的组合。
在一些具体的实施方案中，所述提供自组装基团的化合物可以为碳原子数为1-16，优选碳原子数为1-6的烷基硼酸、碳原子数为1-16，优选碳原子数为1-6的烷基醛、苯硼酸、苯甲醛、苄醇、邻苯二酚、酰氯或酸酐中的一种或两种以上的组合，上述自组装基团的化合物均可以由取代基取代，所述取代基可以选自苄溴基、苄氯基、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-COOH、-SO3H、-NH2、-OH、碳原子数为1-6的烷氧基、碳原子数为1-6的烷基，卤素取代的碳原子数为1-6的烷基等；例如多巴胺、3,4-二羟基苯丙氨酸、4-溴甲基苯硼酸等。
对于具体的反应条件，本发明不作特别限定，可以根据亲电反应、亲核反应、缩合反应进行反应，得到所需的反应产物。
进一步，为了使所得到的反应产物能够溶于水，以离子的形式存在，可以在反应产物中添加阴离子交换树脂，从而得到含自组装氧化还原聚合物的溶液。对于阴离子交换树脂的量，本发明不作特别限定，可以根据需要进行添加，对于加入的时间一般可以是5-20小时，例如：7小时、9小时、10小时、12小时。14小时、16小时、18小时等。
进一步，使用超滤膜过滤，获得取需切割分子量的含自组装氧化还原聚合物的溶液，之后进行纯化至废弃液导电率≤50μs/cm后，冻干，切割分子量为1000Da以上的自组装氧化还原聚合物的。
<第三方面>
如图2所示：本发明的第三方面提供一种传感器，其包括：
柔性电极，所述柔性电极包括基材、工作电极、对电极以及参比电极，其中，
所述工作电极和所述对电极分别设置于所述基材的两侧，所述对电极的远离所述基材的一侧设置有电介质层；
所述工作电极的远离所述基材一侧设置所述参比电极，所述工作电极与所述参比电极之间设有电介质层，所述参比电极的远离所述工作电极的一侧设置有电介质层，并且，
所述工作电极的表面具有未设置电介质层和参比电极的裸露部，在所述裸露部的表面负载有自组装传感层(图2中的传感层)，所述自组装传感层源自于本发明第一方面所述的自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶。
本发明的自组装氧化还原聚合物含有与氧化还原酶的氨基酸残基共价结合的基团，而自组装氧化还原聚合物中的电子中介体可以自由的摆动，且本发明的所述自组装传感层不含有交联剂。
在一些具体的实施方案中，所述自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶的质量比为1:0.5至1:2，例如：1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1等。当所述自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶的质量比为1:0.5至1:2时，能够获得性能优异的自组装传感层。
进一步，对于氧化还原酶，其可以是葡萄糖响应酶，例如：葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶，优选为葡萄糖氧化酶。
本发明对工作电极、对电极以及参比电极的材料不作特别限定，可以是本领域常用的工作电极、对电极以及参比电极。具体地，所述工作电极、对电极以及参比电极的导电材料可以为石墨、石墨烯、纳米碳、碳纳米管以及银/氯化银等中的一种或两种以上的组合。
另外，在本发明中，工作电极、对电极以及参比电极可以采用丝网印刷导电材料在基材上，以形成工作电极、对电极以及参比电极。
进一步，在本发明中，所述基材可以为柔性薄膜，例如：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等。
进一步，在本发明中，对于工作电极、对电极以及参比电极的厚度，本发明不作特别限定，可以根据需要进行设置。当采用丝网印刷导电材料在基材以制备工作电极、对电极以及参比电极时，印刷导电材料的厚度可以为1-100μm，当直接采用导电材料作为工作电极、对电极以及参比电极时，工作电极、对电极以及参比电极的厚度同样可以为1-100μm。
进一步，本发明的电介质层即绝缘层，对于电介质层的原料，本发明也不作特别限定，可以经过市售购买得到的绝缘料即可。对于电介质层的厚度，本发明不作特别限定，可以是1-50μm。
在一些具体的实施方案中，所述柔性电极的表面具有阳离子聚合物；优选地，所述阳离子聚合物的重均分子量可以为1000-50000Da。
在另一些具体的实施方案中，在所述传感器的表面还设置有限制扩散膜。本发明的限制扩散膜是用于限制葡萄糖向电化学传感器中工作电极的流量，因此传感器线性响应范围和稳定性均得到提高。且限制扩散膜可提供多种功能，如生物相容性、抗干扰物等。
进一步，在本发明中，所述限制扩散膜源自于含氮杂环基团的聚合物和交联剂；优选地，所述含氮杂环基团的聚合物和交联剂的质量比为64：1至10：1，例如：60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1等。所述含氮杂环基团的聚合物和交联剂的质量比为64：1至10：1时，限制扩散膜的功效能够获得最有效的发挥。
具体地，含氮杂环基团的聚合物可以是聚乙烯吡啶、聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物和聚乙烯咪唑等中的一种或两种以上的组合，所述交联剂包括聚(二甲基硅氧烷)-二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、P-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙氧基)苯胺、二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐中的一种或两种以上的组合。
进一步，所述含氮杂环基团的聚合物经亲水基团修饰。所述亲水基团可以是聚乙二醇基、磺酸基、氨基、羧基中的一种或两种以上的组合，用于提高限制扩散层的生物相容性。
<第四方面>
本发明的第四方面提供一种根据本发明第三方面所述的传感器的制备方法，其包括以下步骤：
制备柔性电极的步骤，其中，所述柔性电极包括基材、工作电极、对电极以及参比电极；
将自组装传感层负载于所述工作电极的未设置电介质层和参比电极的裸露部的步骤。
<柔性电极的制备>
本发明采用堆叠工作电极、对电极以及参比电极的方式以制备所述柔性电极。
具体地，取电极衬底材料，在其表面印刷导电材料作为导电层以制备工作电极和对电极；所述电极衬底材料可以为柔性高分子薄膜，即聚对苯二甲酸乙二醇酯。
举例而言，可以将一个柔性高分子薄膜作为基材，并将工作电极和对电极分别设置于所述基材的两侧，然后在对电极的远离所述基材的一侧设置电介质层；在工作电极的远离所述基材一侧设置有电介质层，在该电介质层的远离工作电极的一侧印刷一层导电材料作为参比电极，经激光切割后得到所需的柔性电极，并使工作电极的表面具有未设置电介质层和参比电极的裸露部。
<传感器的制备>
在本发明中，考虑到使传感器的作用得到最大的发挥，在一些具体的实施方案中，先利用等离子体在所述柔性电极的表面引发接枝所述阳离子聚合物，得到预处理的柔性电极。引发接枝过程中，等离子体的气体流速为10mL/分钟-500mL/分钟，例如：50mL/分钟、100mL/分钟、150mL/分钟、200mL/分钟、250mL/分钟、300mL/分钟、350mL/分钟、400mL/分钟、450mL/分钟等；引发接枝的处理功率为30w-200w，例如：50w、80w、100w、120w、150w、180w等；引发接枝的处理时间为1分钟-30分钟，例如：5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟等。
具体地，所述等离子体包括氩气、氧气、氢气、氮气或空气中的一种或两种以上的组合。所述阳离子聚合物包括聚烯丙基胺、聚(L-赖氨酸)、聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺树状聚合物中的一种或两种以上的组合。
进一步，将自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶在缓冲溶液中混合，其中，自组装氧化还原聚合物的浓度为1mg/mL-200mg/mL，例如：20mg/mL、50mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、150mg/mL、180mg/mL等；氧化还原酶的浓度为1mg/mL-200mg/mL例如：20mg/mL、50mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、150mg/mL、180mg/mL等。对于混合的时间，本发明不作特别限定，可以根据需要进行设置，例如：30分钟-200分钟，例如：50分钟、80分钟、100分钟、120分钟、150分钟、180分钟等。
对于缓冲溶液，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的溶剂，优选为缓冲溶液，优选为pH为4.5-9的缓冲溶液，具体地，pH值可以为5、6、7、8等，例如：HEPES缓冲溶液、TES缓冲液或MES缓冲液等中的一种或两种以上的组合。
将自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶混合后，负载在所述预处理后的柔性电极的工作电极的未设置电介质层和参比电极的裸露部的表面。具体地，用微量进样器定量滴加传感层溶液到裸露部，室温放置0.5-2天，得到具有自组装传感层的柔性电极。
在一些具体的实施方案中，将含氮杂环基团的聚合物和交联剂在醇缓冲液中混合后，得到混合产物；将所述混合产物浸涂在所述柔性电极的表面，从而获得具有限制扩散膜的传感器。
具体地，所述混合产物中，含氮杂环基团的聚合物的浓度为1mg/mL-200mg/mL，例如：20mg/mL、50mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、150mg/mL、180mg/mL等；交联剂的浓度为0.5mg/mL-10mg/mL，例如：0.8mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL等。对于混合的时间，本发明不作特别限定，可以根据需要进行设置。
对于醇缓冲液，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的醇缓冲液，具体的，醇缓冲液可以为醇类溶剂和缓冲溶液的混合物，优选地，醇类溶液与缓冲溶液的体积比为1-10:1，例如：2:1、4:1、6:1、8:1等。对于醇类溶剂，其可以是甲醇、乙醇、丙醇等常用溶剂，对于缓冲溶液，优选为pH为4.5-9的缓冲溶液，例如：HEPES缓冲溶液、TES缓冲液或MES缓冲液中的一种或两种以上的组合。
然后将所述混合产物浸涂在所述柔性电极的表面，固化后获得具有限制扩散膜的传感器。具体地，对于浸涂的方式，本发明不作特别限定，考虑到原料的适用性，可以采用多次浸涂的方式，例如1-10次，每次间隔的时间可以是5-20min。浸涂后，将混合产物室温固化1-2天，得到具有限制扩散膜的传感器。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例中，使用的式(I)所示的化合物的结构式为：
式(I)所示的化合物的制备方法如下：
在250mL单口瓶中，使用10g聚乙烯吡啶(Mw＝160000，sigma aldrich)溶解在DMF(100mL)中，加入6-溴己酸(2.8g)，置换氮气三次，反应液在90℃下反应24小时，反应液降至室温，滴加到600mL乙酸乙酯中，经抽滤、真空干燥，得到12g己酸接枝的聚乙烯吡啶。
250mL三口瓶中，依次加入6-甲基-2-吡啶甲醛(13g)、乙二醛(40％，15mL)和无水乙醇(25mL),冰浴下缓慢滴加浓氨水(41.6mL),室温搅拌24小时，经纯化后，得到8.4g 2-(6-甲基-2-吡啶)咪唑(黄色固体)。
500mL单口瓶中依次加入8.4g 2-(6-甲基-2-吡啶)咪唑、23g N-Boc-6-溴己胺、125mL DMF和34.4g无水碳酸铯，置换氮气3次，90℃反应2天，反应液降至室温，经分离纯化，得到11.2g 2-(6-甲基-2-吡啶)-1-(6-Boc-氨己基)咪唑。
250mL单口瓶中依次加入11g 2-(6-甲基-2-吡啶)-1-(6-Boc-氨己基)咪唑和55mL乙醇，室温下滴加4N HCl·dioxane(55mL)，室温反应过夜，过滤，真空干燥，得到9.9g 2-(6-甲基-2-吡啶)-1-(6-氨己基)咪唑盐酸盐。
500mL单口瓶中依次加入10g联咪唑、150mL DMF，冰浴下分批加入6.28g NaH(60％)，加入完毕，混合物室温搅拌0.5小时，称取31.93g对甲苯磺酸甲酯，溶于50mL DMF中，冰浴下滴加对甲苯磺酸甲酯溶液，滴加完毕，反应在室温下搅拌过夜。反应液经分离纯化后得到11.3g 1,1′-二甲基-2,2′-联咪唑(白色固体)。
250mL三口瓶中依次加入1g K2OsCl6、0.67g 1,1′-二甲基-2,2′-联咪唑、1g氯化锂和40mL乙二醇，反应液置换氮气3次，140℃反应24小时，反应液降至室温，加入2-(6-甲基-2-吡啶)-1-(6-氨己基)咪唑盐酸盐，置换氮气三次，反应液在170℃搅拌8小时，反应液降至室温，经分离纯化，得到2.95g Os(1,1′-二甲基-2,2′-联咪唑)2[2-(6-甲基-2-吡啶)-1-(6-氨己基)咪唑](PF6)3。
50mL三口瓶中依次加入己酸接枝的聚乙烯吡啶(515mg)、DMF(10mL)、TSTU(202mg)和DIEA(200uL)，室温搅拌7小时，冰浴下分批加入Os(1,1′-二甲基-2,2′-联咪唑)2[2-(6-甲基-2-吡啶)-1-(6-氨己基)咪唑](PF6)3,加入完毕，室温搅拌24小时。反应液滴加到200mL乙酸乙酯中，过滤，固体经分离纯化后得到745mg式(I)所示的化合物(深蓝色固体)。
实施例1
自组装氧化还原聚合物a的合成：在25mL单口瓶中依次加入100mg式(I)所示的化合物、9.08mg 4-溴甲基苯硼酸和2mL无水DMF，氮气氛围中室温搅拌过夜，反应液加入50mL纯水，加入2g氯离子交换树脂，搅拌10小时，过滤，水相用型号为5000Da的超滤膜(即产物的切割分子量：5000Da以上)纯化至废弃液导电率≤50μs/cm，冻干，得到50mg黄绿色固体，其结构如下所示。
柔性电极的制备：采用堆叠电极的方式制备柔性电极。
取三个电极衬底材料，在其表面印刷碳浆料作为导电层以制备工作电极和对电极；所述电极衬底材料为柔性高分子薄膜，即聚对苯二甲酸乙二醇酯。
将其中一个柔性高分子薄膜作为基材，并将工作电极和对电极分别设置于所述基材的两侧，然后在对电极的远离所述基材的一侧设置电介质层；在工作电极的远离所述基材一侧依次设置有电介质层，在该电介质层的远离工作电极的一侧印刷一层银/氯化银浆料作为参比电极，经激光切割后得到所需的柔性电极，具体参见图1所示。其中工作电极和对电极印刷的碳层厚度是15μm，参比电极的厚度是20μm，电介质层的厚度是10μm。
柔性电极的预处理：将柔性电极用(100mL/min)空气等离子体(80w，5分钟)处理后，将处理后的柔性电极浸泡到15mg/mL聚(L-赖氨酸)(重均分子量为15000-30000Da)过夜，温度为37℃。水洗三次，晾干，得到接枝阳离子聚合物的柔性电极。
含有自组装传感层a的柔性电极的制备：3.4mg/mL葡萄糖氧化酶与43mg/mL自组装氧化还原聚合物a按体积比10:1混合，旋涡振荡3min，溶剂是pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲溶液。采用微量注射器将20nL的传感层溶液点样到接枝阳离子聚合物的柔性电极的工作电极的裸露部上，有效面积1mm2，室温固化一天，得到含有自组装传感层a的柔性电极。
限制扩散膜的制备：由磺酸基修饰的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与聚乙二醇二缩水甘油醚(MW＝200Da)溶液配制得到限制扩散溶液。其中，溶解聚乙二醇二缩水甘油醚(MW＝200Da)所使用的溶剂为乙醇和pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲液混合，其中，乙醇与HEPES缓冲液的体积比为4:1；限制扩散溶液中磺酸基修饰的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与聚乙二醇二缩水甘油醚的浓度分别是64mg/mL和2mg/mL。使用限制扩散溶液将含有自组装传感层a的柔性电极浸涂6次，每次间隔10min，浸涂完毕，室温固化1天，即得到所需的传感器a，结构图如图2所示。
实施例2
自组装氧化还原聚合物b的合成：25mL单口瓶中依次加入100mg非自组装氧化还原聚合物、50mg 4-溴甲基苯甲醛和2mL无水DMF，氮气氛围中室温搅拌24小时，反应液加入50mL纯水，加入3g氯离子交换树脂，搅拌10小时，过滤，水相用型号为30000Da的超滤膜(即产物的切割分子量：30000Da以上)纯化至废弃液导电率≤50us/cm，冻干，得到68mg黄绿色固体。
柔性电极的制备：采用堆叠电极的方式制备柔性电极。
取三个电极衬底材料，在其表面印刷碳浆料作为导电层以制备工作电极和对电极；所述电极衬底材料为柔性高分子薄膜，即聚对苯二甲酸乙二醇酯。
将其中一个柔性高分子薄膜作为基材，并将工作电极和对电极分别设置于所述基材的两侧，然后在对电极的远离所述基材的一侧设置电介质层；在工作电极的远离所述基材一侧依次设置有电介质层，在该电介质层的远离工作电极的一侧印刷一层银/氯化银浆料作为参比电极，经激光切割后得到所需的柔性电极，具体参见图1所示。其中工作电极和对电极印刷的碳层厚度均是15μm，参比电极的厚度是20μm，电介质层的厚度是10μm。
柔性电极的预处理：将柔性电极用(100mL/min)空气等离子体(80w，5分钟)处理后，将处理后的柔性电极浸泡到15mg/mL聚(L-赖氨酸)(重均分子量为15000-30000Da)过夜，温度为37℃。水洗三次，晾干，得到接枝阳离子聚合物的柔性电极。
含有自组装传感层b的柔性电极：将20mg/mL葡萄糖氧化酶与20mg/mL自组装氧化还原聚合物b按体积比1:2混合，旋涡振荡3min，溶剂是pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲溶液。采用微量注射器将20nL的传感层溶液点样到接枝阳离子聚合物的柔性电极的工作电极的裸露部上，有效面积1mm2，室温固化一天，得到含有自组装传感层b的柔性电极。
限制扩散膜的制备：由磺酸基修饰的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与聚乙二醇二缩水甘油醚(MW＝200Da)溶液配制得到限制扩散溶液。其中，溶解聚乙二醇二缩水甘油醚(MW＝200Da)所使用的溶剂为乙醇和pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲液混合，其中，乙醇：HEPES缓冲溶液的体积比为4:1；限制扩散溶液中磺酸基修饰的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与聚乙二醇二缩水甘油醚的浓度分别是64mg/mL和2mg/mL。使用限制扩散溶液将含有自组装传感层b的柔性电极浸涂6次，每次间隔10min，浸涂完毕，室温固化1天，即得到所需的传感器b，结构图如图2所示。
实施例3
柔性电极的制备：采用堆叠电极的方式制备柔性电极。
取三个电极衬底材料，在其表面印刷碳浆料作为导电层以制备工作电极和对电极；所述电极衬底材料为柔性高分子薄膜，即聚对苯二甲酸乙二醇酯。
将其中一个柔性高分子薄膜作为基材，并将工作电极和对电极分别设置于所述基材的两侧，然后在对电极的远离所述基材的一侧设置电介质层；在工作电极的远离所述基材一侧依次设置有电介质层，在该电介质层的远离工作电极的一侧印刷一层银/氯化银浆料作为参比电极，经激光切割后得到所需的柔性电极，具体参见图1所示。其中工作电极和对电极印刷的碳层厚度均是15μm，参比电极的厚度是20μm，电介质层的厚度是10μm。
柔性电极的预处理：将柔性电极用(100mL/min)氮气等离子体(80w、5分钟)处理后，将处理后的柔性电极浸泡到15mg/mL聚(L-赖氨酸)(重均分子量为15000-30000Da)过夜，温度为37℃。水洗三次，晾干，得到接枝阳离子聚合物的柔性电极。
含有自组装传感层c的柔性电极的制备：将20mg/mL葡萄糖氧化酶与20mg/mL实施例2的自组装氧化还原聚合物b按体积比1:2混合，旋涡振荡3min，溶剂是pH为5.5的10mmol/L的MES缓冲溶液。采用微量注射器将20nL的传感层溶液点样到已接枝阳离子聚合物的柔性电极的工作电极的裸露部上，有效面积1mm2，室温固化一天，得到含有自组装传感层c的柔性电极。
限制扩散膜的制备：由磺酸基修饰后的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与P-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙基)苯胺溶液配制得到限制扩散溶液。其中，溶解P-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙基)苯胺所使用的溶剂为乙醇和pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲液混合，其中，乙醇与HEPES缓冲溶液的体积比为4:1；限制扩散溶液中磺酸基修饰的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与P-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙基)苯胺溶液的浓度分别是64mg/mL和2mg/mL。使用限制扩散溶液将含有自组装传感层c的柔性电极浸涂6次，每次间隔10min，浸涂完毕，室温固化1天，即得到所需的传感器c，结构图如图2所示。
对比例1
柔性电极的制备：采用堆叠电极的方式制备柔性电极。
取三个电极衬底材料，在其表面印刷碳浆料作为导电层以制备工作电极和对电极；所述电极衬底材料为柔性高分子薄膜，即聚对苯二甲酸乙二醇酯。
将其中一个柔性高分子薄膜作为基材，并将工作电极和对电极分别设置于所述基材的两侧，然后在对电极的远离所述基材的一侧设置电介质层；在工作电极的远离所述基材一侧依次设置有电介质层，在该电介质层的远离工作电极的一侧印刷一层银/氯化银浆料作为参比电极，经激光切割后得到所需的柔性电极，具体参见图1所示。其中工作电极和对电极印刷的碳层厚度均是15μm，参比电极的厚度是20μm，电介质层的厚度是10μm。
柔性电极的预处理：将柔性电极用(100mL/min)空气等离子体(80w、5分钟)处理后，将处理后的柔性电极浸泡到15mg/mL聚(L-赖氨酸)(重均分子量为15000-30000Da)过夜，温度为37℃。水洗三次，晾干，得到接枝阳离子聚合物的柔性电极。
非自组装传感层的制备：3.4mg/mL葡萄糖氧化酶与43mg/mL式(I)所示的化合物按体积比10:1混合，旋涡振荡3min，溶剂是pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲溶液。采用微量注射器将20nL的传感层溶液点样到接枝阳离子聚合物的柔性电极的工作电极的裸露部上，有效面积1mm2，室温固化一天，得到含有非自组装传感层的柔性电极。
限制扩散膜的制备：由磺酸基修饰后的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与聚乙二醇二缩水甘油醚(MW＝200Da)溶液配制得到限制扩散溶液。其中，溶解聚乙二醇二缩水甘油醚(MW＝200Da)所使用的溶剂为乙醇和pH为8的10mmol/L的HEPES缓冲液混合，其中，乙醇与HEPES缓冲溶液的体积比为4:1；限制扩散溶液中磺酸基修饰的聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物与聚乙二醇二缩水甘油醚的浓度分别是64mg/mL和2mg/mL。使用限制扩散溶液将含有非自组装传感层的柔性电极浸涂6次，每次间隔10min，浸涂完毕，室温固化1天，即得到所需的非自组装传感器。
性能测试
1、传感器植入部分(5mm)浸没于含有10mM葡萄糖溶液的透明样品瓶中，且溶液维持37℃恒温中。采用计时电流法(i-t)，进行稳定性测试，测试电流信号随时间变化的曲线。附图3即为实施例2的含有自组装传感层的传感器电流信号随时间变化的曲线，附图4即为对比例1的非自组装传感器电流信号随时间变化的曲线。由图3和图4可以看出，自组装传感器连续测试14天，电流衰减＜20％，而对比例1的非自组装传感器无电流信号。
本申请对实施例1和实施例3进行上述相关测试，其结果与实施例2的结果大致相同。
2、传感器线性测试
传感器植入部分(5mm)浸没于含有PBS溶液的烧瓶中，并将烧瓶置于磁力搅拌器工作台上，油浴使溶液维持在37℃下，并保持转速120转/min。采用计时电流法(i-t)进行线性测试。传感器测试先预热约15min，每隔一定时间，向烧瓶中注入一定量高浓度的葡萄糖溶液，使烧瓶中的葡萄糖浓度从0-30mM连续上升，结果如图5和图6所示。附图5为实施例3的含有自组装传感层的传感器的线性图谱，附图6为对比例1的非自组装传感器线性图谱。由图5和图6所示，自组装传感器在浓度0-30mmol的葡萄糖溶液表现出优异的线性关系，而对比例1的非自组装传感器没有线性关系。
本申请对实施例1和实施例2进行上述相关测试，其结果与实施例3的结果大致相同。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施方式，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施方式。在不偏离所说明的各实施方式的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施方式的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施方式。

Claims (15)

1.一种自组装氧化还原聚合物，其特征在于，具有以下结构：
其中，R1和R2各自独立的表示连接键，且R1和R2相同或不同；
M表示过渡金属；
L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地表示配体，所述配体为杂环，并且通过所述杂环的杂原子与M配位结合；
X表示自组装基团；
Y表示阴离子，
a表示整数；b表示阴离子的个数，为自然数；其中，b>a+1；
n、m以及r表示自然数，且n、m以及r之和为20以上；
e、g以及f表示整数；
所述自组装基团选自取代基取代或未取代的如下基团中的一种：
其中，c和d是1-16的整数；
所述自组装基团的取代基选自苄溴基、苄氯基、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-COOH、-SO3H、-NH2、-OH、碳原子数为1-6的烷氧基或碳原子数为1-6的烷基中的一种。
2.根据权利要求1所述的自组装氧化还原聚合物，其特征在于，所述自组装氧化还原聚合物的切割分子量为1000Da以上。
3.一种根据权利要求1或2所述的自组装氧化还原聚合物的制备方法，其特征在于，包括在氧化还原聚合物上接枝自组装基团制备得到。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述接枝的方式包括亲电反应、亲核反应、缩合反应中的一种或两种以上的组合。
5.一种传感器，其特征在于，包括：柔性电极，所述柔性电极包括基材、工作电极、对电极以及参比电极，其中，
所述工作电极和所述对电极分别设置于所述基材的两侧，所述对电极的远离所述基材的一侧设置有电介质层；
所述工作电极的远离所述基材一侧设置所述参比电极，所述工作电极与所述参比电极之间设有电介质层，所述参比电极的远离所述工作电极的一侧设置有电介质层，并且，
所述工作电极的表面具有未设置电介质层和参比电极的裸露部，在所述裸露部的表面负载有自组装传感层，所述自组装传感层源自于权利要求1或2所述的自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶。
6.根据权利要求5所述的传感器，其特征在于，所述自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶的质量比为1:0.5至1:2。
7.根据权利要求5或6所述的传感器，其特征在于，所述柔性电极的表面具有阳离子聚合物。
8.根据权利要求7所述的传感器，其特征在于，所述阳离子聚合物的重均分子量为1000-50000Da。
9.根据权利要求5或6所述的传感器，其特征在于，在具有自组装传感层的柔性电极的表面还设置有限制扩散膜。
10.根据权利要求9所述的传感器，其特征在于，所述限制扩散膜源自于含氮杂环基团的聚合物和交联剂。
11.根据权利要求10所述的传感器，其特征在于，所述含氮杂环基团的聚合物经亲水基团修饰。
12.一种根据权利要求5-11任一项所述的传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备柔性电极的步骤，其中，所述柔性电极包括基材、工作电极、对电极以及参比电极；
将自组装传感层负载于所述工作电极的未设置电介质层和参比电极的裸露部的步骤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，将自组装氧化还原聚合物和氧化还原酶混合后，负载在所述工作电极的未设置电介质层和参比电极的裸露部的表面，得到具有所述自组装传感层的柔性电极。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，其特征在于，在负载所述自组装传感层之前，在所述柔性电极的表面，利用等离子体引发接枝阳离子聚合物，得到接枝阳离子聚合物的柔性电极。
15.根据权利要求12或13所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将含氮杂环基团的聚合物和交联剂在溶剂中混合后，浸涂在具有自组装传感层的柔性电极的表面，得到具有限制扩散膜的传感器。
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