CN115151567A - 治疗性Fc组合物的化学诱导结合和解离以及T细胞接合器与人血清白蛋白的化学诱导二聚化 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种***，该***通过由小分子诱导治疗部分与Fc结构域的结合或解离，使得能够对治疗部分的血清半衰期进行精确的时间控制。本发明还提供了一种***，该***通过并入化学诱导二聚体(CID)使得能够精确控制T细胞接合器结构域的血清半衰期。CID的一半与T细胞接合器融合，并且CID的另一半与HSA结合结构域融合。添加或去除小分子诱导T细胞接合器与HSA的结合或解离，从而使得能够对T细胞接合器的血清半衰期进行精确的时间控制。

Description

治疗性Fc组合物的化学诱导结合和解离以及T细胞接合器与 人血清白蛋白的化学诱导二聚化

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月23日提交的美国临时申请62/953,003和于2019年12月23日提交的美国临时申请62/952,984的优先权，其内容都通过引用整体明确地并入。

技术背景

T细胞接合器(T cell engager)是抗体衍生的治疗剂，其经由T细胞受体复合物(TCR)将T细胞暂时束缚到肿瘤细胞上的表面抗原。这导致T细胞的活化和T细胞诱导的所附着靶肿瘤细胞的裂解的方向。T细胞接合器的治疗潜力被博纳吐单抗(blinatumomab)(一种批准用于治疗患有复发性/难治性急性淋巴细胞性白血病的成年患者的CD19/CD13双特异性T细胞接合器)证明。尽管T细胞接合疗法取得了成功，但是现有的T细胞接合器的不足之处之一是血清半衰期短。

已经进行改进以解决T细胞接合器的短血清半衰期，例如，通过将T细胞接合器与人血清白蛋白(HSA)或Fc结构域融合(Merlot等,Future Med Chem.2015；7:553-556；Kontermann等,Chem Biotechnol.Pharm Biotechnol.2011；22:868–876)。

人血清白蛋白(HSA)(分子量约67kDa)是血浆中最丰富的蛋白质，以约50mg/ml存在，并且在人中的半衰期为约20天。HSA用于维持血浆pH，有助于胶体血压，充当许多代谢物和脂肪酸的载体，并且用作血浆中的主要药物转运蛋白。与白蛋白的非共价结合延长了短寿命蛋白质的消除半衰期。例如，与单独施用Fab片段相比，当分别向小鼠和兔静脉内施用时白蛋白结合结构域与Fab片段的重组融合导致体内清除率为25倍和58倍，半衰期延长26倍和37倍(Dennis等,J Biol Chem.2002；277(38):35035-43)。在另一实例中，当胰岛素被脂肪酸酰化以促进与白蛋白结合时，当在兔或猪中皮下注射时观察到延长效应(Kurtzhals等,Biochem.J.1995；312:725-731)。总之，这些研究证明了白蛋白结合和延长作用之间的联系。

基于Fc的融合蛋白由与另一肽直接连接的免疫球蛋白Fc结构域组成。融合的配偶体可以是任何其他目标蛋白质分子，例如在与细胞表面受体相互作用时活化的配体、针对具有挑战性的病原体的肽抗原或用于鉴定组装在蛋白质微阵列中的结合配偶体的“诱饵”蛋白。但是最常见的是，融合的配偶体具有显著的治疗潜力，并且它们附着于Fc结构域以赋予杂交体许多另外的有益生物学和药理学特性。最重要的有益特性之一是Fc结构域的存在显著增加了它们的血浆半衰期，这延长了治疗活性，这是由于它与挽救性新生儿Fc受体的相互作用(FcRn；Roopenian&Akilesh,Nat Rev Immunol.2007；7(9):715-25)以及较大尺寸分子的较慢肾脏清除率(Kontermann,Curr Opin Biotechnol.2011；22(6):868-76)。所附着Fc结构域还使得这些分子能够与免疫细胞上发现的Fc受体(FcR)相互作用，该特征对于它们在肿瘤治疗和疫苗中的用途特别重要(Nimmerjahn&Ravetch,Nat Rev Immunol.2008；8(1):34-47)。从生物物理学的角度来看，Fc结构域独立折叠，并且可以提高配偶体分子在体外和体内的溶解度和稳定性，而从技术角度来看，在制造期间Fc区允许通过蛋白质-G/A亲和色谱法的经济高效的纯化(Carter,Exp Cell Res.2011；317:1261–1269)。

尽管在通过将生物制剂与Fc结构域融合来延长其血清半衰期方面取得了努力和进步，但是迄今为止，血清半衰期的延长是不可调节的。本发明通过提供一种***来满足开发更先进疗法的需要，该***使得能够对生物制剂的血清半衰期进行精确的时间控制，并且这样做使得能够向患者更安全且更有效地施用生物制剂。

发明内容

本发明提供了一种用于T细胞接合器的血清半衰期的可调节控制***。在一方面，本发明提供组合物，所述组合物包含(1)异源二聚体Fc融合蛋白，该异源二聚体Fc融合蛋白包含第一单体，其包含第一化学诱导二聚体(CID)结构域和IgG的第一Fc结构域，其中所述第一CID结构域与所述第一Fc结构域共价连接；和第二单体，其包含所述IgG的第二Fc结构域；以及(2)融合蛋白部分，其包含第二CID结构域和治疗部分，其中所述第二CID结构域在N或C端与所述治疗部分共价连接。在CID小分子的存在下，第一CID结构域和CID第二结构域形成第一CID结构域-CID小分子-第二CID结构域的复合物。

在一些实施方案中，所述CID小分子选自FK1012、利米多赛、FK506、FKCsA、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、香豆霉素、赤霉素、HaXS、TMP-tag、ABT-737。

在一些实施方案中，第一CID结构域-CID小分子-第二CID结构域选自FKBP-FK1012-FKBP、变体FKBP-利米多赛-变体FKBP、FKBP-FK506-钙调磷酸酶、FKBP-FKCsA-CyP-Fas、FKBP-雷帕霉素-FRB、变体FKBP-雷帕霉素类似物-变体FRB、GyrB-香豆霉素-GyrB、GAI-赤霉素-GID1、SNAP-tag-HaXS-HaloTag、eDHFR-TMP-tag-HaloTag和AZ1-ABT-737-BCL-xL，其中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域可以交换在复合物中的位置。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述CID小分子是甲氨蝶呤。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域是BCL-2或其变体，所述CID小分子是ABT-199或ABT-263，并且所述第二CID结构域包含能够与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述第一CID结构域是BCL-2或BCL-2(C158A)，所述CID小分子是ABT-199，并且所述第二CID结构域包含可变重结构域(VH)，其包含包含SEQ ID NO：1的vhCDR1、包含SEQ ID NO：72的vhCDR2、包含SEQID NO：129的vhCDR3；和可变轻结构域(VL)，其包含包含SEQ ID NO：310的vlCDR1、包含SEQID NO：311的vlCDR2和包含SEQ ID NO：233的vlCDR3。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域是Bcl-xL的ABT-737结合结构域，所述CID小分子是ABT-737，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域是FKBP的雷帕霉素结合结构域，所述CID小分子是雷帕霉素，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域是cIAPl的GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427或比瑞那帕结合结构域，所述CID小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427或比瑞那帕，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域是cereblon的沙利度胺结合结构域，所述小分子是沙利度胺、来那度胺或泊马度胺，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、肽和抗体药物缀合物。在一些实施方案中，所述治疗部分是双特异性抗体。

在一些实施方案中，所述治疗部分是双特异性T细胞接合器部分。在一些实施方案中，所述双特异性T细胞接合器部分包含T细胞抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

在一些实施方案中，所述治疗部分是人白介素分子。在一些实施方案中，所述治疗部分是人IL-2。

在一些实施方案中，所述第一CID结构域经由第一接头与所述第一Fc结构域连接。在一些实施方案中，所述第二CID结构域经由第二接头与所述治疗部分连接。

在一些实施方案中，所述IgG是人IgGl。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域是第一变体Fc结构域，并且所述第二Fc结构域是第二变体Fc结构域。

本发明的另一方面涉及用于在患者中延长治疗部分的血清半衰期的方法。所述方法包括向患者施用(1)包含其上述各种实施方案的组合物；(2)上述CID小分子。施用小分子诱导第一CID结构域和第二CID结构域形成复合物，从而延长治疗部分的血清半衰期。

本发明的另一方面涉及用于从患者中清除治疗部分的方法，所述患者已经被施用上述包含治疗部分和CID小分子的组合物。所述方法包括停止向患者施用所述CID小分子，使得所述治疗部分从所述患者的血液中清除。

本发明的另一方面涉及组合物，所述组合物包含(1)异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包含(a)第一单体，其包含第一化学抑制二聚体(CInD)结构域和IgG的第一Fc结构域，其中所述第一CInD结构域与所述第一Fc结构域共价连接；(b)第二单体，其包含IgG的第二Fc结构域；(2)融合蛋白部分，其包含第二CInD结构域和第二治疗部分，其中所述第二CInD结构域在N或C端与所述第二治疗部分共价连接。所述第一CInD结构域与所述第二CInD结构域结合并且形成复合物，并且所述复合物可以被CInD小分子破坏。

在一些实施方案中，所述第一CInD结构域或所述第二CInD结构域包含抗体部分。

在一些实施方案中，所述第一CInD结构域经由第一接头与所述第一Fc结构域连接。在一些实施方案中，所述第二CInD结构域经由第二接头与所述治疗部分连接。

在一些实施方案中，其中上述IgG是人IgGl。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域是第一变体Fc结构域，并且所述第二Fc结构域是第二变体Fc结构域。

在一些实施方案中，所述第二治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、多肽和抗体药物缀合物。在一些实施方案中，所述第二治疗部分是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述第二治疗部分是双特异性T细胞接合器部分。在一些实施方案中，所述第二治疗部分是包含T细胞抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域的双特异性T细胞接合器部分。在一些实施方案中，所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

在一些实施方案中，所述第二治疗部分是人白介素分子。在一些实施方案中，所述第二治疗部分是人IL-2。

在一些实施方案中，上述第二单体还包含与所述第二Fc结构域共价连接的第一治疗部分。在一些实施方案中，所述第一治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、多肽和抗体药物缀合物。

在一些实施方案中，所述第一治疗部分是T细胞抗原结合结构域并且所述第二治疗部分是肿瘤相关抗原结合结构域。可替代地，第一治疗部分是肿瘤相关抗原结合结构域，并且第二治疗部分是T细胞抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

本发明的另一方面涉及组合物，所述组合物包含(1)同源二聚体Fc融合蛋白，其包含两个相同单体，其中两个单体各自包含与IgG的Fc结构域共价连接的第一CInD结构域；(2)融合蛋白部分，其包含第二CInD结构域和治疗部分，其中所述第二CInD结构域在N或C端与所述治疗部分共价连接。所述第一CInD结构域与所述第二CInD结构域结合形成复合物，并且所述复合物可以被CInD小分子破坏。

在一些实施方案中，所述第一CInD结构域或所述第二CInD结构域包含抗体部分。

在一些实施方案中，所述第一CInD结构域经由第一接头与所述第一Fc结构域连接。在一些实施方案中，所述第二CInD结构域经由第二接头与所述治疗部分连接。

在一些实施方案中，所述IgG是人IgGl。

在一些实施方案中，所述治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、多肽和抗体药物缀合物。在一些实施方案中，所述治疗部分是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述治疗部分是双特异性T细胞接合器部分。在一些实施方案中，所述双特异性T细胞接合器部分包含T细胞抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

在一些实施方案中，所述治疗部分是人白介素分子。在一些实施方案中，所述治疗部分是人IL-2。

本发明的另一方面涉及一种用于在患者中延长治疗部分的血清半衰期的方法，并且所述方法包括向患者施用上述的任何包含CInD的组合物。

本发明的另一方面涉及一种用于从患者中清除治疗部分的方法，所述患者先前已经被施用上述的包含CInD的组合物。所述方法包括向患者施用CInD小分子，使治疗部分从异源二聚体或同源二聚体Fc融合蛋白中解离。

本发明提供了一种用于T细胞接合器的血清半衰期的可调节控制***。一方面，本发明提供组合物，所述组合物包含第一单体和第二单体，其中第一单体包含第一CID结构域、任选的结构域接头和人血清白蛋白(HSA)结合结构域；第二单体包含第二CID结构域、任选的结构域接头和T细胞接合器；并且在CID小分子的存在下，所述第一结构域和所述第二结构域结合形成所述第一结构域-所述CID小分子-所述第二结构域复合物。在不存在小分子的情况下，第一结构域和第二结构域不相互结合。所述T细胞接合器包含CD3抗原结合结构域(ABD)、任选的结构域接头和肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域。

在一些实施方案中，所述小分子选自FK1012、利米多赛、FK506、FKCsA、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、香豆霉素、赤霉素、HaXS、TMP-tag、ABT-737。

在一些实施方案中，所述第一结构域-所述CID小分子-所述第二结构域的所述复合物选自FKBP-FK1012-FKBP、变体FKBP-利米多赛-变体FKBP、FKBP-FK506-钙调磷酸酶、FKBP-FKCsA-CyP-Fas、FKBP-雷帕霉素-FRB、变体FKBP-雷帕霉素类似物-变体FRB、GyrB-香豆霉素-GyrB、GAI-赤霉素-GID1、SNAP-tag-HaXS-HaloTag、eDHFR-TMP-tag-HaloTag、AZ1-ABT-737-BCL-xL、钙调磷酸酶-FK506-FKBP、CyP-Fas-FKCsA-FKBP、FRB-雷帕霉素-FKBP、变体FRB-雷帕霉素类似物-变体FKBP、GID1-赤霉素-GAI、HaloTag-HaXS-SNAP-tag、HaloTag-TMP-tag-eDHFR、BCL-xL-ABT-737-AZ1。

在一些实施方案中，所述HSA结合结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述第一结构域经由第一接头与所述HSA结合结构域连接，并且所述第二结构域经由第二接头与所述T细胞接合器连接。

另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含上述组合物中的任一种。

在另一方面，本发明提供了一种用于在患者中延长T细胞接合器的血清半衰期的方法，并且所述方法包括向患者施用本文所述的组合物或药物组合物中的任一种，以及向患者施用患者CID小分子，所述CID小分子诱导本文所述的第一CID和第二CID结构域的结合，从而延长T细胞接合器的血清半衰期。

在另一方面，本发明提供了一种用于在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用本文所述的组合物或药物组合物中的任一种，以及向患者施用CID小分子，该CID小分子诱导本文所述的第一CID结构域和第二CID结构域的结合，从而治疗癌症。

在另一方面，本发明提供了一种用于从患者中清除T细胞接合器的方法，所述患者已经被施用本文所述的含有T细胞接合器和CID小分子的组合物，并且所述方法包括停止向患者施用所述小分子，使得所述T细胞接合器不再与HSA结合并且从所述患者的血液中清除。

在另一方面，本发明提供了一种用于在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：a)向所述患者施用包含根据本文所述的组合物中的任一种的所述T细胞接合器的所述组合物或所述药物组合物；b)向所述患者施用根据本文所述的任何组合物的所述小分子；其中在所述患者中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域与所述小分子形成复合物以治疗癌症。

本发明还提供了一种用于T细胞接合器的血清半衰期的可调节控制***。在一方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含第一单体和第二单体，其中第一单体包含第一CID结构域、任选的结构域接头和人血清白蛋白(HSA)结合结构域；第二单体包含第二CID结构域、任选的结构域接头和T细胞接合器；并且在CID小分子的存在下，第一结构域和第二结构域结合形成第一结构域-CID小分子-第二结构域复合物。在不存在小分子的情况下，第一结构域和第二结构域不相互结合。所述T细胞接合器包含CD3抗原结合结构域(ABD)、任选的结构域接头和肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域。

在一些实施方案中，所述小分子选自FK1012、利米多赛、FK506、FKCsA、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、香豆霉素、赤霉素、HaXS、TMP-tag、ABT-737。

在一些实施方案中，第一结构域-CID小分子-第二结构域的复合物选自FKBP-FK1012-FKBP、变体FKBP-利米多赛-变体FKBP、FKBP-FK506-钙调磷酸酶、FKBP-FKCsA-CyP-Fas、FKBP-雷帕霉素-FRB、变体FKBP-雷帕霉素类似物-变体FRB、GyrB-香豆霉素-GyrB、GAI-赤霉素-GID1、SNAP-tag-HaXS-HaloTag、eDHFR-TMP-tag-HaloTag、AZ1-ABT-737-BCL-xL、钙调磷酸酶-FK506-FKBP、CyP-Fas-FKCsA-FKBP、FRB-雷帕霉素-FKBP、变体FRB-雷帕霉素类似物-变体FKBP、GID1-赤霉素-GAI、HaloTag-HaXS-SNAP-tag、HaloTag-TMP-tag-eDHFR、BCL-xL-ABT-737-AZ1。

在一些实施方案中，所述HSA结合结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

在一些实施方案中，所述第一结构域经由第一接头与所述HSA结合结构域连接，并且所述第二结构域经由第二接头与所述T细胞接合器连接。

另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含上述组合物中的任一种。

在另一方面，本发明提供了一种用于在患者中延长T细胞接合器的血清半衰期的方法，并且所述方法包括向患者施用本文所述的组合物或药物组合物中的任一种，并且向患者施用CID小分子，该CID小分子诱导本文所述的第一CID结构域和第二CID结构域的结合，从而延长T细胞接合器的血清半衰期。

另一方面，本发明提供了一种用于在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用本文所述的组合物或药物组合物中的任一种，以及向患者施用CID小分子，该CID小分子诱导本文所述的第一CID结构域和第二CID结构域的结合，从而治疗癌症。

在另一方面，本发明提供了一种从患者中清除T细胞接合器的方法，所述患者已经被施用本文所述的包含T细胞接合器和CID小分子的组合物，并且所述方法包括停止向患者施用小分子，使得T细胞接合器不再与HSA结合并且从患者的血液中清除。

附图说明

图1A-1B描绘了本发明的一方面。通常，向患者共施用异源二聚体Fc融合蛋白(101)和融合蛋白部分(102)。异源二聚体Fc融合蛋白(101)包含第一单体，其含有使用结构域接头(104)与第一Fc结构域(105)(例如人IgG1 Fc)连接的如本文定义的第一CID结构域(103)；和第二单体，其含有与第一Fc结构域异源二聚化的第二Fc结构域(106)。融合蛋白(102)(其本质上是第三单体)包含使用结构域接头(108)与治疗部分(109)连接的本文定义的第二CID结构域(107)。在暴露于CID小分子(110)时(例如，当向患者施用CID小分子时)，第一CID结构域(103)和第二CID结构域(107)各自与CID小分子(110)结合，使得形成异源二聚体Fc融合蛋白(101)和融合蛋白部分(102)的复合物。因此，治疗部分现在与Fc结构域非共价结合，并且整个复合物被保护免于从患者的血流中快速清除，并且治疗部分(109)的血清半衰期延长。通常，由于CID小分子在血清中的半衰期非常短，因此施用CID小分子随着时间而持续。在某些时候，当不再需要治疗部分的活性或导致不良副作用时，停止施用CID小分子，导致复杂的解离，然后从患者中清除融合蛋白部分(102)。在一些实施方案中，如图1B所示，治疗部分(109)是T细胞接合器，其包含与呈抗scFv形式的抗CD3抗原结合结构域(111)连接的抗原结合结构域(ABD)(112)(例如呈scFv形式的抗CD19 ABD)。

图2A-2B描绘了本发明的另一方面。通常，向患者共施用异源二聚体Fc融合蛋白(101)和融合蛋白部分(102)。异源二聚体Fc融合蛋白(101)包含第一单体，其含有使用结构域接头(103)与第一Fc结构域(105)(例如人IgG1 Fc)连接的如本文定义的第一CInD结构域(104)；和第二单体，其含有与第一Fc结构域异源二聚化的第二Fc结构域(106)。融合蛋白部分包含使用结构域接头(108)与治疗部分(109)连接的本文定义的第二CInD结构域(107)。在共施用时，第一CID结构域(105)和第二CInD结构域(106)结合形成复合物。因此，治疗部分(109)现在与Fc结构域非共价结合，并且整个复合物被保护免于从患者的血流中快速清除，并且治疗部分(109)的血清半衰期延长。在某些时候，当不再需要治疗部分(109)的活性或导致不良副作用时，向患者施用CInD小分子(110)，其破坏第一CID结构域(105)和第二CinD结构域(106)之间形成的复合物。结果，治疗部分(109)从Fc融合蛋白中解离，并且由于其血清半衰期短而从血清中快速清除。在一些实施方案中，如图1B所示，治疗部分是T细胞接合器，其包含与呈scFv形式的抗原结合结构域(例如，抗CD19抗原结合结构域112)连接的抗CD3抗原结合结构域(ABD)(111)。

图3描绘了本发明的另一方面。通常，向患者共施用异源二聚体Fc融合蛋白(101)和融合蛋白部分(102)。异源二聚体Fc融合蛋白(101)包含第一单体，其含有使用结构域接头(103)与第一Fc结构域(例如，人IgG1 Fc)(105)连接的如本文定义的第一CInD结构域(104)；和第二单体，其含有与第一治疗部分(111)共价连接并且与第一Fc结构域(105)异源二聚化的第二Fc结构域(106)。融合蛋白部分(102)包含使用结构域接头(108)与第二治疗部分(109)连接的本文定义的第二CInD结构域(107)。在共施用时，第一CID结构域(107)和第二CInD结构域(107)结合形成复合物，因此，将两个治疗部分(111)和(109)结合在一起(例如，抗CD3抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域，例如抗CD19抗原结合结构域)。第二治疗部分(109)现在与Fc结构域非共价结合，并且被保护免于从患者的血流中快速清除。第二治疗部分(109)的血清半衰期延长。在某些时候，当不再需要第二治疗部分(109)的活性或导致不良副作用时，向患者施用CInD小分子(110)，其破坏第一CID结构域(104)和第二CInD结构域(107)之间形成的复合物。结果，第二治疗部分109从Fc融合蛋白中解离并且从血清中快速清除。

图4描绘了本发明的另一方面。通常，向患者共施用同源二聚体Fc融合蛋白(101)和融合蛋白部分(102)。同源二聚体Fc融合蛋白(101)包含两个相同单体，每个单体含有使用结构域接头(103)与第一Fc结构域(105)(例如人IgGl Fc)连接的如本文定义的第一CInD结构域(104)。融合蛋白部分(102)包含使用结构域接头(107)与治疗部分(108)连接的本文定义的第二CInD结构域(106)。在共施用时，第一CID结构域(104)和第二CInD结构域(106)结合形成复合物，因此，将两个治疗部分结合在一起。治疗部分(108)现在与Fc结构域非共价结合，并且被保护免于从患者的血流中快速清除。治疗部分(108)的血清半衰期延长。在某些时候，当不再需要治疗部分(108)的活性或导致不良副作用时，向患者施用CInD小分子(109)，其破坏第一CID结构域(104)和第二CInD结构域(106)之间形成的复合物。结果，治疗部分(108)从Fc融合蛋白中解离并且从血清中快速清除。

图5说明了异源二聚体Fc融合蛋白Ab59的一个实例，其包含第一单体，其含有使用结构域接头与第一Fc结构域(人IgGl Fc)连接的第一CID结构域(BCl-2 C158A)；和第二单体，其含有与第一Fc结构域异源二聚化的第二Fc结构域(人IgG1 Fc)。

图6说明了示例性融合蛋白部分，其各自包含第二CID结构域(AZ-21)和T细胞接合器，该T细胞接合器含有与呈scFv形式的抗CD3抗原结合结构域连接的抗CD19抗原结合结构域。AZ-21可以与T细胞接合器的N或C端连接。AZ-21可以制成Fab或单链Fab形式。抗CD3抗原结合结构域可以源自克隆L2K或UCHT1.v9。His标签用于促进融合蛋白部分的纯化。

图7A-7J示出了图5和图6所示的示例性融合蛋白部分的氨基酸序列。

图8A说明了示例性融合蛋白部分，其各自包含经由结构域接头与人IL-2(hIL-2)连接的第二CID结构域(AZ-21)。AZ-21是呈scFv的形式，并且可以与hIL-2的N或C端连接。His标签用于促进融合蛋白部分的纯化。图8B提供了IL-2、IL-12和IL-15及其变体的氨基酸序列。

图9示出了图8所示的示例性融合蛋白部分的氨基酸序列。

图10示出了AZ-21、BCL-2和BCL-2(C158A)的氨基酸序列。在CID小分子ABT-199的存在下，AZ-21和BCL-2或BCL-2(C158A)形成CID。

图11示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子ABT-737的存在下能够与第一CID结构域Bcl-xL形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图12A和12B示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子ABT-199(维奈托克)的存在下能够与第一CID结构域BCL-2或BCL-2(C158A)形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图13示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子ABT-263的存在下能够与第一CID结构域BCL-2形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图14示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子LCL161的存在下能够与第一CID结构域cIAP1形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图15示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子GDC-0152的存在下能够与第一CID结构域cIAP1形成复合物。

每个克隆代表是第二CID结构域。

图16示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子AT406的存在下能够与第一CID结构域cIAP1形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图17示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子CUDC-427的存在下能够与第一CID结构域cIAP1形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图18示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子雷帕霉素的存在下能够与第一CID结构域FKBP形成复合物。每个克隆代表是第二CID结构域。

图19示出了第二CID结构域的vh-CDR和vl-CDR的氨基酸序列，其在CID小分子甲氨蝶呤的存在下能够与第一CID结构域——甲氨蝶呤结合结构域——形成复合物。

图20A-20B示出了与Ab52、Ab53、Ab54、Ab55、Ab57和Ab63一起孵育的Jurkat T细胞活化的剂量反应曲线。

图21示出了在Ab59和ABT-199或载剂对照的存在下与Ab52、Ab53、Ab54、Ab55和Ab57一起孵育的Jurkat T细胞活化的剂量反应曲线。

图22A示出了与原代人T细胞和Ab53或Ab57共培养后Raji细胞细胞毒性的剂量反应曲线。图22B示出了在Ab59和ABT-199或载剂对照的存在下与原代人T细胞和Ab53共培养后Raji细胞细胞毒性的剂量反应曲线。

图23示出了在人T细胞中检测到的STAT5磷酸化，其中人T细胞用hIL-2或包含hIL-2的融合蛋白部分处理。

图24示出了融合蛋白部分的尺寸排阻色谱图。

图25A示出了与固定化BCL-2结合的Ab53和Ab57的生物层干涉测量术。图25B示出了与固定化AZ21结合的Ab59的生物层干涉测量术。

图26示出了在存在或不存在ABT-199的情况下与固定化BCL-2结合的Ab93和Ab94的生物层干涉测量术。示出了结合的KD值。

图27示出了示例性抗CD3 ABD的氨基酸序列。

图28示出了示例性IgGl Fc结构域的氨基酸序列。

图29描绘了本发明的另一方面。通常，有两个向患者共施用的单体：第一单体，其包含使用结构域接头与人血清白蛋白(HSA)结合结构域连接的如本文定义的第一CID结构域。在向患者施用时，第一单体与患者的血流中的HSA结合。第二单体包含使用结构域接头与如本文定义的T细胞接合器结构域连接的第二CID结构域。在暴露于CID小分子时(例如，当向患者施用CID小分子时)，第一CID结构域和第二CID结构域各自与CID小分子结合，使得形成两个单体的二聚体。因此，T细胞接合器结构域现在与HSA非共价结合，并且整个复合物被保护免于从患者的血流中快速清除，并且将循环和导致T细胞与肿瘤细胞接合，导致癌症的治疗。因此，第一单体和第二单体以及CID小分子的共施用导致癌症的治疗。通常，由于CID小分子在血清中的半衰期非常短，因此施用CID小分子将持续。在某些时候，当不再需要T细胞接合活性或导致不良副作用时，停止施用CID小分子，导致二聚体解离，然后从患者中清除第二单体以及T细胞接合器。

图30A示出了由与HSA ABD连接的第一CID结构域[与单结构域抗HSA抗体连接的Bcl-2(C1158A)]组成的单体的氨基酸序列。图30B示出了在CID小分子ABT-199的存在下上述单体与第二CID结构域AZ21的结合曲线。

图31A和图31B示出了示例性HSA结合结构域的氨基酸序列。

图32示出了化学诱导二聚化使得小分子能够控制双特异性T细胞接合器的半衰期。(A)双特异性T细胞接合器的基于CID的半衰期延长的示意图。(B)本研究中使用的治疗模块和半衰期延长模块。(C)当向小鼠给药维奈托克时，在小鼠中双特异性Ab57的血浆消除半衰期延长了5倍。****：P≤0.0001，双尾t检验。

图33示出了化学诱导二聚化使得小分子能够控制IL-2的半衰期。(A)IL-2的基于CID的半衰期延长的示意图。(B)本研究中使用的治疗模块和半衰期延长模块。(C)当向小鼠给药维奈托克时，在小鼠中细胞因子IL-2的血浆消除半衰期延长了17倍。****：P≤0.0001，双尾t检验。

发明详述

A.概述

本发明通过添加小分子(例如向患者施用)或去除小分子(例如停止施用，然后患者清除分子)使得能够可调节地控制治疗部分在血清中的半衰期，该小分子接合化学诱导二聚化(CID)结构域，如图中一般概述的。这些小分子是化学诱导二聚体(CID)小分子(CIDSM)，其诱导二聚体形成，例如图1中描绘的；或者是化学抑制二聚体(CInD)小分子(CInDSM)，其破坏二聚体，如图2中描绘的。

通常，本发明涉及通过将分子与半衰期延长部分(例如Fc结构域或人血清白蛋白(HSA))结合来延长治疗分子的血清半衰期。如本领域已知的，通常从机体中快速清除的生物药物与Fc结构域或HSA的结合导致药物在血清中的半衰期延长。

因此，关于使用Fc结构域作为半衰期延长分子通常在图1A中描述，本发明的一方面涉及任选地经由结构域接头，将Fc结构域与化学诱导二聚体(CID)的一半(在本文中被称为“第一CID结构域”)连接。治疗部分任选地经由结构域接头与CID的另一半(在本文中被称为“第二CID结构域”)连接。因此图1的组合物通常具有三个蛋白质链或单体：第一单体，其包含第一Fc结构域、结构域接头和第一CID结构域；第二单体，其包含第二Fc结构域；和第三单体，在本文中也被称为融合蛋白部分。添加CIDSM诱导CID的两半结合，从而使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。在治疗部分需要从血液中快速清除的情况下，停止施用CID小分子，导致CID的两半解离以及治疗部分与Fc结构域解离。

例如，可以向患者给药如本文所述的包含Fc融合蛋白和融合蛋白部分的组合物。还可以向患者施用诱导CID的两半二聚化的CID小分子，从而将Fc融合蛋白和融合蛋白部分结合在一起形成二聚体。结果，治疗部分立即与Fc结构域结合并且延长其血清半衰期。为了维持治疗部分与Fc结构域的结合，可以向患者定期给药CIDSM，其中给药频率取决于CIDSM的血清半衰期、CIDSM对第一CID结构域和第二CID结构域的结合亲和力以及CID复合物(例如CID二聚体)的寿命的组合。在患者需要快速清除治疗部分的情况下，例如由于安全考虑，停止向患者给药CIDSM，导致患者中CIDSM的清除、治疗部分与Fc结构域的解离以及患者中治疗部分的清除。治疗部分的清除率取决于CIDSM的血清半衰期、CID复合物的寿命以及不再与Fc结构域结合的治疗部分的清除率。

如图2A、图3和图4中一般描绘的，本发明的另一方面涉及任选地经由结构域接头，将第一Fc结构域与化学抑制二聚体(CInD)的一半(在本文中被称为“第一CInD结构域”)连接。第二单体是第二Fc结构域，其与第一Fc结构域一起形成异源二聚体Fc结构域。第三单体(在本文中也被称为融合蛋白部分)包含任选地经由结构域接头与CInD的另一半(在本文中被称为“第二CInD结构域”)连接的治疗部分。CInD结构域的两半相互结合并且形成二聚体，使得治疗部分与异源二聚体Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。在治疗部分需要从血液中快速清除的情况下，施用CInD小分子，其诱导CInD的两半解离，从而使得治疗部分与异源二聚体Fc结构域能够解离，并且能够清除患者中的治疗部分。

本领域技术人员将理解术语“二聚体”在本文中的两个上下文中使用。一个上下文是指第一Fc结构域和第二Fc结构域一起形成二聚体(例如，在图1、2和3的情况下为异源二聚体Fc结构域，在图4的情况下为同源二聚体Fc结构域)。第二个上下文是指通过使用本发明的将本发明的第一CID结构域和第二CID结构域结合在一起的CIDSM形成的二聚体，以及是指本发明的第一CInD结构域和第二CInD结构域之间形成的二聚体。

在一些实施方案中，如图2A中一般描绘的，Fc融合蛋白是异源二聚体，其中一个单体含有与第一Fc结构域连接的第一CInD结构域，并且另一个单体含有单独的第二Fc结构域(例如，“空Fc结构域”)。第一Fc结构域和第二Fc结构域异源二聚化，例如，通过并入本文所述的异源二聚化突变。第三单体融合蛋白部分包含经由结构域接头与如本文所述的治疗部分连接的第二CInD结构域。

在一些实施方案中，如图3中一般描绘的，Fc融合蛋白是异源二聚体，其中一个单体含有与第一Fc结构域连接的第一CInD结构域。另一个Fc单体含有与第一治疗部分连接的第二Fc结构域。第三单体包含用结构域接头与第二治疗部分连接的第二CInD结构域。第一Fc结构域和第二Fc结构域异源二聚化，例如，通过并入本文所述的异源二聚化突变。施用包含与第二CInD结构域连接的第二治疗部分的融合蛋白部分诱导CInD结构域的两半结合，使得第二治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长其血清半衰期。另外，该形式在同时增加其半衰期的时候赋予治疗部分和第二治疗部分双特异性性质。

在一些其他实施方案中，如图4中描绘的，Fc融合蛋白是具有两个相同单体的同源二聚体，每个单体含有任选地经由结构域接头与Fc结构域连接的第一CInD结构域。施用包含与第二CInD结构域连接的治疗部分的融合蛋白部分诱导CInD结构域的两半结合，使得两个治疗部分与单个Fc二聚体能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期治疗部分。该形式在同时延长其半衰期的时候增加治疗部分的化学计量和平衡。

在一些实施方案中，施用本文所述的本发明组合物将治疗部分的血清半衰期延长至至少约2天、至少约4天、至少约6天、至少约8天、至少约10天、至少约12天或至少约14天。这与单独施用治疗部分(具有相对短得多的血清消除半衰期)形成对比。当不再需要治疗部分时，它们可以通过去除(例如，停止施用，然后患者清除CID小分子)短寿命CID小分子或添加(例如，向患者施用)CInD小分子快速去除。

由于它涉及使用人血清白蛋白(HSA)作为半衰期延长部分，这在图29中一般描绘。如图29中一般描绘的，T细胞接合器结构域任选地经由结构域接头与化学诱导二聚体(CID)(在本文中被称为“第一CID结构域”)的一半连接。HSA结合结构域可以与HAS组成型结合。添加小分子诱导CID的两半结合，从而将两个单体结合在一起，并且使得T细胞接合器结构域与HAS能够结合，并且能够延长T细胞接合器结构域的血清半衰期。在需要从血液中快速清除T细胞接合器结构域的情况下，停止施用CID小分子，导致CID的两半解离以及T细胞接合器结构域与HAS解离。

例如，可以向患者给药如本文所述的包含第一单体和第二单体的组合物。还可以向患者施用CID小分子，该小分子诱导CID的两半二聚化，因此将两个单体结合在一起形成二聚体。结果，T细胞接合器结构域立即与HSA结合，并且延长其血清半衰期。为了维持T细胞接合器结构域与HSA的结合，可以向患者定期给药CID小分子，其中给药频率取决于CID小分子的血清半衰期、CID小分子对第一CID结构域和第二CID结构域的结合亲和力以及CID复合物(例如CID二聚体)的寿命的组合。在患者需要快速清除T细胞接合器的情况下，例如由于安全考虑，停止向患者给药小分子，导致患者中小分子的清除、T细胞接合器与HAS的解离以及患者中T细胞接合器的清除。T细胞接合器的清除率取决于小分子药物的血清半衰期、CID复合物的寿命以及不再与HAS结合的T细胞接合器的清除率。

在一些实施方案中，施用本文所述的组合物将T细胞接合器的血清消除半衰期延长至至少约2天、至少约4天、至少约6天、至少约8天、至少约10天，至少约12天或至少约14天。这与单独施用T细胞接合器(具有相对短得多的血清消除半衰期)形成对比。例如，

(CD19xCD3双特异性scFv-scFv融合分子)由于其血清消除半衰期短，需要持续静脉输注。

施用本文所述的组合物不仅可以延长T细胞接合器的血清半衰期，而且使得能够在不需要时通过停止给药小分子快速去除T细胞接合器。

B.定义

为了可以更完整地理解本申请，以下阐述了数个定义。此类定义意指涵盖语法等价物。

除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

登录号：在由美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(美国国家生物技术信息中心)中分配给各种核酸和氨基酸序列的参考号。本说明书中列出的登录号通过引用并入本文，如截至提交本申请之日数据库中提供的。

在本文中术语“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)，当作为多肽序列的一部分存在时，其与如本文所讨论的靶抗原特异性结合。因此，“HSA抗原结合结构域”结合如本文所概述的人血清白蛋白。如本领域已知的，这些CDR通常作为第一组可变重CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻CDR(vlCDR或VLCDR)存在，每组包含三个CDR：可变重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3和可变轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于可变重结构域和可变轻结构域中，并且一起形成Fv区。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR由可变重链和可变轻链贡献。例如，在scFv形式中，通常通过使用如本文所概述的接头将vh和vl结构域共价连接到单个多肽序列中，其可以是(从N端开始)vh-接头-vl或vl-接头-vh，前者通常是优选的(在每一侧包括任选的结构域接头，取决于使用的形式)。在一些情况下，接头是如本文所述的结构域接头。

另外，在一些情况下，本发明中使用的ABD可以是单结构域ABD(“sdABD”)。在本文中“单结构域Fv”、“sdFv”或“sdABD”意指通常基于骆驼抗体技术的仅具有三个CDR的抗原结合结构域。参见：Protein Engineering 9(7):1129-35(1994)；Rev Mol Biotech 74:277-302(2001)；Ann Rev Biochem 82:775-97(2013)。这些有时在本领域中被称为“VHH”结构域。

如本领域技术人员将理解的，CDR的准确编号和放置在不同编号***中可以不同。然而，应理解，可变重序列和/或可变轻序列的公开包括相关(固有)CDR的公开。因此，每个可变重区域的公开是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开，并且每个可变轻区域的公开是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开。

CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003)。贯穿本说明书，当提及可变结构域中的残基(大约，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)和Fc区的EU编号***(例如，Kabat等,SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICALINTEREST,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))时，通常使用Kabat编号***。

表1

在本文中“结构域接头”或语法等价物意指将两个蛋白质结构域连接在一起的接头，例如用于连接蛋白质的不同结构域的那些。通常，有许多可以使用的合适接头，包括通过重组技术(其允许两个结构域的重组附着具有足够的长度和柔性以允许每个结构域保留其生物学功能)生成的传统肽键。

“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇，被称为互补位。表位是分子的集团(例如氨基酸或糖侧链)并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可以具有多于一个表位。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也被称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段的空间并列氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下失去与前者的结合而不是后者的。

在本文中“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、***和/或缺失或与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是与蛋白质所附着的碳水化合物或PEG结构改变。在本文中“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、***和/或缺失。为了清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。

在本文中“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸取代亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。为了清楚起见，经工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但是如果该蛋白质在其开始的特定位置具有相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。

如本文所用，“氨基酸***”或“***”意指在亲本多肽序列中在特定位置添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在233位之后和234位之前***谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在233位之后和234位之前***AlaAspGlu。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del表示233位谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从233位开始的序列GluAspAla的缺失。

如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指凭借至少一种氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以是指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码它的氨基序列。

如本文所用，在本文中“蛋白质”意指至少两个共价附着的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基包含天然存在的氨基酸和肽键。另外，多肽可以包括一个或更多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。

如本文所用，“结构域”意指蛋白质结构域，给定蛋白质序列的一部分和可以发挥作用的三级结构，并且独立于蛋白质链的其余部分存在。每个结构域形成紧凑的三维结构，并且通常可以是独立稳定和折叠的。结构域的长度不同，并且为至少10个氨基酸长。因为它们是独立稳定的，所以可以通过一种蛋白质和另一种蛋白质之间的基因工程化来“交换”结构域以制备嵌合蛋白质。

如本文所用，“残基”意指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。

如本文所用，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以是指独立的该区域，或在全长抗体或抗体片段的上下文中是指该区域。

如本文所用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。如本领域技术人员将理解的，这些由两个结构域(可变重结构域和可变轻结构域)组成。

如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”意指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。

如本文所用，“亲本多肽”意指随后被修饰以生成变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽、或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以是指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，如本文所用，“亲本免疫球蛋白”意指被修饰以生成变体的未经修饰的免疫球蛋白多肽，并且如本文所用，“亲本抗体”意指被修饰以生成变体抗体的未经修饰的抗体。应注意，“亲本抗体”包括已知的商业重组产生的抗体，如下所概述的。

如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可以按顺序编号，或根据已建立的形式编号，例如用于抗体编号的EU索引。

如本文所用，“靶抗原”意指被给定抗体的可变区特异性结合的分子。在目前的情况中，例如，在本文中目标靶抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，包括CD19蛋白。因此，“抗CD19结合结构域”是抗原结合结构域(ABD)，其中抗原是CD19。另外的靶标在下文概述。

如本文所用，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。

如本文所用“，可变结构域”意指包含一个或更多个基本上由Vκ(V.kappa)、Vλ(V.lamda)和/或VH基因(分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座)中的任一个编码的Ig结构域的免疫球蛋白的区域。因此，“可变重结构域”包含(VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4，并且“可变轻结构域”包含(VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL)FR3-vlCDR3-(VL)FR4。

在本文中“野生型或WT”意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白具有未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本发明的抗体通常是重组的。“重组”意指在外源宿主细胞中使用重组核酸技术生成的抗体。

“特异性结合”特定抗原或表位或“与”其“特异性结合”或“对”其“具有特异性”意指与非特异性相互作用显著不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合比较确定分子的结合来测量，该对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与和靶标相似的对照分子竞争来确定特异性结合。

如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”旨在是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“Kdis”或“Kd”旨在是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”旨在是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域充分建立的方法来确定。在一些实施方案中，用于确定抗体KD的方法是通过使用表面等离子共振，例如通过使用生物传感器***(例如

***)。在一些实施方案中，抗体的KD通过生物层干涉测量术来确定。在一些实施方案中，使用流式细胞术用抗原表达细胞测量KD。在一些实施方案中，KD值是用固定化的抗原测量的。在另一些实施方案中，KD值是用固定化的抗体(例如，亲本小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体变体)测量的。在某些实施方案中，KD值以二价结合模式测量。在另一些实施方案中，KD值以单价结合模式测量。对特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过对抗原或表位的KD为至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9、至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、至少约10-13M或至少约10-14M的抗体显示出。通常，对于相对于抗原或表位的对照分子，特异性结合抗原的抗体的KD大20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍。

关于蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的序列百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件(例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一种特定的程序是在美国公开号20160244525第[0279]至[0280]段中概述的ALIGN-2程序，在此通过引用并入。核酸序列的另一种近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics,2:482-489(1981)的局部同源算法提供。该算法可以通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff ed.,5suppl.

3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发并由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)归一化的评分矩阵应用于氨基酸序列。

确定序列同一性百分比的算法实施实例由“BestFit”实用程序应用程序中的遗传学计算机组(Madison,WI)提供。该方法的默认参数在Wisconsin Sequence AnalysisPackage Program Manual,Version 8(1995)(可从Genetics Computer Group,Madison,WI获得)中进行了描述。在本发明的上下文中建立同一性百分比的另一种方法是使用由爱丁堡大学拥有版权、John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)分发的MPSRCH程序包。从该软件包套件中，可以使用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分12、空位扩展罚分1和空位6)。从生成的数据中，“匹配”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适程序通常是本领域已知的，例如，另一种比对程序是BLAST，与默认参数一起使用。例如，可以使用BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+瑞士蛋白+

Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在通过放置http://in front ofblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的互联网地址中找到。

本发明的氨基酸序列(“本发明序列”)和亲本氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列的比对中精确匹配的数量除以“本发明序列”的长度或亲本序列的长度(最短的那个)。结果以同一性百分比表示。

术语“治疗(treatment、treating、treat)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状或者降低疾病或其症状的可能性而言，该效果可以是预防性的，和/或就疾病和/或可归因于疾病的副作用的部分或完全治愈而言，该效果可以是治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物，特别是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断具有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即导致疾病消退和/或缓解一种或更多种疾病症状。“治疗”还意指涵盖递送试剂以提供药理学效果，即使在不存在疾病或病症的情况下。例如，“治疗”涵盖递送组合物，该组合物可以在不存在疾病病症的情况下引发免疫反应或赋予免疫力，例如在疫苗的情况下。

组合物的“有效量”或“治疗有效量”包括足以向施用组合物的受试者提供有益效果的组合物的量。递送载剂的“有效量”包括足以有效结合或递送组合物的量。

术语“核酸”包括具有多于一个核苷酸的任何形式的RNA或DNA分子，包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”包括核酸单链形式的寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸的排序。

“载体”能够将基因序列转移到靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够引导目标基因表达并且可以将基因序列转移到靶细胞的任何核酸构建体，这可以通过全部或部分载体的基因组整合、或载体作为染色体外元件的瞬时或可遗传维持实现。因此，该术语包括克隆和表达载剂以及整合载体。

术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”包括肿瘤细胞上产生的任何抗原物质。肿瘤相关抗原包括仅存在于肿瘤细胞上而不存在于非肿瘤细胞上的抗原以及存在于一些肿瘤细胞和一些正常细胞上的抗原。

如本文所用，“单链可变片段”或“scFv”是指包含可变重结构域和可变轻结构域的抗体片段，其中可变重结构域和可变轻结构域经由短柔性多肽接头连续连接，并且能够作为单个多肽链表达，并且其中scFv保留了其所来源的完整抗体的特异性。scFv的可变重结构域和可变轻结构域可以是例如，以以下任何方向：可变轻结构域-scFv接头-可变重结构域或可变重结构域-scFv接头-可变轻结构域。

如本文所用，“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的比对的IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在EU 296位IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。类似地，因为IgG1在241位具有脯氨酸并且IgG4在此处具有丝氨酸，所有具有S241P的IgG4分子被认为是IgG亚类修饰。注意，在本文中亚类修饰被认为是氨基酸取代。

如本文所用，关于IgG结构域的“非天然存在的修饰”意指非同种型的氨基酸修饰。例如，因为没有一个IgG在434位包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂合体)中的434S取代被认为是非天然存在的修饰。

如本文所用，“效应器功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生化事件。效应器功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。

如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含抗体恒定区的多肽，在一些情况下，不包括所有第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CHl)或其部分，并且在一些情况下，任选地包括全部或部分铰链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)以及任选的CH1(Cγ1)和CH2(Cγ2)之间的全部或部分铰链区。因此，在一些情况下，Fc结构域从N端到C端包含CH2-CH3或铰链-CH2-CH3。在一些实施方案中，Fc结构域来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，其中发现IgG1铰链-CH2-CH3特别可用于许多实施方案中。另外，在某些实施方案中，其中Fc结构域是人IgG1 Fc结构域，铰链包含C220S氨基酸取代。此外，在其中Fc结构域是人IgG4 Fc结构域的一些实施方案中，铰链包含S228P氨基酸取代。尽管Fc区的边界可以不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基端包含残基E216、C226或A231，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。因此，在IgG上下文中“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的118-215位。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的216-230位。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的231-340位，并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的341-447位。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一种或更多种FcγR或与FcRn的结合。

如本文所用，“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcgammaR”意指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；并且FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis等,2002,Immunol Lett 82:57-65，通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。在一些情况下，如本文所概述的，与一种或更多种FcγR受体的结合减少或消融。例如，减少与FcγRIIIa的结合降低ADCC，并且在一些情况下，期望减少与FcγRIIIa和FcγRIIb的结合。

如本文所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并且至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域中已知的，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，经常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，并且重链由FcRn基因编码。除非在本文中另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。如本文所讨论的，与FcRn受体的结合是期望的，并且在一些情况下，可以引入Fc变体以增加与FcRn受体的结合。

如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。修改可以是添加、缺失或取代。本发明的Fc变体是根据构成它们的氨基酸修饰来定义的。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在434位处具有丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有M428L和N434S取代的Fc变体。野生型氨基酸的身份可以是未指明的，在这种情况下上述变体被称为428L/434S。注意，提供取代的顺序是任意的，即例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体，等等。对于本文所讨论的关于抗体或其衍生物及其片段(例如，Fc结构域)的所有位置，除非另有说明，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。“EU索引”或“如Kabat中的EU索引”或“EU编号”方案是指EU抗体的编号(Edelman等,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85，在此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。

如本文所用，“融合蛋白”意指至少两个蛋白质或蛋白质结构域的共价连接。融合蛋白可以包含人工序列，例如如本文所述的结构域接头、Fc结构域(例如，变体Fc结构域)、CID或CInD结构域。在本文中“Fc融合蛋白”意指包含Fc区的蛋白质，该Fc区通常与一个或更多个不同的蛋白质结构域连接(任选地通过结构域接头，如本文所述)。在一些情况下，两个Fc融合单体可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白。在一些实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包含单独的Fc结构域(例如，“空Fc结构域”)，并且另一个单体是Fc融合蛋白，其包含CID结构域或CInD结构域，如本文所概述的。在一些实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包含与CID结构域或CInD结构域连接的Fc结构域，并且另一个单体包含与治疗部分连接的Fc结构域。在一些其他实施方案中，第一单体和第二单体都是包含Fc结构域和CInD结构域的Fc融合蛋白。

在本文中“融合”或“共价连接”意指组分(例如，CID结构域和Fc结构域)通过肽键连接，直接或经由结构域接头间接连接，本文所概述的。

在本文中“重链恒定区”意指IgG抗体的CH1-铰链-CH2-CH3部分。

“轻链恒定区”意指来自κ或λ的CL结构域。

发明详述

如本领域将理解的，本发明的组合物可以采用多种构型，以各种构型连接本发明的组分。通常，如本文所概述的，本发明的组合物依赖于两种机制之一：单体组分与小分子保持在一起用以发挥功能，而小分子的去除导致单体组分解离并随后从患者中清除。这些实施方案依赖于CID小分子并且通常在图1中描绘。可替代地，本发明的组合物在不存在小分子的情况下自结合，但是通过添加小分子来解离；这些实施方案依赖于CInD小分子并且通常在图2、3和4中描绘。

这些***用于通过使用Fc结构域或HSA来增加治疗部分的半衰期，这二者都是本领域众所周知的以增加它们所附着的分子的血清半衰期。通过使用CID结构域和小分子(CIDSM)，控制Fc结构域或HSA结构域与治疗部分的结合：在小分子的存在下，CID结构域结合，因此将半衰期延长部分并入含有治疗部分的组合物中。如果去除CIDSM(或不再向患者施用)，则两“半”的结合停止，并且治疗部分被快速清除。

A.包含CID的组合物

本发明提供了用于在患者的血清中对T细胞接合器结构域的半衰期进行时间控制的组合物和方法。如本文所概述的，组合物包含以特定方式结合的多种不同组分，如本文所述。通常，本发明的组合物包含第一单体和第二单体，它们通常在CID小分子的存在下非共价结合在一起。在本文中描述了组合物的各种实施方案。

因此，本发明的一方面涉及包含异源二聚体Fc融合蛋白和融合蛋白部分的组合物，如图1A中一般描绘的。异源二聚体Fc融合蛋白由第一单体和第二单体融合。第一单体包含任选地经由结构域接头与第一Fc结构域共价连接的CID结构域的一半(在本文中被称为“第一CID结构域”)。在一些实施方案中，第一单体从N到C端包含第一CID结构域-结构域接头-Fc结构域，并且在另外的实施方案中，N到C端顺序是Fc结构域-结构域接头-第一CID领域。第二单体包含空Fc结构域。融合蛋白部分包含任选地经由结构域接头与CID的另一半(在本文中被称为“第二CID结构域”)共价连接的治疗部分。在一些实施方案中，融合蛋白部分从N到C端包含第二CID结构域-结构域接头-治疗部分，并且在另外的实施方案中，N到C端顺序是治疗部分-结构域接头-第二CID结构域。添加CID小分子诱导CID的两半结合，从而使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。在治疗部分需要从血液中快速清除的情况下，停止施用CID小分子，导致CID的两半解离以及治疗部分与Fc结构域解离。在本文中描述了组合物的各种实施方案。

1.第一单体

如本领域技术人员将理解的，本发明的组合物包括具有不同功能的数种不同融合蛋白。

在一些实施方案中，本发明利用HSA作为半衰期延长部分并且提供了包含第一单体的组合物，该第一单体包含第一CID结构域、结构域接头和HSA结合结构域，如图29中一般描绘的。在一些实施方案中，第一单体从N到C端包含第一CID结构域-结构域接头-HSA结合结构域，并且在另外的实施方案中，N到C端顺序是HSA结合结构域-结构域接头-CID结构域。

在一些实施方案中，本发明的第一单体利用Fc结构域作为半衰期延长部分并且包含以各种构型的三种组分：CID结构域、结构域接头和Fc结构域，如本文所概述的。

a.CID结构域

化学诱导二聚化是一种生物学机制，其中两个蛋白质仅在二聚化剂的存在下非共价结合(associate或bind)。在本发明中，二聚化剂被称为“化学诱导二聚体小分子”或“CID小分子”或“CIDSM”。

在本发明中，CID结构域成对出现，其在CIDSM的存在下结合。如本领域技术人员将理解的，一些CID对是相同的，例如，两个CID结构域是相同的，并且通过CIDSM结合在一起。在另一些实施方案中，CID对由通过CIDSM结合在一起的两个不同CID结构域组成。

在本发明的一些实施方案中，CID对源自CIDSM的天然存在的结合配偶体。例如，CID由两个FKBP半组成，其在FK1012的存在下二聚化(参见Fegan,A等,ChemicalReviews.110(6):3315–36)；CID由两个变体FKBP半组成，其在利米多赛的存在下二聚化(参见Clackson T等,Proc Natl Acad Sci U SA.95(18):10437-42)；CID的一半是FKBP，并且CID的另一半是钙调磷酸酶，其在FK506的存在下二聚化(Ho,SN等,Nature.382(6594):822–6)；CID的一半是FKBP，并且CID的另一半是CyP-Fas，其在FKCsA的存在下二聚化(Belshaw,PJ等,Proc Natl Acad Sci U S A.93(10):4604–7)；CID的一半是FKBP，并且CID的另一半是FRB，其在雷帕霉素的存在下二聚化(Rivera,VM等,Nature Medicine.2(9):1028–32)；CID的一半是变体FKBP，并且CID的另一半是变体FRB，其在雷帕霉素类似物的存在下二聚化(J.Henri Bayle等,Chemistry and Biology第13卷,第1期,第99-107页)；CID的一半是GyrB，并且CID的另一半是GyrB，其在香豆霉素的存在下二聚化(Farrar,MA.等,Nature.383(6596):178–81)；CID的一半是GAI，并且CID的另一半是GID1，其在赤霉素的存在下二聚化(Miyamoto,T等,Nature Chemical Biology.8(5):465–70)；CID的一半是SNAP-tag，并且CID的另一半是HaloTag，其在HaXS的存在下二聚化(Erhart,D等,Chemistry andBiology.20(4):549–57)；CID的一半是eDHFR，并且CID的另一半是HaloTag，其在TMP-tag的存在下二聚化(Ballister，E等,Nature Communications.5(5475))。

在本发明的一些实施方案中，第一CID结构域是CID小分子的天然存在的结合配偶体，并且第二CID结构域是与第一CID结构域和CIDSM之间形成的复合物特异性结合而在没有CID小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离小分子结合的抗原结合结构域(ABD)。实例可以在WO2018/213848中找到，其通过引用并入本文。在该上下文中该第二CID结构域还可以被称为“CID-ABD”；即，与第一CID结构域和CIDSM结合的抗原结合结构域。

例如，在一些实施方案中，第一CID结构域是Bcl-xL的ABT-737结合结构域并且CID小分子是ABT-737。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图11所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有CID小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，Bcl-xL的ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO：314的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，第一CID结构域是BCl-2或BCl-2(C158A)的ABT-199结合结构域并且CID小分子是ABT-199(维奈托克)。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图12A-12B所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离小分子结合。在一些实施方案中，BCl-2或BCl-2(C158A)的ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO：315的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一CID结构域是BCL-2的ABT-263结合结构域并且CID小分子是ABT-263。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图13所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，BCl-2的ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO：315的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，第一CID结构域是cIAP1的LCL161结合结构域并且CID小分子是LCL161。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图14所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，cIAP1的LCL161结合结构域包含SEQ ID NO：317的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，第一CID结构域是cIAP1的GDC-0152结合结构域并且CID小分子是GDC-0152。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图15所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，cIAP1的GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO：317的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，第一CID结构域是cIAP1的AT406结合结构域并且CID小分子是AT406。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图16所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，cIAP1的AT406结合结构域包含SEQ ID NO：317的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，第一CID结构域是cIAP1的CUDC-427结合结构域并且CID小分子是CUDC-427。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图17所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，cIAP1的CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO：317的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，第一CID结构域是FKBP的雷帕霉素(SLF)结合结构域的合成配体并且CID小分子是SLF。第二CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其包含如图18所示的vhCDR和vlCDR的氨基酸序列。第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是在没有小分子的情况下不与第一CID结构域结合并且不与游离CID小分子结合。在一些实施方案中，FKBP的SLF结合结构域包含SEQ ID NO：316的氨基酸序列。

在本发明的一些其他实施方案中，两个CID结构域都是抗原结合结构域(ABD)。第一CID结构域与充当抗原的CID小分子特异性结合，并且第二CID结构域与第一CID结构域和CID小分子之间形成的复合物特异性结合，但是不与第一CID结构域或游离CID小分子结合。

在一些实施方案中，CID小分子是甲氨蝶呤，并且第一CID结构域是甲氨蝶呤ABD，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，包含分别作为SEQ ID NO：319、320、321、322、323和324的氨基酸序列vh-CDR1、vh-CDR2、vh-CDR3、vl-CDR1、vl-CDR2和vl-CDR3。第二CID结构域包含能够与甲氨蝶呤和第一CID结构域之间的复合物特异性结合的ABD，并且第二CID结构域包含如图19所示的vhCDR和vlCDR。在一些实施方案中，甲氨蝶呤ABD是如Gayda等Biochemistry 2014 53(23),3719-3726所述的甲氨蝶呤结合Fab。

在一些实施方案中，CID的第二半包含ABD并且与复合物的包含小分子的至少一部分和CID的第一半的一部分的部位结合。在一些实施方案中，CID的第二半包含ABD，并且与小分子和CID的第一半的复合物的部位结合，其中CID的第二半与包含小分子的至少一个原子和CID的第一半的一个原子的部位结合。

在一些实施方案中，CID的第二半与CID的第一半和小分子的复合物结合，其中解离常数(KD)不超过其与游离小分子和CID的游离第一半结合的KD的约1/250倍(例如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500倍或更少中的任一个)。

与小分子和同源结合部分之间的复合物特异性结合的结合部分可以根据本领域已知的方法产生，参见例如WO2018/213848，其通过引用在此整体并入本文，特别是用于产生CID结构域的方法。简而言之，从抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库或噬菌体展示Fab文库进行筛选。例如，作为步骤1，可以选择在不存在小分子的情况下不与同源结合部分结合的结合部分，从而生成一组反向选择的结合部分；以及然后，作为步骤2，可以针对与小分子和同源结合部分的复合物结合的结合部分筛选反向选择的结合部分，从而生成一组正向选择的结合部分。步骤1和2的筛选可以进行一轮或更多轮，其中每轮筛选包括步骤1的筛选和步骤2的筛选，使得生成一组与小分子和同源结合部分之间的复合物特异性结合的结合部分。在一些实施方案中，进行两轮或更多轮筛选，其中用于第一轮筛选的步骤1的结合部分的输入组是结合分子文库；用于每轮筛选的步骤2的结合部分的输入组是来自给定轮筛选的步骤1的反向选择的结合部分组；在第一轮筛选之后的用于每轮筛选的步骤1的结合部分的输入组是来自前一轮筛选的步骤2的正向选择的结合部分组；并且与小分子和同源结合部分之间的复合物特异性结合的结合部分组是用于最后一轮筛选的步骤2的正向选择的结合部分组。

噬菌体展示筛选可以根据先前建立的协议进行(参见Seiler等,Nucleic AcidsRes.,42:D12531260(2014))。例如，为了选择用于BCL-xL和ABT-737的复合物的抗体结合部分，可以针对用链霉亲和素包被的磁珠(Promega)捕获的生物素化BCL-xL筛选抗体噬菌体文库。在每次选择之前，可以在不存在ABT-737的情况下与固定在链霉亲和素珠上的1mMBCL-xL一起孵育噬菌体池以耗竭apo形式的BCL-xL的任何结合剂文库。随后，可以去除珠并且可以以1mM的浓度向噬菌体库中添加ABT-737。总计，进行四轮选择，减少BCL-xL抗原的量(100nM、50nM、10nM和10nM)。为了减少非特异性结合噬菌体的有害影响，可以通过添加2g/mLTEV蛋白酶从磁珠中选择性地洗脱特异性BCL-xL结合Fab-噬菌体。然后可以分析来自第四轮选择的单个噬菌体克隆用于测序。

b.HSA结合结构域

除了第一CID结构域之外，一些实施方案依赖于本发明的第一单体，其还包含HSA结合结构域作为半衰期延长部分。在一些实施方案中，HSA结合结构域包含源自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体或人源化抗体的抗原结合结构域。抗HSA抗原结合结构域可以采用任何形式，包括但不限于全抗体、Fab、Fv、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(例如源自骆驼的单结构域抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。

可以选择HSA结合结构域的结合亲和力以靶向特定血清半衰期的T细胞接合器。因此，在一些实施方案中，HSA结合结构域对HAS的结合亲和力高。在另一些实施方案中，HSA结合结构域对HAS的结合亲和力中等。在又另一些实施方案中，HSA结合结构域对HAS的结合亲和力低或最低。示例性结合亲和力包括KD浓度为10nM或更低(高)、在10nM和100nM之间(中)和大于100nM(低)。如上，对HSA的结合亲和力通过已知方法(例如表面等离子共振(SPR))来确定。

在一些实施方案中，HSA结合结构域是包含结合HSA的scFv的抗原结合结构域。在一些实施方案中，HSA结合结构域是sdABD。在一些实施方案中，HSA结合结构域是链球菌蛋白G的HSA结合结构域。在一些实施方案中，HSA结合结构域是人源化抗HSA结合片段，例如人源化scFv或sdABD。在一些实施方案中，HSA结合结构域包含SEQ ID NO：339的重链可变结构域和SEQ ID NO：340的轻链可变结构域。在一些实施方案中，HSA结合结构域是sdABD并且包含选自SEQ ID NO：341、342、343、344、345、346和347的单个单体可变结构域。在一些实施方案中，HSA结合结构域被修饰以增加或降低其对HSA的亲和力，例如使用Ralph等,MABS.2016,VOL.8,NO.7,1336–1346所示的方法。在一些实施方案中，HSA结合结构域包含SEQ ID NO：348的重链和SEQ ID NO：349的轻链。示例性氨基酸序列示于在图31A和图31B中。

c.结构域接头

在本文的许多实施方案中，结构域接头用于将本发明的各种组分连接在一起，使得保留组分的生物学功能。

结构域接头可以例如简单地用作连接两个实体的方便方式，用作在空间上分离两个实体的手段。结构域接头可以具有足以以这样的方式连接两个分子的长度，即它们相对于彼此呈现正确的构象使得它们保留期望的活性。通常，连接两个结构域的接头可以被设计为(1)允许两个结构域折叠并且彼此独立发挥作用，(2)不具有形成可能干扰两个结构域的功能结构域的有序二级结构的倾向，(3)具有可能与功能性蛋白质结构域相互作用的最小疏水性或带电特性和/或(4)提供两个结构域的空间分离。结构域接头还可以用于提供例如两个结构域、酶切割位点(例如蛋白酶的切割位点)、稳定序列、分子标签、可检测标记或其各种组合之间连接的不稳定性。

结构域接头的长度和组成可以显著不同，前提是它可以实现其作为分子桥的目的。通常考虑接头的预期功能以及任选的其他因素(例如合成的容易程度、稳定性、对某些化学和/或温度参数的抗性及生物相容性)，选择接头的长度和组成。例如，结构域接头可以是包含以下氨基酸残基的肽：Gly、Ser、Ala或Thr。在一些实施方案中，接头肽的长度为约1至50个氨基酸、约1至30个氨基酸、约1至20个氨基酸或约5至约10个氨基酸。示例性肽接头包含甘氨酸-丝氨酸聚合物，例如(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n(GGSGG)n、(GSGGS)n和(GGGGS)n，其中n为至少1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；和其他柔性接头。

可替代地，多种非蛋白质聚合物可以用作结构域接头，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。

结构域接头也可以源自免疫球蛋白轻链，例如

或

接头也可以源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如

和

例如，结构域接头可以包含任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但是不是CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。

结构域接头也可以源自其他蛋白质，例如Ig样蛋白质(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列和来自其他蛋白质的其他天然序列。

在本发明的一些实施方案中，第一CID结构域经由第一结构域接头与Fc结构域连接。在一些实施方案中，第二CID结构域经由第二结构域接头与治疗部分连接。第一结构域接头和第二结构域接头可以相同或可以不同。

在本发明的一些实施方案中，第一CID结构域经由第一结构域接头与HSA结合结构域连接。在一些实施方案中，第二CID结构域经由第二结构域接头与治疗部分连接。第一结构域接头和第二结构域接头可以相同或可以不同。

在一些实施方案中，结构域接头用于将Fv的VH和VL结构域连接在一起以形成scFv，并且可以被称为“scFv接头”。在这些实施方案中，scFv接头足够长以允许VH和VL结构域正确结合。在一些实施方案中，scFv接头的长度为10至25个氨基酸。

d.Fc结构域

在一些实施方案，特别是那些利用Fc结构域作为半衰期延长部分的实施方案中，本发明提供了异源二聚体Fc融合蛋白，其包含包含第一Fc结构域和第一CID结构域的第一单体和包含第二Fc结构域(例如，“空Fc结构域”)的第二单体。Fc融合蛋白基于每个单体上两个Fc结构域的自组装性质。异源二聚体Fc结构域是通过改变每个单体中Fc结构域的氨基酸序列以“歪曲”异源二聚体Fc结构域的形成来制备的，如下文更全面讨论的。

Fc结构域可以源自IgG Fc结构域，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，其中发现IgGl Fc结构域特别可用于本发明中。如本文所述，IgG1 Fc结构域可以经常但不总是与消融变体结合使用以消融效应器功能。类似地，当期望低效应器功能时，可以使用IgG4 Fc结构域。

对于本文所述的任何二聚体Fc融合蛋白，每条链的羧基端部分定义了主要负责效应器功能的恒定区。Kabat等收集了大量重链可变区和轻链可变区的一级序列。根据序列的保守程度，他们将单个一级序列分类为CDR和框架，并且制作了其列表(参见SEQUENCES OFIMMUNOLOGICALINTEREST,5th edition,NIH publication,No.91-3242,E.A.Kabat等，通过引用整体并入)。贯穿本说明书，当提及可变结构域中的残基(大约，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)和Fc区的EU编号***时，通常使用Kabat编号***(例如，Kabat等，同上(1991))。

在本文所述的二聚体Fc融合蛋白的一些实施方案中，第一单体和第二单体中的每一个都包含具有铰链-CH2-CH3式的Fc结构域，其中铰链是完整或部分的铰链序列。在本文所述的二聚体Fc融合蛋白的一些实施方案中，第一单体和第二单体中的每一个都包含具有CH2-CH3式的Fc结构域。

(i)异源二聚体Fc变体

在利用Fc结构域作为半衰期延长部分的实施方案中，Fc融合蛋白是异源二聚体Fc融合蛋白。此类异源二聚体蛋白质包含两个不同的Fc结构域(在第一单体和第二单体中的每一个上的Fc结构域)，其包含促进第一单体和第二单体的异源二聚化和/或允许异源二聚体比同源二聚体更容易纯化的修饰，在本文中共同地被称为“异源二聚化变体。”如本领域技术人员将理解的，通常这些异源二聚体单体通过将每个单体的基因包含到宿主细胞中来制备。这通常导致形成期望的异源二聚体(A-B)以及两个同源二聚体(A-A和B-B)。如本领域已知的，有许多可以用于生成本发明的Fc异源二聚体的机制。因此，导致异源二聚体产生的氨基酸变体被称为“异源二聚化变体”。如下文所讨论的，异源二聚化变体可以包括空间变体(例如，下文所述的“杵臼结构(knobs and holes)”变体和下文所述的“电荷对”变体)，其相对于A-A和B-B同源二聚体向形成A-B异源二聚体“歪曲”。

一种机制在本领域中通常被称为“杵臼结构”，或KIH是指产生空间影响以利于异源二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化。即，一个单体被工程化成具有庞大的氨基酸(“杵”)，而另一个单体被工程化成减小氨基酸侧链的大小(“臼”)，这相对同源二聚体向形成异源二聚体歪曲。这些技术和序列在Ridgway等,Protein Engineering 9(7):617(1996)；Atwell等,J.Mol.Biol.1997 270:26；美国专利号8,216,805、US 2012/0149876中进行了描述，所有这些都通过引用整体并入本文。这些参考文献的图(对于氨基酸变体，也特别地通过引用并入本文)鉴定了许多依赖于“杵臼结构”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等,Nature Biotech.16:677(1998)所述，这些“杵臼结构”突变可以与二硫键组合以使形成向异源二聚化歪曲。

发现可用于生成异源二聚体的另外机制有时被称为“静电转向”或“电荷对”，如Gunasekaran等,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)所述，在此通过引用整体并入。这有时在本文中被称为“电荷对”。在该实施方案中，静电用于使形成向异源二聚化歪曲。如本领域技术人员将理解的，这些也可能对pI有影响，因此对纯化有影响，并且因此在一些情况下也可能被认为是pI变体。然而，由于这些生成以强制异源二聚化并且不用作纯化工具，因此它们被分类为“空间变体”。这些包括但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如，这些是“单体对应组)和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。

异源二聚化变体可以包括歪曲变体(例如，下文所述的“杵臼结构”和“电荷对”变体)。示例性方法包括对称-不对称立体互补设计，例如，引入KiH、HA-TF和ZW1突变[参见Atwell等,J Mol Biol(1997)270(1):26–35；Moore et al.,MAbs(2011)3(6):546–57；VonKreudensteinet al.,MAbs(2013)5(5):646–54，所有这些都通过引用整体明确地并入本文]；电荷-电荷交换(例如，引入DD-KK突变)(参见Gunasekaran等,J Biol Chem2010；285:19637-46，通过引用整体并入本文)；电荷-空间互补交换外加另外的长程静电相互作用(例如，引入EW-RVT突变)(Choi等,Mol Cancer Ther(2013)12(12):2748–59，通过引用整体并入本文)；和同种型链交换，例如引入链交换工程化结构域(SEED)(Klein等,MAbs(2012)4(6):653–63；Von Kreudenstein等,MAbs(2013)5(5):646–54，所有这些都通过引用整体明确地并入本文)，如表2所总结的。

表2

除了异源二聚化变体之外，本文提供的二聚体Fc融合蛋白(同二聚体和异源二聚体)可以独立地包含影响功能(包括但不限于改变与一种或更多种Fc受体(例如，FcγR和FcRn)结合)的Fc修饰。

(ii)FcγR变体

在一些实施方案中，Fc融合蛋白包含一个或更多个影响与一种或更多种Fcγ受体结合的氨基酸修饰(例如，“FcγR变体”)。导致结合增加和结合减少的FcγR变体(例如，氨基酸取代)可以是有用的。例如，已知与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致靶细胞裂解)增加。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(抑制性受体)的结合减少也可以是有益的。发现降低FcγR活化和Fc介导的毒性的FcγR变体(例如P329G、L234A、L235A)可以用于本发明的Fc融合蛋白中(参见，Schlottauer等Protein EngDes Sel.2016；29(10):457-466，整体并入本文用于参考)。例如，并入P329G、L234A、L235A的IgG1 Fc结构域可以用于本发明中，并且可以进一步被修饰以促进异源二聚化。示例性氨基酸序列示于图28中。

另外的FcγR变体可以包括美国专利号8,188,321(特别是图41)和8,084,582以及美国专利公开号20060235208和20070148170中列出的那些，所有这些都通过引用整体明确地并入本文，特别是其中公开的影响Fcγ受体结合的变体。发现可用的特别变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。

(iii)FcRn变体

此外，本文所述的Fc融合蛋白可以独立地包含赋予与FcRn结合增加和血清半衰期增加的Fc取代。此类修饰在例如美国专利号8,367,805中公开，在此通过引用整体并入，特别是用于增加与FcRn的结合和增加半衰期的Fc取代。此类修改包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。

(iv)消融变体

在一些实施方案中，本文所述的Fc融合蛋白包含一个或更多个减少或去除Fc结构域与一种或更多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb,、FcγRIIIa等)的正常结合以避免另外的作用机制的修饰。此类修饰被称为“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在一些实施方案中，特别是在使用免疫调节蛋白时，期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性使得Fc结构域之一包含一种或更多种Fcγ受体消融变体。这些消融变体在美国专利号10,259,887的图31中进行描绘，其通过引用整体并入本文，并且各自可以独立地且任选地被包括或不被包括，优选的方面利用选自G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del(根据EU索引)的消融变体。应注意，本文提及的消融变体消融FcγR结合，但是通常不消融FcRn结合。

2.第二单体

在一些实施方案中，本文提供了异源二聚体Fc融合蛋白，其包含包含第一Fc结构域和第一CID结构域的第一单体和包含第二Fc结构域的第二单体。在一些情况下，第二单体仅包含Fc结构域(例如“空Fc结构域”)。在本文中描述了第二单体的异源二聚变体和其他Fc变体。

在一些其他实施方案中，如图29中一般描绘的，本发明提供了第一单体和第二单体，其在CIDSM的存在下结合以导致半衰期延长结构域与T细胞接合器结构域结合，因此允许对T细胞接合器结构域的半衰期进行时间控制。因此，除了上文讨论的第一单体之外，本发明提供了包含第二单体的组合物，该第二单体包含第二CID结构域、结构域接头和T细胞接合器结构域，如图29中一般描绘的。在一些实施方案中，第二单体从N到C端包含第二CID结构域-结构域接头-T细胞接合器域，并且在另外的实施方案中，N到C端顺序是T细胞接合器结构域-结构域接头-CID结构域。

第二CID结构域和结构域接头如本文所概述的。

a.T细胞接合域

在许多实施方案中，治疗部分是T细胞接合器结构域。通常，如本领域已知的，T细胞接合器结构域至少包含与T细胞结合(通常与在T细胞表面上表达的CD3蛋白结合)的ABD，与癌细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)结合的ABD连接。这些T细胞接合器结构域被设计成允许通过募集细胞毒性T细胞来特异性靶向表达靶抗原的细胞。因此，本文所述的T细胞接合器结构域可以经由与表面表达的CD3蛋白结合来接合细胞毒性T细胞，该表面表达的CD3蛋白形成T细胞受体(TCR)的一部分。T细胞接合器与CD3和特定肿瘤细胞表面上表达的靶抗原的同时结合导致T细胞活化并且介导特定靶抗原表达细胞的后续裂解。因此，T细胞接合器结构域可以诱导强烈、特异性且高效的靶细胞杀伤(Ellerman,Methods,2019；54:102-107)。

在一些实施方案中，T细胞ABD的C端经由结构域接头与TAA-ABD的N端连接。在另一些实施方案中，T细胞结合结构域的N端经由结构域接头与T细胞接合器的靶抗原结合结构域的C端连接。

(i)T细胞ABD

T细胞接合器结构域与T细胞的结合特异性由TCR的识别介导。作为TCR的一部分，CD3是蛋白质复合物，包含存在于细胞表面上的CD3λ(gamma)链、CD3δ(delta)链和两条CD3ε(epsilon)链。CD3与TCR的α(alpha)和β(beta)链以及CD3(zeta)一起结合以形成完整的TCR。CD3在T细胞上的聚集(例如通过固定化抗CD3抗体)导致T细胞活化，类似于T细胞受体的接合，但是不依赖于其克隆典型特异性。

本文所述的T细胞接合器结构域包含与TCR特异性结合的结构域。在一些实施方案中，本文所述的T细胞接合器结构域包含与人CD3特异性结合的结构域。

在一些实施方案中，T细胞接合器结构域的T细胞ABD包含源自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体或人源化抗体的抗原结合结构域。T细胞ABD可以采用任何形式，包括但不限于Fv、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(例如源自骆驼的单结构域抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。

在一些实施方案中，T细胞接合器部分的T细胞ABD是抗CD3 ABD，其包含抗CD3抗体的一组三条轻链CDR(vlCDRl、vlCDR2和vlCDR3)和三条重链CDR(vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3)。有助于CDR组的示例性抗CD3抗体包括但不限于L2K、UCHT1、UCHT1的变体(包括UCHT1.v9)、莫罗莫那-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34(参见Yang SJ,The Journal of Immunology(1986)137；1097-1100)、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLBT3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01和WT-31。抗CD3 ABD的示例性氨基酸序列在图27中提供。

在一些实施方案中，抗CD3 ABD具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸修饰(具有发现特别可用的氨基酸取代)。即，只要这组6个CDR的变化总数小于6个氨基酸修饰，就可以修饰CDR，其中可以改变CDR的任意组合；例如，可以在vlCDR1中有一个氨基酸变化，在vhCDR2中有两个氨基酸变化，在vhCDR3中没有，等等)。

在一些实施方案中，抗CD3 ABD是人源化的或来自人的。例如，抗CD3ABD可以包含轻链可变区，其包含人轻链框架区中的人CDR或非人轻链CDR；以及重链可变区，其包含人重链框架区中的人或非人重链CDR。在一些实施方案中，轻链框架区是λ轻链框架。在另一些实施方案中，轻链框架区是κ轻链框架。

在一些实施方案中，抗CD3 ABD是包含本文提供的抗-CD3抗体序列的轻链可变区和重链可变区的单链可变片段(scFv)。如本文所用，“单链可变片段”或“scFv”是指包含轻链的可变区和重链的可变区的抗体片段，其中轻链和重链的可变区经由短柔性多肽接头连续连接，并且能够作为单个多肽链表达，并且其中scFv保留了其所来源的完整抗体的特异性。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如，以以下任何方向：轻链可变区-scFv接头-重链可变区或重链可变区-scFv接头-轻链可变区。

因此，在一些实施方案中，抗CD3 ABD是包含本文提供的抗-CD3抗体序列的轻链可变区和重链可变区的单链可变片段(scFv)。可以根据已知方法制备与CD3结合的scFv。例如，可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生scFv分子。scFv分子包含具有优化长度和/或氨基酸组成的scFv接头。因此，在一些实施方案中，scFv接头的长度为10至约25个氨基酸。关于scFv接头的氨基酸组成，选择赋予柔性、不干扰可变结构域以及允许链间折叠以将两个可变结构域结合在一起以形成功能性CD3结合位点的肽。在一些实施方案中，scFv接头包含甘氨酸和丝氨酸残基。scFv接头的氨基酸序列可以例如通过噬菌体展示方法来优化以提高scFv的CD3结合和产量。适用于连接scFv中的可变轻链区和可变重链区的肽scFv接头的实例包括但不限于(GS)n(SEQ ID NO：325)、(GGS)n(SEQ ID NO：326)、(GGGS)n(SEQ ID NO：327)、(GGSG)n(SEQ ID NO：328)、(GGSGG)n(SEQ ID NO：329)或(GGGGS)n(SEQ ID NO：330)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，肽scFv接头选自GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：312)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：313)、GGSGGSGGSGGSGG(SEQ ID NO：318)。

在一些实施方案中，T细胞接合器结构域的抗CD3抗原结合结构域对CD3表达细胞上的CD3具有亲和力，其中KD为1000nM或更小、500nM或更小、200nM或更小、100nM或更小、80nM或更小、50nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小或0.5nM或更小。对与CD3结合的亲和力可以例如通过表面等离子共振(SPR)来确定。

(ii)肿瘤相关抗原抗原结合结构域(“TAA-ABD”)

在一些实施方案中，T细胞接合器的靶抗原ABD与参与疾病、病症或症状(例如，增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病)和/或与其相关的靶抗原结合。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面分子，例如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，靶抗原位于肿瘤细胞上。

本发明中的靶抗原结合结构域可以采用任何形式，包括但不限于全抗体、Fab、Fv、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(例如源自骆驼的单结构域抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。

在一些实施方案中，靶抗原是癌细胞上表达的肿瘤相关抗原。例如，肿瘤相关抗原是CD19，并且T细胞接合器结构域靶向表达CD19的癌症，例如大多数B细胞恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤。示例性CD19结合结构域可以包含源自博纳吐单抗、SAR3419、MEDI-551或Combotox的抗CD19结合结构域的一个或更多个CDR的抗体部分。

3.融合蛋白部分

在一些实施方案中，融合蛋白部分(在本文中也被称为“第三单体”)从N到C端包含第二CID结构域-结构域接头-治疗部分，并且在另外的实施方案中，N到C端顺序是治疗部分-结构域接头-第二CID结构域。CID的两半如上所述，并且两半中的任一个都可以用于与治疗部分连接以形成本发明中的融合蛋白部分。

a.治疗部分

如本文所讨论的，本发明一般地涉及控制治疗部分在患者的血流中的半衰期的能力。因此，虽然通常在本发明中可以使用任何治疗部分，但是发现具有特定不良副作用的那些(例如T细胞接合器药物)特别可用于本发明中。

任何治疗部分可以用于与第二CID结构域连接以产生本文所述的融合蛋白部分。例如，治疗部分包括但不限于T细胞接合器部分；抗体，包括但不限于采用各种形式的抗体片段，例如Fv、scFv和单结构域抗体(sdAb；包括片段，例如源自骆驼的sdAb的VHH结构域)；细胞因子；激素；肽；抗体药物缀合物；或肽药物缀合物。

在一些实施方案中，治疗部分是靶向与增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物疾病相关的抗原的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，治疗部分是结合如本文所述的肿瘤细胞上表达的一种或更多种肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，治疗部分是如图8中一般示出的白细胞介素分子，例如但不限于IL-2、IL-12、IL-15及其变体。

(i)T细胞接合器结构域

在特别有用的实施方案中，治疗部分是T细胞接合器部分。如本领域已知的，虽然这些通常是非常有效的癌症治疗剂，但是它们也可以表现出毒副作用，并且因此从患者的血流中快速去除它们的能力是极其有益的。

通常，如本领域已知的，T细胞接合器部分包含T细胞抗原结合结构域(TC-ABD)和肿瘤靶标相关抗原结合结构域(TTA-ABD)，并且被设计成允许通过募集细胞毒性T细胞来特异性靶向表达靶抗原的细胞。例如，本文所述的T细胞接合器部分可以经由与形成T细胞受体(TCR)的一部分的表面表达的CD3蛋白结合来接合细胞毒性T细胞。T细胞接合器部分与CD3和特定细胞表面上表达的靶抗原的同时结合导致T细胞活化并且介导特定靶抗原表达细胞的后续裂解。因此，T细胞接合器可以诱导强烈、特异性且高效的靶细胞杀伤。

在一些实施方案中，本文所述的T细胞接合器部分包含T细胞ABD和靶抗原结合结构域，其中靶抗原在致病细胞(例如，肿瘤细胞、病毒性或细菌性感染的细胞、自身反应性T细胞等)上表达。结果，T细胞接合器刺激细胞毒性T细胞的靶细胞杀伤以消除致病细胞。示例性T细胞接合器在Dreier,T.等,Int.J.Cancer,100:690-697(2002)；和BrischweinK等,Molecular Immunology第43卷,第8期,1129-1243(2006)中进行了描述，其两者均通过引用整体并入。

在一些实施方案中，T细胞ABD的C端经由结构域接头与靶ABD的N端连接。在另一些实施方案中，T细胞结合结构域的N端经由结构域接头与T细胞接合器的靶抗原结合结构域的C端连接。

在一些实施方案中，包括图3中描绘的那些，为T细胞接合器部分的治疗部分实际上分开在两个单体之间，其中T细胞ABD和肿瘤抗原ABD在不同的链上。这在下文一般讨论。

(a)T细胞ABD

T细胞接合器部分与T细胞的结合特异性由TCR的识别介导。作为TCR的一部分，CD3是一种蛋白质复合物，包括存在于细胞表面上的CD3λ(gamma)链、CD3δ(delta)链和两条CD3ε(epsilon)链。CD3与TCR的α(alpha)和β(beta)链以及CD3(zeta)一起结合以形成完整的TCR。CD3在T细胞上的聚集(例如通过固定化抗CD3抗体)导致T细胞活化，类似于T细胞受体的接合，但是不依赖于其克隆典型特异性。

本文所述的T细胞接合器部分包含与TCR特异性结合的结构域。在一些实施方案中，本文所述的T细胞接合器部分包含与人CD3ε特异性结合的结构域。

在一些实施方案中，T细胞接合器部分的T细胞ABD包含源自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体或人源化抗体的抗原结合结构域。T细胞ABD可以采用任何形式，包括但不限于Fv、scFv和sdAb(例如源自骆驼的sdAb的VHH结构域)。

在一些实施方案中，T细胞接合器部分的T细胞ABD是抗CD3 ABD，其包含抗CD3抗体的一组三条轻链CDR(vlCDRl、vlCDR2和vlCDR3)和三条重链CDR(vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3)。有助于CDR组的示例性抗CD3抗体包括但不限于L2K、UCHT1、UCHT1的变体(包括UCHT1.v9)、莫罗莫那-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion))、SP34、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLBT3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01和WT-31。抗CD3 ABD的示例性氨基酸序列在图27中提供。

在一些实施方案中，抗-CD3 ABD具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸修饰(具有特别有用的氨基酸取代)。即，只要这组6个CDR的变化总数小于6个氨基酸修饰，就可以修饰CDR，其中可以改变CDR的任意组合；例如，可以在vlCDR1中有一个氨基酸变化，在vhCDR2中有两个氨基酸变化，在vhCDR3中没有，等等。

在一些实施方案中，抗CD3 ABD是人源化的或来自人的。例如，抗CD3ABD可以包含轻链可变区，其包含人轻链框架区中的人CDR或非人轻链CDR；以及重链可变区，其包含人重链框架区中的人或非人重链CDR。在一些实施方案中，轻链框架区是λ轻链框架。在另一些实施方案中，轻链框架区是κ轻链框架。

在一些实施方案中，抗-CD3 ABD是包含本文提供的抗-CD3抗体序列的轻链可变区和重链可变区的单链可变片段(scFv)。可以根据已知方法制备与CD3结合的scFv。例如，可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生scFv分子。scFv分子包含具有优化长度和/或氨基酸组成的scFv接头。因此，在一些实施方案中，scFv接头的长度为10至约25个氨基酸。关于scFv接头的氨基酸组成，选择赋予柔性、不干扰可变结构域以及允许链间折叠以将两个可变结构域结合在一起以形成功能性CD3结合位点的肽。在一些实施方案中，scFv接头包含甘氨酸和丝氨酸残基。scFv接头的氨基酸序列可以例如通过噬菌体展示方法来优化以提高scFv的CD3结合和产量。适用于连接scFv中的可变轻链区和可变重链区的肽scFv接头的实例包括但不限于(GS)n(SEQ ID NO：325)、(GGS)n(SEQ ID NO：326)、(GGGS)n(SEQ ID NO：327)、(GGSG)n(SEQ ID NO：328)、(GGSGG)n(SEQ ID NO：329)或(GGGGS)n(SEQID NO：330)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，肽scFv接头选自GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：312)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：313)、GGSGGSGGSGGSGG(SEQ ID NO：318)。

在一些实施方案中，T细胞接合器部分的抗CD3抗原结合结构域对CD3表达细胞上的CD3具有亲和力，KD为1000nM或更小、500nM或更小、200nM或更小、100nM或更小、80nM或更小、50nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小或0.5nM或更小。与CD3结合的亲和力可以例如通过表面等离子共振(SPR)来确定。

(b)靶ABD

除了与T细胞结合的组分，例如抗CD3 ABD(CD3-ABD)之外，T细胞接合器部分还包含与靶抗原(通常靶肿瘤相关抗原(TTA))结合的ABD，通过如上所述的结构域接头连接。因此，在一些实施方案中，T细胞接合器部分的靶抗原ABD与参与疾病、病症或症状(例如，增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病)和/或与其相关的靶抗原结合。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面分子，例如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原。

本发明中的靶抗原ABD可以采用任何形式，包括但不限于全抗体、Fab、Fv、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(例如源自骆驼的单结构域抗体的VHH)。在许多实施方案中，靶抗原ABD是scFv。

在一些实施方案中，靶抗原是癌细胞上表达的肿瘤相关抗原。例如，肿瘤相关抗原是CD19，并且T细胞接合器部分靶向表达CD19的癌症，例如大多数B细胞恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤。示例性CD19结合结构域可以包含源自博纳吐单抗、SAR3419、MEDI-551或Combotox的抗CD19结合结构域的一个或更多个CDR的抗体部分。

除了CD19之外，还设想了任何其他肿瘤相关抗原，例如Her2。

B.包含CInD的组合物

如本文所讨论的，本发明的组合物依赖于两种机制之一：单体组分与小分子保持在一起用以发挥功能(如上所述的“CID实施方案”)或通过添加小分子分离结合的单体(“CInD实施方案”)。

因此，本发明的另一方面涉及包含二聚体Fc融合蛋白和融合蛋白部分的组合物。二聚体Fc融合蛋白包含第一单体，其含有任选地经由结构域接头与化学抑制二聚体(CInD)的一半(在本文中被称为“第一CInD结构域”)连接的第一Fc结构域；和第二单体，其含有与第一Fc结构域二聚化的第二Fc结构域。融合蛋白部分包含任选地经由结构域接头与CInD结构域的另一半(在本文中被称为“第二CInD结构域”)连接的治疗部分。在施用之后，CInD结构域的两半形成二聚体，使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。在治疗部分需要从血液中快速清除的情况下，施用CInD小分子，该CInD小分子诱导CInD的两半解离，从而使得治疗部分与Fc结构域能够解离，并且能够清除患者中的治疗部分。

在一些实施方案中，Fc融合蛋白是异源二聚体，其中一个单体包含与第一Fc结构域连接的第一CInD结构域，并且另一个单体包含单独的Fc结构域(例如，“空Fc结构域”)，如图2A所示。第一Fc结构域和第二Fc结构域例如通过并入本文所述的异源二聚化突变来异源二聚化。

在一些实施方案中，Fc融合蛋白是异源二聚体，其中一个单体含有与第一Fc结构域连接的第一CInD结构域，并且另一个单体含有任选地经由接头与第二治疗部分连接的第二Fc结构域，如图3所示。施用异源二聚体Fc融合蛋白与融合蛋白部分(该融合蛋白部分包含如上所述的与第二CInD结构域连接的治疗部分)诱导CInD结构域的两半的结合，使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。另外，该形式赋予治疗部分双特异性性质，并且可以在同时增加其血清半衰期的时候增加治疗部分的效力。第一Fc结构域和第二Fc结构域例如通过并入本文所述的异源二聚化突变来异源二聚化。

在一些其他实施方案中，Fc融合蛋白是具有两个相同单体的同源二聚体，每个单体含有任选地经由接头与Fc结构域连接的第一CInD结构域，如图4所示。施用同源Fc融合蛋白(其中融合蛋白部分包含如上所述的与第二CInD结构域连接的治疗部分)诱导CInD结构域的两半的结合，使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。该形式在同时延长其半衰期的时候增加治疗部分的化学计量和平衡。

1.异源二聚体Fc融合蛋白

对于包含第一CInD结构域的异源二聚体Fc融合蛋白，彼此异源二聚化的Fc结构域在本文中一般地进行描述。还可以引入另外的Fc变体(包括但不限于Fc消融变体、FcRn变体、FcγR变体和/或半衰期延长变体)与本文一般概述的异源二聚化突变组合。

在一些实施方案中，异源二聚体Fc融合蛋白包含任选地经由接头与第二单体连接的第一治疗部分。第一治疗部分可以是抗体；采用各种形式的抗体片段，例如但不限于Fab、Fv、scFv、单结构域抗体(例如源自骆驼的单结构域抗体的VHH)；细胞因子；激素；肽；抗体药物缀合物；或肽药物缀合物。在一些实施方案中，第一治疗部分是靶向与增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物疾病相关的抗原的抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，第一治疗部分是结合本文所述的肿瘤细胞上表达的一种或更多种肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，第一治疗部分是白细胞介素分子，例如但不限于IL-2、IL-12和IL-15。

在一些实施方案中，第一治疗部分与融合蛋白部分的第二治疗部分一起作用以充当双特异性分子，与两个靶标结合。在一些实施方案中，两个靶标位于同一细胞上。在一些实施方案中，两个靶标位于不同的细胞上。在一些实施方案中，一个靶标位于细胞上，并且另一个靶标位于细胞所在的微环境中。

例如，第一治疗部分可以与融合蛋白部分内的第二治疗部分一起起作用以充当T细胞接合器，其中第一治疗部分是识别T细胞抗原的ABD，例如CD3 ABD；并且第二治疗部分是识别参与疾病、病症或症状(例如增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病)和/或与其相关的靶抗原的ABD。可替代地，第二治疗部分可以是识别T细胞抗原的ABD，例如CD3ABD；并且第一治疗部分可以是识别参与疾病、病症或症状(例如增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病)和/或与其相关的靶抗原的ABD。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面分子，例如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，靶抗原是本文所述的肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原，例如CD19。

a.CInD

化学抑制二聚化是一种生物学机制，其中两个蛋白质非共价结合(associate或bind)，并且结合被小分子破坏。在本发明中，破坏性小分子被称为“化学抑制二聚体(CInD)小分子”或“CInD小分子”或“CInDSM”。

在本发明中，两个CInD结构域成对出现，其在CInDSM的存在下解离。如本领域技术人员将理解的，一些CInD对是相同的，例如，两个CInD结构域是相同的。在另一些实施方案中，CInD对由两个不同的CInD结构域组成。

任何CInD对可以用于本发明中。在本发明的一些实施方案中，CInD对源自天然存在的结合配偶体。在一些实施方案中，CInD对包含蛋白质和与该蛋白质特异性结合的抗原结合结构域(ABD)。在一些实施方案中，CInD对包含两个抗体部分，其中一个充当抗原并且另一个充当抗体。

CInD小分子可以是天然存在的并且破坏CInD对的结合。CInD小分子也可以从可以破坏CInD对配对的小分子文库中筛选出。在一些实施方案中，CInD小分子通过以比CInD对的两个结构域的结合亲和力高至少2倍(例如，至少2倍、在至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍)的亲和力与CInD对的一个结构域结合来破坏CInD对。在一些实施方案中，CInD小分子通过掩蔽或改变CInD对的两个结构域之间的结合界面来破坏CInD对。

CInD结构域对和CInDSM可以使用从抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库或噬菌体展示的Fab文库进行的筛选来产生。例如，作为步骤1，可以选择在不存在小分子的情况下与同源结合部分结合的结合部分，从而生成一组选择的结合部分；并且然后，作为步骤2，可以针对在小分子的存在下不与同源结合部分结合的结合部分筛选选择的结合部分，从而生成一组反向选择的结合部分。步骤1和2的筛选可以进行一轮或更多轮，其中每轮筛选包括步骤1的筛选和步骤2的筛选，使得在小分子的存在下生成一组与同源结合部分特异性解离的结合部分。

2.同源二聚体Fc融合蛋白

a.Fc结构域

在一方面，二聚体Fc融合蛋白是同源二聚体Fc融合蛋白。此类同源二聚体Fc融合蛋白包含第一单体和第二单体，每个单体具有Fc结构域和具有相同氨基酸序列的第一CInD结构域。在一些实施方案中，Fc结构域经由结构域接头与第一CInD结构域连接，这在本文中一般地进行描述。在一些实施方案中，Fc结构域在没有结构域接头的情况下与第一CInD结构域连接。这些Fc结构域通常如上所述，但是缺少异源二聚化变体。

3.融合蛋白部分

融合蛋白部分包含第二CInD结构域和治疗部分。第二CInD结构域和治疗部分如本文一般地描述的。

C.示例性组合物

在一些实施方案中，本发明涉及组合物，该组合物包含异源二聚体Fc融合蛋白的组合物，其包含第一CID结构域；和融合蛋白部分，其包含第二CID结构域和治疗结构域，如图1B所示。异源二聚体Fc融合蛋白由第一单体和第二单体融合。第一单体包含经由结构域接头与人IgG1 Fc结构域共价连接的第一CID结构域BCL-2或BCL-2(C158A)。第一单体从N到C端包含BCL-2或BCL-2(C158A)-结构域接头-人IgG1 Fc结构域，或从N到C端包含人IgG1 Fc结构域-结构域接头-BCL-2或BCL-2(C158A)。第二单体包含与第一单体的Fc结构域二聚化的空人IgG1 Fc。融合蛋白部分包含第二CID结构域AZ21，该第二CID结构域AZ21经由结构域接头与包含CD3 scFv和CD19scFv的T细胞接合器连接。在一些实施方案中，融合蛋白部分从N到C端包含AZ21-结构域接头-CD19 scFv-CD3 scFv。在一些实施方案中，融合蛋白部分从N到C端包含CD19 scFv-CD3 scFv-结构域接头-AZ21。AZ21可以形成Fab或单链Fab。组合物的不同构型在图5和图6中描绘为Ab59、Ab51、Ab52、Ab53、Ab54、Ab55、Ab63、Ab57和Ab58。添加CID小分子ABT199诱导BCl-2或BCL-2(C158A)与AZ21结合，从而使得T细胞接合器与Fc结构域能够结合，并且延长T细胞接合器的血清半衰期。

在一些实施方案中，本发明涉及组合物，该组合物包含异源二聚体Fc融合蛋白，其包含第一CInD结构域；和融合蛋白部分，其包含第二CInD结构域和治疗结构域，如图2B所示。异源二聚体Fc融合蛋白由第一单体和第二单体融合。第一单体包含经由结构域接头与人IgG1 Fc结构域共价连接的第一CInD结构域。第一单体从N到C端包含第一CInD结构域-结构域接头-人IgG1Fc结构域，或从N到C端包含人IgG1 Fc结构域-结构域接头-第一CInD结构域。第二单体包含与第一单体的Fc结构域二聚化的空人IgG1 Fc。融合蛋白部分包含第二CInD结构域，该第二CInD结构域经由结构域接头与包含CD3 scFv和CD19 scFv的T细胞接合器连接。在一些实施方案中，融合蛋白部分从N到C端包含第二CInD结构域-结构域接头-CD19 scFv-CD3 scFv。在一些实施方案中，融合蛋白部分从N到C端包含CD19 scFv-CD3scFv-结构域接头-第二CInD结构域。第一CInD结构域和第二CInD结构域结合形成二聚体，使T细胞接合器与Fc结构域结合，并且从而延长T细胞接合器的血清半衰期。在患者需要快速清除治疗部分的情况下，例如由于安全考虑，向患者给药CInD小分子，该CInD小分子破坏CInD对。这导致T细胞接合器与Fc结构域的解离以及患者中T细胞接合器的快速清除。

在一些实施方案中，本发明涉及包含异源二聚体Fc融合蛋白和融合蛋白部分的组合物，如图3所示。异源二聚体Fc融合蛋白包含第一单体，其含有经由接头与第一人IgGl Fc连接的第一CInD结构域；和第二单体，其含有经由接头与第二治疗部分(例如CD19 scFv)连接的第二人IgG1 Fc结构域。与第二Fc结构域二聚化的第一IgG1 Fc结构域。融合蛋白部分包含与治疗部分(例如CD3 scFv)连接的第二CInD结构域。两个CInD结构域的结合使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。另外，该形式将治疗部分结合在一起并且赋予治疗部分双特异性性质(例如将CD3 ABD和CD19 ABD结合在一起作为T细胞接合器)，在同时增加其血清半衰期的时候增加效力。CD3 scFv和CD19 scFv可以交换在组合物中的位置，并且它们可以在其N或C端与相邻结构域连接。在患者需要快速清除治疗部分的情况下，例如由于安全考虑，向患者给药CInD小分子，该CInD小分子破坏CInD对。这导致一个治疗部分与Fc结构域的解离以及患者中治疗部分的快速清除。

在一些实施方案中，本发明涉及包含同源二聚体Fc融合蛋白和融合蛋白部分的组合物，如图4所示。Fc融合蛋白包含两个相同单体，每个单体含有经由接头与人IgGl Fc连接的第一CInD结构域。融合蛋白部分包含经由结构域接头与治疗部分连接的第二CInD结构域。例如，治疗部分可以是包含CD19scFv和CD3 scFv的T细胞接合器。两个CInD结构域的结合使得治疗部分与Fc结构域能够结合，并且延长治疗部分的血清半衰期。该形式使得两个治疗部分与单个Fc二聚体能够结合，这导致化学计量增加并且可以增加治疗部分的效力，同时延长其血清半衰期。在患者需要快速清除治疗部分的情况下，例如由于安全考虑，向患者给药CInD小分子，该CInD小分子破坏CInD对。这导致治疗部分与Fc结构域的解离以及患者中治疗部分的快速清除。

D.编码组合物的核酸

提供了编码本文所述的组合物的核酸组合物，包括编码本发明的单体组分的多核苷酸分子。即，本发明的组合物通常包含三个单体(两个Fc融合蛋白单体和融合蛋白部分)，每个单体都由核酸编码。

还提供了含有核酸的表达载体以及用核酸和/或表达载体转化的宿主细胞。如本领域技术人员将理解的，由于遗传密码的简并性，本文所描绘的蛋白质序列可以由任何数量的可能的核酸序列编码。

在一些实施方案中，多核苷酸分子作为DNA构建体提供。

在一些实施方案中，将编码二聚体Fc融合蛋白和融合蛋白部分的每个单体的多核苷酸分子置于单个表达载体中。在一些实施方案中，将编码二聚体Fc融合蛋白和融合蛋白部分的每个单体的多核苷酸分子置于不同的表达载体中。如本领域已知的，表达载体可以含有适当的转录和翻译控制序列，包括但不限于信号和分泌序列、调节序列、启动子、复制起点、选择基因等。

表达载体可以转化到宿主细胞中，在其中它们被表达以形成本文所述的组合物。适当的宿主细胞表达***包括但不限于细菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞。优选的用于表达根据本发明的至少一些实施方案的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、PER.C6、HEK293和本领域已知的其他细胞。

在一些实施方案中，本文所述的组合物通过将一种或更多种表达该组合物的表达载体引入宿主细胞中并且在表达蛋白质的条件下培养所述宿主细胞来产生，可以分离和任选地进一步纯化。

E.制剂

用于实施上述方法的组合物可配制成药物组合物，该药物组合物包含适用于期望递送方法的载体。合适的载体包括当与治疗性组合物组合时保留治疗性组合物的治疗功能并且通常不与患者的免疫***反应的任何材料。实例包括但不限于数种标准药物载体中的任一种，例如无菌磷酸盐缓冲液、抑菌水等(通常参见，Remington's PharmaceuticalSciences第16版,A.Osal.,Ed.,1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且可以包括缓冲剂。

本发明中描述的药物组合物的施用(优选以无菌水溶液的形式)可以以多种方式进行，包括但不限于静脉内或局部。

F.使用组合物的方法

1.Fc融合蛋白

本文所述的组合物可以用于许多治疗应用。通常，患者是人，但是还可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。

可以向患者施用组合物，该组合物包含异源二聚体Fc融合蛋白，其含有第一CID结构域；和融合蛋白部分，其含有第二CID结构域和治疗部分。对同一患者施用CID小分子诱导两个CID结构域的结合，使治疗部分与Fc结构域结合，并且从而延长治疗部分的血清半衰期。CID小分子可以在施用组合物之前、同时或之后施用。

如本领域技术人员将理解的，治疗部分的起始血清半衰期可以广泛不同，其中一些部分，如IL-2，半衰期以小时为单位测量，并且其他部分，如抗体，半衰期以天为单位测量。因此，治疗部分的血清半衰期可以延长至至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约4天、至少约6天、至少约8天、至少约10天、至少约12天或至少约14天。可替代地，血清半衰期可以延长1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或在一些情况下延长1至100倍。为了维持治疗部分与Fc结构域的结合，可以向患者定期给药CID小分子，并且给药频率取决于CID小分子的血清半衰期和CID复合物的寿命的组合。

在患者需要快速清除治疗部分的情况下，例如由于安全考虑，停止向患者给药CID小分子，导致CID小分子的清除、治疗部分与Fc结构域的解离以及患者中治疗部分的快速清除。治疗部分的清除率取决于CID小分子的血清半衰期、CID小分子与第一CID结构域和第二CID结构域的结合亲和力、CID复合物的寿命以及当不再与Fc结构域结合时治疗部分的清除率的组合。

可以向患者施用组合物，该组合物包含异源二聚体或同源二聚体Fc融合蛋白，其含有第一CInD结构域；和融合蛋白部分，其含有第二CInD结构域和治疗部分。第一CInD结构域和第二CInD结构域结合形成二聚体，使治疗部分与Fc结构域结合，并且从而延长治疗部分的血清半衰期。

如上所讨论的，治疗部分的血清半衰期可延长至至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约4天、至少约6天、至少约8天、至少约10天、至少约12天或至少约14天。可替代地，血清半衰期可以延长1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或在一些情况下延长1至100倍。

在患者需要快速清除治疗部分的情况下，例如由于安全考虑，向患者给药CInD小分子，该CInD小分子破坏CInD对。这导致治疗部分与Fc结构域的解离以及患者中治疗部分的快速清除。治疗部分的清除率取决于CInD小分子与第一CInD结构域和第二CInD结构域的结合亲和力以及当不再与Fc结构域结合时治疗部分的清除率。

上述方法使得能够对在患者中治疗部分的血清半衰期进行精确的时间控制，并且该方法适用于遭受多种疾病或症状(例如，增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫障碍、自身免疫病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病)的患者。根据患者的疾病和适当的治疗部分，可以被设计成并入本文所述的组合物中。例如，为了在遭受大多数B细胞恶性肿瘤(包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤)的患者中治疗和控制治疗部分的血清半衰期，治疗部分可以将包含CD19 ABD和CD3 ABD的T细胞接合器并入本文所述的组合物中。

本文所述的组合物的施用可以以多种方式进行，包括但不限于静脉内或局部。

在一个优选的实施方案中，选择施用的给药量和频率以治疗或预防有效。如本领域所知的，任一个患者的剂量取决于许多因素，年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间和途径、药物相互作用和症状的严重程度可能是必要的，并且本领域技术人员可使用常规实验确定。

2.HSA

本文所述的包含第一单体和第二单体的组合物可以用于许多治疗应用。通常，患者是人，但是还可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。

在一些实施方案中，向患者施用该组合物以在患者中延长T细胞接合器结构域的血清半衰期，其中该T细胞接合器在患者中用于刺激细胞毒性T细胞的靶细胞杀伤。靶细胞参与疾病、病症或症状(例如增殖性疾病和肿瘤性疾病)和/或与其相关。向同一患者施用CID小分子诱导第一单体和第二单体的结合，使T细胞接合器结构域与HSA结合并且从而延长T细胞接合区的血清半衰期。小分子可以在施用组合物之前、同时或之后施用。

T细胞接合器结构域的血清半衰期可以延长至至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约4天、至少约6天、至少约8天、至少约10天、至少约12天或至少约14天。可替代地，血清半衰期可以延长1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或在一些情况下延长1至100倍。为了维持T细胞接合器与HSA的结合，可以向患者定期给药CID小分子，并且给药频率取决于CID小分子的血清半衰期和CID复合物的寿命的组合。

在患者需要快速清除T细胞接合器的情况下，例如由于安全考虑，停止向患者给药小分子，导致小分子的清除、T细胞接合器与HSA的解离以及患者中T细胞接合器的快速清除。T细胞接合器的清除率取决于小分子的血清半衰期、CID小分子与第一CID结构域和第二CID结构域的结合亲和力、CID复合物的寿命以及当不再与HAS结合时T细胞接合器的清除率的组合。

上述方法使得能够对在患者中T细胞接合器结构域的血清半衰期进行精确的时间控制，并且该方法适用于遭受多种疾病或症状(例如增殖性疾病和肿瘤性疾病)的患者。根据患者的疾病和设想被细胞毒性T细胞靶向的细胞，适当的T细胞接合器结构域可以被设计成并入本文所述的组合物中。例如，为了在遭受患有大多数B细胞恶性肿瘤(包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤)的患者中治疗和控制T细胞接合器结构域的血清半衰期，可以将包含CD19 ABD和CD3 ABD的T细胞接合器结构域并入本文所述的组合物中。

本文所述的组合物的施用可以以多种方式进行，包括但不限于静脉内或局部。

在一个优选的实施方案中，选择施用的给药量和频率以治疗或预防有效。如本领域所知的，任一个患者的剂量取决于许多因素，年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间和途径、药物相互作用和症状的严重程度可能是必要的，并且本领域技术人员可使用常规实验确定。

VII.实施例

现在一般地描述的本发明通过参考以下实施例将更容易理解，包括这些实施例仅仅是出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，而不是旨在限制本发明。

A.实施例1

将融合蛋白部分构建成包含第二CID结构域(AZ21)和治疗结构域(包含抗CD3抗原结合结构域和抗CD19抗原结合结构域的T细胞接合器结构域)。不同的形式示于图6中。测试了这些融合蛋白部分活化T细胞的能力。

将Raji B淋巴瘤细胞用在DPBS中的CFSE-DA(Tonbo，750nM最终浓度)标记10分钟，然后用RPMI+10％FBS培养基洗涤。然后将Raji B细胞与Jurkat T细胞以10:1的效应器:靶标之比混合并且以总共1.1e5个细胞/孔接种在U型底96孔板中。将连续稀释的融合蛋白部分添加到细胞中并且在37℃和5％CO2下孵育16小时。在孵育之后，在37℃下通过添加不可透过膜的蛋白质反应性染料(Biotium CF405S-SE，1.5μM最终浓度)对细胞进行染色10分钟用于活力。然后立即通过添加多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，1.6％最终浓度)将细胞固定10分钟。将细胞离心，吸出上清液，然后将沉淀物重悬于50μLPE缀合的抗人CD69(BioLegend，克隆FN50)中并且在室温下染色30分钟，然后通过流式细胞术测量。通过流式细胞术和手动门控评估活的JurkaT细胞(CF405S阴性，CFSE阴性)的CD69表达。CD69+细胞的频率表示为活的JurkaT细胞的百分比。在GraphPad Prism 8软件中计算非线性(逻辑)拟合曲线和EC50值。如图20A-20B所示，Ab52、Ab53、Ab54、Ab55、Ab57和Ab63活化了T细胞。

B.实施例2

进行Jurkat/Raji共培养测定，并且通过流式细胞术测量Jurkat CD69表达，如实施例1所述，具有以下改变：将Ab59(抗HSA BCL2融合蛋白)以融合蛋白部分被滴定的等摩尔浓度添加到所有孔中。然后将细胞在37℃下孵育10分钟，然后添加10nM ABT-199(venetoclax，实心圆)或载剂对照(DMSO，空心圆)。在每种条件下测量EC50。

如图21所示，在与抗HSA BCL2融合蛋白复合之后，融合蛋白部分活化T细胞的能力没有受到显著影响。

C.实施例3

检测了融合蛋白部分诱导T细胞对Raji B淋巴瘤细胞的细胞毒性的能力。将RajiB淋巴瘤细胞用在DPBS中的CFSE-DA(Tonbo，750nM最终浓度)标记10分钟，然后用RPMI+10％FBS培养基洗涤。然后将Raji B细胞与磁分离的原代人T细胞(用EasySep人T细胞分离试剂盒磁分离，阴性选择；StemCell Technologies Cat 17951)以10:1的效应物:靶标之比混合并且以总共1.1e5个细胞/孔接种在U形底96孔中。添加连续稀释的融合蛋白部分并且将细胞在37℃和5％CO2下孵育42小时。在孵育之后，在37℃下通过添加不可透过膜的蛋白质反应性染料(Biotium CF405S-SE，1.5μM最终浓度)对细胞进行染色10分钟用于活力。然后立即通过添加多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，1.6％最终浓度)将细胞固定10分钟。将细胞离心，吸出上清液，然后将沉淀物重悬于75μLAutoMACS Running Buffer(Miltenyi)中，然后通过流式细胞术测量。通过手动门控鉴定Raji细胞(CF405S阳性，CFSE阳性)。死亡(CF405S+)Raji细胞的频率表示为所有Raji细胞的百分比。在R:ALanguage andEnvironment for Statistical Computing中使用dr4pl包计算非线性(逻辑)拟合曲线和EC50值。

如图22A所示，融合蛋白部分Ab53和Ab57诱导T细胞对Raji B淋巴瘤细胞的细胞毒性。

进行原代T细胞/Raji共培养测定，并且通过流式细胞术测量细胞毒性，如上所述，具有以下改变：将Ab59(人IgGl FC BCL2融合蛋白)以抗体被滴定的等摩尔浓度添加到一些孔中(图22B所示的圆)。在添加Ab59之后，将细胞在37℃下孵育10分钟，然后以10nM的最终浓度添加ABT-199(venetoclax，图22B中的实心符号)或载剂对照(DMSO，图22B中的空心符号)。该实验的共培养孵育时间为40小时。如图22B所示，在与抗HSA BCL2融合蛋白复合之后，融合蛋白部分诱导T细胞细胞毒性的能力没有受到显著影响。

D.实施例4

测定含有人IL-2的融合蛋白部分活化T细胞中的STAT5转录因子的能力并且与人IL-2进行比较。

将原代人T细胞(用EasySep人T细胞分离试剂盒磁分离，阴性选择；StemCellTechnologies Cat 17951)以1e6个细胞/mL重悬于RPMI+10％FCS培养基中，并且用指定浓度的人白介素2(IL-2)或含有人IL-2的融合蛋白部分在37℃下处理15分钟。Ab93是与AZ21的单链Fv抗体片段C端融合的人IL-2。Ab94是与AZ21的单链Fv抗体片段N端融合的人IL-2。在孵育之后，立即通过添加多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，1.6％最终浓度)将细胞固定10分钟。将细胞离心，吸出上清液，然后在4℃下将沉淀物重悬于冰冷的100％甲醇中10分钟。用等体积的AutoMACS Running Buffer(Miltenyi)稀释甲醇并且将细胞再次离心。将细胞再次用AutoMACS Running Buffer洗涤，并且然后在室温下用AlexaFluor647缀合的抗人磷酸化-STAT5(pY694)(BD Biosciences，克隆47)染色30分钟。再次洗涤细胞两次，然后通过流式细胞术测量。磷酸化STAT5的丰度表示为singlet门控细胞中的中值荧光强度。在Cytobank软件(cytobank.org)中计算中值。

如图23所示，含有人IL-2的融合蛋白部分能够将T细胞中的STAT5转录因子活化到与人IL-2相似的程度。

E.实施例5

经由Ni-NTA树脂纯化带有his标签的融合蛋白部分。在纯化之后，通过在UV 280nm下监测的在

200Increase 10/300GL柱上运行的尺寸排阻色谱法进一步分离融合蛋白部分。每个融合蛋白部分的尺寸排阻色谱法色谱图示于图24中。

F.实施例6

通过生物层干涉测量术测定融合蛋白部分和BCL-2之间的结合动力学。如图25A所示，Ab53和Ab57在ABT-199的存在下显示出与BCL-2的有效且可逆的结合(灰线)，并且在不存在ABT-199的情况下未观察到显著的结合(黑线)。如图26所示，Ab93和Ab94在ABT-199的存在下显示出与BCL-2的有效且可逆的结合(右)，并且在不存在ABT-199的情况下未观察到显著的结合(左)。曲线代表Octet RED384上的测量数据点。还计算了KD。

通过生物层干涉测量术测定BCl-2融合蛋白Ab59和AZ-21之间的结合动力学。如图25B所示，Ab59在ABT-199的存在下显示出与AZ21的有效且可逆的结合(灰色)，并且在不存在ABT-199的情况下未观察到显著的结合(黑色)。曲线代表Octet RED384上的测量数据点。

G.实施例7：Bcl-2 CID结构域与AZ21 CID结构域二聚化

在存在或不存在CID小分子ABT-199的情况下测试了CID结构域Bcl-2(C158A)与其同源CID结构域AZ21的结合。在CHO细胞中产生并且纯化了由与单结构域抗HSA抗体连接的BCL-2(C158A)组成的单体(序列参见图30A)。同源CID结构域AZ21以Fab形式产生，并且包含vh-CDR1(SEQ ID NO：1)、vh-CDR2(SEQ ID NO：72)、vh-CDR3(SEQ ID NO：129)、vl-CDR1(SEQID NO：310)、vl-CDR2(SEQ ID NO：311)和vl-CDR3(SEQ ID NO：223)。将AZ21固定，通过Octet RED 384测量在存在或不存在1μM ABT-199的情况下单体与AZ21的结合动力学。图30B示出了ABT-199介导Bcl-2(C158A)与其同源CID结构域AZ21的结合，并且在不存在ABT-199的情况下未观察到显著的结合。

H.实施例8：Ab57+Ab59 PK研究

将十只C57BL/6J 6周龄雄性小鼠随机分成两组，每组5只小鼠。在抗体施用前6天，从所有小鼠中采集25μL血液样品作为预处理对照样品，处理成血浆，在PBS中的50％甘油中1/10稀释，在专用96孔储存板中冷冻，并且在-20℃下储存。在抗体施用前2小时，向第1组小鼠以5mg/kg、5ml/kg给药(经口管饲法)维奈托克，并且向第2组小鼠以5ml/kg给药(经口管饲法)载剂。在抗体施用后的22、46、70、94、142和166小时，向这些小鼠重复给药这些化合物。在第0天的0小时，将Ab93和Ab59组合，并且分别以0.15mg/kg和5mg/kg以及总共5ml/kg静脉注射。在3m、30m、1h、2h、6h、1d、3d和7天从所有小鼠中采集25μL血液样品。如上所述，处理血样。通过ELISA评估血浆样品。使用人IgG ELISA(Mabtech)测量Ab59浓度。使用定制的人Fab ELISA(小鼠抗人IgG Kappa捕获抗体，BioLegend和山羊抗人Fab检测抗体，JacksonImmunoResearch)测量Ab57浓度。使用PK Solutions软件对由Ab93和Ab59的ELISA生成的血浆浓度进行PK分析。

I.实施例9：Ab93+Ab59 PK研究

将十只C57BL/6J 6周龄雄性小鼠随机分成两组，每组5只小鼠。在抗体施用前6天，从所有小鼠中采集25μL血液样品作为预处理对照样品，处理成血浆，在PBS中的50％甘油中1/10稀释，在专用96孔储存板中冷冻，并且在-20℃下储存。在抗体施用前2小时，向第1组小鼠以5mg/kg、5ml/kg给药(经口管饲法)维奈托克，并且向第2组小鼠以5ml/kg给药(经口管饲法)载剂。在抗体施用后的22、46、70、94、142和166小时，向这些小鼠重复给药这些化合物。在第0天的0小时，将Ab93和Ab59组合，并且分别以0.15mg/kg和5mg/kg以及总共5ml/kg静脉注射。在3m、30m、1h、2h、6h、1d、3d和7天从所有小鼠中采集25μL血液样品。如上所述，处理血样。通过ELISA评估血浆样品。使用人IgG ELISA(Mabtech)测量Ab59浓度，并且使用人IL-2ELISA(R&D Systems)测量Ab93浓度。使用PK Solutions软件对由Ab93和Ab59的ELISA生成的血浆浓度进行PK分析。

Claims (65)

1.组合物，其包含：

(1)异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：

a)第一单体，其包含第一CID结构域和IgG的第一Fc结构域，其中所述第一CID结构域与所述第一Fc结构域共价连接，

和

b)第二单体，其包含所述IgG的第二Fc结构域；

(2)融合蛋白部分，其包含第二CID结构域和治疗部分，其中所述第二CID结构域在N或C端与所述治疗部分共价连接，

其中在CID小分子的存在下，所述第一CID结构域和所述CID第二结构域形成所述第一CID结构域-所述CID小分子-所述第二CID结构域的复合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CID小分子选自FK1012、利米多赛(rimiducid)、FK506、FKCsA、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、香豆霉素、赤霉素、HaXS、TMP标签、ABT-737。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第一CID结构域-所述CID小分子-所述第二CID结构域的所述复合物选自由FKBP-FK1012-FKBP、变体FKBP-利米多赛-变体FKBP、FKBP-FK506-钙调磷酸酶、FKBP-FKCsA-CyP-Fas、FKBP-雷帕霉素-FRB、变体FKBP-雷帕霉素类似物-变体FRB、GyrB-香豆霉素-GyrB、GAI-赤霉素-GID1、SNAP标签-HaXS-HaloTag、eDHFR-TMP标签-HaloTag和AZ1-ABT-737-BCL-xL组成的复合物组，其中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域可以交换在所述复合物中的位置。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一CID结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述小分子是甲氨蝶呤。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一CID结构域是BCL-2或其变体，所述CID小分子是ABT-199或ABT-263，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第一CID结构域是BCL-2或BCL-2(C158A)，所述CID小分子是ABT-199，并且所述第二CID结构域包含：

a)可变重结构域(VH)，其包含：

i)包含SEQ ID NO：1的vhCDR1；

ii)包含SEQ ID NO：72的vhCDR2；和

iii)包含SEQ ID NO：129的vhCDR3；以及

b)可变轻结构域(VL)，其包含：

i)包含SEQ ID NO：310的vlCDR1；

ii)包含SEQ ID NO：311的vlCDR2；和

iii)包含SEQ ID NO：233的vlCDR3。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一CID结构域是Bcl-xL的ABT-737结合结构域，所述CID小分子是ABT-737，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一CID结构域是FKBP的雷帕霉素结合结构域，所述CID小分子是雷帕霉素，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一CID结构域是cIAP1的GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427或比瑞那帕(Birinapant)结合结构域，所述CID小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427或比瑞那帕，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一CID结构域是cereblon的沙利度胺结合结构域，所述小分子是沙利度胺、来那度胺或泊马度胺，并且所述第二CID结构域包含能够与所述第一CID结构域和所述CID小分子之间形成的复合物结合的重链可变结构域和轻链可变结构域。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、肽和抗体药物缀合物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述治疗部分是双特异性抗体。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述治疗部分是双特异性T细胞接合器部分。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述双特异性T细胞接合器部分包含T细胞抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述治疗部分是人白介素分子。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述治疗部分是人IL-2。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述第一CID结构域经由第一接头与所述第一Fc结构域连接。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述第二CID结构域经由第二接头与所述治疗部分连接。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述IgG是人IgG1。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc结构域是第一变体Fc结构域，并且所述第二Fc结构域是第二变体Fc结构域。

23.一种用于在患者中延长治疗部分的血清半衰期的方法，所述方法包括：

a)向所述患者施用根据权利要求1-22中任一项所述的包含所述治疗部分的所述组合物；

b)向所述患者施用根据权利要求1-22中任一项所述的所述CID小分子；

其中在所述患者中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域与所述小分子形成复合物，并且从而延长所述治疗部分的血清半衰期。

24.一种从患者中清除治疗部分的方法，其中所述患者已经被施用根据权利要求1-22中任一项所述的包含所述治疗部分和所述CID小分子的所述组合物，所述方法包括停止向所述患者施用所述CID小分子，使得所述治疗部分从所述患者的血液中清除。

25.组合物，其包含：

(1)异源二聚体Fc融合蛋白，其包含：

a)第一单体，其包含第一CInD结构域和IgG的第一Fc结构域，其中所述第一CInD结构域与所述第一Fc结构域共价连接，

和

b)第二单体，其包含IgG的第二Fc结构域；

(2)融合蛋白部分，其包含第二CInD结构域和第二治疗部分，其中所述第二CInD结构域在N或C端与所述第二治疗部分共价连接，

其中所述第一CInD结构域与所述第二CInD结构域结合形成复合物，并且其中所述复合物可以被CInD小分子破坏。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述第一CInD结构域或所述第二CInD结构域包含抗体部分。

27.根据权利要求25或26所述的组合物，其中所述第一CInD结构域经由第一接头与所述第一Fc结构域连接。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的组合物，其中所述第二CInD结构域经由第二接头与所述治疗部分连接。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的组合物，其中所述IgG是人IgG1。

30.根据权利要求25-29中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc结构域是第一变体Fc结构域，并且所述第二Fc结构域是第二变体Fc结构域。

31.根据权利要求25-30中任一项所述的组合物，其中所述第二治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、多肽和抗体药物缀合物。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述第二治疗部分是双特异性抗体。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述第二治疗部分是双特异性T细胞接合器部分。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述双特异性T细胞接合器部分包含T细胞抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

36.根据权利要求31所述的组合物，其中所述第二治疗部分是人白介素分子。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第二治疗部分是人IL-2。

38.根据权利要求25-31中任一项所述的组合物，其中所述第二单体还包含与所述第二Fc结构域共价连接的第一治疗部分。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述第一治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、多肽和抗体药物缀合物。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述第一治疗部分是T细胞抗原结合结构域并且所述第二治疗部分是肿瘤相关抗原结合结构域，或其中所述第一治疗部分是肿瘤相关抗原结合结构域并且所述第二治疗部分是T细胞抗原结合结构域。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

42.组合物，其包含：

(1)同源二聚体Fc融合蛋白，其包含两个相同单体，其中所述两个单体各自包含与IgG的Fc结构域共价连接的第一CInD结构域；

(2)融合蛋白部分，其包含第二CInD结构域和治疗部分，其中所述第二CInD结构域在N或C端与所述治疗部分共价连接，

其中所述第一CInD结构域与所述第二CInD结构域结合形成复合物，并且其中所述复合物可以被CInD小分子破坏。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述第一CInD结构域或所述第二CInD结构域包含抗体部分。

44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述第一CInD结构域经由第一接头与所述第一Fc结构域连接。

45.根据权利要求42-44中任一项所述的组合物，其中所述第二CInD结构域经由第二接头与所述治疗部分连接。

46.根据权利要求42-45中任一项所述的组合物，其中所述IgG是人IgG1。

47.根据权利要求42-46中任一项所述的组合物，其中所述治疗部分选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素、多肽和抗体药物缀合物。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述治疗部分是双特异性抗体。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述治疗部分是双特异性T细胞接合器部分。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述双特异性T细胞接合器部分包含T细胞抗原结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域。

51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述T细胞抗原是CD3并且所述肿瘤相关抗原是CD19。

52.根据权利要求47所述的组合物，其中所述治疗部分是人白介素分子。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述治疗部分是人IL-2。

54.一种用于在患者中延长治疗部分的血清半衰期的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求25-53中任一项所述的组合物。

55.一种从患者中清除治疗部分的方法，其中所述患者先前已经被施用根据权利要求25-53中任一项所述的组合物，所述方法包括施用根据权利要求25-53所述的所述CInD小分子，从而所述治疗部分从所述异源二聚体或同源二聚体Fc融合蛋白中分离。

56.组合物，其包含：

(a)第一单体，其包含：

i)第一CID结构域；

ii)任选的结构域接头；和

iii)人血清白蛋白(HSA)结合结构域；以及

(b)第二单体，其包含：

i)第二CID结构域；

ii)任选的结构域接头；和

iii)T细胞接合器，其包含：

A)CD3抗原结合结构域(ABD)；

B)任选的结构域接头；和

C)肿瘤相关抗原(TAA)ABD(TAA-ABD)；

其中在CID小分子的存在下，所述第一CID结构域和所述第二CID结构域形成所述第一CID结构域-所述CID小分子-所述第二CID结构域的复合物。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述CID小分子选自FK1012、利米多赛、FK506、FKCsA、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、香豆霉素、赤霉素、HaXS、TMP标签、ABT-737。

58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述第一CID结构域-所述CID小分子-所述第二CID结构域的所述复合物选自由FKBP-FK1012-FKBP、变体FKBP-利米多赛-变体FKBP、FKBP-FK506-钙调磷酸酶、FKBP-FKCsA-CyP-Fas、FKBP-雷帕霉素-FRB、变体FKBP-雷帕霉素类似物-变体FRB、GyrB-香豆霉素-GyrB、GAI-赤霉素-GID1、SNAP标签-HaXS-HaloTag、eDHFR-TMP标签-HaloTag、AZ1-ABT-737-BCL-xL、钙调磷酸酶-FK506-FKBP、CyP-Fas-FKCsA-FKBP、FRB-雷帕霉素-FKBP、变体FRB-雷帕霉素类似物-变体FKBP、GID1-赤霉素-GAI、HaloTag-HaXS-SNAP标签、HaloTag-TMP标签-eDHFR、BCL-xL-ABT-737-AZ1组成的复合物组。

59.根据权利要求56-58中任一项所述的组合物，其中所述HSA结合结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域、或单个单体可变抗体结构域。

60.根据权利要求56-59中任一项所述的组合物，其中所述第一CID结构域经由第一接头与所述HSA结合结构域连接，并且所述第二CID结构域经由第二接头与所述T细胞接合器连接。

61.药物组合物，其包含根据权利要求56-60中任一项所述的组合物。

62.一种在患者中延长T细胞接合器的血清半衰期的方法，所述方法包括：

a)向所述患者施用根据权利要求56-61中任一项所述的包含所述T细胞接合器的所述组合物或所述药物组合物；

b)向所述患者施用根据权利要求56-61中任一项所述的所述小分子药物；

其中在所述患者中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域与所述小分子形成复合物，并且从而延长所述T细胞接合器的血清半衰期。

63.一种在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

a)向所述患者施用根据权利要求56-61中任一项所述的包含所述T细胞接合器的所述组合物或所述药物组合物；

b)向所述患者施用根据权利要求56-61中任一项所述的所述小分子；

其中在所述患者中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域与所述小分子形成复合物以治疗癌症。

64.一种从患者中清除T细胞接合器的方法，其中所述患者已经被施用根据权利要求56-61中任一项所述的包含所述T细胞接合器和所述小分子的所述组合物，所述方法包括停止向所述患者施用所述小分子，使得所述T细胞接合器从所述患者的血液中清除。

65.一种在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

a)向所述患者施用根据权利要求1-53中任一项所述的包含所述T细胞接合器的所述组合物或所述药物组合物；

b)向所述患者施用根据权利要求1-53中任一项所述的所述小分子；

其中在所述患者中所述第一CID结构域和所述第二CID结构域与所述小分子形成复合物以治疗癌症。

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