CN115161319B - 一种响应潜艇金属Ni2+离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用。所述启动子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示，其具有显著提高金属Ni²⁺检测灵敏度的能力。本发明还利用所述启动子元件转录表达NAD⁺合成酶和甲酸脱氢酶基因制备得到了电化学信号输出传感器，其通过提高胞内电子池(NAD⁺)总量和NADH/NAD⁺的比值，实现了感应潜艇金属Ni²⁺离子后电化学信号的输出，为筛选高效诱导型启动子及检测方式提供了新的思路和方法，并提高了金属Ni²⁺检测的准确性、安全性和效率。

Description

一种响应潜艇金属Ni2+离子的启动子元件及其制备的电化学 信号输出传感器和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用。

背景技术

潜艇由于其隐蔽性高、打击力强的特点，已经成为现代海军的重要组成部分。同时，潜艇作为海洋军事侦查的重要力量，对敌方能够造成巨大威胁。因此，如何实现我国海岸线周边活动潜艇的高效准确探测，是我国海洋防务重点关注的领域。当前潜艇探测方法主要分为声呐探潜和非声探潜，其中非声探潜包括红外、电磁信号检测等等。然而，这些传统的探潜方式存在易暴露、干扰大等不同程度的局限性。近年来，随着现代微生物学及分子生物学技术的快速发展，微生物传感器技术开始受到广泛关注。微生物传感器可以感应环境中各类因素的细微变化，并向外界输出易于被检测的生物信号。因此，基于潜艇舰体及循环水管道释放的金属离子检测的微生物传感器的开发具有重要前景。通过对潜艇合金组成及海水中金属离子分析发现，潜艇合金中含金属镍，而海水中几乎不含该金属元素，因此金属Ni²⁺可作为响应潜艇金属离子的生物传感器的诱导物。目前，开发用于检测潜艇金属离子的生物传感器的主要挑战是高效感应元件的筛选。

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是一种紫色非硫细菌(purplenon-sulfur bacteria，PNSB)，在自然界中分布很广泛，主要分布在光照充足的厌氧水环境中，它们既能在厌氧光照条件下以低级脂肪酸、多种二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机物作为光合作用的电子供体进行光能异养生长，又能在黑暗有氧条件下以有机物为呼吸基质进行好氧异养生长。同时，该假单胞菌属在生长时需要金属Ni元素作为微量元素，且其基因组中存在金属Ni相关的编码基因。另外，在海水中传统光学信号的传输受到很多因素的干扰，所以通过荧光信号等建立的传感器具有很大的局限性。而结合微生物生理代谢的特点，利用感应金属Ni²⁺离子的启动子元件实现NAD⁺合成酶和甲酸脱氢酶基因的响应表达，提高胞内电子池(NAD⁺)总量和NADH/NAD⁺的比值，通过构建电化学装置实现感应金属Ni²⁺离子后电化学信号的输出，为筛选探潜的高效微生物传感器提供了新的思路和方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用。本发明基于转录组学筛选到高效响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件，并利用该启动子元件与NAD⁺合成酶、甲酸脱氢酶基因制备得到电化学信号输出传感器，通过提高胞内电子池(NAD⁺)总量和NADH/NAD⁺的比值，实现了感应潜艇金属Ni²⁺离子后电化学信号的高输出。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件，所述启动子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述启动子元件来源于沼泽红假单胞菌，是利用转录组学筛选得到的。

进一步的，利用转录组学筛选到的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的启动子元件P₀₇₂₄能够以高灵敏度响应潜艇金属Ni²⁺离子。

进一步的，由所述启动子元件P₀₇₂₄经定向进化优化后，得到的核苷酸序列如SEQID NO.3所示的启动子元件P_0724-1对潜艇金属Ni²⁺离子的响应灵敏度显著提高。

本发明还提供了一种包含所述的启动子元件的电化学信号输出传感器，所述电化学信号输出传感器中包括响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件、NAD⁺合成酶基因和甲酸脱氢酶基因。

进一步的，所述电化学信号输出传感器中同时包含响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件、NAD⁺合成酶基因和甲酸脱氢酶基因。

进一步的，所述NAD⁺合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，所述NAD⁺合成酶基因来源于Rhodopseudomonas palustris；所述甲酸脱氢酶基因来源于Candida boidinii。

本发明还提供了所述的电化学信号输出传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用金属Ni²⁺溶液刺激沼泽红假单胞菌，提取刺激后的沼泽红假单胞菌的RNA进行转录组学分析，找到上调基因；

(2)以沼泽红假单胞菌的基因组为模板，扩增所述上调基因，得到待验证启动子；

(3)将所述待验证启动子与荧光报告基因进行连接，并利用金属Ni²⁺溶液进行荧光检测验证，筛选得到能够响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件；

(4)将所述启动子元件与NAD⁺合成酶基因、甲酸脱氢酶基因分别连接，克隆至表达载体pBBR1MCS-5中，得到含有启动子元件的重组表达质粒pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P；

(5)将所述重组表达质粒pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P通过接合转移的方式接合至沼泽红假单胞菌中，得到重组工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)，即为电化学信号输出传感器。

进一步的，所述荧光报告基因为绿色荧光蛋白基因eGFP，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步的，所述重组工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)能够在感应金属Ni²⁺离子后诱导表达NAD⁺合成酶和甲酸脱氢酶，实现胞内电子池(NAD⁺)总量和NADH/NAD⁺比值的提高。

本发明还提供了所述的启动子元件在用于制备检测金属Ni²⁺离子的表达盒、试剂盒或制剂中的应用。

进一步的，检测所述金属Ni²⁺离子的浓度不低于0.1μmol/L。

本发明还提供了所述的启动子元件或者所述的电化学信号输出传感器在用于制备检测潜艇金属的电化学装置中的应用。

进一步的，所述电化学装置是利用碳毡、Ag/AgCl校正电极与含有启动子元件的工程菌或者电化学信号输出传感器共同组成的。

进一步的，当所述电化学装置检测到潜艇金属Ni²⁺离子时，其电流密度明显增加，导致电化学信号输出明显提高。

进一步的，所述潜艇金属为Ni²⁺离子，其浓度不低于0.1μmol/L。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过用金属Ni²⁺离子刺激沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，分析转录组学变化，筛选得到响应金属Ni²⁺离子的启动子元件，并通过定向进化进一步提高其检测灵敏度，得到的启动子元件P_0724-1具有显著提高潜艇金属Ni²⁺检测灵敏度的能力。本发明的筛选方法简单，使用方便，安全性高。本发明的方法颠覆了传统检测技术，能够通过金属Ni²⁺刺激后沼泽红假单胞菌转录组学的变化，有目的性和选择性的从沼泽红假单胞菌基因组中筛选可受金属Ni²⁺诱导感应元件。

本发明进一步将金属Ni²⁺诱导感应的元件启动子与NAD⁺合成酶基因和甲酸脱氢酶基因连接表达，实现胞内电子池(NAD⁺)总量和NADH/NAD⁺比值的提高，可通过电化学装置实现电化学信号的输出。这不仅为获得高效诱导型启动子和构建高效探潜微生物传感器提供了新的思路和方法，同时筛选出的启动子元件可用于生态***中的环境污染物的检测，高效微生物电化学传感器的开发对军事、反恐和环保等都有重要的意义。

附图说明

图1为筛选出的P₀₇₂₄新型启动子酶标仪检测结果。

图2为优化后的P_0724-1新型启动子酶标仪检测结果。

图3为搭建的沼泽红假单胞菌三电极体系电化学装置。

图4为工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)感应有无金属Ni²⁺离子后电化学信号输出图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1：高效感应金属Ni²⁺离子的启动子元件的筛选及定向进化

(1)用终浓度为1μmol/L的金属Ni²⁺溶液刺激沼泽红假单胞菌后，以等体积水刺激作为阴性对照，分别提取RNA，进行高通量转录组测序分析。

(2)将转录差异表达基因的预测启动子区域分别与绿色荧光蛋白基因eGFP(如SEQID NO.1所示)连接后克隆到pACYCDuet-1质粒，验证正确后，设置金属Ni²⁺溶液诱导后进行荧光检测，用酶标仪(Biotek)恒温30℃实时监测菌株荧光强度，每20min进行一次检测，共监测12h。

利用转录组学数据初筛时共构建筛选了76个启动子，其中P₀₇₂₄启动子在不同浓度金属Ni²⁺溶液中有较强的响应，并且随着溶液中金属Ni²⁺浓度的升高，荧光值也逐渐增强(图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。表明本发明通过一定浓度金属Ni²⁺溶液刺激沼泽红假单胞菌进行转录组学研究的方法，筛选出了一个能够感应金属Ni²⁺的启动子元件P₀₇₂₄。

(3)利用易错PCR扩增P₀₇₂₄启动子片段，连接eGFP筛选载体转化后，对共计约6000个转化子进行后续筛选，结果经过定向进化后筛选获得感应效果更好的P_0724-1启动子，其酶标仪检测结果如图2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，响应金属Ni²⁺的荧光强度明显增强，且在检测最低浓度0.1μmol/L时，也出现较为明显的荧光信号，相比于未定向进化前的启动子，检测限明显提高。

实施例2：工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)的构建

(1)以Rhodopseudomonas palustris基因组为模板，分别PCR扩增获得P_0724-1启动子片段和NADs基因片段(如SEQ ID No.4所示)，以Candida boidinii基因组为模板，PCR扩增获得fdh基因片段(如SEQ ID No.5所示)，验证回收后，通过overlap PCR获得P_0724-1-NADs和P_0724-1-fdh融合片段，进一步overlap PCR后获得P_0724-1-NADs-fdh-P_0724-1片段。

①以P_0724-1启动子为模板，使用引物F1(GGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCGGCAGCATCGTGGTCGGGATGA)和R1(CTTCGGTCATGGCGGTCTCCGGCCGGTGAGCA)，扩增获得P_0724-1-1片段；

②以P_0724-1启动子为模板，使用引物F2(AACGATCTTCATGGCGGTCTCCGGCCGGTGAGCA)和R2(ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCCGGCAGCATCGTGGTCGGGATGA)，扩增获得P_0724-1-2片段；

③以Rhodopseudomonas palustris基因组为模板，使用引物F11(GAGACCGCCATGACCGAAGCCGCCCGCCTGA)和R11(CGATAAGAAATAACTACCCCTCGAACGCCTCGCT)，扩增获得NADs基因片段；

④以Candida boidinii基因组为模板，使用引物F22(CGAGGGGTAGTTATTTCTTATCGTGTTTACCG)和R22(AGACCGCCATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT)，扩增获得fdh片段；

⑤以P_0724-1-1片段和NADs基因片段为模板，使用引物F1(GGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCGGCAGCATCGTGGTCGGGATGA)和R11(CGATAAGAAATAACTACCCCTCGAACGCCTCGCT)，overlapPCR融合后扩增获得P_0724-1-NADs片段；

⑥以P_0724-1-2片段和fdh片段为模板，使用引物F22(CGAGGGGTAGTTATTTCTTATCGTGTTTACCG)和R2(ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCCGGCAGCATCGTGGTCGGGATGA)，overlap PCR融合后扩增获得P_0724-1-fdh片段；

⑦以P_0724-1-NADs片段和P_0724-1-fdh片段为模板，使用引物F1(GGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCGGCAGCATCGTGGTCGGGATGA)和R2(ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCCGGCAGCATCGTGGTCGGGATGA)，overlap PCR融合后获得P_0724-1-NADs-fdh-P_0724-1片段。

(2)使用无缝克隆技术将P_0724-1-NADs-fdh-P_0724-1片段与线性化的pBBR1MCS-5质粒片段进行in-fusion，融合体系转化至E.coli S17-1感受态细胞。

(3)进行菌落PCR验证，进一步测序获得连接正确的E.coli S17-1/pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P菌株。

(4)质粒pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P接合转移至Rpal菌中，详细步骤如下：

①沼泽红假单胞菌CGA009于PM(乙酸钠)液体培养基中30℃光照静置培养，重组菌株(E.coli S17-1/pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)于带有Gm抗生素的10ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜活化。

②待CGA009生长至OD660＝0.4时，1％转接重组菌株于液体LB中，37℃，200rpm，培养3h。

③于超净台中，取2ml CGA009菌液和1ml重组菌菌液于1.5ml EP管中，4℃，10000rpm，离心1min；完全去除上清，分别用1ml无菌PM液体培养基，冲悬菌体，4℃，10000rpm，离心1min。重复1次。

④完全去除上清，CGA009与重组菌株中分别加入100μl和200μl无菌PM液体培养基冲悬。

⑤吸取100μl冲悬重组菌菌液，加入至CGA009菌液中，混匀；吸取所有混合菌液，缓慢的滴至CA平板的正中央。

⑥在超净台中静置3h以上至菌液完全干后封口，30℃暗培养箱中，正置24h后，倒置36h培养。

⑦超净台中，用接菌环挑取CA平板菌落边缘***的菌体，三区画线至PMS-Gm平板，倒置于30℃暗培养箱中培养。

⑧出现单菌落后，挑取3个单菌落，小三区画线至PMS-10％蔗糖平板，倒置于30℃暗培养箱中培养。

⑨在PMS-10％蔗糖平板上用10μl枪头挑取52个单菌落，分别画至PMS-Gm-10％蔗糖平板和PMS-10％蔗糖平板，倒置于30℃暗培养箱中培养。

⑩出现单菌落后，进行菌落PCR验证，进一步测序后，获得工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)。

实施例3：工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)三电极体系化学装置的构建(图3)

(1)准备3cm×4cm、3cm×3cm的碳毡和Ag/AgCl校正电极分别作为对电极、工作电极和参比电极；配置20mM的碳酸氢钠溶液作为电子受体；配置饱和KCl琼脂作为盐桥；准备灭菌的50mL离心管及不加电子供体的培养基。

(2)100mL琼脂微波炉加热，快速加入30g KCl并搅拌，在凝固之前，用胶头滴管吸入饱和KCl琼脂，待凝固之后在滴管上部加入饱和KCl溶液，以连接参比电极；

(3)用超纯水洗净碳毡，将碳毡使用丙酮浸泡并超声30min，重复两次后浸泡24h；随后用1mol/L HCl浸泡超声30min，重复两次后再浸泡24h；最后用超纯水超声30min，重复两次，浸泡24h后用超纯水洗净，放置烘箱烘干。

(4)将制备好的碳毡电极，用钛丝引入到100mL蓝盖瓶反应器中，工作电极要被对电极充分覆盖，以保证工作电极充分利用以及唯一变量性。

(5)待转接的工程菌Rpal(pBBR1MCS-5-P-NADs-fdh-P)培养至OD＝1.0，5000×g离心5min收集菌体，使用不加电子供体的培养基洗涤重悬，将50mL的菌液加入到50mL不含电子供体的血清瓶培养基中，放入光照培养箱中，完成该工程菌三电极体系电化学装置的构建。

实施例4：工程菌感应有无金属Ni²⁺离子后电化学装置的检测及信号输出

(1)三电极体系中绿色接工作电极，红色接对电极，白色是参比电极。

(2)参数设置：Sample Interval(sec)为60s；Sampling Time为1e+007；QuietTime(sec)为1000s；Scales during Run为1；Sensitivity(A/V)为1e-003。

(3)装置中分别设置无金属Ni²⁺离子和0.1μmol/L金属Ni²⁺离子，启动电化学装置后，记录i-t曲线。

如图4所示，无金属Ni²⁺离子时，电化学装置记录的最高电流密度约为1-2μA/cm²，而0.1μmol/L金属Ni²⁺离子响应后，出现明显的电化学信号，最高电流密度达到近35μA/cm²，表明金属探测元件响应潜艇金属Ni²⁺离子后，通过NAD⁺合成酶和甲酸脱氢酶的基因表达增强，实现胞内电子池(NAD⁺)总量和NADH/NAD⁺的比值得到提升，最终通过电化学装置实现了电化学信号的增强。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种响应潜艇金属Ni2+离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用

<141> 2022-06-08

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

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cttgagtttg taacagctgc tgggattacc catggtatgg atgaattgta caaataa 717

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<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

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gggcagcact tgaccgggaa ggtgaaggat tgcgacgact cgtgagccag gagaccggcc 360

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<210> 4

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<212> DNA

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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tatggttgta ctgaaaataa attaggtatt gctaattggt taaaagatca aggtcatgaa 120

ctaattacta cttctgataa agaaggtgaa acaagtgaat tggataaaca tatcccagat 180

gctgatatta tcatcaccac tcctttccat cctgcttata tcactaagga aagacttgac 240

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gattatatta atcaaacagg taagaaaatc tcagtcttgg aagttacagg ttctaatgtt 360

gtctctgttg ctgaacacgt tgtcatgacc atgcttgtct tggttagaaa tttcgttcca 420

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gatatcgaag gtaaaactat tgctaccatt ggtgctggta gaattggtta cagagtcttg 540

gaaagattac tcccttttaa tccaaaagaa ttattatact acgattatca agctttacca 600

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cacgataaga aataa 1095

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatcccccg ggctgcagga attccggcag catcgtggtc gggatga 47

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttcggtcat ggcggtctcc ggccggtgag ca 32

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacgatcttc atggcggtct ccggccggtg agca 34

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actaaaggga acaaaagctg ggtacccggc agcatcgtgg tcgggatga 49

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagaccgcca tgaccgaagc cgcccgcctg a 31

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgataagaaa taactacccc tcgaacgcct cgct 34

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgaggggtag ttatttctta tcgtgtttac cg 32

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agaccgccat gaagatcgtt ttagtcttat 30

Claims (8)

1.一种响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件，其特征在于，所述启动子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示。

2.一种包含权利要求1所述的启动子元件的电化学信号输出传感器，其特征在于，所述电化学信号输出传感器中包括响应潜艇金属Ni²⁺离子的启动子元件、NAD⁺合成酶基因和甲酸脱氢酶基因。

3.根据权利要求2所述的电化学信号输出传感器，其特征在于，所述NAD⁺合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.权利要求1所述的启动子元件在用于制备检测金属Ni²⁺离子的表达盒、试剂盒或制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测所述金属Ni²⁺离子的浓度不低于0.1 μmol/L。

6.权利要求1所述的启动子元件或者权利要求2所述的电化学信号输出传感器在用于制备检测潜艇金属Ni²⁺的电化学装置中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述电化学装置是利用碳毡、Ag/AgCl校正电极与含有启动子元件的重组工程菌或者电化学信号输出传感器共同组成的。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，当所述电化学装置检测到潜艇金属Ni²⁺离子时，其电流密度明显增加，导致电化学信号输出明显提高。