CN115181215A - 一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法；包括以高分子单体为反应单体、聚乙二醇、Pluronic PE10100、聚乙烯醇和吐温为分散剂，过氧化二苯甲酰和过硫酸铵为引发剂，在绿色溶剂水中用分散聚合的方法制备得到粒径均一的高分子微球；随后通过铁离子在碱性溶液中的化学共沉淀在高分子微球中引入磁性四氧化三铁粒子，并通过表面接枝聚合引入功能基团，即获得用于免疫诊断、即时检测和基因测序等的免疫微米磁珠。本发明整个操作过程都是在水溶液中进行，没有有机溶剂参与，是一种绿色环保的制备方法；且是通过分散聚合一步法得到的高分子微球，比以前的通过种子溶胀的方法制备微球的过程更简单快速，大大缩短了工艺。

Description

一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，涉及免疫微米磁珠的制备方法，具体涉及一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法。
背景技术
免疫微米磁珠是一种均匀且具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，由载体微球和免疫配基结合而成。免疫配基一般包括抗原、抗体或凝集素等，配基具有生物专一性而且载体微球与配基结合不影响或改变配基原有的生物学特性，保证了微球的特殊识别功能。免疫磁性分离技术是利用抗原抗体的高度特异性识别作用，使抗体(或抗原)固定于免疫磁性微球(IMMS)表面，形成固相抗体/抗原的复合物，经外磁场作用后，复合物被滞留，磁性微球载抗原/抗体复合物与其他组分分离,从而达到分离目的。由于磁性微球代替其他固相载体用于免疫分离，不仅简单易行，而且特异性高，损失小，还可将免疫分离与富集结合为一体，因此它在医学、生物分离、食品卫生检测、环境检测等诸多领域展现了广阔的研究与应用前景。
目前市场上的免疫微米磁珠主要是美国赛默飞的dynabeads和日本JSR的magbeads,但目前国内外其他企业很难制备出同样粒径均一的免疫微米磁珠，主要的原因是这个工艺是通过油水乳化的方法来实现的，然后由精密的筛选仪器筛选，乳化的方法是在不相容的油和水两相中制备成水包油的微球，然后引发剂加热聚合产生微球，由于是不相容的两相溶剂，所以得到的微球粒径很难控制，不易得到均一的粒径。
经对专利文献检索发现，专利CN 104492397 A公开了一种以分散剂十二烷基苯磺酸钠和PEG4000组合的聚合反应，但得到是粒径不均一的50～150微米的聚苯乙烯微球和磁珠，免疫磁珠的定义和要求是粒径均一的磁珠，所以此方法得到的微球磁珠不能用于免疫磁珠。
CN 108129614B和US4654267A通过种子膨胀的方法在油水两相溶剂中进行乳化，这个过程繁琐复杂，需要先合成种子材料，然后才能通过水包油乳化的方法得到高分子微球，而且此过程需要采用大量的油性溶剂参与乳化，并且后期产物需要长时间的清洗过程去除油性溶剂。此外由于是乳化过程，有两相溶剂参与，高分子单体在两相中的分散不容易控制，经常造成分散不均，所以经常得到粒径大小不一的高分子微球。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法。本发明是在水相中进行的分散聚合反应，通过优化分散剂的组分和配比研发出一种制备均一粒径高分子微球和免疫微米磁珠的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种用于免疫诊断、即时检测和基因测序的免疫微米磁珠，所述免疫微米磁珠是外壳为包裹的功能性高分子层，内核为高分子微球以及弥散在高分子微球内部和表面的Fe3O4纳米颗粒的核壳结构。
优选的，所述纳米磁珠是粒径为1～3微米的粒径均一微球。
优选的，所述外壳的高分子层上有各种功能基团，内部是粒径均一的高分子微球和镶入的四氧化三铁纳米颗粒；所述功能基团包括羧基、氨基、环氧基、羟基等。
本发明的免疫微米磁珠制备过程都是在绿色溶剂水中进行的，并通过简单快速的分散聚合一步法制备的高分子微球，相对于以前的其他方法，本发明是第一次通过水中分散聚合的方法制备出粒径均一的高分子微球和免疫微米磁珠的方法。
第二方面，本发明涉及一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法，所述免疫微米磁珠具有外壳为包裹的功能性高分子层，内核为高分子微球以及弥散在高分子微球内部和表面的Fe3O4纳米颗粒的核壳结构；所述方法包括如下步骤：
S1、以水为溶剂，高分子单体在分散剂和引发剂存在条件下，通过分散聚合一步法制备得到粒径均一的高分子微球；
S2、通过铁离子在碱性溶液中的化学共沉淀在高分子微球中引入磁性四氧化三铁粒子，并通过表面接枝聚合引入功能基团，即得粒径均一的免疫微米磁珠。
优选的，所述分散剂选择选择聚乙二醇、Pluronic PE10100、聚乙烯醇和吐温的组合。
优选的，聚乙二醇、Pluronic PE10100、聚乙烯醇和吐温的质量比为(0.05～1):(0.01～1):(0.1～2):(0.01～1)。该配比能充分地使单体和引发剂分散在水相中，从而得到粒径均一的、不同的粒径的高分子微球。
优选的，所述聚乙二醇平均分子量为300-20 000。
优选的，所述聚乙烯醇选用1799型。
优选的，所述吐温选用吐温20或吐温80。在具体实施例中，以上原料可选用阿拉丁生化科技股份有限公司销售的产品。
优选的，所述高分子单体选自苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种。
优选的，所述引发剂为过硫酸铵APS、过氧化二苯甲酰BPO或偶氮二异丁腈(AIBN)。
优选的，所述分散聚合的反应温度为55～90℃，反应时间为5～48个小时。
优选的，每0.1～2毫升水对应高分子单体0.1～1克、聚乙二醇0.05～1克、Pluronic PE10100 0.01～1克、聚乙烯醇0.01～2克、吐温0.01～1克和引发剂0.00001～0.1克；更优选引发剂0.0001～0.1克。
在一些实施例中，步骤S1具体为：在水中加入高分子单体、聚乙二醇PEG、PluronicPE10100、聚乙烯醇1799型和吐温，充分分散，在引发剂过硫酸铵APS或过氧化二苯甲酰BPO的作用下加热聚合获得高分子微球。
优选的，步骤S2中引入磁性四氧化三铁粒子具体为：以氯化亚铁或硫酸亚铁和氯化铁为原料，在铁离子的混合水溶液中加入所述高分子微球，混合孵育，然后加入氨水或氢氧化钠加热，通过共沉淀法在高分子微球内外部引入磁性四氧化三铁颗粒，得到粒径均一的微米磁珠。
优选的，铁离子的混合水溶液中Fe3+离子摩尔浓度为0.01摩尔/升～10摩尔/升，三价铁和二价铁离子的摩尔比为1:2～2:1。
优选的，以每0.1～2毫升铁离子的混合水溶液对应高分子微球0.1～1克的比例在0～100℃混合孵育1～48小时。
优选的，加入氨水或氢氧化钠使混合溶液pH值为11～13。
优选的，共沉淀是在25～90℃条件下反应1～24小时。
优选的，步骤S2中引入功能基团具体为：将引入磁性四氧化三铁粒子的高分子微球超声分散在水中，然后加入功能单体、交联剂和引发剂，通过加热接枝聚合在微球表面引入功能基团。
优选的，每0.1～2毫升去离子水对应引入磁性四氧化三铁粒子的高分子微球0.1～1克、功能性单体0.1～1克、交联剂0.001～1克和引发剂0.00001～0.1克。更优选交联剂0.05～1克和引发剂0.0005～0.1克。
优选的，所述功能单体为甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯或丙烯酰胺。
优选的，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA或甲叉双丙烯酰胺。
优选的，所述引发剂为过硫酸铵APS、过氧化二苯甲酰BPO或偶氮二异丁腈AIBN。
优选的，所述加热接枝聚合的反应温度为55～90℃，反应时间为5～48个小时。
在一些具体实施例中，步骤S2包括：
首先，氯化铁、氯化亚铁或硫酸亚铁溶解在水中，三价铁和二价铁离子的摩尔比为1:2～2：1，然后以每0.1～2毫升铁离子溶液对应高分子微球0.1～1克的比例在0～100℃混合孵育1～48小时，然后加入氨水或氢氧化钠水溶液到孵育溶液中，使混合溶液pH值为11～13，温度在25～90℃条件下反应1～24小时，得到所述粒径均一的免疫微米磁珠。
然后，依旧以水为溶剂，上述得到的免疫微米磁珠与功能性单体、交联剂和引发剂反应来实现的，即每0.1～2毫升去离子水对应免疫微米磁珠0.1～1克、功能性单体0.1～1克、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)0.1～1克和引发剂过硫酸铵(APS)或过氧化二苯甲酰(BPO)0.001～0.1克；所述反应温度为55～90℃，反应时间为5～48个小时。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明创新了一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，也就是只在一个绿色溶剂水相中的分散聚合，通过加入分散剂使单体均匀分散，然后引发剂加热聚合。由于是均相分散聚合，所以微球的制备主要受分散剂的影响，不像乳液聚合不仅受分散剂的影响而且还受溶剂的影响，这样更容易控制聚合反应，得到的粒径更均一。
2)此外这也是目前所有文献和专利中唯一只采用绿色溶剂水去制备高分子免疫微米磁珠的方法，避免了溶剂的毒性。此方法由于在水相中进行，所有反应结束后，产物容易清洗和收集，避免了繁琐的清洗过程，大大缩短了工艺周期，因此非常适合大规模工业化生产。
3)解决免疫微米磁珠在复杂样本中可能存在非特异性吸附和分散不稳定的问题。本发明利用接枝聚合的方法在免疫微米磁珠表面包裹一层功能性高分子层，然后在这层高分子层表面引入各种功能基团，因此在水溶液中，这层高分子层大大降低了免疫微米磁珠的非特异性吸附，提高了免疫微米磁珠结合靶标分子的效率和载量，也增加了免疫微米磁珠在水溶液中分散的稳定性，增加了免疫微米磁珠在生理***如血液，组织液等的单分散性，进而解决免疫微米磁珠在生理环境下的稳定性，为后续细胞治疗和生物检测奠定基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明制备的粒径均一的1微米羧基免疫微米磁珠的显微镜图(目镜10X，物镜50X)；
图2是本发明制备的粒径均一的1微米氨基免疫微米磁珠的显微镜图(目镜10X，物镜50X)；
图3是本发明制备的粒径均一的1微米环氧基免疫微米磁珠的显微镜图(目镜10X，物镜50X)；
图4是本发明制备的粒径均一的2.8微米羧基免疫微米磁珠的显微镜图(目镜10X，物镜50X)；
图5是本发明制备的粒径均一的2.7微米氨基免疫微米磁珠的显微镜图(目镜10X，物镜50X)；
图6是本发明制备的粒径均一的2.7微米环氧基免疫微米磁珠的显微镜图(目镜10X，物镜50X)；
图7是对比例1制备的羧基微珠的显微镜图；
图8是对比例2制备的羧基微珠的显微镜图；
图9是对比例3制备的羧基微珠的显微镜图；
图10是对比例4制备的羧基微珠的显微镜图；
图11是对比例5制备的羧基微珠的显微镜图；
图12是对比例6制备的氨基微珠的显微镜图；
图13是对比例7制备的氨基微珠的显微镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，磁珠的制备方法包括以下步骤：
第一步，将反应物5克苯乙烯单体，2克甲基丙烯酸单体，分散剂1克聚乙二醇(分子量600)、0.5克Pluronic PE10100、2克聚乙烯醇1799型、0.5克吐温20和引发剂0.01克过硫酸铵(APS)分散在50毫升去离子水中，然后在60℃下，反应24小时，然后离心收集，用去离子水清洗5次，每次100毫升，清洗离心收集后，50℃烘箱干燥，得到粒径均一的1微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸微球。
第二步，在聚苯乙烯/甲基丙烯酸微球内部和表面镶入四氧化三铁纳米颗粒：3克六水氯化铁和3克四水氯化亚铁溶解在20毫升水中，2克1微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸微球在4℃混合孵育2小时，然后加入氨水到孵育溶液中，使混合溶液pH值为11，在50℃条件下反应16小时，离心清洗去除未镶入的四氧化三铁纳米颗粒，得到粒径均一的免疫微米磁珠。
第三步，通过接枝聚合的方法在聚苯乙烯/甲基丙烯酸微球表面引入羧基功能基团：聚苯乙烯/甲基丙烯酸磁珠分散在20毫升去离子水中，然后加入2克甲基丙烯酸、1克交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和0.008克引发剂过硫酸铵(APS)在70℃下，反应8个小时，得到粒径均一的、图1所示的1微米羧基免疫磁珠。
实施例2
本实施例涉及一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，磁珠的制备方法包括以下步骤：
第一步，将反应物6克苯乙烯单体，3克甲基丙烯酸甲酯单体，分散剂2克聚乙二醇(分子量300)、0.8克Pluronic PE10100、4克聚乙烯醇1799型、0.8克吐温20和引发剂0.02克过氧化二苯甲酰(BPO)分散在50毫升去离子水中，然后在60℃下，反应24小时，然后离心收集，用去离子水清洗5次，每次100毫升，清洗离心收集后，50℃烘箱干燥，得到粒径均一的1微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球。
第二步，在聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球内部和表面镶入四氧化三铁纳米颗粒：3克六水氯化铁和3克四水氯化亚铁溶解在20毫升水中，2克1微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球在60℃混合孵育2小时，然后加入氨水到孵育溶液中，使混合溶液pH值为12，在80℃条件下反应3小时，离心清洗去除未镶入的四氧化三铁纳米颗粒，得到粒径均一的免疫微米磁珠。
第三步，通过接枝聚合的方法在聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球表面引入氨基功能基团：聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯磁珠分散在20毫升去离子水中，然后加入2克功能单体丙烯酰胺、0.5克交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和0.01克引发剂过硫酸铵(APS)在70℃下，反应24个小时，得到粒径均一的、图2所示的1微米氨基免疫磁珠。
实施例3
本实施例涉及一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，磁珠的制备方法包括以下步骤：
将实施例1和2中的免疫微米磁珠通过接枝聚合的方法在磁珠表面引入环氧功能基团：将磁珠分散在30毫升去离子水中，然后加入3克功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、1克交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和0.02克过氧化二苯甲酰(BPO)在70℃下，反应12个小时，得到粒径均一的、图3所示的1微米环氧基免疫磁珠。
实施例4
本实施例涉及一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，磁珠的制备方法包括以下步骤：
第一步，将反应物8克苯乙烯单体，4克丙烯酸单体，分散剂2克聚乙二醇(分子量1000)、1克Pluronic PE10100、4克聚乙烯醇1799型、1克吐温20和引发剂0.5克过硫酸铵(APS)分散在50毫升去离子水中，然后在70℃下，反应24小时，然后离心收集，用去离子水清洗5次，每次100毫升，清洗离心收集后，50℃烘箱干燥，得到粒径均一的2.7微米聚苯乙烯/丙烯酸微球。
第二步，在聚苯乙烯/丙烯酸微球内部和表面镶入四氧化三铁纳米颗粒：3克六水氯化铁和3克四水氯化亚铁溶解在20毫升水中，2克2.7微米聚苯乙烯/丙烯酸微球在10℃混合孵育5小时，然后加入氨水到孵育溶液中，使混合溶液pH值为11，在50℃条件下反应24小时，离心清洗去除未镶入的四氧化三铁纳米颗粒，得到粒径均一的免疫微米磁珠。
第三步，通过接枝聚合的方法在聚苯乙烯/丙烯酸微球表面引入羧基功能基团：聚苯乙烯/丙烯酸磁珠分散在20毫升去离子水中，然后加入2克丙烯酸、1克交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和0.01克引发剂过硫酸铵(APS)在70℃下，反应16个小时，得到粒径均一的、图4所示的2.8微米羧基免疫磁珠。
实施例5
本实施例涉及一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，磁珠的制备方法包括以下步骤：
第一步，将反应物8克苯乙烯单体，3克甲基丙烯酸甲酯单体，分散剂2克聚乙二醇(分子量2000)、0.8克Pluronic PE10100、5克聚乙烯醇1799型、0.8克吐温80和引发剂0.05克过氧化二苯甲酰(BPO)分散在50毫升去离子水中，然后在70℃下，反应24小时，然后离心收集，用去离子水清洗5次，每次100毫升，清洗离心收集后，50℃烘箱干燥，得到粒径均一的2.6微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球。
第二步，在聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球内部和表面镶入四氧化三铁纳米颗粒：3克六水氯化铁和3克四水氯化亚铁溶解在20毫升水中，2克2.6微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球在80℃混合孵育1小时，然后加入氨水到孵育溶液中，使混合溶液pH值为11，在60℃条件下反应8小时，离心清洗去除未镶入的四氧化三铁纳米颗粒，得到粒径均一的免疫微米磁珠。
第三步，通过接枝聚合的方法在聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯微球表面引入氨基功能基团：聚苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯磁珠分散在20毫升去离子水中，然后加入3克功能单体丙烯酰胺、0.8克交联剂甲叉双丙烯酰胺和0.02克引发剂过硫酸铵(APS)在70℃下，反应24个小时，得到粒径均一的、图5所示的2.7微米氨基免疫磁珠。
实施例6
本实施例涉及一种绿色、简单快速、新颖的制备免疫微米磁珠的方法，磁珠的制备方法包括以下步骤：
第一步，将反应物10克苯乙烯单体，4克甲基丙烯酸-2-羟基乙酯单体，分散剂3克聚乙二醇(分子量10 000)、1克Pluronic PE10100、5克聚乙烯醇1799型、1克吐温80和引发剂0.05克过氧化二苯甲酰(BPO)分散在60毫升去离子水中，然后在80℃下，反应24小时，然后离心收集，用去离子水清洗5次，每次100毫升，清洗离心收集后，50℃烘箱干燥，得到粒径均一的2.6微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸-2-羟基乙酯微球。
第二步，在聚苯乙烯/甲基丙烯酸-2-羟基乙酯微球内部和表面镶入四氧化三铁纳米颗粒：3克六水氯化铁和3克四水氯化亚铁溶解在20毫升水中，2克2.6微米聚苯乙烯/甲基丙烯酸-2-羟基乙酯微球在80℃混合孵育2小时，然后加入氨水到孵育溶液中，使混合溶液pH值为12，在80℃条件下反应3小时，离心清洗去除未镶入的四氧化三铁纳米颗粒，得到粒径均一的免疫微米磁珠。
第三步，通过接枝聚合的方法在聚苯乙烯/甲基丙烯酸-2-羟基乙酯微球表面引入环氧基功能基团：聚苯乙烯/甲基丙烯酸-2-羟基乙酯磁珠分散在20毫升去离子水中，然后加入2克功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.5克交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和0.01克引发剂过硫酸铵(APS)在70℃下，反应24个小时，得到粒径均一的、图6所示的2.7微米环氧基免疫磁珠。
对比例1
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例1，所不同之处在于：分散剂为4g聚乙二醇(分子量600)，无Pluronic PE10100、聚乙烯醇1799型和吐温80。
本对比例制得的免疫磁珠，如图7所示得到粒径不均一的微球。
对比例2
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例1，所不同之处在于：分散剂为4g聚乙二醇(分子量4000)，无Pluronic PE10100、聚乙烯醇1799型和吐温80。
本对比例制得的免疫磁珠，如图8所示得到粒径不均一的微球。
对比例3
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例1，所不同之处在于：分散剂为4克聚乙烯醇1799型，无Pluronic PE10100、聚乙二醇和吐温80。
本对比例制得的免疫磁珠，如图9所示得到粒径不均一的微球。
对比例4
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例1，所不同之处在于：分散剂为1克聚乙二醇(分子量600)、0.5克Pluronic PE10100、2克聚乙烯醇1799型、无吐温20。
本对比例制得的免疫磁珠，如图10所示得到粒径不均一的微球。
对比例5
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例1，所不同之处在于：分散剂为1克聚乙二醇(分子量600)、0.5克吐温20、2克聚乙烯醇1799型、无Pluronic PE10100。
本对比例制得的免疫磁珠，如图11所示得到粒径不均一的纳米球。
对比例6
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例5，所不同之处在于：分散剂为5.8克聚乙二醇(分子量2000)和2.8克吐温80。
本对比例制得的免疫磁珠，如图12所示得到粒径不均一的微球。
对比例7
本对比例涉及一种制备免疫磁珠的方法，磁珠的制备方法基本同实施例1，所不同之处在于：用2克分散剂聚乙烯吡咯烷酮K30替代了2克聚乙烯醇1799型。
本对比例制得的免疫磁珠，如图13所示得到粒径不均一的微球。
综上所述，本发明在水中加入高分子单体、聚乙二醇(PEG，分子量300-20 000)、Pluronic PE10100、聚乙烯醇1799型和吐温(吐温20或吐温80)，充分分散，在引发剂过硫酸铵(APS)或过氧化二苯甲酰(BPO)的作用下加热聚合获得高分子微球微球，通过调节各反应物的比例和量、反应时间和温度等方法制备高分子微球，并对颗粒的大小和形状等进行表征，得到粒径均一的高分子微球。随后通过铁离子在碱性溶液中的化学共沉淀在高分子微球中引入磁性四氧化三铁粒子，并通过表面接枝聚合引入功能基团，即获得用于免疫诊断、即时检测和基因测序等的免疫微米磁珠。本发明有三个显著创新：1.绿色反应：整个操作过程都是在水溶液中进行，没有有机溶剂参与，是一种绿色环保的制备方法；2.简单快速：本制备方法是通过分散聚合一步法得到的高分子微球，比以前的通过种子溶胀的方法制备微球的过程更简单快速，大大缩短了工艺；3.新颖：是第一次在水溶液中通过分散聚合得到粒径均一的高分子微球和免疫微米磁珠的方法。因此，本发明的方法可用于实现高分子微球和免疫微米磁珠的大规模工业生产。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种均一粒径免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，所述免疫微米磁珠具有外壳为包裹的功能性高分子层，内核为高分子微球以及弥散在高分子微球内部和表面的Fe3O4纳米颗粒的核壳结构；所述方法包括如下步骤：
S1、以水为溶剂，高分子单体在分散剂和引发剂存在条件下，通过分散聚合一步法制备得到粒径均一的高分子微球；
S2、通过铁离子在碱性溶液中的化学共沉淀在高分子微球中引入磁性四氧化三铁粒子，并通过表面接枝聚合引入功能基团，即得粒径均一的免疫微米磁珠。
2.根据权利要求1所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，所述分散剂选择质量比为(0.05～1):(0.01～1):(0.1～2):(0.01～1)的聚乙二醇、Pluronic PE10100、聚乙烯醇和吐温的组合。
3.根据权利要求2所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇平均分子量为300-20 000；聚乙烯醇选用1799型；吐温选用吐温20或吐温80。
4.根据权利要求1所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，所述高分子单体选自苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种；所述引发剂为过硫酸铵APS、过氧化二苯甲酰BPO或偶氮二异丁腈AIBN。
5.根据权利要求1所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，所述分散聚合的反应温度为55～90℃，反应时间为5～48个小时。
6.根据权利要求1所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，每0.1～2毫升水对应高分子单体0.1～1克、聚乙二醇0.05～1克、Pluronic PE10100 0.01～1克、聚乙烯醇0.01～2克、吐温0.01～1克和引发剂0.00001～0.1克。
7.根据权利要求1所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S2中引入磁性四氧化三铁粒子具体为：以氯化亚铁或硫酸亚铁和氯化铁为原料，在铁离子的混合水溶液中加入所述高分子微球，混合孵育，然后加入氨水或氢氧化钠加热，通过共沉淀法在高分子微球内外部引入磁性四氧化三铁颗粒，得到粒径均一的微米磁珠。
8.根据权利要求7所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，铁离子的混合水溶液中Fe3+离子摩尔浓度为0.01摩尔/升～10摩尔/升，三价铁和二价铁离子的摩尔比为1:2～2:1；以每0.1～2毫升铁离子的混合水溶液对应高分子微球0.1～1克的比例在0～100℃混合孵育1～48小时；加入氨水或氢氧化钠使混合溶液pH值为11～13；共沉淀是在25～90℃条件下反应1～24小时。
9.根据权利要求1所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S2中引入功能基团具体为：将引入磁性四氧化三铁粒子的高分子微球超声分散在水中，然后加入功能单体、交联剂和引发剂，通过加热接枝聚合在微球表面引入功能基团。
10.根据权利要求9所述的免疫微米磁珠的制备方法，其特征在于，每0.1～2毫升去离子水对应引入磁性四氧化三铁粒子的高分子微球0.1～1克、功能性单体0.1～1克、交联剂0.001～1克和引发剂0.00001～0.1克；所述功能单体为甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯或丙烯酰胺；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA或甲叉双丙烯酰胺；所述引发剂为过硫酸铵APS、过氧化二苯甲酰BPO或偶氮二异丁腈AIBN；所述加热接枝聚合的反应温度为55～90℃，反应时间为5～48个小时。
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