CN115181194A - 一种果胶的快速纯化降解和结构解析方法 - Google Patents

一种果胶的快速纯化降解和结构解析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种果胶的纯化降解和结构解析方法。采用季铵强阴离子交换材料对果胶进行分离纯化，具有样品用量少、时间短、操作简单的特点；纯化得到的果胶，以过氧化氢为反应物，以抗坏血酸为催化剂进行降解，优化了基于芬顿体系的自由基降解(H2O2‑VC)法，使制备的果胶寡糖分子大小更适合质谱检测并减少结构丢失；最后采用HILIC‑MS/MS和生物信息学软件GlycReSoft 2.0联合分析，实现对质谱数据的自动定性和量化，解析果胶精细结构。

Description

一种果胶的快速纯化降解和结构解析方法
技术领域
本发明涉及植物果胶多糖寡糖领域，特别是涉及一种果胶的纯化降解和结构解析方法。
背景技术
果胶(Pectin)是一类富含半乳糖醛酸(GalA)的杂多糖，广泛存在于植物细胞的胞间层和初生壁中。现有研究根据果胶分子主链和支链结构的不同，大致将其分为4类结构域：同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan，HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(Rhamngalacturonan I，RGI)、鼠李半乳糖醛酸聚糖II(Rhamngalacturonan II，RGII)和木糖半乳糖醛酸聚糖(Xylogalacturonan，XG)。果胶结构复杂(50～1000kDa)，且粘度较大，根据来源、提取条件、植物发育阶段、植物种类、细胞壁位置和环境因素，果胶在其组成上也呈现多样化，至今关于果胶结构域的相对位置以及果胶中这些结构域之间如何连接仍有疑问。前期研究发现果胶的结构与其功能密切相关，不同结构的果胶在凝胶构成、肠道菌群调节和抗结肠炎等方面差异显著。因此，解析果胶精细结构是利用丰富果胶资源的前提。
对完整的果胶多糖结构解析十分困难。由于提取后的果胶粗多糖含有较多的杂质(蛋白质、多酚、淀粉和一些小分子物质等)影响后续分析，必须对其进行分离纯化。传统方法联合使用多级分离纯化、高碘酸-Smith降解、甲基化和核磁共振波谱等方法对果胶多糖解析存在耗时、操作繁琐、精细结构丢失的问题。因此，开发快速、高效、微量的果胶多糖精细结构解析方法成为了现在的必然趋势。
目前，越来越多的研究使用可控的方法将果胶降解成寡糖，并利用液相质谱联用技术分析。常用的多糖降解方法包括酸降解、酶法降解、自由基降解等。其中，酸降解反应剧烈、难控制，还会造成多糖精细结构的丢失；酶法降解具有特异性强、温和可控的优势，但相关酶种类少，不能完全降解复杂的果胶多糖。基于芬顿体系(H2O2)的自由基降解不同于酶解的特异性和酸法的反应剧烈，自由基降解可应用于所有种类的多糖，且可以通过相关条件使反应可控，不引起分支断裂或硫酸基团的损失，重现性好，此方法通常需要使用到金属Cu2+和Fe2+进行辅助超声，但这两种金属离子在反应之后需要采用一定的方法脱除，使反应时间延长，降低了分析效率。因而需要对自由基降解法进行改进，建立一种非金属的可控自由基降解方法。
发明内容
本发明目的是针对背景技术中提到的现有果胶结构解析方法不足，首次将季铵强阴离子交换层析柱应用于果胶的纯化分离，可以显著提升纯化效率；建立了果胶纯化后自由基降解方法，使得果胶降解彻底的同时减少结构丢失，尤其适用于LC-MS/MS检测，实现对果胶精细结构的解析；结合生物信息软件实现对质谱数据的快速处理(10min)，显著提升解析效率。
本发明提供一种针对果胶的快速纯化、果胶的非金属Fenton降解和对降解得到的果胶寡糖进行HILIC-MS/MS分析的方法，可用于果胶寡糖的制备以及果胶精细结构解析，具体包括：
1.果胶的纯化和降解
(1)将粗多糖溶液上样至层析柱进行洗脱分离，所述层析柱的填料为季铵型阴离子交换填料；
(2)将步骤(1)得到的洗脱液进行透析，冻干后得到果胶纯多糖；
(3)将步骤(2)得到的果胶纯多糖溶解于水中得到浓度为1～2mg/ml的果胶多糖水溶液；加入抗坏血酸，混合均匀后，加入过氧化氢溶液，在80～100℃条件下恒温反应；其中抗坏血酸浓度为10～12mM，所述过氧化氢溶液体积分数为1％，反应结束后冷冻干燥，得到果胶寡糖。
步骤(1)中，可采用本领域常用的收集方法来进行洗脱液的有效收集。例如，每分钟收集1管洗脱液，分析洗脱液的出峰位置检测洗脱液的成分，筛选出相同组分合并。
分析方法可以为微量苯酚-硫酸法：向40μL样品中加入20μL 5％(v/v)苯酚水溶液后，在加入200μL浓硫酸混合，静置显色15min，490nm波长下检测。也可以是微量间羟基联苯法：40μL样品中加入4μL氨基磺酸试剂，混匀后加入250μL浓硫酸，90℃烘箱孵育20min,冷却至室温，加入4μL间羟基联苯，混匀，525nm波长下检测。
进一步地，粗多糖溶液的浓度为5～6mg/mL。
进一步地，步骤(1)的洗脱程序为：0～10min去离子水、10～50min0～0.8mol/LNaCl溶液、50～60min 1mol/L NaCl溶液、60～70min去离子水，洗脱液流速2.5mL/min。
进一步地，步骤(3)中，恒温反应时间为6h。
进一步地，步骤(1)中的季铵型阴离子交换填料以琼脂糖凝胶为基质。
2.对上述所得果胶寡糖进行结构鉴定
本发明采用基于HILIC—MS/MS联合生物信息学软件的结构解析方法，具体方法如下：
a.将上述步骤(3)得到的果胶寡糖溶解于体积分数50％的乙腈水溶液中，浓度1～2mg/ml；
b.步骤a所得溶液使用超高效液相***结合飞行时间Q-TOF质谱对寡糖进行分离及质谱检测。
液相检测条件：超高效液相色谱仪Waters Acqtity UPLC classic；色谱柱UPLC-Amide(2.1×150mm,1.7μm)；流动相A相—20％乙腈+10mM甲酸铵+0.2％甲酸(v/v)，B相—80％乙腈+10mM甲酸铵+0.2％甲酸(v/v)；流速0.25mL/min；柱温35℃；时间梯度：0→35→50→55→56；浓度梯度：100％→70％→20％→20％→100％B相，进样体积：5μL。
质谱条件：Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪；负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100～1500；雾化气：55psi；雾化气：55psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：550℃；离子源电压(IS)：-4500V；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40±20eV，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
c.直接使用GlycReSoft 2.0软件自动获取和量化UPLC Q-TOF MS数据，包括两个步骤：首先建立果胶寡糖数据库；然后搜索样品中符合数据库结构的寡糖，具体参数设置如下：最小丰度：1.0；最小扫描次数：1；分子量下界：200；分子量上限：2,000；质量转移：CHOOH；匹配误差：5.0ppm；分组误差：80ppm；和加合物公差：5.0ppm。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的分离纯化采用新型强阴离子柱层析，相比于现有技术，可以保证填料的高结合载量、高流速并以高流速纯化粘性样本，具有微量高效快速、操作简单的优势，可将纯化时间由原来的1天缩短至1小时。
(2)本发明的降解方法采用改进的H2O2-VC技术，反应条件易控制、无金属离子、高效快速、降解效果好，使得果糖降解彻底的同时减少结构丢失，有利于后续LC-MS精细结构解析。
(3)本发明采用HILIC-MS/MS和生物信息学软件GlycReSoft 2.0联合，分析果胶寡糖的结构，实现了质谱数据的自动定性和量化，极大提升了结构解析速率，可将结构解析时间由2天缩短至10分钟。
附图说明
图1是本发明实施示意图；
图2柑橘果胶快速分离纯化图；
图3柑橘果胶纯化后的凝胶渗透色谱图；
图4柑橘果胶纯化样品Fenton降解后的Superdex Peptide 30色谱图；
图5柑橘果胶寡糖HILIC-MS/MS图；
图6是由GlycReSoft计算得到柑橘果胶寡糖定量结果；
图7柑橘果胶推测结构式；
图8苹果果胶快速分离纯化图；
图9苹果果胶纯化后的凝胶渗透色谱图；
图10苹果果胶纯化样品Fenton降解后的Superdex Peptide 30色谱图；
图11苹果果胶寡糖HILIC-MS/MS图；
图12是由GlycReSoft计算得到苹果果胶寡糖定量结果；
图13柑橘果胶传统强阴离子色谱分离纯化图；
图14SCP0.4M的核磁谱图；a：1H NMR；b：13C NMR；c：13C NMR(160～185ppm)；d：13CNMR(160～185ppm)(D2O，25℃)。。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明实施过程如图1所示，下面根据实例进一步描述本发明。
实例一：柑橘果胶寡糖的制备及结构鉴定
使用HiTrap Capto Q强阴离子交换柱进行分离纯化。样品浓度10mg/mL，12000rpm离心20min，上样2.5mL，梯度洗脱溶液最高浓度是1mol/L NaCl溶液，蠕动泵控制流速2.5mL/min，梯度洗脱：0～10min,0mol/L NaCl；10～50min,0～0.8mol/L NaCl；50～60min,1mol/L NaCl；60～70min,0mol/L NaCl。每1min收集一管，并测定总糖和糖醛酸含量，绘制洗脱曲线。分别收集合并洗脱曲线上同一个峰的样品，10kDa透析后冻干，洗脱情况如图2所示，根据其出峰顺序分别命名为SCPW，SCP1，SCP2，SCP3，SCP4，SCP5回收率(质量分数)分别为4.3％、8.5％、10.3％、10.7％、20.6％、6.2％，总回收率高达60.6％，显著提升了纯化效率。纯化后柑橘果胶(SCP4)的凝胶色谱图如图3所示，其分子量为76.18kDa，Mw/Mn＝2.61，比对纯化前SCP(Mw/Mn＝4.65)，纯化显著提升了多糖样品的均一性。
取6mg纯化后的SCP4，完全溶解于6ml新配置的10mmol/L抗坏血酸水溶液中，再加入60μL 30％的过氧化氢溶液，将反应体系置于100℃条件下恒温反应6h，之后冷冻干燥，得到柑橘果胶(SCP4)寡糖，柑橘果胶(SCP4)寡糖的Superdex Peptide 30色谱图如图4所示，可以看到经过Fenton降解后，SCP4几乎完全被降解成聚合度(DP)2～10的寡糖。将寡糖重新溶解于50％(v/v)乙腈水溶液，过膜后在HILIC-MS/MS***中进样，数据使用Decon Tools反卷积之后使用GlycReSoft 2.0进行定量分析，分析结果如图5和图6所示，从数据分析结果可以看出，SCP4中最要以HG为主，含有少量的RG-I结构域，仅有少量的单糖被检测到，进一步说明非金属Fenton降解SCP4彻底，且结构丢失少。根据分析结果，推测SCP4结果可能如图7所示。
实例二：苹果果胶寡糖的制备及结构鉴定
使用HiTrap Capto Q强阴离子交换柱进行分离纯化。样品浓度10mg/mL，12000rpm离心20min，上样2.5mL，梯度洗脱最高浓度溶液是1mol/L NaCl溶液，蠕动泵控制流速2.5mL/min，梯度洗脱：0～10min,0mol/L NaCl；10～50min,0～0.8mol/L NaCl；50～60min,1mol/L NaCl；60～70min,0mol/L NaCl。每1min收集一管，并测定总糖和糖醛酸含量，绘制洗脱曲线。分别收集合并洗脱曲线上同一个峰的样品，10kDa透析后冻干，洗脱情况如图8所示，根据其出峰顺序分别命名为SAPW，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP5，SAP6，回收率(质量分数)分别为8.4％、6.3％、14.6％、18.9％、10.7％、3.3％，总回收率高达62.2％，显著提升纯化效率。纯化后苹果果胶(SAP3)的凝胶色谱图如图9所示，其分子量为45.82kDa，Mw/Mn＝1.78，比对纯化前SAP(Mw/Mn＝4.65)，纯化显著提升了多糖样品的均一性。
取6mg纯化后的SAP3，完全溶解于6mL新配置的10mmol/L抗坏血酸水溶液中，再加入60μL 30％的过氧化氢溶液，将反应体系置于100℃条件下恒温反应6h，之后冷冻干燥，得到苹果胶(SAP3)寡糖。苹果胶(SAP3)寡糖的Superdex Peptide 30色谱图如图10所示，可以看到经过Fenton降解后，SAP3几乎完全被降解成DP 2～10的寡糖。将寡糖重新溶解于50％乙腈水溶液，过膜后在HILIC-MS/MS***中进样，采用一级质谱和二级质谱分析，结果如图11，图11显示了SAP3寡糖结构，从图中可以看出果胶降解彻底，且结构丢失少。数据使用Decon Tools反卷积之后使用GlycReSoft进行定量分析，分析结果如图12所示，从数据分析结果可以看出，相比SCP4，SAP3中拥有更多的RG-I结构域，***聚糖和半乳糖聚糖通过O-4与RG-I链接，HG和RG-I的占比3:1。
对比例1：柑橘果胶寡糖的制备和结构解析
将300mL QFF填料装入2.6×30mL玻璃层析柱中，对柑橘果胶进行分离纯化。由于层析柱填料不同，需对应调整实验参数。样品浓度16mg/mL，8000r/min离心20min，上样50mL，梯度洗脱最高浓度溶液是0.6mol/L NaCl溶液，蠕动泵控制流速3mL/min，梯度洗脱：分别用0～120min，蒸馏水；120～240min，0.2mol/L；240～360min，0.4mol/L；360～480min，0.6mol/LNaCl，每5min收集一管，并测定总糖和糖醛酸含量，绘制洗脱曲线。分别收集合并洗脱曲线上同一个峰的样品，10kDa透析后冻干。洗脱情况如图13所示，根据其出峰顺序分别命名为SCP0M、SCP0.2M、SCP0.4M，回收率(质量分数)分别为4.5％、19.75％和21.24％，总回收率44.99％，显著低于HiTrap Capto Q强阴离子交换柱，且纯化耗时1天。
由于并没对样品进行降解，故采用核磁技术对SCP 0.4M结构解析，耗时3天，如图14所示，结构信息相较质谱有部分的丢失，能揭示部分中性糖(1-4linked Gal,1-5linkedAra)、半乳糖醛酸主链信息(1-4linked GalA)，并且数据处理需要花费2天，阻碍了果胶结构解析效率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种果胶的纯化降解方法，其特征在于，该方法至少包括：
(1)将粗多糖溶液上样至层析柱进行洗脱分离，所述层析柱的填料为季铵型阴离子交换填料；
(2)将步骤(1)得到的洗脱液进行透析，冻干后得到果胶纯多糖；
(3)将步骤(2)得到的果胶纯多糖溶解于水中得到浓度为1～2mg/ml的果胶多糖水溶液；加入抗坏血酸，混合均匀后，加入过氧化氢溶液，在80～100℃条件下恒温反应；其中抗坏血酸浓度为10～12mM，所述过氧化氢溶液体积分数为1％，反应结束后冷冻干燥，得到果胶寡糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，粗多糖溶液的浓度为5～6mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的洗脱程序为：0～10min去离子水、10～50min 0～0.8mol/L NaCl溶液、50～60min 1mol/L NaCl溶液、60～70min去离子水，洗脱液流速2.5mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，恒温反应时间为6h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的季铵型阴离子交换填料以琼脂糖凝胶为基质。
6.一种基于质谱的果胶精细结构快速解析方法，其特征在于：将权利要求1所得到的果胶寡糖，采用HILIC-MS/MS和生物信息学软件GlycReSoft 2.0联合分析，实现对质谱数据的自动定性和量化，解析果胶精细结构。
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