CN115192563B - C3a/C3aR通路拮抗剂治疗原发性膜性肾病的用途 - Google Patents
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Abstract
提供了C3a/C3aR通路拮抗剂治疗原发性膜性肾病的用途。本发明涉及C3a/C3aR通路拮抗剂在制备用于治疗受试者中的膜性肾病的药物中的用途。C3aR拮抗剂可以选自下组:N2‑[(2,2‑联苯基乙氧基)乙酰基]‑L‑精氨酸、5‑(二(4‑氯苯基)甲基)‑3‑甲基噻吩‑2‑羰基)‑l‑精氨酸或其药学上可接受的盐。本发明具有副作用少、对其他脏器有保护作用、无过敏反应等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体地涉及C3a/C3aR通路拮抗剂治疗原发性膜性肾病的用途。
背景技术
原发性膜性肾病(Primary membranous nephropathy,PMN)是自身免疫性肾小球疾病,是成人肾病综合征最常见的病因,其发病率为每年约2000/100万,且呈逐年攀增趋势。在我国,由于环境污染等原因,其发病率增长更为迅速,可到达每年增加13%。PMN主要累及中老年人,平均发病年龄50-60岁,男性占比2/3。未经治疗的情况下,约有30-40%患者最终将进展至终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD),需要接受肾脏替代治疗或肾移植治疗。目前KIDGO指南推荐利妥昔单抗(CD20单抗)、钙调神经蛋白抑制剂(calcineurin inhibitor,CNI)类药物和环磷酰胺作为一线用药。现有的一线治疗药物,由于其抑制免疫的作用谱较宽,导致其在发挥疗效的同时具有较多副作用,CD20单抗易产生过敏反应、因抑制B细胞而造成免疫缺乏导致患者感染风险显著增大,CNI和环磷酰胺有感染风险增大、骨髓抑制、肝肾毒性等不良反应。PMN的病理特征是肾小球毛细血管壁上皮下区域免疫复合物沉积。
C3a是补体***中重要的组成部分,作为一种过敏毒素,其与受体结合后在不同病理状态下在不同细胞中可分别发生促炎或抗炎的作用。补体通路是免疫治疗中至关重要的一环,关于干预补体通路的药物的研究方兴未艾,前景广阔。但是,尽管目前有大量关于抗C5、C5a、C5aR1药物的临床试验,C5单抗(Eculizumab)和C5aR1拮抗剂(Anacopan)已批准临床应用,但针对C3的临床试验较少,且大多处于I期,并且没有针对C3a或C3aR的临床试验注册。近些来,越来越多研究表明,C3a/C3aR通路可能在各种肾脏疾病中具有显著作用。
使用蛇毒因子阻断补体导致大鼠无法被诱导出海曼肾炎,因此补体活化在其发病机制中是必要条件。补体层级反应的效应因子包括膜攻击复合物(Membrane attackcomplex,MAC)、C3a和C5a。在足细胞中,免疫复合物中的抗体激活补体***的级联反应,最终产生MAC。既往研究认为MAC是导致肾损伤的必要分子,其通过诱导足细胞的亚溶解损伤,破坏肾小球滤过屏障,造成蛋白尿。然而,在补体C6缺乏的大鼠中抑制MAC的形成并不能完全阻碍PMN大鼠产生蛋白尿,这表明足细胞损伤存在其他非MAC独立的机制。
鉴于现有治疗药物的不足,本领域中仍然需要治疗原发性膜性肾病的药物。
发明内容
发明人对临床数据进行了分析,发现C3a及C3aR与PMN临床表现和预后存在相关性,认为C3a/C3aR通路的激活在PMN中具有致病作用,如本发明通过体外足细胞实验和体内海曼肾炎大鼠模型证实。此外,本发明人还证明了C3aR拮抗剂SB290157和JR14a可通过阻断C3a/C3aR通路达到减轻PMN大鼠疾病严重程度的效果。目前C3aR拮抗剂SB290157和JR14a已广泛应用于体内、体外实验中,其对C3aR的拮抗作用稳定,且在动物实验中尚未出现严重的致死性不良反应。因此,发明人的研究表明可通过C3aR拮抗剂干预C3a/C3aR通路治疗PMN。
在一方面,本发明提供了C3a/C3aR通路拮抗剂或包含C3a/C3aR通路拮抗剂的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者中的膜性肾病的药物中的用途。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的膜性肾病的方法,其包括对受试者施用C3a/C3aR通路拮抗剂或包含C3a/C3aR通路拮抗剂的药物组合物。
在上述方面的一个实施方案中,C3a/C3aR通路拮抗剂是C3aR拮抗剂。
在上述方面的一个实施方案中,C3aR拮抗剂选自下组:N2-[(2,2-联苯基乙氧基)乙酰基]-L-精氨酸、5-(二(4-氯苯基)甲基)-3-甲基噻吩-2-羰基)-l-精氨酸或其药学上可接受的盐。
在上述方面的一个实施方案中,C3aR拮抗剂是N2-[(2,2-联苯基乙氧基)乙酰基]-L-精氨酸三氟乙酸盐。
在上述方面的一个实施方案中,药物为口服或胃肠外用的药物。
在上述方面的一个实施方案中,胃肠外用的药物是皮下、皮内、静脉内、肌内、动脉内或输注施用的药物。
在上述方面的一个实施方案中,受试者是人或哺乳动物。在一个实施方案中,哺乳动物是啮齿类,诸如大鼠。
在上述方面的一个实施方案中,膜性肾病是原发性膜性肾病。
在上述方面的一个实施方案中,药物组合物包含CD20单抗、钙调神经蛋白抑制剂类药物、糖皮质激素、霉酚酸酯、环磷酰胺和血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素受体拮抗剂(ARB)类药物中的一种或多种。
在上述方面的一个实施方案中,药物组合物包含药学可接受的载体。
在上述方面的一个实施方案中,药物用于减轻膜性肾病的临床症状,包括降低蛋白尿、提高血清白蛋白水平和/或降低肌酐;和/或在膜性肾病患者中减少肾小球的上皮下免疫复合物沉积数目和/或足突融合,或减轻基底膜增厚程度。
在上述方面的一个实施方案中,所述用途通过阻断或抑制C3a/C3aR通路实现。在一个实施方案中,所述用途通过降低动物模型(海曼肾炎大鼠模型)中绵羊抗Fx1a抗体血清诱导的特异性针对抗Fx1a抗体的IgG抗体(而不影响动物体内的总IgG水平)实现。本发明的拮抗剂可以治疗膜性肾病而不影响受试者的基础免疫和天然免疫。
相对于现有技术,本发明的优点包括:
(1)副作用少:激素、现有的免疫抑制剂和利妥昔单抗的特点是较广谱的干预免疫***,在治疗疾病的同时导致患者免疫功能低下,容易被感染,甚至有肿瘤发生率升高的风险。C3aR拮抗剂具有高特异性,除C3aR外不与其他分子发生反应,不影响补体***其他分子或T、B淋巴细胞发挥正常生理作用,副作用较少。
(2)对其他脏器有一定的保护作用:C3aR拮抗治疗除了证明具有PMN治疗作用,在心脏(动脉粥样硬化)、神经(阿尔兹海默症)等***均被证明具有保护作用,PMN作为一种老年人易患的慢性肾脏病,阻断C3a/C3aR通路或可以同时保护其他脏器,使患者的生活质量得到提高。
(3)过敏反应罕见:目前可用的利妥昔单抗是一种人鼠嵌合的蛋白抗体,因此在应用的过程中易发生过敏反应,因此需要在使用前加用抗过敏药物,如激素和苯海拉明等。但是,本文使用的C3aR拮抗剂SB290157和JR14a是均属于有机化合物,发明人猜测在患者身上使用时过敏反应较生物制剂少见。
附图说明
通过本发明可获得的结果、实验和优点在附图和实施例中进行了总结。附图和实施例显示了本发明的优选实施方案,但应当理解,附图和实施例不应视为限制本发明。
图1:C3aR在不同疾病及健康对照肾小球的表达情况。A图为免疫组化照片。B图为各种肾小球疾病患者和健康对照者肾小球的相对C3aR表达量。PMN:原发性膜性肾病;DN:糖尿病肾病;FSGS:局灶节段肾小球硬化症;MCD:微小病变。
图2:C3aR在足细胞上的表达(红色荧光:C3aR;绿色荧光:足细胞标记蛋白podocin)。
图3:肾小球C3aR表达与患者临床指标的相关性分析。A:肾小球C3aR表达与尿蛋白呈正相关;B:肾小球C3aR表达与血肌酐呈正相关;C:治疗后达到完全缓解的患者血浆C3a水平更低。
图4:足细胞迁移实验。上图:刺激12h、24h、36h、48h、60h和72h后各组足细胞迁移距离折线图;下图:刺激72h时各组足细胞迁移距离散点图。
图5:足细胞活性实验:刺激36h、48h、72h后各组足细胞的相对活性。
图6:不同刺激条件下足细胞骨架蛋白和细胞因子mRNA表达情况。A:不同刺激条件下C3aR mRNA相对表达量;B:不同刺激条件下PLA2R mRNA相对表达量;C:不同刺激条件下Bcl-2mRNA相对表达量;D:不同刺激条件下synapotodin mRNA相对表达量;E:不同刺激条件下WNT3mRNA相对表达量;F:不同刺激条件下β-catenin mRNA相对表达量。
图7:不同刺激条件下足细胞C3aR、PLA2R和synapotodin蛋白含量。A:C3aR、PLA2R、synapotodin和GAPDH蛋白(内参蛋白)Western blot条带;B:C3aR、PLA2R和synapotodin蛋白相对表达量散点柱状图。
图8:足细胞PLA2R表达情况。A:刺激后各组足细胞PLA2R免疫荧光相对IOD值;B:C3aR、PLA2R、synapotodin和GAPDH蛋白(内参蛋白)Western blot条带;C:各组PLA2R免疫荧光代表图。
图9:各组大鼠蛋白尿水平。A,SB290157治疗组中,蛋白尿与时间的曲线;B,JR14a治疗组中,蛋白尿与时间的曲线;C,SB290157实验各组大鼠在第7周时的蛋白尿水平;和D,JR14a实验各组大鼠在第7周时的蛋白尿水平。
图10:各组大鼠肾小球免疫复合物沉积(Amount of electron dense deposit)、足突宽度(Foot process width)和基底膜厚度(GBM thickness)情况。A-C为SB290157实验的结果;和D-E为JR14a实验的结果。
图11:JR14a治疗组在第2周、第5周和第7周的特异性抗绵羊IgG相对表达量。
图12:SB290157治疗组在第2周、第5周和第7周的特异性抗绵羊IgG相对表达量。
图13:各处理组中总IgG随时间的变化。
图14:大鼠肾小球C3d、C4d、C5aR、MBL相对表达水平。
具体实施方式
发明人首次发现C3a/C3aR通路在PMN中的致病作用,提出并证明通过使用C3aR拮抗剂可治疗PMN大鼠,这是之前从未被发现和验证的治疗PMN的新途径。具体地,发明人首先用免疫组化的方法检测PMN患者肾组织(肾小球)上C3aR表达的情况,并通过ELISA的方法检测PMN患者血清中C3a的水平,经过分析发现C3aR的表达水平和PMN患者的临床症状严重程度(蛋白尿、肾功能)及预后均具有显著相关性。发明人还进行了足细胞实验,通过使用PMN患者血浆和C3aR拮抗剂证明PMN患者血浆中的C3a可干扰足细胞的功能并诱导足细胞凋亡;以及进行了海曼肾炎大鼠PMN疾病实验,分别通过30mg/kg/d腹腔注射C3aR拮抗剂SB290157或10mg/kg/d灌胃C3aR拮抗剂JR14a达到阻断C3a/C3aR通路的效果。实验用C3aR拮抗剂已有10余年历史,国内外各大生物制剂公司均有生产。发明人证实了C3aR拮抗剂可治疗PMN大鼠:C3aR拮抗剂对PMN大鼠具有显著的治疗效果,并有望开展药物临床试验。在抗Fx1A抗体血清诱导的PHN疾病模型中,本文使用的拮抗剂仅抑制特异性针对抗Fx1A抗体(例如绵羊抗Fx1A抗体)的抗体,大鼠血浆中总IgG水平并未受到C3aR阻断剂的影响,在所有实验大鼠中未观察到感染等副作用。
C3a是一个包含约77个氨基酸的多肽,作为强效的炎性因子并能广泛作用于免疫及非免疫细胞。C3a能够调节血管舒张,增加小血管的通透性,引发平滑肌的收缩。对于有吞噬功能的细胞(中性粒细胞、巨噬细胞),C3a有强烈的化学趋化作用,使吞噬细胞迁移至组织的损伤或炎症区域。C3a还能促进嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺,引发中性粒细胞的氧化猝发现象。C3a还参与组织的再生和纤维化过程,在肝组织再生中,C3a能促进细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的生成。C3a通过与其特异性受体C3aR结合从而发挥一系列生物学效应。
C3a受体(C3aR)是一个7次跨膜受体,属于G蛋白偶联家族。在早期的研究中,在骨髓源性细胞上(如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞及肥大细胞等)检测到C3aR的表达,并且在不同的生理病理状态的组织细胞中表现出多样的生理功能。在肾脏组织中,肾小管上皮细胞和足细胞均能表达C3aR。
C3a/C3aR信号通路拮抗剂是指阻断C3a/C3aR信号通路的试剂,其可以是C3a拮抗剂或抑制剂,或者C3aR拮抗剂或抑制剂。优选地,本发明的C3a/C3aR信号通路拮抗剂是C3aR拮抗剂或抑制剂。更优选地,C3aR拮抗剂或抑制剂是SB290157或JR14a。
SB290157的化学名称为N2-[(2,2-联苯基乙氧基)乙酰基]-L-精氨酸(N2-[(2,2-Diphenylethoxy)acetyl]-L-arginine)。SB290157是一种有效的选择性C3a受体拮抗剂。目前关于SB290157的研究及应用主要在以下方面:①SB290157具有神经保护功能,可用于血栓栓塞时静脉溶栓治疗的辅助治疗、脑出血时的神经保护功能、阿尔茨海默病以及小血管疾病和血管性痴呆;②SB290157可减轻Abelcet引起的高血压,具有降低血压的应用前景;③SB290157与阿片受体激动剂联合使用可产生无耐受性的强效止痛剂;④SB290157可能是一种治疗早期年龄相关性黄斑变性的方法;⑤SB290157可抑制饮食诱导的肥胖、代谢功能障碍以及脂肪细胞和巨噬细胞信号转导;⑥SB290157具有抗炎作用,具有抑制关节炎、抑制晚期哮喘反应和气道高反应的应用前景;⑦SB290157具有治疗狼疮性肾炎的应用前景;⑧SB290157可以作为一种药物调动造血干细胞的移植等。SB290157可以以其盐的形式使用,例如SB290157三氟乙酸盐(C24H29F3N4O6)。
JR14a的化学名称为5-(二(4-氯苯基)甲基)-3-甲基噻吩-2-羰基)-l-精氨酸(5-(Bis(4-chlorophenyl)methyl)-3-methylthiophene-2-carbonyl)-l-arginine)(C25H26Cl2N4O3S)。JR14a是一种有效的人补体C3a受体噻吩拮抗剂。JR14a对人C3a受体的选择性高于C5a受体。JR14a可以抑制C3aR介导的炎症。
膜性肾病(MN)是最常见的原发性肾小球疾病之一,病理特点是肾小球基底膜上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚。临床以肾病综合征(NS)或无症状性蛋白尿为主要表现。膜性肾病可为原发性,亦可继发于多种疾病,见于感染(乙、丙型肝炎病毒)、***性疾病(如红斑狼疮)、药物治疗(如金、青霉胺等)以及恶性肿瘤。目前认为膜性肾病是一种针对正常肾小球上皮细胞膜上的抗原成分产生的自体抗体介导的肾小球损害,免疫复合物由上皮细胞膜上脱落到基底膜的上皮细胞形成典型的免疫复合物沉着。沉着的免疫复合物激活补体,在此产生C5b-9。补体膜攻击复合物引起蛋白尿病变过程中激活的细胞因子导致基底膜细胞外基质成分改变,引起基底膜增厚使病变进一步发展。目前使用的药物包括血管紧张素转化酶抑制药、免疫刺激剂、糖皮质激素及细胞毒药物(例如环磷酰胺(CTX)与糖皮质激素合用和苯丁酸氮芥与糖皮质激素合用)。本发明的C3aR拮抗剂可以用于治疗膜性肾病,特别可用于治疗原发性膜性肾病,如通过有效降低PHN大鼠的症状和肾损伤证明。本发明的C3aR拮抗剂相对于目前可用的药物具备诸多优势,例如除C3aR外不与其他分子发生反应,不影响补体***其他分子或T、B淋巴细胞发挥正常生理作用,副作用较少;C3a/C3aR通路除了证明具有PMN致病作用,在心脏、神经等***均被证明没有显著的致病作用,PMN作为一种老年人易患的慢性肾脏病,阻断C3a/C3aR通路或可以同时保护其他脏器,使患者的生活质量得到提高;作为小分子药物,不易引起受试者的过敏反应。
足细胞是肾小球毛细管管壁选择性滤过的关键细胞,连同肾小球基膜、有窗孔的肾小球内皮细胞、内皮细胞表面蛋白多糖和足细胞下区共同构成肾小球滤过屏障。越来越多的研究证明足细胞在肾脏疾病的发展中有重要作用。多种以蛋白尿为主要临床表现的获得性肾小球疾病(包括糖尿病肾病,膜性肾病等)都伴有足细胞的形态和功能的异常。
“治疗”在本文中用于指治愈疾病、改善疾病的临床症状、改善患者的预后等的治疗性处理。在本文中,可以通过注射或口服C3aR拮抗剂通过阻断C3a/C3aR通路治疗PMN患者达到以下一种或多种效果:(1)减轻其临床症状,包括降低蛋白尿、提高血清白蛋白水平、降低肌酐等;(2)减少上皮下免疫复合物沉积数目和/或足突融合,或减轻基底膜增厚程度;(3)改善患者肾脏长期预后,延长患者自发病至需要肾脏替代治疗的时间,或者终身无需透析;(4)减少患者在疾病过程中因疾病自身或因治疗使用激素、免疫抑制剂、透析导致的心脑血管慢性疾病;和(5)避免常规一线治疗药物的副作用,如激素导致的代谢综合征、免疫抑制剂导致的免疫功能低下等。
“药学可接受的盐”意指生理学上或毒物学上可耐受的盐,并且在适当时包括药用碱加成盐和药用酸加成盐。例如,在化合物含有一个或多个酸性基团(例如羧基)的情况下,可以形成的药学可接受碱加成盐包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铵盐,或与有机胺诸如二乙胺、N-甲基-葡萄糖胺、二乙醇胺或氨基酸(例如赖氨酸)等的盐。
术语“肠胃外”包括皮下,皮内,静脉内,肌内,动脉内,或输注形式。
本发明的药物或药物组合物能够以任何经口可接受的剂量形式经口给药,包括但不仅限于,胶囊、药片、乳剂和水悬浮液、分散液和溶液。在使用药片用于经口给药时,通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还会添加润滑剂,例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的经口给药,可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当经口给予水成悬浮液和/或乳剂时,活性成分可以被悬浮或溶解在油相中,并与乳化剂和/或悬浮剂组合。如果需要,可以添加某些甜味剂和/或芳香剂和/或着色剂。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点,而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
实施例
实施例1:C3aR在膜性肾病患者肾小球上高表达,且与疾病严重程度具有相关性
1.材料与方法
小鼠抗人/大鼠/小鼠C3aR单克隆抗体 | Santa Cruz | 美国 |
兔抗人podocin多克隆抗体 | Invitrogen | 美国 |
山羊抗小鼠IgG(H+l)二抗 | Invitrogen | 美国 |
山羊抗兔IgG(H+l)二抗 | Novus Biologicals | 美国 |
小鼠二步法试剂 | 中杉金桥 | 中国 |
DAB显色试剂盒 | 中杉金桥 | 中国 |
人补体C3a ELISA试剂盒 | 巧伊生物 | 中国 |
1.1研究对象及标本
本研究纳入37例经北京大学第一医院肾内科肾活检确诊为PMN的患者,剔除继发性MN和合并了其他肾小球疾病、肾小管间质疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和感染的病例,并纳入10例DN、10例MCD和7例FSGS患者作为疾病对照,13例健康移植肾供者术前肾穿刺活检标本作为健康对照。收集所有PMN患者肾穿刺活检当日血浆标本,使用EDTA抗凝管采集全血后置4℃低温环境下,2000rpm/min离心15min,收集血浆,分装后快速冻存于-80℃冰箱。
本研究严格遵守《赫尔辛基宣言》,并得到了北京大学第一医院伦理委员会的批准,获取的组织和血液标本均具有书面知情同意书。
1.2临床资料收集
收集37例PMN患者的临床资料,包括:年龄、确诊日期等基本信息,肾穿刺活检前最近一次24h尿蛋白定量、血浆白蛋白、血肌酐、eGFR、抗PLA2R抗体和肾脏病理资料等临床数据,标准化治疗后病情变化情况。所有数据信息均通过北京大学第一医院住院患者病案、门诊患者随诊资料或电话询问等方式获取。
1.3实验方法
1.3.1 PMN患者和健康对照肾活检冰冻标本C3aR和podocin共表达检测(间接免疫荧光法)
(1)将保存于-40℃或-20℃的切片取出;
(2)固定:冰冻切片在预冷的丙酮中-20℃条件下固定15min;
(3)切片在通风橱内风干,使丙酮基本挥发;
(4)PBS水洗3min×3次;
(5)PBS缓冲液配制3%BSA封闭液,0.25μm滤过器过膜后使用;
(6)非特异性抗原封闭:37℃条件下,3%BSA封闭液孵育封闭1h;
(7)孵育一抗:小鼠抗人C3aR单克隆抗体(1:500稀释)和兔抗人podocin多克隆抗体(1:100稀释)共同孵育,4℃过夜,室温复温45min;
(8)PBS水洗3min×3次;
(9)孵育二抗:山羊抗小鼠IgG(H+l)二抗(1:500稀释)和山羊抗兔IgG(H+l)二抗(1:500稀释)共同避光孵育37℃30min;
(10)PBS水洗3min×3次;
(11)封片:用含DAPI的防荧光淬灭封片剂封片;
(12)阅片:暗室中使用莱卡荧光显微镜阅片。
1.3.2 PMN、DN、FSGS、MCD和健康对照肾活检石蜡标本C3aR检测(免疫组化法)
(1)脱蜡至水:二甲苯中浸泡15min×2次,无水乙醇中浸泡5s×3次,95%乙醇中浸泡5s×2次,80%乙醇中浸泡5s×1次,自来水水洗3min×3次,PBS水洗3min×3次;
(2)高温高压修复:PBS缓冲液1:50稀释50×EDTA抗原修复液,高压锅中高温高压修复3min,通风橱内自然冷却至室温;
(3)PBS水洗3min×3次
(4)封闭内源性过氧化物酶:滴加100μl过氧化氢溶液(购自中杉金桥的小鼠二步法试剂盒中的试剂一),室温避光孵育20min;
(5)PBS水洗3min×3次;
(6)PBS缓冲液配制3%BSA封闭液,0.25μm滤过器过膜后使用;
(7)非特异性抗原封闭:37℃条件下,3%BSA封闭液孵育封闭1h;
(8)孵育一抗:小鼠抗人C3aR单克隆抗体(1:500稀释)孵育,4℃过夜,室温复温45min;
(9)PBS水洗3min×3次;
(10)滴加100μl反应增强液(小鼠二步法试剂盒中的试剂二),室温孵育20min;
(11)PBS水洗3min×5次
(12)滴加100μl酶标山羊抗小鼠IgG聚合物(小鼠二步法试剂盒里的试剂三),室温孵育20min;
(13)PBS水洗3min×5次;
(14)DAB显色:DAB显色试剂盒(购自中杉金桥)试剂一和试剂二1:20混合,混匀后加至切片,室温显色1~2min,显微镜下控制程度,出现浅棕色本底时即可,立即放入PBS中,自来水充分冲洗10min;
(15)苏木素染色:滴加苏木素染液,室温孵育10min;
(16)自来水冲洗15min返蓝;
(17)脱水和透明:80%、95%、无水乙醇依次脱水5s,二甲苯中浸泡透明15min×2次;
(18)封片:中性树胶封片,置于超净通风台风干;
(19)阅片:莱卡光学显微镜阅片,每个组织连续拍照至少10个完整肾小球;
(20)肾小球C3aR染色强度定量测量:使用Image Pro Plus7.0(MediaCybernetics,马里兰州,美国)通过积分光密度(integrated optical density,IOD)测量染色强度。
1.3.3 PMN患者血浆C3a水平检测(ELISA法)
(1)试剂盒(人补体C3a ELISA试剂盒,购自巧伊生物)自冰箱中取出后应置室温平衡20min;
(2)将20×浓缩洗涤液用去离子水1:20稀释;
(3)将5×标准品稀释液用去离子水1:5稀释;
(4)制备不同浓度标准品:使用1×标准品稀释液按照试剂复溶标签稀释C3a标准品,使C3a终浓度达到2500pg/ml,室温条件下静置15~20min后轻轻混悬至彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释标准品至1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156.25pg/ml、78.125pg/ml,标准品稀释液作为0浓度;
(5)患者全血经过EDTA抗凝,2000rpm/min离心15min,分装后快速冻存于-80℃冰箱,从冰箱中取出冷冻血浆,4℃条件下解冻,避免反复冻融,稀释15000倍;
(6)分别将稀释后的样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入包被后的96孔板中,每例样品复孔3孔,用封板膜封住反应孔,室温静置孵育120min;
(7)加入洗涤液300μl/孔洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(8)加入生物素化抗体工作液(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,室温孵育60min。
(9)洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(10)加入亲和素连接的HRP酶工作液(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,避光室温孵育20min;
(11)洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(12)加入显色剂TMB(100μl/孔),避光室温孵育15min;
(13)加入终止液(50μl/孔),混匀后即刻使用酶标仪检测,设置OD值的波长为405nm并读数;
(14)使用EIA软件绘制标准曲线,以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点,通过标本的OD值可在标准曲线上查出其C3a浓度,测得浓度乘以样本稀释倍数(15000)得到血浆样本真实C3a浓度。
2.数据分析
使用SPSS 23.0(IBM,纽约,美国)进行数据统计分析。对于正态分布数据,结果表示为平均值±标准偏差(SD)。对于非正态分布的数据,结果以中位数(四分位间距,IQR)表示。T检验和Mann-Whitney U检验用于评估定量和半定量数据的差异。根据分布情况,单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验用于比较连续变量组间差异。P<0.001为具有显著统计学意义,P<0.01为具有明显统计学意义,P<0.05为具有统计学意义。
3.结果
3.1 C3aR在各种肾小球疾病和健康对照肾小球中的表达
通过Image-pro plus软件对免疫组化(图1的A图)结果进行IOD测量,可定量表示C3aR在肾小球上的相对表达量。结果显示37例PMN患者肾小球C3aR的表达量为0.6(0.6,0.7),显著高于DN[0.6(0.6,0.7)vs.0.4(0.3,0.5),P<0.001]、FSGS[0.6(0.6,0.7)vs.0.5(0.5,0.6),P<0.001]、MCD[0.6(0.6,0.7)vs.0.3(0.3,0.4),P<0.001]及健康对照组[0.6(0.6,0.7)vs.0.2(0.2,0.3),P<0.001](图1的B图)。此外,FSGS肾小球C3aR表达量为0.5(0.5,0.6),高于DN[0.5(0.5,0.6)vs.0.4(0.3,0.5),P=0.013],显著高于MCD[0.5(0.5,0.6)vs.0.3(0.3,0.4),P<0.001]及健康对照[0.5(0.5,0.6)vs.0.2(0.2,0.3),P<0.001];DN肾小球上C3aR表达量为0.4(0.3,0.5),高于MCD[0.4(0.3,0.5)vs.0.3(0.3,0.4),P<0.001]和健康对照[0.4(0.3,0.5)vs.0.2(0.2,0.3),P=0.040];MCD肾小球上C3aR表达量为0.3(0.3,0.4),明显高于健康对照[0.3(0.3,0.4)vs.0.2(0.2,0.3),P=0.005]。
3.2 C3aR在PMN患者肾小球足细胞上的表达
PMN冰冻肾组织标本C3aR免疫荧光染色在高倍荧光显微镜下可见耀眼荧光,正常对照肾组织肾小球荧光似不可见。Podocin是足细胞骨架蛋白,常用作足细胞标记蛋白,在PMN肾小球和正常肾小球中表达无差异。C3aR和podocin共染可见PMN患者肾小球上C3aR和podocin的荧光重合,说明足细胞表达C3aR;而正常对照肾脏组织中C3aR主要表达在肾小管间质中,podocin表达在足细胞上,二者荧光无重合(图2)。
3.3 PMN患者的临床特征、病理表现和治疗反应
本研究纳入37例PMN患者,男性26例,女性11例,中位年龄56(46.5,62.0)岁。主要临床特征:尿蛋白定量6.1(3.3,10.1)g/24h,血浆白蛋白浓度26.0(23.0,31.0)g/l,血肌酐78.6(67.3,117.8)μmol/l,eGFR 92.2(59.6,100.3)ml/min/1.73m2。37例PMN中25例(67.6%)患者循环中抗PLA2R抗体阳性(>20U/ml),抗体中位水平为150.0(22.0,437.5)U/ml。使用ELISA方法检测肾活检当日血浆标本中的C3a,结果显示其中位水平为1817.7(1142.9,6721.4)ng/ml。
所有患者肾穿刺活检病理结果由北京大学第一医院肾内科病理室提供,结果显示33例(89.2%)患者肾小球PLA2R染色呈阳性,其染色强度中位数为1+。37例患者均观察到IgG和C3呈颗粒样沉积,中位染色强度分别为2+和3+。
3.4 PMN患者肾小球C3aR的表达及与临床特征和预后的相关性
相关性分析结果显示PMN患者肾小球C3aR水平与24h尿蛋白定量(r=0.569,P<0.001)和血肌酐(r=0.642,P<0.001)呈正相关,有显著统计学意义;与血浆白蛋白呈负相关(r=-0.3719,P=0.023),有统计学意义(图3中的A和B图)。C3aR的表达水平与抗PLA2R抗体(P=0.463)和血浆C3a(P=0.806)不具有相关性。
肾脏病理层面,C3aR的表达与肾小球PLA2R(P=0.467)、IgG沉积(P=0.299)和C3沉积(P=0.333)均不具有相关性。
经过KDIGO指南推荐的常规治疗(有15名患者接受了口服激素治疗,13名患者接受了口服环孢素/他克莫司治疗,4名患者接受静脉注射环磷酰胺治疗,12名患者接受静脉注射美罗华治疗,以上治疗包括同一患者同时或先后接受两种及两种以上药物治疗,12名患者仅接受ACEI/ARB)后,33例(89.2%)患者达到缓解,其中13例(35.1%)达到完全缓解(complete remission,CR),20例(54.1%)达到部分缓解(partial remission,PR)。在随访中,6例患者缓解后复发,占达到缓解的患者18.2%。达到缓解的PMN患者在其起病时肾活检组织C3aR的表达量低于未达到缓解的患者(P=0.021),有统计学意义(图3的C图);在治疗后疾病缓解的患者中,CR和PR的患者C3aR水平无差异(P=0.537),缓解后复发和未复发的患者C3aR水平也无差异(P=0.194)。
实施例2:膜性肾病患者的足细胞活性和表达水平。
本实施例主要通过迁移实验探索足细胞在受到刺激后足突迁移能力的变化,通过MTT活性检测探究不同刺激条件下不同时间点足细胞活性,从细胞功能和凋亡两方面探究PMN患者血浆中C3a对足细胞的作用。同时,本实施例通过qRT-PCR、Western blot和细胞荧光技术分别从mRNA水平和蛋白质水平探究足细胞细胞骨架蛋白和多种细胞因子的变化。
1.材料和方法
本实验所用的条件性永生化人足细胞由Jochen Reiser教授(美国芝加哥Rush大学医学中心)惠赠。以下试剂均为商品化试剂盒。实施例中的测定方法均按照商业试剂盒的用法说明进行操作。
1.1 PMN患者血浆的采集和配制
(1)采集在北京大学第一医院肾内科接受肾穿刺活检并确诊为PMN,且未接受免疫抑制治疗的PMN患者5例,收集肾穿刺活检当日血浆标本,分别使用肝素钠抗凝管和EDTA抗凝管采集全血后放于4℃低温环境下,2000rpm/min离心15min,收集血浆,分装后快速冻存于-80℃冰箱。收集5例健康对照志愿者血浆标本,处理及储存方法同上。肝素钠抗凝血浆用于细胞刺激,EDTA抗凝血浆用于检测C3a浓度。
(2)使用0.22μm滤器过滤所有血浆标本;
(3)刺激液配制方案:
PMN患者血浆组:
患者血浆 10%
青霉素、链霉素 1%
RPMI 1640培养基 89%
PMN患者血浆+C3aR拮抗剂组(分为4个浓度梯度):
患者血浆 10%
SB290157(C3aR拮抗剂) 浓度梯度:200nM,400nM,2000nM,4000nM
青霉素、链霉素 1%
RPMI 1640培养基 89%
PMN患者血浆+JR14a拮抗剂组(分为4个浓度梯度):
患者血浆 10%
JR14a(C3aR拮抗剂) 浓度梯度:200nM,400nM,2000nM,4000nM
青霉素、链霉素 1%
RPMI 1640培养基 89%
PMN患者血浆+重组人C3a蛋白:
健康对照血浆
健康对照血浆 10%
青霉素、链霉素 1%
RPMI 1640培养基 89%
阳性对照组
阴性对照组
胎牛血清 5%
青霉素、链霉素 1%
RPMI 1640培养基 94%
1.2足细胞的分化和饥饿
(1)足细胞在33℃环境下增殖,当细胞繁殖至培养瓶底面积的80%-95%时,按1:5-6进行传代,加入37℃培养基,置于37℃5%CO2细胞培养箱进行分化。
(2)分化10-14天后足细胞分化完成,可以进行实验;
(3)刺激细胞之前对细胞进行同步化,即弃去培养基,加入PBS洗一次,加入不含胎牛血清的RPMI 1640培养基饥饿6h;
(4)弃去同步化培养基,加入刺激液。
1.3 MTT足细胞活性实验
(1)将分装储存于-20℃冷库的所有试剂平衡至室温;
(2)分别将刺激36h、48h和72h的细胞拿到组织间超净台进行操作;
(2)吸出培养基,并收集于15ml离心管里;
(3)用提前预冷的4℃PBS洗三次,并将其收集于离心管里;
(4)加入适量不含EDTA的胰蛋白酶,置于37℃培养箱中1 2min,在显微镜下观察细胞脱落情况,待细胞基本从培养瓶底面脱落时加入阴性培养基终止消化作用,将悬液收集于离心管里;
(5)用4℃PBS洗一次,收集于离心管里;
(6)1200g离心5min;
(7)弃去上清液,加入适量RPMI 1640培养基重悬细胞至细胞密度为1-5×106/ml;
(8)96孔板每孔加入50μl含有细胞的RP1640培养基,复孔3孔,因培养基里含有酚红,故需要增加背景孔(阴性RPMI 1640培养基50μl/孔);
(9)加入50μl MTT试剂/孔,组织间细胞培养箱内37℃培养3h;
(10)加入MTT solvent 150μl/孔,避光37℃震荡孵育15min;
(11)即刻使用酶标仪检测,设置OD值的波长为590nm并读数;
(12)吸光度与活性细胞呈正比,相对细胞活性(吸光度)=平均每个样本的重复读数-背景孔平均读数。
1.4检测足细胞刺激后C3aR和其他重要因子mRNA的表达(实时荧光定量PCR,即qRT-PCR)
提取刺激24h和48h足细胞内总RNA,并通过qRT-PCR技术定量检测C3aR、PLA2R、synapotodin、vinculin、actin-α4、BCL-2、b-catenin、WNT1、WNT2、WNT3、PIK3CA、AKT1、GSK3B、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10在mRNA水平的表达量。使用GAPDH作为内参基因。
1.5基因表达测定
使用天根细胞总RNA提取试剂盒DP430提取细胞内总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,并且通过QRT-PCR进行基因表达测定。
(1)通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取目的基因的编号,通过primerbank网站查询引物序列,预实验验证引物质量,所有目的基因的正向引物和反向引物物见下表。按照引物包装上的要求使用RNase-free双蒸水溶解引物。
(2)依次加入以下试剂以配制PCR反应体系(10μl体系)
(3)运行PCR反应程序:将96孔板放在PCR仪上,根据以下条件进行QRT-PCR反应:
标准反应模式(引物Tm≥60℃)
溶解曲线条件
(4)计算目的基因表达量:
①输出数据为excel格式;
②计算每组每个目的基因、阴性组和GAPDH的CT均值;
③计算ΔCT:ΔCT=每组目的基因CT值-内参基因(GAPDH)CT值;
④计算ΔΔCT:ΔΔCT=样品组ΔCT-阴性组ΔCT;
⑤计算目的基因表达量:基因表达量=POWER(2,-ΔΔCT)。
表1人C3aR和其他重要因子PCR扩增引物序列信息
1.6检测足细胞刺激后C3aR等蛋白的表达(蛋白质印迹法/Western blot)
刺激48h时提取足细胞内总蛋白,并通过Western blot技术半定量检测C3aR在蛋白水平的表达量。使用GAPDH作为内参蛋白。
1.7体外培养人足细胞PLA2R检测(间接免疫荧光法)
(1)弃去培养基,加入4℃的PBS洗3次,将PBS弃净后将培养板置于室温环境中;
(2)固定细胞:细胞培养板每孔加入适量4%多聚甲醛固定细胞;
(3)PBS水洗3min×3次;
(4)PBS缓冲液配制3%BSA封闭液,0.25μm滤过器过膜后使用;
(5)非特异性抗原封闭:37℃条件下,3%BSA封闭液孵育封闭1h吸出封闭液;
(6)孵育一抗:小鼠抗人PLA2R单克隆抗体(1:200稀释)孵育,4℃过夜,室温复温45min;
(7)PBS水洗3min×3次;
(8)孵育二抗:山羊抗小鼠IgG(H+l)二抗(1:500稀释)避光孵育37℃30min;
(9)PBS水洗3min×3次;
(10)封片:用含DAPI的防荧光淬灭封片剂封片;
(11)阅片:暗室中使用莱卡荧光显微镜阅片。
2.结果
2.1足细胞迁移实验
PMN患者血浆、PMN患者血浆+重组人C3a蛋白和重组人C3a蛋白刺激后,足细胞迁移功能较健康对照组和阴性对照组降低,加入C3aR拮抗剂(SB290157和JR14a)后,迁移能力基本恢复至健康对照组水平。PMN患者血浆中加入2μg/ml C3a蛋白诱导足细胞迁移功能损伤较血浆组更为严重,说明PMN血浆与C3a蛋白具有加性作用(图4的上图)。
刺激72h时,PMN患者血浆组足细胞迁移距离为61.7(25.0,111.1)μm,较健康对照组明显降低[61.7(25.0,111.1)μm vs.179.1(170.2,185.6)μm,P=0.001]。患者血浆中加入不同浓度C3aR拮抗剂(SB290157或JR14a)后,足细胞迁移距离增加至177.2(156.1,196.9)μm,较患者血浆组显著增加(P<0.001),基本恢复至健康对照组水平[177.2(156.1,196.9)μm vs.179.1(170.2,185.6)μm,P=0.848]。患者血浆中加入2μg/ml重组人C3a蛋白后,足细胞迁移功能进一步下降,72h时迁移距离为1.1(-25.0,65.0)μm,较患者血浆组降低[61.7(25.0,111.1)μm vs.1.1(-25.0,65.0)μm,P=0.146],但是无统计学意义;较健康对照组显著降低[179.1(170.2,185.6)μm vs.1.1(-25.0,65.0)μm,P<0.001]。(图4的下图)
2.2 MTT细胞活性实验
MTT实验中,OD值与有活性细胞数目成正比,因每组细胞总数一致,故可使用OD值表示细胞活性。刺激36h时,PMN患者血浆组、患者血浆中加入不同浓度C3aR拮抗剂组、PMN患者血浆中加入2μg/ml重组人C3a蛋白组和健康对照组OD值分别为1.7(1.2,1.8)、1.4(1.2,1.6)、1.5(1.7,1.1)和2.2(1.5,2.3),各组无统计学意义(P均>0.05)。刺激48h时,PMN患者血浆组、患者血浆中加入不同浓度C3aR拮抗剂组(SB290157或JR14a)、PMN患者血浆中加入2μg/ml重组人C3a蛋白组和健康对照组OD值分别为1.2(1.1,1.2)、1.6(1.3,2.2)、1.3(1.3,1.3)和1.4(1.2,1.5),各组无统计学意义(P均>0.05)。刺激72h时,PMN患者血浆组、患者血浆中加入不同浓度C3aR拮抗剂组、PMN患者血浆中加入2μg/ml重组人C3a蛋白组和健康对照组OD值分别为0.3(0.2,0.3)、0.4(0.2,0.6)、0.1(0.1,0.1)和0.4(0.3,0.4);PMN患者血浆组足细胞活性较健康对照组明显降低(P=0.007);加入不同浓度C3aR拮抗剂SB290157(MCE,中国,HY-101502A)或C3aR拮抗剂JR14a(MCE,中国,HY-138161)后,细胞活性较血浆组升高(P=0.232),但是无统计学意义,与健康对照组细胞活性水平相当(P=0.984);血浆中加入重组人C3a蛋白后,细胞活性较血浆组进一步降低,有明显统计学意义(P=0.003)。图5显示了各种刺激条件下,刺激36h、48h和72h时足细胞相对活性。
2.3足细胞骨架蛋白和细胞因子在mRNA水平的变化
PMN患者血浆刺激48h后,足细胞C3aR mRNA表达量较健康对照组上调[1.1(0.8,1.3)vs.0.6(0.6,0.7),P=0.011],加入不同浓度C3aR拮抗剂(SB290157或JR14a)后表达量明显下降[1.1(0.8,1.3)vs.0.6(0.4,0.8),P=0.001](图6的A图)。
PMN患者血浆刺激48h后,足细胞PLA2R mRNA表达量较健康对照组显著上调[17.3(17.1,19.8)vs.0.9(0.6,1.1),P<0.001],加入拮抗剂后表达量降低[17.3(17.1,19.8)vs.1.2(0.4,2.2),P=0.027](图6的B图)。
PMN患者血浆刺激48h后,足细胞抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达量较健康对照组下调,但无统计学意义[0.9(0.4,0.9)vs.1.1(0.4,1.6),P=0.332],加入较高浓度拮抗剂(2000nM和4000nM SB290157、100nM和200nM JR14a)后,其表达量升高[0.9(0.4,0.9)vs.2.2(0.3,2.6),P=0.038],拮抗剂组Bcl-2mRNA与健康对照组水平相当[2.2(0.3,2.6)vs.1.1(0.4,1.6),P=0.950];PMN患者血浆中加入2μg/ml重组人C3a蛋白组Bcl-2mRNA表达量较血浆组进一步下调[0.4(0.2,0.5)vs.0.9(0.4,0.9),P=0.037](图6的C图)。
PMN患者血浆刺激48h后,足细胞骨架蛋白synapotodin mRNA表达量较健康对照组下调[1.8(0.8,2.1)vs.7.0(4.2,8.5),P=0.020],加入拮抗剂后表达量升高[1.8(0.8,2.1)vs.5.7(4.2,8.6),P=0.020],且拮抗剂组与健康对照组synapotodin水平相当[5.7(4.2,8.6)vs.7.0(4.2,8.5),P=0.863];PMN患者血浆中加入2μg/ml重组人C3a蛋白组synaptopodin mRNA表达量较血浆组进一步下调[1.8(0.8,2.1)vs.0.6(0.0,1.1),P=0.105],但是无统计学意义(图6的D图)。
PMN患者血浆诱导足细胞WNT/β-catenin通路激活。PMN患者血浆刺激48h后,足细胞WNT3 mRNA表达量较健康对照组明显升高[1.2(0.9,1.2)vs.0.1(0.1,0.1),P=0.008],加入拮抗剂后表达量降低[1.2(0.9,1.2)vs.0.6(0.4,0.9),P=0.035](图6E)。β-cateninmRNA表达量的变化与WNT3一致,血浆组表达量较健康对照组升高[0.8(0.8,0.8)vs.0.4(0.4,0.5),P=0.037],加入拮抗剂后表达量降低[0.8(0.8,0.8)vs.0.6(0.4,0.7),P=0.069],但是无统计学意义(图6的F图)。
除了以上因子,还检测了vinculin、WNT1、WNT2、PIK3CA、AKT1、GSK3β、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10mRNA在各组间的变化,未见变化趋势。
2.4足细胞在蛋白水平的变化
PMN患者血浆刺激48h后,Western blot结果(图7的A图)显示足细胞C3aR蛋白含量较健康对照组和阴性对照组显著增加[C3aR/GAPDH IOD:1.2(1.1,1.4)vs.0.2(0.1,0.3),P<0.001)];加入不同浓度C3aR拮抗剂SB290157或JR14a后C3aR蛋白水平降低[1.2(1.1,1.4)vs.0.7(0.3,1.0),P=0.259)],但无统计学意义;拮抗剂JR14a组C3aR蛋白含量减少[1.2(1.1,1.4)vs.0.3(0.2,0.5),P=0.020)](图7的B图)。
PMN患者血浆刺激48h后,Western blot结果显示足细胞PLA2R蛋白含量较健康对照组和阴性对照组显著增加[PLA2R/GAPDH IOD:2.0(1.7,2.2)vs.0.0(0.0,0.1),P<0.001)],加入不同浓度C3aR拮抗剂后PLA2R蛋白含量降低[2.0(1.7,2.2)vs.1.0(0.8,1.5),P=0.012)](图8的B图)。
PMN患者血浆刺激48h后,Western blot结果显示足细胞骨架蛋白synaptopodin含量较健康对照组和阴性对照组显著降低[synaptopodin/GAPDH IOD:0.0(0.0,0.1)vs.2.2(2.7,1.1),P<0.001)],加入不同浓度C3aR拮抗剂后synaptopodin蛋白含量升高[0.0(0.0,0.1)vs.1.1(0.4,2.7),P=0.021)](图8的B图)。
2.5足细胞PLA2R免疫荧光染色结果
PMN患者血浆刺激48h后,足细胞免疫荧光结果显示PLA2R相对IOD值较健康对照组升高[9.0(7.6,9.7)vs.3.0(0.8,3.1),P=0.030],加入不同浓度C3aR拮抗剂(SB290157或JR14a)后IOD值明显下降[9.0(7.6,9.7)vs.6.2(3.8,7.2),P=0.007],拮抗剂组PLA2R相对IOD值仍高于健康对照组,但无统计学意义[6.2(3.8,7.2)vs.3.0(0.8,3.1),P=0.068](图8的C图)。
本实施例的结果显示,PMN患者血浆诱导体外培养人足细胞C3aR和PLA2R上调、抗凋亡因子Bcl-2和骨架蛋白synaptopodin下调、激活Wnt/β-catenin通路,导致足细胞迁移功能下降和细胞活性降低。在患者血浆中加入C3aR特异性拮抗剂SB290157和JR14a后,C3a/C3aR通路被拮抗,C3aR、骨架蛋白synapotodin、抗凋亡因子Bcl-2表达水平基本恢复至健康对照组水平,PLA2R表达有部分降低,但仍高于健康对照组;Wnt/β-catenin通路被抑制;足细胞迁移功能和细胞活性基本恢复至健康对照组水平。据此推断PMN患者血浆中的C3a刺激足细胞膜C3aR表达上调,C3a/C3aR通路激活,诱导Wnt/β-catenin通路活化,并诱导PLA2R表达上调、抗凋亡因子Bcl-2和骨架蛋白synaptopodin下调,最终导致足细胞结构损伤、迁移功能下降、细胞活性降低。发明人认为PMN患者血浆中的C3a可通过与C3aR作用,激活Wnt/β-catenin通路,上调C3aR和PLA2R表达,下调抗凋亡因子Bcl-2和骨架蛋白synapotodin,导致足细胞迁移功能下降和细胞活性降低。在PMN患者血浆中加入C3aR特异性拮抗剂后,能够阻断上述作用,减轻足细胞损伤。
实施例3:C3aR拮抗剂治疗海曼肾炎(PHN)大鼠
目前最广泛应用的PMN动物模型是通过注射外源性蛋白构建的主动型或被动型海曼肾炎(Heymann nephritis,HN)大鼠模型。本实施例采用PHN模型,使用C3aR拮抗剂阻断C3a/C3aR通路,探索C3aR拮抗剂对于PMN的治疗效果及其作用机制。腹腔注射C3aR拮抗剂SB290157 30mg/kg/d或灌胃C3aR拮抗剂JR14a 10mg/kg/d治疗海曼肾炎大鼠。
1.材料和方法
1.1研究对象
5周龄的SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠30只,体重130 150g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。
本研究涉及的所有动物实验均获得了北京大学第一医院动物伦理委员会的批准,实验动物福利伦理审查受理编号:202073。
实验材料
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1.2实验方法
1.2.1 HN大鼠模型实验设计
SB290157:5周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠30只,随机分为3组,分别为模型组(18只)、早治疗组(6只)、阴性对照组(6只),其中模型组和早治疗组均予羊抗大鼠Fx1a抗体血清(绵羊抗大鼠Fx1A血清PTX-002S,Ptobetex,美国)0.8ml/100g体重单次尾静脉注射构建PHN,注射血清的时间定义为第0天,阴性对照组在第0天以同样的方式注射同等剂量的生理盐水。早治疗组,从第0天开始每日在固定时间点腹腔注射C3aR拮抗剂SB290157,30mg/kg体重,直至处死。定期收集大鼠的血和24h尿液标本,第21天时,对模型组18只大鼠,根据尿蛋白水平分层抽样,随机抽出8只作为晚治疗组,从第22天开始,晚治疗组,每日在固定时间点腹腔注射C3aR拮抗剂,30mg/kg体重,直至处死。
JR14a:早治疗组,从第0天开始每日在固定时间点灌胃C3aR拮抗剂JR14a,10mg/kg/d体重,直至处死。定期收集大鼠的血和24h尿液标本,第21天时,对模型组14只大鼠,根据尿蛋白水平分层抽样,抽出6只作为晚治疗组,从第22天开始,晚治疗组,每日在固定时间点灌胃C3aR拮抗剂JR14a,10mg/kg/d体重,直至处死。
模型构建成功定义:第21天时,24h蛋白尿≥100mg。
1.2.2血浆标本
构建模型前一天收集大鼠的血浆标本(第-1天),注射抗Fx1a抗体后2周内为了防止药物损失不采血,之后每7天采血1次(Day14、21、28、35、42、49)。使用5%戊巴比妥1.0ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后,待大鼠失去知觉后,进行内眦采血,分别使用EDTA和肝素钠抗凝采血管收集全血,于4℃2000rpm/min离心15min,收集上层血浆,分装并冻存于-80℃冰箱。
1.2.3尿液标本
构建模型前一天收集大鼠24h尿液标本(第-1天),之后每周收集1次(第7、14、21、28、35、42、49天)。使用大鼠代谢笼,将每只大鼠单独饲养于饲料和饮水充足的代谢笼内24h,收集期间大鼠的全部尿液标本于离心管内,4℃1500rpm/min离心15min,记录尿量,收集上清液,分装并冻存于-40℃冰箱。
1.2.4肾脏标本
(1)第49天使用5%戊巴比妥1ml/kg体重腹腔注射麻醉大鼠,待大鼠失去知觉后,打开腹腔,使用静脉穿刺针和20ml注射器通过腹主动脉取血,大鼠失血后死亡,留置静脉穿刺针;
(2)钝性分离大鼠左侧肾脏,切取三块厚度约3~5mm的肾脏皮质组织,分别放入4%多聚甲醛中固定,留待后续制备石蜡组织的包埋和切片用;放入1.5ml EP管后立即放入液氮中冻存,留待后续制备冰冻组织的包埋和切片用;放入电镜液中固定,留待后续制备电镜标本用;其余肾脏组织切碎后放入1.5ml EP管后立即放入液氮中冻存,备用;使用止血钳夹闭左肾动静脉;
(3)通过留置在腹主动脉的静脉穿刺针向大鼠血管内灌注生理盐水至右肾发白肿胀,钝性分离大鼠右侧灌注后肾脏,切碎后放入1.5ml EP管后立即放入液氮中冻存,备用。
1.2.5大鼠24h蛋白尿
(1)通过代谢笼收集大鼠24h尿,记录尿量;
(2)使用移液枪取100μl澄清尿液于生化杯中;
(3)通过自动生化仪采用双缩脲的方法进行检测,本部分实验委托试验技术员完成。
1.2.6大鼠肾小球微观结构病变情况检测(电镜)
(1)样本制备:处死大鼠并3min内取下肾脏,取2mm×2mm大小的尽量薄的皮质组织,将组织立即投入电镜固定液内固定2h,之后保存于4℃,避免冷冻结冰;
(2)委托武汉赛维尔生物科技有限公司进行电镜标本制作及透射电镜扫描,每例大鼠肾脏标本每个倍镜随机扫描电镜照片5张;
(3)半定量测量并分析以下项目:
①上皮下电子致密物沉积的个数;
②基底膜厚度;
③足突宽度
1.2.7大鼠血浆中大鼠抗绵羊抗Fx1A血清IgG浓度检测(ELISA法)
(1)试剂配制:
0.05M重碳酸盐缓冲液(pH=9.6)
NaHCO3 2.95g
Na2CO3 1.08g
ddH2O 900ml
(2)包被抗原:抗原包被孔:用碳酸盐缓冲液(pH=9.6)以1:300的比例稀释绵羊抗Fx1A血清,包被一半酶标板;非抗原包被孔:用碳酸盐缓冲液稀释1%BSA,包被另一半酶标板;包被液100μl/孔,4℃过夜;
(3)洗板:用0.1%PBST(1000ml PBS里加入1ml Tween-20)洗3次,300μl/孔,90s/次,每次洗完于吸水纸上拍干;
(4)封闭:向酶标板各孔加入1%BSA溶液(PBST稀释),100μl/孔,37℃静置孵育1h;
(5)拍干酶标板,将待测血浆样本用1%BSA溶液以1:50的比例稀释,100μl/孔,37℃温和振荡1h,振速100rpm;
(6)洗板:用PBST洗板3次,拍干;
(7)孵育二抗:将碱性磷酸酶标记的兔抗大鼠IgG用1%BSA溶液以1:5000比例稀释,以100μl/孔加入酶标板,37℃静置孵育1h;
(8)洗板:用PBST洗板3次,拍干;
(9)加入碱性磷酸酶显色液,100μl/孔,避光孵育;
(10)即刻使用酶标仪检测,设置OD值的波长为405nm并连续读数;
(11)结果计算:每板需设置不加入血浆样本的阴性对照,每个样本的OD值=抗原包被孔OD-非抗原包被孔OD-阴性孔OD值;其中,阴性孔OD值=阴性抗原包被孔OD-阴性非抗原包被孔OD;
(12)阈值:检测6例阴性对照组大鼠血浆,抗体阳性的OD阈值为正常对照OD值的均数加3倍标准差。
1.2.8大鼠血浆中总IgG浓度检测(ELISA法)
(1)试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20min;
(2)将浓缩洗涤液用去离子水1:19稀释;
(3)制备不同浓度标准品:10000rpm/min离心IgG标准品冻干粉末1min,使用标准品稀释液按照试剂复溶标签稀释,室温条件下静置15~20min后轻轻混悬至彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释标准品,标准品稀释液作为0浓度;
(5)大鼠全血经过EDTA抗凝,2000rpm/min离心15min,分装后快速冻存于-80℃冰箱,从冰箱中取出冷冻血浆,4℃条件下解冻,避免反复冻融,分别稀释10000倍;
(6)分别将稀释后的样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入包被后的96孔板中,每例样品复孔3孔,用封板膜封住反应孔,37℃静置孵育90min;
(7)甩去样品和标准品,于厚吸水纸上拍干;
(8)加入生物素化抗体工作液(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃孵育60min。
(9)洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(10)加入亲和素连接的HRP酶工作液(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,避光室温孵育30min;
(11)洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(12)加入显色剂TMB(100μl/孔),避光室温孵育15-30min;
(13)加入终止液(50μl/孔),混匀后即刻使用酶标仪检测,设置OD值的波长为405nm并读数;
(14)使用EIA软件绘制标准曲线,以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点,通过标本的OD值可在标准曲线上查出其总IgG浓度,测得浓度乘以样本稀释倍数(3)得到血浆样本真实总IgG浓度。
1.2.9大鼠血浆中C3a浓度检测(ELISA法)
(1)试剂盒(大鼠C3a ELISA试剂盒,Novus biologicals,美国)自冰箱中取出后应置室温平衡20min;
(2)将浓缩洗涤液用去离子水1:24稀释;
(3)制备不同浓度标准品:10000rpm/min离心C3a标准品冻干粉末1min,使用标准品稀释液按照试剂复溶标签稀释使C3a终浓度达到40ng/ml,室温条件下静置15~20min后轻轻混悬至彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释标准品至20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml,标准品稀释液作为0浓度;
(5)大鼠全血经过EDTA抗凝,2000rpm/min离心15min,分装后快速冻存于-80℃冰箱,从冰箱中取出冷冻血浆,4℃条件下解冻,避免反复冻融,稀释3倍;
(6)分别将稀释后的样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入包被后的96孔板中,每例样品复孔3孔,用封板膜封住反应孔,37℃静置孵育90min;
(7)甩去样品和标准品,于厚吸水纸上拍干;
(8)加入生物素化抗体工作液(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃孵育60min;
(9)洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(10)加入亲和素连接的HRP酶工作液(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,避光室温孵育30min;
(11)洗板5次,最后一次洗板后于厚吸水纸上拍干;
(12)加入显色剂TMB(100μl/孔),避光室温孵育15-30min;
(13)加入终止液(50μl/孔),混匀后即刻使用酶标仪检测,设置OD值的波长为405nm并读数;
(14)使用EIA软件绘制标准曲线,以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点,通过标本的OD值可在标准曲线上查出其C3a浓度,测得浓度乘以样本稀释倍数(3)得到血浆样本真实C3a浓度。
1.2.10大鼠肾小球IgG、补体分子和免疫细胞标记蛋白水平检测
检测大鼠肾脏石蜡或冰冻切片大鼠IgG、绵羊IgG和补体分子,包括C3aR、MAC、C3d、C3、C4d、C1q、B因子、MBL和C5aR。
1.2.11大鼠肾脏冰冻切片标本肾小球大鼠IgG、绵羊IgG和C3C检测(直接免疫荧光法)
(1)将保存于-40℃或-20℃的切片取出;
(2)固定组织:切片放入预冷的丙酮中-20℃条件下固定15min;
(3)切片在通风橱内风干,使丙酮基本挥发;
(4)PBS水洗3min×3次;
(5)PBS缓冲液配制3%BSA封闭液,0.25μm滤过器过膜后使用;
(6)非特异性抗原封闭:37℃条件下,3%BSA封闭液孵育封闭1h,甩去;
(7)孵育抗体:FITC标记山羊抗大鼠IgG单克隆抗体(1:50稀释)/alexa flour 488标记兔抗绵羊IgG抗体(1:150稀释)/FITC荧光抗C3c抗体(1:500稀释),37℃避光孵育1h;
(8)PBS水洗3min×3次;
(9)封片:用含DAPI的防荧光淬灭封片剂封片;
(10)阅片:暗室中使用莱卡荧光显微镜阅片。
1.2.12大鼠肾脏石蜡切片标本肾小球C3aR同实施例1。孵育一抗:小鼠抗大鼠C5aR1单克隆抗体(1:100稀释)/兔抗大鼠C1q多克隆抗体(1:100稀释)。
1.2.13大鼠肾脏石蜡切片标本肾小球C3aR、C5b-9、C3d、C4d、B因子、MBL、CD68(巨噬细胞)、Foxp3(调节性T细胞)、CD4(辅助T细胞)和CD8(细胞毒性T细胞)检测(免疫组化法)实验步骤同实施例1。
孵育一抗:小鼠抗大鼠C3aR单克隆抗体(Santa Cruz,美国)(1:500稀释,EDTA溶液高温高压3min修复)/小鼠抗大鼠C5b-9单克隆抗体(HycultBiotech,中国)(1:50稀释,0.4mg/ml蛋白酶K 37℃孵育5min修复)/山羊抗大鼠C3d单克隆抗体(R&D,美国)(1:20稀释,0.4mg/ml蛋白酶K 37℃孵育5min修复)/兔抗大鼠C4d单克隆抗体(CST,美国)(1:100稀释,EDTA溶液高温高压3min修复)/兔抗大鼠B因子单克隆抗体(Abcam,美国)(1:200稀释,柠檬酸溶液高温高压3min修复)/兔抗大鼠MBL单克隆抗体(Abcam,美国)(1:200稀释,EDTA微波高火2min+解冻8min修复)/小鼠抗大鼠CD68单克隆抗体(BIO-RAD,美国)(1:100稀释,胃蛋白酶37℃孵育30min修复)/小鼠抗大鼠Foxp3单克隆抗体(Abcam,美国)(1:1000稀释,EDTA溶液高温高压3min修复)/兔抗大鼠CD4单克隆抗体(CST,美国)(1:400稀释,柠檬酸溶液高温高压3min修复)/小鼠抗大鼠CD8单克隆抗体(Santa Cruz,美国)(1:100稀释,柠檬酸溶液高温高压3min修复)。
2.结果
2.1使用绵羊抗Fx1A抗体血清构建PHN疾病模型
构建PHN大鼠疾病模型时,疾病对照组、早治疗组和晚治疗组,同时注射同等剂量绵羊抗Fx1A抗体血清,阴性对照组注射等剂量生理盐水。
免疫荧光法检测大鼠肾小球绵羊IgG水平,结果显示疾病对照组、早治疗组和晚治疗组绵羊IgG沉积量均高于阴性对照组,有显著统计学意义(P均<0.001),疾病组、早治疗组和晚治疗组之间无统计学差异(P值分别为0.108,0.239,0.875),说明构建模型时三组大鼠注射的抗体血清量相当,且有效进入大鼠体内并沉积在肾小球上的绵羊IgG水平无统计学差异,各组间疾病模型严重程度一致,后续C3aR拮抗剂的治疗效果不受组间疾病模型严重程度影响。
2.2 C3aR拮抗剂可有效降低PHN大鼠的症状和肾损伤
2.2.1 C3aR拮抗剂可有效降低PHN疾病大鼠尿蛋白水平
PHN大鼠主要表现为尿蛋白显著升高,本研究收集大鼠24h尿,通过检测大鼠的尿蛋白水平,从临床表现上判断大鼠的病情严重程度。同时,检测大鼠血浆肌酐、尿素氮、总胆固醇水平,探究PHN大鼠、C3aR拮抗剂SB290157和JR14a早期及晚期治疗组、阴性对照组大鼠,在肾功能和血脂等血生化指标的变化。
通过单次静脉注射绵羊抗Fx1A抗体血清在SD大鼠构建PHN模型。第3周,所有大鼠均出现蛋白尿,并逐渐加重。第7周,与阴性对照组大鼠相比,疾病对照组大鼠出现严重蛋白尿[SB290157:299.1(237.2,367.0)vs.94.0(35.2,119.5)mg/d,P<0.001;JR14a:484.9(460.7,512.6)vs.195.1(179.2,221.5)mg/d,P<0.001],而血清肌酐、血尿素氮和总胆固醇处于正常范围(P>0.05)。
早期治疗组从第0天开始给予C3aR拮抗剂,与疾病对照组相比第7周时大鼠蛋白尿显著降低[SB290157:299.1(237.2,367.0)vs.120.6(76.0,161.0)mg/d,P<0.001;JR14a:484.9(460.7,512.6)vs.282.6(247.3,306.0)mg/d,P<0.001]。第3周时所有未治疗模型组大鼠均达到HN模型构建成功标准(蛋白尿>100mg/24h),将其随机分为疾病对照组和晚治疗组,二组蛋白尿无差异,晚期治疗组在第3周时开始给予C3aR拮抗剂。晚期治疗组与疾病对照组相比蛋白尿水平降低[SB290157:238.6(166.7,346.5)vs.196.3(119.1,289.8)mg/d,P=0.0.039;JR14a:513.1(324.6,571.6)vs.255.3(308.8,345.0)mg/d,P<0.001](图9)。
2.2.2 C3aR拮抗剂显著减轻PHN疾病大鼠肾小球损伤
与PMN患者肾小球病变相似,PHN疾病大鼠肾脏病变主要表现为肾小球上皮下免疫复合物沉积、足突融合和GBM增厚。因此本实验对实验大鼠的肾脏标本进行电镜检测,从以下三个角度对疾病严重程度进行分析。
2.2.3上皮下免疫复合物沉积数目减少
本实验结果显示,PHN疾病组大鼠肾小球上皮下免疫复合物沉积数目显著多于阴性对照组(SB290157:P<0.001;JR14a:P<0.001)。经过早期或晚期治疗,免疫复合物的沉积数目显著减少(早治疗组:SB290157:P<0.001;JR14a:P<0.001;晚治疗组:SB290157:P<0.001;JR14a:P<0.001)(图10的A和D图)。
2.2.4足突融合减少
本实验结果显示,PHN疾病组大鼠肾小球足突宽度最大,明显宽于阴性对照组(SB290157:P<0.001;JR14a:P<0.001),说明患病大鼠肾脏足突融合严重。早治疗组和晚治疗组足突宽度均减少(早治疗组:SB290157:P=0.012;JR14a:P<0.001;晚治疗组:SB290157:P=0.002;JR14a:P=0.001)(图10的B和E图)。
2.2.5基底膜增厚程度减轻
本实验结果显示,PHN疾病组的GBM厚度最大,明显宽于阴性对照组(SB290157:P=0.005;JR14a:P<0.001),说明患病大鼠肾脏GBM增厚。经过C3aR拮抗剂治疗,早治疗组和晚治疗组GBM增厚程度减轻,其中以JR14a治疗效果较为明显(早治疗组:SB290157:P=0.160;JR14a:P<0.001;晚治疗组:SB290157:P=0.998;JR14a:P=0.002)(图10的C和F)。
电镜结果表明,PHN疾病大鼠肾脏病变与PMN患者具有一致性,表现为电子致密物沉积、足突融合和基底膜增厚。C3aR拮抗剂SB290157和JR14a治疗可有效缓解疾病大鼠肾损伤,且早期治疗效果较晚期治疗效果显著(图10)。
3.C3aR拮抗剂抑制PHN大鼠循环中C3a和肾小球C3aR水平
与人类原发性MN类似,C3a/C3aR通路在PHN大鼠中激活。在第7周,与阴性对照组相比,疾病组大鼠血浆C3a[SB290157:42.3(36.1,50.5)vs.11.3(3.5,14.1)ng/ml,P<0.001;JR14a:33.6(30.1,36.3)vs.5.6(4.9,5.8)mg/d,P<0.001]和肾小球C3aR[SB290157:P<0.001;JR14a:P=0.050]显著升高。
C3aR拮抗剂能够抑制C3a/C3aR通路。与疾病对照组相比,治疗组的血浆C3a水平降低[早期治疗SB290157:42.3(36.1,50.5)vs.25.5(18.6,29.6)ng/ml,P=0.001;晚期治疗SB290157:42.3(36.1,50.5)vs.20.5(16.6,28.3)ng/ml,P<0.001;早期治疗JR14a:33.6(30.1,36.3)vs.18.1(14.5,24.2)mg/d,P=0.001;早期治疗JR14a:33.2)vs.32.2](21.3,37.9)mg/d,P=0.476]。治疗组的C3aR染色减少(早期治疗SB290157:P<0.001;晚期治疗SB290157:P<0.001;早期治疗JR14a:P=0.032;早期治疗JR14a:P=0.221)。
4.C3aR拮抗剂抑制PHN大鼠循环中特异性抗绵羊IgG的生成和补体激活
注射绵羊抗Fx1A抗体血清后,实验大鼠发生被动免疫反应,生成抗绵羊IgG抗体,特异性抗体通过GBM进入上皮下形成免疫复合物,激活补体***激活,最终导致肾脏损伤。使用ELISA法检测被动免疫后2周、5周和7周大鼠循环中特异性抗绵羊IgG和总IgG水平,结果显示阴性对照组大鼠基本不生成抗绵羊IgG,疾病对照组、早治疗组和晚治疗组抗绵羊IgG水平均显著高于阴性对照组(图11-12)。在整个实验过程中,疾病对照组大鼠血浆中抗绵羊IgG抗体水平稳定(P>0.05)。各组总IgG水平无统计学差异(P>0.05)(图13)。
在治疗组中,第14天和第35天的绵羊抗Fx1A抗体与PHN疾病组的抗体相当(P>0.005)。在第49天,特异性IgG水平显著降低(早治疗SB290157:P=0.015;晚治疗SB290157:P<0.001;早期治疗JR14a:P=0.009;晚期治疗JR14a:P=0.0.067)。随后,由于特异性IgG降低,C1q(P=0.037;P=0.190;P=0.023;P=0.011)、C5b-9(P=0.013;P=0.004;P=0.049;P=0.045)和因子B(P=0.007;P=0.011;P<0.001;P=0.007)的过度表达也受到抑制。总IgG水平不受影响。拮抗C3a/C3aR通路影响DC细胞、Treg细胞和B细胞的功能,减少特异性IgG产生。但是大鼠血浆中总IgG水平并未受到C3aR阻断剂的影响,而且在所有实验大鼠中未观察到感染等副作用,推测C3aR拮抗剂只影响被动免疫诱导的特异性IgG的生成,不影响天然免疫过程。在使用C3aR拮抗剂后对患病大鼠肾小球C5aR、C3d、C4d、MBL进行测定。使用C3aR拮抗剂治疗后,大鼠肾小球C5aR、C3d、C4d、MBL水平无显著变化,如图14所示。
5.C3aR拮抗剂治疗后PHN大鼠肾小球浸润免疫细胞的变化
使用C3aR拮抗剂治疗后,大鼠肾小球Foxp2(调节性T细胞标记蛋白)、CD68(巨噬细胞标记蛋白)、CD4(辅助性T细胞标记蛋白)和CD8(细胞毒性T细胞标记蛋白)水平无显著变化,说明调节性T细胞、巨噬细胞、辅助T细胞和细胞毒性T细胞水平变化无统计学意义。
PHN大鼠动物实验证明:C3aR拮抗剂治疗显著减轻PHN大鼠蛋白尿水平和肾脏病理损伤程度,有效抑制PHN大鼠肾皮质C3aR的表达,减轻足细胞损伤,同时减少PHN大鼠循环中特异性IgG的产生和肾脏沉积。
应当理解,虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述,但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 北京大学
<120> C3a/C3aR通路拮抗剂治疗原发性膜性肾病的用途
<130> C22P1819
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3aR正向引物
<400> 1
cctgaagatg cagcggacag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3aR反向引物
<400> 2
ccaagtgagc cagcgagaag 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PLA2R正向引物
<400> 3
tggagtggca ggataaagga a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PLA2R反向引物
<400> 4
agggtcagaa ccgatttacc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> synapotodin正向引物
<400> 5
atggaggggt actcagagga g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> synapotodin反向引物
<400> 6
ctctcggttt tgggacaggt g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vinculin正向引物
<400> 7
ctcgtccggg ttggaaaaga g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vinculin反向引物
<400> 8
agtaagggtc tgactgaagc at 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> actin-α4正向引物
<400> 9
gcagcatggg cgactacat 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> actin-α4反向引物
<400> 10
ttgagcccgt ctcggaagt 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL-2正向引物
<400> 11
gacttcgccg agatgtccag 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL-2反向引物
<400> 12
gaactcaaag aaggccacaa tc 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> b-catenin正向引物
<400> 13
aaagcggctg ttagtcactg g 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> b-catenin反向引物
<400> 14
cgagtcattg catactgtcc at 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT1正向引物
<400> 15
cgatggtggg gtattgtgaa c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT1反向引物
<400> 16
ccggattttg gcgtatcaga c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT2正向引物
<400> 17
aggttccatc gaatcctgca c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT2反向引物
<400> 18
catctcggag aatacggtcg t 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT3正向引物
<400> 19
agctacccga tctggtggtc 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT3反向引物
<400> 20
caaactcgat gtcctcgcta c 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PIK3CA正向引物
<400> 21
ccacgaccat catcaggtga a 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PIK3CA反向引物
<400> 22
cctcacggag gcattctaaa gt 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AKT1正向引物
<400> 23
agcgacgtgg ctattgtgaa g 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AKT1反向引物
<400> 24
gccatcattc ttgaggagga agt 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSK3B正向引物
<400> 25
ggcagcatga aagttagcag a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSK3B反向引物
<400> 26
ggcgaccagt tctcctgaat c 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NF-κB正向引物
<400> 27
tatttgaaac actggaagca cg 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NF-κB反向引物
<400> 28
ccggaagaaa agctgtaaac at 22
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α正向引物
<400> 29
aaggacacca tgagcactga aagc 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α反向引物
<400> 30
aggaaggaga agaggctgag gaac 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1β正向引物
<400> 31
gccagtgaaa tgatggctta tt 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1β反向引物
<400> 32
aggagcactt catctgttta gg 22
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6正向引物
<400> 33
cactggtctt ttggagtttg ag 22
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6反向引物
<400> 34
ggacttttgt actcatctgc ac 22
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10正向引物
<400> 35
gttgttaaag gagtccttgc tg 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10反向引物
<400> 36
ttcacaggga agaaatcgat ga 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向引物
<400> 37
aatgcctcct gcaccaccaa 20
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向引物
<400> 38
accatgagtc cttccacgat acc 23
Claims (8)
1.C3a/C3aR通路拮抗剂或包含C3a/C3aR通路拮抗剂的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者中的膜性肾病的药物中的用途,其中C3a/C3aR通路拮抗剂是特异性C3aR拮抗剂,特异性C3aR拮抗剂选自下组:N2-[(2,2-联苯基乙氧基)乙酰基]-L-精氨酸、5-(二(4-氯苯基)甲基)-3-甲基噻吩-2-羰基)-l-精氨酸或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的用途,其中C3aR拮抗剂是N2-[(2,2-联苯基乙氧基)乙酰基]-L-精氨酸三氟乙酸盐。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,其中所述药物为口服或胃肠外用的药物。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,其中胃肠外用的药物是皮下、皮内、静脉内、肌内、动脉内或输注施用的药物。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,其中受试者是人或哺乳动物。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,其中膜性肾病是原发性膜性肾病。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,其中药物组合物包含CD20单抗、钙调神经蛋白抑制剂类药物、糖皮质激素、霉酚酸酯、环磷酰胺、血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂类药物的一种或多种。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,其中药物用于减轻膜性肾病的临床症状,包括降低蛋白尿、提高血清白蛋白水平和/或降低肌酐;和/或在膜性肾病患者中减少肾小球的上皮下免疫复合物沉积数目和/或足突融合,或减轻基底膜增厚程度。
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