CN115192584A - 一种纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米药物及其制备方法和应用，本发明提供的纳米药物，包括金属基体和修饰金属基体的有机配体，有机配体和金属基体发生协同作用，能够有效抑制冠状病毒的增殖，并杀死冠状病毒。上述纳米药物在制备治疗冠状病毒的药物中具有较好的前景。本发明还提供了上述纳米药物的制备方法和应用。

Description

一种纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属，曾经引起过疫情的冠状病毒包括SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome)、MERS-CoV(Middle East Respiratory Syndrome)以及SARS-CoV-2(曾用名2019-nCoV，可引起新冠肺炎)。冠状病毒分布广泛、变异快、传染性强、遗传多样性大，在频繁的跨物种传播过程中，可能会不断发生变异，或可能在人类中周期性出现。就以上几种病毒引起的疫情来看，由冠状病毒引发的新发、突发病毒感染可能是一种新型生物威胁。
在过去的几十年中，有很多药物被发现具有抗病毒活性并被应用到冠状病毒的临床治疗中。然而，一些药物在表现出抗病毒能力的同时会对人类或动物产生一定的毒副作用，此外，当患者需长期用药或病毒传播流行时间较长时，人体内会出现耐药性。
因此，开发具有安全性、高活性和广谱性的抗冠状病毒药物，对于目前的新冠肺炎和未来可能出现的冠状病毒病的防治具有重要理论意义和临床应用价值。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种纳米药物，能够有效抑制冠状病毒的增殖，并杀死冠状病毒。
本发明还提供了上述纳米药物的制备方法。
本发明还提供了上述纳米药物的应用。
根据本发明的第一方面实施例，提供了一种纳米药物，所述纳米药物包括金属基体和修饰所述金属基体的有机配体；
所述有机配体选自式(1)至式(12)所示化合物中的至少一种：
Figure BDA0003686450640000021
根据本发明实施例的纳米药物，至少具有如下有益效果：
(1)纳米药物已成为人类抗击疾病的重要工具，在药物载体递送、病原检测、癌症治疗和杀毒杀菌等方面也已经被研究。针对冠状病毒感染，例如SARS-CoV-2等，虽然纳米药物在感染防护方面已经取得了一定的进展，但目前没有治疗性纳米药物可以直接对冠状病毒感染引发的疾病进行治疗。
本发明提供的纳米药物，可通过多机制、多途径对冠状病毒进行作用。在直接与冠状病毒的相互作用时，纳米药物可对病毒的磷脂双分子层进行物理性破坏，从而对病毒进行直接杀灭；在病毒的细胞内复制阶段，可通过结合冠状病毒的3CL蛋白酶和RdRp酶等发挥抗病毒效果。上述作用机制具有广谱性，不受冠状病毒变异而发生性能降低。且本发明提供的纳米药物对正常细胞的破坏程度较低，具有较高的安全性。
也就是说，本发明提供的纳米药物针对冠状病毒兼具防护和治疗的作用，且对冠状病毒的作用具有广谱性和安全性。
具体的，本发明提供的纳米药物，针对冠状病毒，在体外模型中，其EC50(concentration for 50％of maximal effect)值低至1.19μM。在动物体内的模型中，也可显著降低病毒滴度。
(2)本发明提供的纳米药物，金属基体和有机配体之间相互作用，具体的金属基体是有机配体的载体，有机配体可一定程度上钝化金属基体，使其稳定存在，发明人研究表明，若缺少了有机配体，则无法制备出稳定的纳米药物。
根据本发明的一些实施例，当所述有机配体包括式(8)所示化合物时，式(8)所示化合物的构型为左旋构型(L-form)和右旋构型(D-form)中的至少一种。
与右旋结构相比，式(8)所示化合物的左旋构型化合物与金属基体结合后，对冠状病毒的抑制性更好。
根据本发明的一些优选的实施例，所述有机配体选自式(1)、式(7)、式(8)、式(9)、式(11)和式(12)所示化合物中的至少一种。
根据本发明的一些优选的实施例，所述有机配体选自式(1)所示化合物(4,6-二氨基-2-巯基嘧啶)。
根据本发明的一些优选的实施例，所述有机配体选自式(10)所示化合物。
根据本发明的一些优选的实施例，所述有机配体选自式(5)或式(6)所示化合物。
根据本发明的一些进一步优选的实施例，所述有机配体选自式(8)(谷胱甘肽)和式(9)(N,N,N-三甲基-(11-巯基十一烷基)氯化铵)所示的化合物。
根据本发明的一些实施例，所述金属基体的材质包括金、铜和铁中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述金属基体的材质为金。根据本发明的一些实施例，所述纳米药物的粒径为0.1～15nm。
根据本发明的一些优选的实施例，所述纳米药物的粒径为1～6nm。
由此可知，所述金属基体为纳米颗粒和纳米团簇中的至少一种。
所述纳米团簇的粒径通常≤5nm，是由几个到几百个金属原子聚集而成的超小金属纳米粒子，纳米颗粒的粒径则＞5nm，与纳米颗粒相比，纳米团簇的活性更高，制得的纳米药物性能更优。
根据本发明的一些实施例，所述纳米药物的粒径为1～10nm。
根据本发明的一些实施例，所述纳米药物包括金纳米团簇基体，以及修饰所述金纳米团簇基体的有机配体，所述有机配体包括N,N,N-三甲基-(11-巯基十一烷基)氯化铵和左旋型谷胱甘肽。
根据本发明的第二方面实施例，提供了一种上述纳米药物的制备方法，所述制备方法包括将含有金属源和所述有机配体的分散液反应后纯化。
所述纳米药物的制备方法中，发生的反应机理是：有机配体同时作为配体和还原剂，将金属源中的金属还原为单质，同时和单质原子发生配位，形成稳定的连接。
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：
本发明提供的制备方法简单、过程容易控制，容易实现大批量生产。
根据本发明的一些实施例，所述金属源包括氯金酸。
根据本发明的一些实施例，所述分散液中，所述金属源的浓度为5～10mM。
根据本发明的一些优选实施例，所述分散液中，所述金属源的浓度为7～8mM。
根据本发明的一些实施例，所述分散液中，所述有机配体的浓度为10～50mM。
根据本发明的一些优选的实施例，所述分散液中，所述有机配体的浓度为20～40mM。
根据本发明的一些优选的实施例，所述分散液中，所述金属源为氯金酸，所述有机配体为式(1)至式(12)所示化合物中的至少一种。
根据本发明的一些优选的实施例，所述分散液中，所述金属源为氯金酸，所述有机配体为式(8)所示化合物的左旋化合物和式(9)所示化合物。
根据本发明的一些优选的实施例，所述分散液中，所述氯金酸、式(8)所示化合物的左旋化合物和式(9)所示化合物的摩尔比为(0.5～4):(0.5～4):1。根据本发明的一些实施例，所述分散液的分散剂为水。
由此本发明提供的制备方法不涉及有机溶剂，更不涉及后续有机溶剂的去除等后处理阶段。
根据本发明的一些实施例，所述分散液的制备方法包括：将所述有机配体在溶剂中升温分散后，向其中加入所述金属源。
根据本发明的一些实施例，所述升温分散的方法为搅拌，所述搅拌的转速为500～800rpm。
根据本发明的一些优选的实施例，所述升温分散的方法为搅拌，所述搅拌的转速约为600rpm。
根据本发明的一些实施例，所述升温分散的终点温度为50～95℃。
根据本发明的一些优选的实施例，所述升温分散的终点温度约为70℃。
根据本发明的一些实施例，所述反应的温度为0～95℃。
根据本发明的一些优选的实施例，所述反应为加热反应。
根据本发明的一些实施例，所述加热反应的温度为50～95℃。
根据本发明的一些实施例，所述加热反应的温度为60～90℃。
根据本发明的一些实施例，所述加热反应的温度约为70℃。
根据本发明的一些实施例，所述反应在搅拌状态下进行，所述搅拌状态的转速为800～1200rpm。
根据本发明的一些优选的实施例，所述反应的在搅拌状态下进行，所述搅拌状态的转速约为1000rpm。
根据本发明的一些实施例，所述反应的时长为18～24h。
根据本发明的一些实施例，所述反应的时长约为24h。
根据本发明的一些实施例，所述纯化的方法包括使用纯水透析。
根据本发明的一些实施例，所述透析所用透析膜的规格为3500Da。
根据本发明的一些实施例，所述制备方法还包括在所述纯化后，将所得纳米药物的分散液进行浓缩和保存。
根据本发明的一些实施例，所述浓缩后，所得分散液中所述纳米药物的浓度为1000～2000μg/mL。
根据本发明的一些实施例，所述保存的温度约为4℃。
根据本发明的一些实施例，所述保存的形式包括以细胞培养基、PBS(磷酸盐平衡生理盐水)、葡萄糖注射液或生理盐水为稀释剂，将所述浓缩后的分散液稀释至工作浓度。
根据本发明的第三方面实施例，提供了一种上述纳米药物在制备抗冠状病毒药物中的应用。
由于上述纳米药物对体内、体外冠状病毒均有较为优异的抑制、杀灭作用，由此可知由其制备得到的抗冠状病毒药物对冠状病毒引起的疾病具有较好的预防、治疗作用。
根据本发明的一些实施例，所述冠状病毒包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV和GX_P2V(分离自穿山甲)中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2变异株B.1.617.2和B.1.1.529中的至少一种。
若无其他特殊说明，本发明中的“约”表示允许误差在±2％之间，例如约100实际表示98～102。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例1所得纳米药物的zeta电位测试结果；
图2是本发明实施例1所得纳米药物的粒径测试结果；
图3是本发明实施例1所得纳米药物的EDS图谱和HAADF图像；
图4是本发明测试例1～2测得的纳米药物对冠状病毒的抑制性结果以及其对正常细胞的毒性结果；
图5是本发明测试例1～2测得的瑞的西韦对冠状病毒的一致性结果以及其对正常细胞的毒性结果；
图6是本发明测试例3测得的纳米药物和瑞德西韦对小鼠肺部抗病毒效果；
图7是本发明测试例3测得的纳米药物和瑞德西韦对小鼠气管抗病毒效果；
图8是本发明实施例1～21所得纳米药物对冠状病毒的抑制结果。
图9是本发明实施例1所得纳米药物对冠状病毒3CL蛋白酶的活性抑制曲线。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
若无特殊说明，具体实施方式中所用所有试验材料均来自商购，且使用前未经任何预处理。
实施例1
本实施例制备了一种纳米药物，具体过程如下：
S1.配置浓度为25mM的N,N,N-三甲基-(11-巯基十一烷基)氯化铵(左旋构型)水溶液；
配置浓度为100mM的谷胱甘肽的水溶液；
S2.将步骤S1所得N,N,N-三甲基-(11-巯基十一烷基)氯化铵水溶液和谷胱甘肽的水溶液按照4:1的体积比混合，加热至70℃，加热过程中以600rpm的转速搅拌；温度达到70℃后进行下一步试验。
本步骤的反应容器可根据反应的量以及试验条件进行调整，本实施例中，反应容器可以是圆底烧瓶；
本步骤的加热方法可以根据反应容器和设备条件进行调整，本实施例中，加热方法可以是油浴加热；
S3.向步骤S2所得混合溶液(2.5mL)中加入1mL氯金酸溶液母液(浓度为25mM)，将搅拌速度提升至1000rpm开始反应，反应时间持续24h；
S4.步骤S3的反应结束后，将圆底烧瓶从油浴中拿出，冷却后使用超纯水透析纯化；
S5.透析结束后，对抗病毒团簇水溶液进行无菌和超滤浓缩处理，终浓度为1000μg/mL之间，置于4℃保存备用。
采用zeta电位分析仪测试本实施例所得纳米药物的粒径，电位结果如图1所示，对应的粒径结果如图2所示。结果显示，纳米药物zeta电位的峰值为14.7±2.72mV，即所得纳米药物(胶体粒子)呈现一定的正电性；粒径主要集中在4.79±0.43nm附近。说明本发明制备得到的纳米药物确实具有纳米尺寸。
采用EDS(能谱)表征了本实施例所得纳米药物的元素分布，结果如图3所示，图3中HAADF表示高角环形暗场像-扫描透射电子像，overlay展示了金元素分布和硫元素分布，Au展示了金元素分布，S展示了硫元素分布。结果显示：
本实施例所得纳米药物确实具有1～5nm的尺寸；且图谱显示，金元素的分布和硫元素的分布具有相似的区域性，而硫元素来源于有机配体，加之表征之前纳米药物已经经过了纯化处理，由此说明，本实施例制备的纳米药物中，有机配体和金纳米簇之间确实发生了结合。
为了验证不同种金属源和有机配体的组合所得的纳米药物对冠状病毒的性能，本发明设置了实施例2～13，具体如下：
实施例2～13与实施例1的区别在于：
金属源和有机配体的组成不同，具体组成如表1所示：
表1实施例1～13中，有机配体和金属源的组成(比例为物质的量之比)
Figure BDA0003686450640000071
Figure BDA0003686450640000081
表1中，各有机配体的信息如下：
式(1)所示化合物的CAS号为：1004-39-3；
式(2)所示化合物的CAS号为：657-24-9；
式(3)所示化合物的CAS号为：7134-41-0；
式(4)所示化合物的CAS号为：2935-90-2；
式(5)所示化合物的CAS号为：123-30-8；
式(6)所示化合物的CAS号为：645-96-5；
式(7)所示化合物的CAS号为：5192-03-0；
式(8)所示化合物的CAS号为：70-18-8；
式(9)所示化合物的CAS号为：225790-17-0；
式(10)所示化合物的CAS号为：49594-30-1；
式(11)和式(12)所示的化合物参考文献Chem.Sci.2021,12,14871-14882中化合物13和14的制备方法合成。
测试例1
本测试例以Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞系)模拟宿主细胞，验证了实施例1所得纳米药物对冠状病毒GX_P2V(来源于北京化工大学生命学院)的体外抑制性。
由于新冠病毒(SARS-CoV-2)传染性和致病性强，只能在生物安全3级(BSL-3)及以上实验室开展相关研究工作，但生物安全3级实验室数量少、操作规程繁琐，大大限制了大规模药物筛选的进度。从穿山甲身上提取的冠状病毒GX_P2V，经高通量测序及后续分析，发现与新冠病毒存在很高的同源性，全基因组同源性为85.94％、刺突蛋白(S)同源性为92.2％。S蛋白是新冠病毒入侵宿主细胞重要的结构蛋白。这是目前成功分离培养的与新冠病毒同源性最高的冠状病毒。研究表明，GX_P2V与新冠病毒一样均利用血管紧张素转化酶2(ACE2)作为入胞受体，ACE2是新冠病毒感染细胞的受体，可以识别S蛋白。此外，目前尚无发现GX_P2V对人具有致病性，可在常规BSL-2实验室培养。为验证GX_P2V替代新冠病毒作为新型的药物筛选模型的有效性，使用已被广泛报道在体外具有抗新冠病毒活性的药物如Remdesivir、Chloroquine、Hydroxychloroquine、Nefinavir、Lopinavir等进行抗GX_P2V测试，结果显示，这些药物的抗GX_P2V活性与抗新冠病毒活性高度一致。证明了GX_P2V作为药物筛选替代模型的有效性，表明GX_P2V是一种理想的抗新冠病毒药物筛选替代模型。也就是说，本测试例以GX_P2V毒株进行试验，至少可验证实施例1所得纳米药物对GX_P2V和SARS-CoV-2两种病毒的作用。
具体测试方法的步骤为：
D1.孵育：将Vero E6细胞接种于96孔板，接种后培养至单层贴壁细胞密度长至80％以上，向每个孔板中添加GX_P2V(MOI＝0.01)50μL，和不同浓度的纳米药物分散液50μL，孵育2h后吸出，用PBS温和洗涤所得细胞1遍；
添加纳米药物分散液后，孵育培养基中纳米药物分散液的浓度分别是0.047μM、0.094μM、0.188μM、0.375μM、0.750μM、1.5μM、3.0μM、6.0μM和12.0μM，每个浓度设置两个重复；
在本步骤的孵育过程中，纳米药物和病毒既会在宿主细胞之外发挥相互作用，也会在宿主细胞内发挥相互作用；考察了病毒感染宿主细胞的过程中，纳米药物的整体作用。
D2.设置实验组：将步骤D1孵育的洗涤得到的细胞添加含相同浓度梯度的纳米药物的培养基中，并放入37℃，5％CO2细胞培养箱；培养48h后，收集细胞上清和贴壁细胞进行RT-qPCR分析；
其中培养基中纳米药物的具体浓度和步骤D1中的浓度相同：每个纳米药物的浓度进行两个平行试验；
培养基除含上述纳米药物外，还含10％FBS和1％Antibiotic-Antimycotic(真菌抗生素)。
设置阳性对照组A：和试验组的区别在于，培养基中不含有纳米药物；
设置阳性对照组B，和实验组的区别在于，将培养基中的纳米药物替换为瑞的西韦，瑞的西韦的浓度为；0.20μM、0.40μM、0.8μM、1.6μM、3.2μM、6.4μM、12.5μM、50μM和100μM。
本步骤中，RT-qPCR测试的是病毒的基因拷贝数，测试过程中采用的引物序列为：
GAPDH-F,5’-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3’(SEQ ID NO.1)，
GAPDH-R,5’-ATGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3’(SEQ ID NO.2)；
GX_P2V-F,5’-GGTGATTGCCTTGGTGATATTG-3’(SEQ ID NO.3)，
GX_P2V-R,5’-GCAAGTAGTGCAGAAGTGTATTG-3’(SEQ ID NO.3)。
D3.计算(1-实验组病毒含量/阳性对照组A病毒含量)×100％的数值，并以此为基准拟合得到EC50值。
实施例1所得纳米药物的测试结果如图4和表2所示。结果显示实施例1所得的纳米药物对GX_P2V病毒的EC50抑制率约为1.19μM(利用X射线光电子能谱技术和核磁共振技术证明，实施例1中纳米药物中，每个微粒含金原子42个，式(8)所示配体39个，式(9)所示配体16个，分子质量(微粒质量)约为25kDa)；即在体外实验中，本发明提供的纳米药物对冠状病毒显示出了优异的抑制性。
阳性对照组B中瑞德西韦的测试结果如图5所示(横坐标为瑞德西韦浓度以10为底的对数值)。测试结果显示，在Vero E6细胞和GX_P2V的体系中，瑞的西韦的EC50值为1.01μM，与本发明提供的纳米药物的效果相当。
测试例2
本测试例测试了实施例1所得纳米药物对Vero E6细胞的毒性，并计算得到了半数细胞毒性(CC50)，具体测试方法为：
A1.在96孔板中接种Vero E6细胞，直至单层贴壁细胞密度长至80％左右时开始实验；
A2.将含有纳米药物的培养基添加至步骤A1所得的96孔板中，每孔100μL；随后放入37℃，5％CO2细胞培养箱继续培养48h，以CellTiter-Blue法检测细胞活力。每孔加20μL刃天青细胞染料，每隔30min用多功能读板仪测定细胞在570nm处的吸光度(OD实验组)。细胞毒性的计算公式如下：细胞致死率(％)＝1-(OD实验组/ODcontrol)×100％。并拟合得到CC50。本测试例中，细胞致死率也称抑制率。
其中ODcontrol为空白对照组细胞在570nm处的吸光度，空白对照组中既不添加纳米药物，也不添加瑞的西韦。
同时设置瑞德西韦对照组，具体与纳米药物组的区别在于，添加的100μL培养基中，不含有纳米药物，而是含有瑞德西韦。
添加含有纳米药物的培养基后，所得培养体系中纳米药物和瑞的西韦的浓度分别于测试例1中相同。且每个浓度同步进行3个平行试验。
本测试例所得的细胞毒性的结果如图4～5、和表2～3所示，结果显示：实施例1中所制备的纳米药物对Vero E6的CC50值＞12μM，表现出极低的细胞毒性。该结果趋势与图5显示的瑞的西韦的细胞毒性趋势相同。
结合测试例1的结果可知，本发明制备得到的纳米药物在Vero E6和GX_P2V体系中，表现出优异的抗冠状病毒性能和极低的细胞毒性。
表2实施例1所得纳米药物对冠状病毒的抑制结果以及对正常细胞的毒性结果
Figure BDA0003686450640000111
表2中SD表示标准差。
表3瑞德西韦对冠状病毒的抑制结果以及对正常细胞的毒性结果
浓度μM 抑制率％ 细胞毒性％
0.20 -0.85 -11.94
0.39 17.05 -17.59
0.78 47.76 -7.96
1.56 39.25 -4.6
3.13 74.05 -0.85
6.25 97.76 3.48
12.5 99.97 5.21
25 100 9.62
50 99.98 13.63
100 99.99 32.99
测试例3
本测试例测试了实施例1所得纳米药物在动物体内的抗冠状病毒效果，具体方法为：
B1.动物造模：采用叙利亚金黄地鼠作为模式动物，以冠状病毒GX_P2V作为模式病毒；
每只金黄地鼠用50μL GX_P2V(终滴度为2×105PFU/mL)进行滴鼻感染；
B2.实验组：按照3.2mg/kg的给药浓度(金元素的质量和模式动物体重之比)，对步骤B1所得叙利亚金黄地鼠进行连续腹腔给药4天；所给药物为实施例1所得纳米药物；
对照组：将试验组的纳米药物替换为瑞德西韦，给药浓度为15mg/kg(用于黄金地鼠上时，瑞的西韦的标准浓度)；
B3.将步骤B2所得叙利亚金黄地鼠处以安乐死，解剖取肺脏及气管，经冷冻研磨仪研磨后提取总RNA，随后进行逆转录及RT-qPCR检测，从而测定实施例1所得纳米药物对冠状病毒的体内作用效果。
其中肺脏中病毒复制数的结果如图6所示，气管中病毒的复制数如图7所示。
图6～7的结果说明，实施例1中所制备的纳米药物在金黄地鼠模型中能有效降低冠状病毒在肺部及气管的病毒滴度，其中肺部可降低约2～3个数量级，气管中降低0.5～1.5个数量级，说明本发明制备得到的纳米药物具有良好的体内抗冠状病毒效果。
综合测试例1～3可知，本发明提供的纳米药物，在体内外抗冠状病毒效果均非常优异，在制备治疗冠状病毒感染疾病的药物中具有较好的前景。
测试例4
本测试例测试了实施例1所得纳米药物对冠状病毒3CL蛋白酶的活性抑制情况。
测试方法为：荧光共振能量转移(FRET)法检测小分子对3CLpro细胞外蛋白酶切活性的影响，具体为：
实验材料与仪器：
荧光底物Dabcyl-KNSTLQSGLRKE-Edans:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
荧光底物母液：用高压灭菌的缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.4,120mM NaCl)配制，终浓度为100μM。分装成小份，冻存于-20℃备用；
纳米药物母液：用100％DMSO配制，终浓度为100mM，4℃保存备用；
HBS-EP工作缓冲液(10mM Hepes,150mM NaCl,3mM EDTA和0.005％(v/v)surfactant P20,pH7.4)；
酶标仪(MD公司)；
化合物抑制2019新型冠状病毒3CL蛋白酶的IC50测定：
将纳米药物母液稀释，取各浓度溶液1.2ul，分别与120ul的2μM 3CL蛋白酶充分混合(DMSO的终浓度为0.5％)，在4℃孵育2小时。然后取各浓度样品100ul加到96孔板中，再分别加入100ul 20μM的荧光底物溶液开始反应，此时3CL蛋白酶的终浓度为1μM，荧光底物的终浓度为10μM，纳米药物的终浓度分别为24μM、12μM、6,3μM、1.5μM、0.3μM、0.15μM、0.03μM、0.015μM、0.003μM、0.0015μM和0.0003μM。以340nm波长的光激发，检测发射波长为488nm下的荧光值变化，反应连续测定1h，完成化合物对新冠病毒3CL蛋白酶抑制作用的测定。测定化合物IC50值时设定空白对照，即不加纳米药物，但加相同浓度DMSO的3CL蛋白酶样品以及单独荧光底物溶液的样品。每个样品设复孔，测定值取平均。根据不同浓度化合物存在条件下，新冠病毒3CL蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与空白对照的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率(以含0.5％DMSO条件下的酶活性为100％，抑制率＝100％-不同纳米药物浓度下的酶的相对活性×100％，相对活性为不同浓度纳米药物对应的酶活性与空白对照酶活性的比值)。根据Logistic公式用origin软件进行非线性拟合计算化合物对3CL蛋白酶活性抑制的IC50值。
测试结果如图9所示。
结果显示随着纳米药物添加量的提升，冠状病毒3CL蛋白酶的活性被显著抑制。由此说明，本发明提供的纳米药物可通过结合冠状病毒的3CL蛋白酶发挥抗病毒效果。
测试例5
本测试例测试了实施例1～13所得纳米药物对冠状病毒的抑制性能，具体测试方法为：
D1.孵育：将Vero E6细胞接种于96孔板，接种后培养至单层贴壁细胞密度长至80％以上，向每个孔板中添加GX_P2V(MOI＝0.01)，和实施例1-13(终浓度为25ug/mL，按金的质量浓度计)，设置3个重复；
D2.96孔板放入37℃，5％CO2细胞培养箱；培养48h后，收集细胞上清和贴壁细胞进行RT-qPCR分析，计算不同药物处理时的GX_P2V/GAPDH的mRNA相对含量(实验组数值与内标的比值，除以照组与内标的比值)。RT-qPCR分析所用引物探针和测试例1相同。
对照组为步骤D2中均不添加纳米药物的组别。
测试结果如图8所示，图8中，横坐标为有机配体结构式的编号，从左到右依次对照实施例2～9、实施例1、实施例10～13；结果显示：当有机配体的种类发生变化时，本发明提供的纳米药物，对冠状病毒均有较为优异的抑制性能。
由此说明，本发明提供的纳米药物，对冠状病毒均有一定的抑制性能，在制备治疗冠状病毒感染疾病的药物中具有较好的前景。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 南方科技大学
北京化工大学
<120> 一种纳米药物及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcctcaaga tcatcagcaa tg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggactgtg gtcatgagtc ctt 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgattgcc ttggtgatat tg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaagtagtg cagaagtgta ttg 23

Claims (10)

1.一种纳米药物，其特征在于，所述纳米药物包括金属基体和修饰所述金属基体的有机配体；
所述有机配体选自式(1)至式(12)所示化合物中的至少一种：
Figure FDA0003686450630000011
2.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，当所述有机配体包括式(8)所示化合物时，式(8)所示化合物的构型为左旋构型和右旋构型中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述有机配体选自式(1)、式(7)、式(8)、式(9)、式(11)和式(12)所示化合物中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述金属基体的材质包括金、铜和铁中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的纳米药物，其特征在于，所述金属基体的材质为金。
6.根据权利要求1～5任一项所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的粒径为0.1～15nm。
7.一种如权利要求1～6任一项所述纳米药物的制备方法，其特征在于，包括将含有金属源和所述有机配体的分散液反应后纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为0～95℃。
9.一种如权利要求1～6任一项所述纳米药物在制备抗冠状病毒药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV和GX_P2V中的至少一种。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101443357A (zh) * 2005-08-12 2009-05-27 先灵公司 Mcp1融合物
CN101932571A (zh) * 2008-01-18 2010-12-29 奥克萨根有限公司 具有crth2拮抗活性的化合物
US20110300532A1 (en) * 2009-03-05 2011-12-08 Wilhelm Jahnen-Dechent Control of the toxicity of gold nanoparticles
CN107105672A (zh) * 2014-09-23 2017-08-29 阿托斯塔特公司 抗微生物组合物和方法
CN110215522A (zh) * 2019-06-13 2019-09-10 南方科技大学 一种CRISPR/Cas9递送***及其制备方法和应用
CN110935030A (zh) * 2019-11-13 2020-03-31 南方科技大学 金纳米簇及其制备方法和应用
WO2021222541A1 (en) * 2020-04-29 2021-11-04 The University Of Massachusetts Metal compositions and methods of use thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101443357A (zh) * 2005-08-12 2009-05-27 先灵公司 Mcp1融合物
CN101932571A (zh) * 2008-01-18 2010-12-29 奥克萨根有限公司 具有crth2拮抗活性的化合物
US20110300532A1 (en) * 2009-03-05 2011-12-08 Wilhelm Jahnen-Dechent Control of the toxicity of gold nanoparticles
CN107105672A (zh) * 2014-09-23 2017-08-29 阿托斯塔特公司 抗微生物组合物和方法
CN110215522A (zh) * 2019-06-13 2019-09-10 南方科技大学 一种CRISPR/Cas9递送***及其制备方法和应用
CN110935030A (zh) * 2019-11-13 2020-03-31 南方科技大学 金纳米簇及其制备方法和应用
WO2021222541A1 (en) * 2020-04-29 2021-11-04 The University Of Massachusetts Metal compositions and methods of use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAO等: "Molecules inhibit the enzyme activity of 3-chymotrypsin-like cysteine protease of SARS-CoV-2 virus the experimental and theory studies", BIORXIV, pages 3 - 4 *
XIE等: "Functionalized Gold Nanoclusters Identify Highly Reactive Oxygen Species in Living Organisms", ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS, vol. 28, no. 14, pages 1 - 7 *

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