CN115215919A

CN115215919A - Kokoonol的制备及其在制备治疗糖尿病药物中的应用

Info

Publication number: CN115215919A
Application number: CN202110421148.2A
Authority: CN
Inventors: 费冬青; 李冰; 张占欣; 崔文博
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2022-10-21

Abstract

本发明涉及α‑葡萄糖苷酶抑制剂技术领域。本发明提供了一种木栓烷型三萜kokoonol(其化学结构如式Ⅰ所示)的一种新应用，具体涉及kokoonol在制备治疗糖尿病的药物中的应用。本发明对从传统中药纹党参(素花党参Codonopsis pilosula var.modesta)中提取分离得到的化合物kokoonol测试了其对α‑葡萄糖苷酶的抑制活性，测试结果表明，kokoonol对α‑葡萄糖苷酶有显著的抑制活性，IC₅₀值为5.5±0.5μM，说明化合物具有潜在的治疗糖尿病活性，可用于制备治疗糖尿病药物，同时也可用于制备预防和辅助治疗糖尿病的药物。

Description

Kokoonol的制备及其在制备治疗糖尿病药物中的应用

一、技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种木栓烷型三萜kokoonol的制备及其应用，所述化合物可以被用于制备治疗糖尿病药物的应用，亦可用于制备预防以及辅助治疗糖尿病药物的应用。

二、背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由于胰岛素分泌绝对或相对不足，导致胰岛素作用低下；或因胰岛素分泌绝对不足与相对不足两者同时缺陷引起的以糖代谢紊乱为特征，继而引发脂肪、蛋白质、水、电解质代谢障碍的慢性代谢性疾病。近年来，由于生活水平的提高以及饮食结构的改变导致糖尿病的发病率逐年上升，糖尿病患者的数量也随之大量增加。国际糖尿病联合会IDF(International Diabetes Federation)全球糖尿病概览第9版发布的最新数据显示，2019年有4.63亿成人患有糖尿病，到2030年，全球糖尿病患者将达到5.78亿人，到2045年将跃升至7亿，故糖尿病的治疗已经成为全球性的重大公共健康问题。

糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(Insulin Dependent Diabetes Mellitus，IDDM)，非胰岛素依赖型糖尿病(Noinsulin Dependent Diabetes Mellitus，NIDDM)，妊娠糖尿病，以及其他一些特殊类型糖尿病。I型糖尿病与绝对的胰岛素分泌缺陷有关，II型糖尿病主要与胰岛素抵抗相关，可伴有不同程度的胰岛素分泌不足，II型糖尿病占糖尿病人数的95％以上，妊娠糖尿病多发生于妊娠的中晚期，且多见于肥胖和高龄产妇。此外，糖尿病的发病过程常伴随着许多并发症的产生，比如中风、肥胖、癌症以及心血管疾病等。有报道表明，餐后血糖状态是诊断糖尿病发展的重要因素，而II型糖尿病和代谢综合症发展风险增加与餐后血浆中高浓度的葡萄糖有关。因此，控制餐后高血糖成为了治疗糖尿病和减轻并发症的有效方法。其中抑制餐后高血糖的最有效方法之一是通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性来减少葡萄糖的生成。

α-葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶，它能催化水解芳基或烃基与糖基之间的α-糖苷键断裂，从而将二糖、多糖水解生成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在动物体内一般由小肠粘膜上皮细胞分泌产生，并附着于微绒毛上。通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可以延迟小肠对碳水化合物的吸收，从而降低餐后血糖和胰岛素水平。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂已被公认为是有效的二型糖尿病(type-Ⅱdiabetes，T2D)治疗剂。目前已研发上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂有：阿卡波糖Acarbose、伏格列波糖Voglibose、米格列醇Miglitol等。α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要来源于天然植物、微生物代谢产物以及化学合成三个方面。

纹党参(素花党参，Codonopsis pilosula var.modesta)是桔梗科(Campanulaceae)党参属植物，为2020版《中华人民共和国药典》规定的党参基源植物之一。其味甘，性平，归脾、肺经，具有补中益气、健脾益肺、养血生津的功效，临床上常用于脾肺气虚、食少倦怠、咳嗽虚喘、气血不足、面色萎黄、心悸气短、津伤口渴、内热消渴等症状。近年有研究表明，党参亦具有降血糖活性，可用于治疗糖尿病。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种具有药用价值的木栓烷型三萜化合物，包括其制备方法以及在制备预防、治疗以及辅助治疗糖尿病药物中的应用。

所述化合物和其药学上可接受的载体在制备治疗糖尿病药物的药物剂型应包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、凝胶剂、缓控释制剂、靶向制剂等，这是本领域技术人员可以理解的。

所述化合物和其药学上可接受的载体在制备预防以及辅助治疗糖尿病药物的药物剂型应包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、凝胶剂、缓控释制剂、靶向制剂等，这是本领域技术人员可以理解的。

本发明的化合物结构应如式(Ⅰ)所示：

所述化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤(1)：将甘肃省道地药材纹党参(素花党参Codonopsis pilosulavar.modesta)的干燥根粉碎，95％乙醇浸泡一周，纱布过滤提取滤液，重复浸泡提取三次，合并滤液减压浓缩后得到乙醇提取物。乙醇提取物溶解于蒸馏水中，并用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:1，得到乙酸乙酯提取物；

步骤(2)：将乙酸乙酯提取物使用硅胶(100-200目)色谱柱进行梯度洗脱，洗脱体系为石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，得到6部分样品Fr.1-Fr.6，取石油醚-丙酮(V/V)10:1部分得第三部分样品Fr.3；

步骤(3)：Fr.3部分经薄层色谱分析合并得到2个部分，取第1部分得Fr.3.1部分；将Fr.3.1部分使用硅胶(200-300目)色谱柱进行分离，以石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1为洗脱溶剂进行梯度洗脱，经薄层色谱分析合并得到Fr.3.1.2部分；Fr.3.1.2部分使用硅胶(200-300目)色谱柱分离，洗脱溶剂为石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1进行梯度洗脱，分离纯化得到化合物kokoonol。

本发明从纹党参中分离得到kokoonol，并对kokoonol进行α-葡萄糖苷酶抑制活性研究。研究结果表明：kokoonol对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC₅₀值为5.5±0.5μM，所以kokoonol有发展成为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜能，可用于制备治疗糖尿病药物，亦可用于制备预防以及辅助治疗糖尿病的药物。

四、附图说明

图1为化合物kokoonol的结构式。

图2为本发明所述化合物对于α-葡萄糖苷酶抑制活性实验结果图。

五、具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅只是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1：本发明所述化合物的制备方法

实验中所用到的纹党参采自甘肃省陇南市文县。

步骤(1)：将纹党参的干燥根粉碎，95％乙醇浸泡一周，纱布过滤提取滤液，重复浸泡提取三次，合并滤液减压浓缩后得到乙醇提取物。乙醇提取物溶解于蒸馏水中，并用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:1，得到乙酸乙酯提取物；

步骤(3)：Fr.3部分经薄层色谱分析合并得到2部分，取第1部分得Fr.3.1部分；将Fr.3.1部分使用硅胶(200-300目)色谱柱进行分离，以石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1为洗脱溶剂进行梯度洗脱，经薄层色谱分析合并得到Fr.3.1.2部分；Fr.3.1.2部分使用硅胶(200-300目)色谱柱分离，洗脱溶剂为石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1进行梯度洗脱，分离纯化得到化合物kokoonol。

实施例2实施例1化合物kokoonol的α-葡萄糖苷酶抑制活性实验

1、实验原理

以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)与α-葡萄糖苷酶反应生成PNG。PNG显黄色，具有紫外吸收能力，而α-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，使得α-葡萄糖苷酶活性降低，生成的PNG量降低。通过使用酶标仪测定405nm下得到的吸光度值(A)来确定被测组分的α-葡萄糖苷酶抑制活力。以PNPG为底物测定目标化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的大小。

2、溶液配制

(1)PBS溶液：NaH₂PO₄+Na₂HPO₄配成0.1M pH＝6.8的缓冲溶液；

(2)Na₂CO₃溶液：0.2M的Na₂CO₃溶液；

(3)底物PNPG：称取4.5mg的PNPG溶于1ml的PBS缓冲溶液中，浓度为15mM；

(4)α-葡萄糖苷酶溶液(0.4U/ml)：称取0.4Uα-葡萄糖苷酶溶于1ml的PBS溶液中，得到0.4U/ml酶溶液；

(5)目标化合物的配制：称取浓度为200μM的目标化合物溶于1ml的DMSO中用于初筛；若抑制率大于50％即可进行浓度梯度实验。

3、活性筛选实验

该实验在96孔板中进行，以阿卡波糖(Acarbose)作为阳性对照药物。实验包括空白对照孔Ab、空白反应孔At0、药物对照孔Abi、药物反应孔Ati四组。其中每组分别加入112μL的PBS溶液，之后对照孔组加入20μL的PBS溶液，反应孔组加入20μL的酶溶液；空白组加入8μL的DMSO溶液，药物组加入8μL的待测样品DMSO溶液。将加入以上溶液的孔板置于孵育器中37℃孵育15分钟。孵育完成后每组各个反应孔分别加入20μL的PNPG溶液并置于孵育器中37℃孵育30分钟。孵育完成后每组各个反应孔分别加入80μL的Na₂CO₃溶液以停止实验。将96孔板置于酶标仪测定在405nm下的吸光度值(A)，并计算抑制率。抑制率的计算公式：抑制率＝[1-(Ati-Abi)/(At0-Ab)]×100％

本实验共重复4次，分别为A，B，C，D四组平行实验。

样品应先进行初筛，初筛完成后再进行浓度梯度实验，使用GraphPad模拟曲线，并使用SPSS计算IC₅₀值。

4、实验结果

表1计算IC₅₀值

综合上述分析，kokoonol对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制活性，可用于制备治疗糖尿病的药物，亦可用于制备预防以及辅助治疗糖尿病的药物。

最后应说明的是：以上所述仅为本专利的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.该含木栓烷型三萜类化合物(以下简称目标化合物)的命名应为kokoonol，其结构如式(Ⅰ)所示：

。

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：

(1)将甘肃省道地药材纹党参(素花党参Codonopsis pilosula var.modesta)的干燥根粉碎，乙醇浸泡一周，纱布过滤提取滤液，重复浸泡提取三次，合并滤液减压浓缩后得到乙醇提取物；

(2)将步骤(1)得到的乙醇提取物溶解于蒸馏水中，并用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:1，得到乙酸乙酯提取物；

(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯提取物使用硅胶(100-200目)色谱柱进行梯度洗脱，洗脱体系为石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，得到6部分样品Fr.1-Fr.6，取石油醚-丙酮(V/V)10:1部分得第三部分样品Fr.3；

(4)Fr.3部分经薄层色谱分析合并得到2个部分，取第1部分得Fr.3.1部分；

(5)Fr.3.1部分使用硅胶(200-300目)色谱柱进行分离，以石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1为洗脱溶剂进行梯度洗脱，经薄层色谱分析合并得到Fr.3.1.2部分；

(6)Fr.3.1.2部分使用硅胶(200-300目)色谱层析分离，洗脱溶剂为石油醚-丙酮(V/V)40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1进行梯度洗脱，分离纯化得到化合物kokoonol。

3.如权利要求2所述的化合物的制备方法：其特征在于，所述步骤(1)中所使用的乙醇浓度应为95％。

4.如权利要求1所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。

5.如权利要求4所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于所述的治疗糖尿病药物应为抑制α-葡萄糖苷酶活性药物。

6.如权利要求4所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述的药物剂型应包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、凝胶剂、缓控释制剂、靶向制剂等。

7.如权利要求1所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备预防以及辅助治疗糖尿病的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备预防以及辅助治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于所述的治疗糖尿病药物应为抑制α-葡萄糖苷酶活性药物。

9.如权利要求7所述的化合物和其药学上可接受的载体在制备预防以及辅助治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述的药物剂型应包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、凝胶剂、缓控释制剂、靶向制剂等。