CN115138385B - 一种仿金属酶生物催化材料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种仿金属酶生物催化材料及其制备方法和用途，属于材料领域。该仿金属酶生物催化材料是以氮化碳材料和钌盐或其溶剂合物为原料，在溶剂中反应制备得到的Ru‑CN材料。本发明提供的Ru‑CN材料可以有效清除ROS，并能持续产生氧气缓解组织乏氧，它比许多天然抗氧化剂以及最近报道的先进的生物催化剂具有更强的ROS清除能力。本发明提供的Ru‑CN材料可以有效保护干细胞，可以在高ROS水平条件下为干细胞的生存、粘附和分化功能(成骨和脂肪生成)提供有效的拯救能力。本发明提供的Ru‑CN材料在制备治疗与ROS相关疾病的生物材料和用于干细胞治疗的生物材料中具有广阔的应用前景。

Description

一种仿金属酶生物催化材料及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及一种仿金属酶生物催化材料及其制备方法和用途。
背景技术
生命***中过量产生的活性氧(reactive oxygen species，简称ROS)，包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(·O2 -)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O2)，会导致DNA损伤、蛋白质变性、脂质过氧化以及其他生物分子的失活，最终导致细胞功能障碍、组织学再生失败，甚至出现难治性的慢性疾病，如神经外伤、心肌梗塞、类风湿性关节炎、骨缺损和糖尿病足等。为了平衡氧化应激，生物***依赖于两种类型的ROS清除剂：1)抗氧化物质，如：维生素、类胡萝卜素和类黄酮；2)天然抗氧化酶，如：过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)，和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。
干细胞疗法(stem cell therapy)是近年来发展迅速的新兴治疗手段，由于干细胞具有自我更新与增殖分化的生物学特性，是基因疗法一种理想的靶细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中存在的一类成体干细胞，具有高度可塑性而且来源广泛，易于在体外扩增，是目前干细胞治疗和组织工程治疗研究的热门的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。目前已经有文献报道间充质干细胞治疗对心肌缺血再灌注损伤、卵巢早衰、肺纤维化、溃疡性结肠炎等疾病具有良好的效果。但是，细胞内高水平的ROS可能会对干细胞DNA造成不可逆的损伤，甚至导致干细胞衰老，细胞周期停滞以及低分化能力。因此，开发出具有优异的活性氧清除能力的材料对干细胞疗法具有重要意义。
目前，天然抗氧化酶因其特异性和高催化活性，被广泛用于对抗多种疾病的氧化应激，特别是干细胞生物疗法。CAT作为一类重要的天然抗氧化金属酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶，由与卟啉大环协调的Fe-N活性位点组成。天然酶虽然能高效清除ROS，但仍存在大量的固有缺陷，如对环境条件敏感、生物活性稳定性差、批量生产困难等。因此，为了缓和抗氧化材料需求量的急剧增加和天然酶内在局限性之间的矛盾，设计出人工生物催化剂来模拟天然酶的ROS清除活性是非常重要的。
近年来，陆续有人工生物催化剂被报道，例如，Cu5.4O(Nat.Commun.2020,11,2788)，Au24Cu1(Nat.Commun.2021,12,114)，IrOx NPs(Angew.Chem.Int.Ed.2020,59,9491)等，但是，这些人工生物催化剂的活性氧清除能力有限，还无法满足实际需求。发明人的前期还研究发现，人工合成的具有Fe-N活性位点的类CAT酶的活性氧清除能力也较差，这可能与其缺乏CAT的三维空间构型或协调结构有关。因此，开发出新型的具有优异的活性氧清除能力的人工生物催化剂具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿金属酶生物催化材料及其制备方法和用途。
本发明提供了一种生物催化材料，它是以氮化碳材料和钌盐或其溶剂合物为原料，在溶剂中反应得到的。
进一步地，所述氮化碳材料、钌盐或其溶剂合物的质量比为(10-40)：1，优选为(13-20)：1，更优选为20：1。
进一步地，所述氮化碳材料为氮化碳纳米片；
和/或，所述钌盐为RuCl3；优选地，所述钌盐的溶剂合物为RuCl3·3H2O；
和/或，所述溶剂为水、醇类试剂中的一种或两种的混合。
进一步地，所述醇类试剂为乙醇。
进一步地，所述氮化碳纳米片是按照以下方法制得的：将块状氮化碳加入氧化剂的水溶液中反应，反应结束后过滤，取固体水洗，加入水并超声处理，形成均质溶液，静置，取静置后的上清液离心，取离心后的上清液干燥，得到氮化碳纳米片。
进一步地，所述氧化剂为次氯酸盐，优选为次氯酸钠；
和/或，所述反应的温度为30-50℃，时间为4-6天；优选地，所述反应的温度为40℃，时间为5天；
和/或，所述块状氮化碳是按照以下方法制得的：将三聚氰胺升温至530-570℃，在空气中保持1-3小时，然后自然冷却至室温，水洗，干燥，得到块状氮化碳。
进一步地，所述块状氮化碳与次氯酸钠的水溶液的质量体积比为1g：(10-30)mL，优选为1g：20mL；次氯酸钠的水溶液中有效氯含量为1％-5％，优选为3％。
进一步地，所述反应的温度为60-80℃，时间为3-7小时；优选地，所述反应的温度为70℃，时间为5小时。
本发明还提供了上述生物催化材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将氮化碳材料加入溶剂并超声处理，得到氮化碳材料均质溶液；将钌盐或其溶剂合物的溶液滴入氮化碳材料均质溶液中，搅拌下反应，反应结束后过滤，取固体，洗涤，干燥，得到生物催化材料。
进一步地，所述氮化碳纳米片均质溶液中，氮化碳纳米片的浓度为2mg/mL，优选为2mg/mL。
本发明还提供了上述生物催化材料在制备清除活性氧和/或保护干细胞的生物材料中的用途。
进一步地，所述生物材料能够用于治疗与活性氧过表达有关的疾病，和/或，所述生物材料能够用于基于干细胞的治疗。
进一步地，所述干细胞为间充质干细胞，优选为骨髓间充质干细胞；
和/或，所述生物材料为组织修复材料，优选为骨修复材料；
和/或，所述生物材料能够用于治疗神经外伤、心肌梗塞、类风湿性关节炎、骨缺损、糖尿病足、心肌缺血再灌注损伤、卵巢早衰、肺纤维化、溃疡性结肠炎。
本发明中，室温指25±5℃。
“金属酶”是一种含有一种或几种金属离子作为辅基的结合酶，金属酶中，金属离子通常为活性中心。“仿金属酶”指一类人工合成的、具有金属酶活性的材料。
实验结果表明，在多种人工金属-CN生物催化剂中，本发明Ru-CN材料的活性氧清除能力最强。在本发明Ru-CN材料中，具有团簇Ru-N配位结构的RuNC-CN和具有纳米颗粒Ru-N配位结构的RuNP-CN的活性氧清除能力均优于具有单原子Ru-N配位结构的RuSA-CN。
本发明提供的Ru-CN材料可以有效清除ROS，并能持续产生氧气缓解组织乏氧，它比许多天然抗氧化剂以及最近报道的先进的生物催化剂具有更强的ROS清除能力。本发明提供的Ru-CN材料可以有效保护干细胞，可以在高ROS水平条件下为干细胞的生存、粘附和分化功能(成骨和脂肪生成)提供有效的拯救能力。本发明提供的Ru-CN材料在制备治疗与ROS相关疾病的生物材料和用于干细胞治疗的生物材料中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1.(a)CAT酶及催化位点的模型示意图；(b)RuSA-CN中孤立的Ru位点和RuNC-CN中协同的Ru催化位点的模型示意图；(c)通过CN纳米片合成RuSA-CN和RuNC-CN的示意图。
图2.CN、RuSA-CN、RuNC-CN、RuNP-CN的XRD谱图。主峰应对应于氮化碳。
图3.CN、RuSA-CN、RuNC-CN和RuNP-CN的傅里叶变换红外光谱。CN杂环(1500cm-1)，三均三嗪(800cm-1)。
图4.(a)RuSA-CN的HRTEM图像，(b)RuNP-CN的HRTEM图像，(c)RuNP-CN对应的平均粒径。
图5.(a)RuNC-CN的高分辨透射电镜图；(b)对应的RuNC-CN的平均尺寸；RuNC-CN的(c)HAADF-STEM图以及(d)原子水平的HAADF-STEM图像；(e)图d中沿实线的Ru团簇的轻度分布；(f)RuNC-CN的能量色散谱映射图像。
图6.纯CN以及不同Ru形式的Ru-CN的高分辨率XPS光谱：(a)C 1s；(b)N1s；(c)Ru3p；(d)Ru-NC的Ru0和Ru3+的原子比。
图7.(a)CN、(b)RuSA-CN、(c)RuNC-CN、(d)RuNP-CN的X射线光电子能谱及其对应的含量饼图。
图8.Ru-CN金属酶模拟ROS清除特性及生物催化动力学研究。Ru-CN生物催化剂的(a)H2O2消除活性和(b)O2生成；(c)以H2O2为底物的Ru-CN的Km和Vmax值；(d)通过TON和TON/Km比较Ru-CN的催化活性；(e)Ru-CN生物催化剂的类SOD酶活性；(f)RuNC-CN的类CAT和类SOD活性的稳定性试验。
图9.天然抗氧化剂对H2O2的清除率。
图10.金属-CN生物催化剂对H2O2的清除率比较。
图11.(a)DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平；(b)流式细胞术检测DCFH-DA强度；(c)DCFH-DA探针染色计算定量结果(n＝4个独立实验，数据以平均±SD表示)。
图12.(a)DAPI和γ-H2Ax染色；(b)彗星试验；(c)γ-H2Ax的荧光强度；(d)活/死细胞染色计算的死细胞比率。阳性组和Ru-CN组：干细胞在含100μMH2O2的培养基中培养；阴性组在不加H2O2的正常培养基中培养。
图13.CalceinAM和PI染色处理后的图。绿色代表活细胞，红色代表死细胞。
图14.(a)通过细胞内western法定量p21；(b)通过荧光计定量与衰老相关的β-半乳糖苷酶。
图15.高ROS水平下的干细胞粘附行为。(a)hMSCs的细胞核/F-actin染色；(b)细胞核骨架及核仁染色；(c)桩蛋白染色；(d)桩蛋白的分布情况；(e)hMSCs actin/Paxillin共同定位。阳性和Ru-CN组:干细胞在含100μM H2O2的培养基中培养；阴性组在不加H2O2的正常培养基中培养。所有实验至少进行三次。图16.用BCIP/NBT法进行碱性磷酸酶(ALP)染色，用碱性磷酸酶(ALP)法进行活性定量试验。
图17.各类Ru-CN处理干细胞以后的(a)茜素红和(b)IBSP染色；(c)茜素红和(d)IBSP信号定量分析；(e)DAPI/IBSP在RuNC-CN和RuNP-CN上的代表性荧光图像。
图18.(a)尼罗红和(b)FABP4/actin染色；(c)尼罗红和(d)FABP4信号定量分析；(e)尼罗红在RuNC-CN和RuNP-CN基团上的代表性荧光图像。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品。
三聚氰胺(C6H6N6)购于阿拉丁试剂(中国上海)；次氯酸钠(NaClO)溶液(Cl 15％)购于阿拉丁试剂(中国上海)，NaClO溶液(Cl 15％)表示有效氯含量15％的NaClO溶液；氯化钌水合物(RuCl3·3H2O)购于能源化工(中国上海)；所有其他化学品也均能通过购买市售产品获得，无需进一步纯化。
实施例1、制备具有单原子Ru-N配位结构的Ru-CN材料：RuSA-CN
1.合成氮化碳纳米片(CN)
将10g三聚氰胺以5℃/min的速度加热至550℃，在空气中保持2小时，然后自然冷却至室温，得到黄色块状固体，将黄色固体用去离子水洗涤三次，在60℃真空过夜干燥，得到块状氮化碳(C3N4)。将0.5g块状C3N4加入10mL含2mL NaClO溶液的去离子水中，在40℃下搅拌5天。然后，将混合物过滤，洗涤，以去除过量的NaClO。将得到的残渣加入装有20mL去离子水的烧瓶中，连续超声(功率：40kW)振荡90min，形成均质溶液。静置12h后，将静置后的上清液在10000rpm下离心10min，离心后收集上清液，冷冻干燥，得到氮化碳纳米片，命名为CN。
2.合成具有单原子Ru-N配位结构的Ru-CN材料
将50mg CN加入含有25mL去离子水的烧瓶中，连续超声(功率：40kW)60min后分散良好，得到均质CN溶液。然后将0.125mL RuCl3·3H2O水溶液(浓度为10mg mL-1)滴入均质CN溶液中，70℃下持续搅拌5h，过滤，取固体用去离子水洗涤，60℃真空烘箱干燥过夜，得到具有单原子Ru-N配位结构的Ru-CN材料，命名为RuSA-CN。
实施例2、制备具有团簇Ru-N配位结构的Ru-CN材料：RuNC-CN
1.合成CN
合成方法与实施例1步骤1相同。
2.合成具有团簇Ru-N配位结构的Ru-CN材料
参照实施例1步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液的体积由0.125mL修改为0.250mL，得到具有团簇Ru-N配位结构的Ru-CN材料，命名为RuNC-CN。
实施例3、制备具有纳米颗粒Ru-N配位结构的Ru-CN材料：RuNP-CN
1.合成CN
合成方法与实施例1步骤1相同。
2.合成具有纳米颗粒Ru-N配位结构的Ru-CN材料
参照实施例1步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液的体积由0.125mL修改为0.375mL，得到具有纳米颗粒Ru-N配位结构的Ru-CN材料，命名为RuNP-CN。
以下为对照样品的制备方法。
对照例1、制备Mn-CN材料
1.合成CN
合成方法与实施例2步骤1相同。
2.合成Mn-CN材料
参照实施例2步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液替换为等量的MnCl2·4H2O水溶液，得到Mn-CN材料。
对照例2、制备Fe-CN材料
1.合成CN
合成方法与实施例2步骤1相同。
2.合成Fe-CN材料
参照实施例2步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液替换为等量的FeCl3·6H2O水溶液，得到Fe-CN材料。
对照例3、制备Co-CN材料
1.合成CN
合成方法与实施例2步骤1相同。
2.合成Co-CN材料
参照实施例2步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液替换为等量的CoCl2·6H2O水溶液，得到Co-CN材料。
对照例4、制备Ni-CN材料
1.合成CN
合成方法与实施例2步骤1相同。
2.合成Ni-CN材料
参照实施例2步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液替换为等量的NiCl2·6H2O水溶液，得到Ni-CN材料。
对照例5、制备Cu-CN材料
1.合成CN
合成方法与实施例2步骤1相同。
2.合成Cu-CN材料
参照实施例2步骤2的合成方法，区别仅在于将RuCl3·3H2O水溶液替换为等量的CuCl2·2H2O水溶液，得到Cu-CN材料。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、Ru-CN的结构表征
1.实验方法
使用扫描电子显微镜(SEM，ThermoFisherScientificApreo S HiVoc)对不同Ru-CN的形貌进行了表征。在200kV的Talos F200xTEM显微镜(FEI Ltd.,USA)上进行了透射电子显微镜(TEM)、高分辨率TEM(HRTEM)、高角度环形暗场扫描TEM(HAADF-STEM)和能量色散光谱(EDS)分析。用X射线衍射仪(XRD,DX-2700BH，中国浩源仪器)分析了Cu Kα辐射在2θ范围为5-80°的催化剂晶体结构。X射线光电子能谱(XPS)在K-AlphaTM+X射线光电子能谱仪(Thermo Scientific)上使用半球180°双聚焦分析仪和128通道探测器进行测量。采用Nicolet-ls50分光光度计(Nicol,US)对CN、RuSA-CN、RuNC-CN和RuNP-CN在4000-500cm-1范围内进行傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析，分辨率为2cm-1。
2.实验结果
通过X射线衍射图(XRD)(图2)、傅里叶变换红外光谱(图3)，以及高分辨透射电镜(HRTEM)图像(图4和图5a,b)对不同配位结构的Ru-CN进行了表征，确定了Ru-CN的成功合成，初步判断了Ru-CN中Ru的存在形式，即在RuSA-NC中未发现Ru的聚集体，可初步判断为单原子结构；在RuNC-CN中发现了尺寸较小的Ru团簇结构，在RuNP-NC中发现了大量的纳米颗粒。利用高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(HAADF-STEM)进一步检测了RuNC-CN生物催化剂的原子结构。如图5c所示，RuNC-CN生物催化剂中，纳米级Ru团簇均匀分布在CN纳米片上。同时，原子HAADF-STEM图像显示CN上的Ru团簇(圆圈)被少量原子分散的Ru原子(方框)所包围(图5d)。线扫描的强度分布表明，Ru团簇的平均尺寸为1.41～1.51nm。同时，能谱(EDS)映射显示出清晰的紫色聚集体，进一步证实了Ru团簇的形成(图5f)。
表1.用XPS法测定了生物催化剂中的元素含量
Figure BDA0003655414740000071
在验证Ru物种的存在后，本发明利用X射线光电子能谱(XPS)研究了Ru-CN生物催化剂的化学组成和价态(图6以及图7，表1)。RuSA-CN、RuNC-CN和RuNP-CN的Ru含量分别为0.35at％、0.65at％和0.89at％。Ru-CN生物催化剂的N1s光谱显示，吡啶N的峰由398.6eV(纯CN)跃迁到398.8eV，表明Ru-Nx/吡啶N的生成。高分辨率Ru 3p光谱显示Ru原子的化学态为Ru0、Ru3+和Ru4+(图6c)。且RuSA-CN中Ru0的含量(12.27at％)很低，而RuNC-CN和RuNP-CN中Ru0的含量分别增加到16.87at％和31.32at％(图6d)，这表明Ru团簇或Ru纳米颗粒的形成，与HAADF-STEM所得结果一致。
上述实验结果证实了本发明合成的RuSA-CN具有单原子Ru-N配位结构，RuNC-CN具有团簇Ru-N配位结构，RuNP-CN具有纳米颗粒Ru-N配位结构。
实验例2、Ru-CN的活性氧清除能力测试
1.实验方法
本实验比较了不同Ru-CN生物催化剂的金属酶模拟ROS清除的性能，具体测试了类CAT酶活性和类SOD酶活性。
(1)类过氧化氢酶(CAT)的活性测定
通过测定材料清除H2O2和生成O2的能力来评估类CAT的活性。对H2O2的清除能力进行测定：首先，将20μL H2O2(1M)、1.97mL PBS(pH＝7.4)和10μL Ru-CN(10mg/mL)混合；30min后，将50μL以上溶液与Ti(SO4)2溶液(100μL,13.9mM)混合均匀，最后用酶标仪测定405nm处的吸收强度。生成氧能力的测定方法为：将200μL H2O2(10M)加入含20μL Ru-CN(10mg/mL)的20mL PBS(pH＝7.4)中，用溶氧仪检测5分钟，间隔5秒。
通过改变过氧化氢浓度来评价类CAT活性的稳态动力学。简单地说，所有检测均在含20mL PBS(pH＝7.4)和20μL Ru-CN(10mg/mL)的50mL离心管中进行。将不同浓度的H2O2(50-1200mM)与20mL含Ru-CN的PBS混合，使用溶氧仪监测5min里O2溶解度变化。然后，对于每个H2O2浓度，得到“吸光度-时间”曲线，以此计算初始反应速度(v0)。然后根据相应的H2O2浓度绘制反应速率曲线，并拟合成Michaelis-Menten曲线(式(1))。最后，利用线性双倒数图(Lineweaver-Burk图，式(2))的斜率和截距来确定最大反应速度(Vmax)和Michaelis-Menten常数(Km)。根据式(3)计算以周转数(TON，每个催化原子转换底物的最大数量)为单位的催化效率，式中[E0]为Ru-CN催化活性中心的摩尔浓度，通过改变底物浓度可以得到拟合良好的Michaelis-Menten图。TON/Km值表示Ru-CN的催化效率。
Figure BDA0003655414740000081
Figure BDA0003655414740000082
TON＝Vmax/[E0] (3)
(2)类超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定
将1mg KO2溶于1mL二甲亚砜溶液(DMSO，含3mg/mL 18-冠-6-醚)中催化清除·O2 -自由基。将Ru-CN分散到上述的KO2/DMSO溶液中，最终浓度为50μg/mL。反应5min后，向上述溶液中加入10μL硝基蓝四唑(NBT)-DMSO溶液(10mg/mL NBT)检测剩余·O2 -浓度。测定溶液在λmax＝680nm处的吸收强度，并与原·O2 -浓度进行比较，判断其清除·O2 -的能力。
2.实验结果
(1)类CAT的活性测定结果
表2.不同Ru活性位点的RuSA-CN、RuNC-CN和RuNP-CN的动力学比较
E<sub>0</sub>(M) V<sub>max</sub>(μM s<sup>-1</sup>) K<sub>m</sub>(mM) TON(s<sup>-1</sup>) TON/K<sub>m</sub>(s<sup>-1</sup>mM<sup>-1</sup>)
Ru<sub>SA</sub>-CN 13.06*10<sup>-6</sup> 10.02 289.43 0.77 2.65*10<sup>-3</sup>
Ru<sub>NC</sub>-CN 23.07*10<sup>-6</sup> 19.61 225.76 4.14 18.34*10<sup>-3</sup>
Ru<sub>NP</sub>-CN 31.91*10<sup>-6</sup> 14.64 246.97 2.29 9.27*10<sup>-3</sup>
本发明首先通过过氧化物-钛络合物法检测了Ru-CN材料的类CAT酶的活性，其中，RuNC-CN(清除率达85.6％)和RuNP-CN(清除率达86.3％)对H2O2具有非常有效的清除能力，而纯CN和RuSA-CN对H2O2的清除率非常低(图8a)。同时，氧气生成测试也验证了RuNC-CN和RuNP-CN生物催化剂可以有效地分解H2O2底物，产生大量的氧气(图8b)。随后，本发明计算了不同Ru-CN生物催化剂的Km、Vmax和TON，如图8c，d和表2所示，与RuSA-CN和RuNP-CN相比，RuNC-CN的Km值最低(225.76mM)，Vmax最大(19.61μM s-1)，TON最高(4.14s-1)，表明Ru团簇具有快速的活性氧清除动力学。此外，RuNC-CN的TON/Km值是RuSA-CN的6.92倍，表明Ru团簇在清除H2O2时更加活跃。
(2)类SOD的活性测定结果
本发明通过四唑氮蓝检测了其类SOD酶的活性，如图8e所示。其中，RuNC-CN和RuNP-CN对·O2 -的清除率均约为80％，而纯CN(～16％)和RuSA-CN(～58％)对·O2 -的清除能力明显较低。
(3)RuNC-CN的循环活性测试结果
本发明还检测了RuNC-CN的循环活性以验证对ROS的长期消除效率。结果表明，在5个循环中，RuNC-CN的类CAT和类SOD活性没有明显下降，说明其具有良好的清除H2O2和·O2 -的稳定性(图8f)，能持续分解H2O2产生氧气，缓解组织乏氧。
上述实验结果表明，本发明合成的Ru-CN具有活性氧清除能力，其中，RuNC-CN和RuNP-CN的类CAT和类SOD活性均优于RuSA-CN，并且RuNC-CN具有最快速的活性氧清除动力学。进一步的循环活性测试结果还表明，本发明RuNC-CN具有良好的活性氧清除稳定性，能持续产生氧气缓解组织乏氧。
实验例3、RuNC-CN与现有ROS清除材料的活性氧清除能力比较
1.实验方法
参照实验例2中类CAT的活性测定方法，分别测试RuNC-CN与天然抗氧化剂、以及最近报道的先进的ROS清除生物催化剂，如Co3O4纳米板、Mn3O4六角板、Cu5.4O、Au24Cu1等的活性氧清除能力。
2.实验结果
表3.RuNC-CN与最近报道的ROS清除生物催化剂的TON和Vmax值的比较
Figure BDA0003655414740000091
Figure BDA0003655414740000101
根据实验例2可知，本发明RuNC-CN对H2O2的清除率高达85.6％，而几种天然抗氧化剂对H2O2的清除率均低于10％(图9)。也就是说，本发明RuNC-CN对H2O2的清除率远高于图9中的天然抗氧化剂。
RuNC-CN与最近报道的ROS清除生物催化剂的TON和Vmax值的比较结果如表3所示，可以看出，本发明RuNC-CN的TON和Vmax值远高于现有的ROS清除生物催化剂，具有更有效的活性氧清除活性。
上述实验结果表明，本发明具有团簇Ru-N配位结构的RuNC-CN的活性氧清除活性比天然抗氧化剂和多种最近报道的ROS清除生物催化剂更优。
实验例4、各金属-CN生物催化剂的活性氧清除能力比较
1.实验方法
参照实验例2中类CAT的活性测定方法，分别测试RuNC-CN材料与对照例1-5合成的Mn-CN、Fe-CN、Co-CN、Ni-CN、Cu-CN材料的活性氧清除能力。
2.实验结果
结果如图10所示，Mn-CN、Fe-CN、Co-CN、Ni-CN、Cu-CN对H2O2的清除率低至2.24％以下，远低于本发明RuNC-CN对H2O2的清除率(高达85.6％)。
上述结果表明，在多种金属-CN生物催化剂中，本发明RuNC-CN的活性氧清除能力最强。
实验例5、生物实验测试
1.实验方法
(1)细胞学实验
人骨髓来源的间充质干细胞(hMSC)购自CyagenBiosciences(HUXMA-01001,Cyagen，中国)，根据制造商说明，在人间充质干细胞生长培养基(HUXMX-90021,Cyagen，中国)中，低于5％CO2的条件下进行传代培养。将第4～6代细胞按5000个/孔的密度接种到48孔板上，培养过夜后处理。
(2)检测细胞内ROS含量
采用2,7-二氯荧光素二醋酸酯(DCFH-DA)检测残留ROS水平，并按照厂家说明书操作。简单地说，先用DCFH-DA工作液孵育细胞30分钟，然后更换为含有100μM过氧化氢的培养基。然后用Celigo图像细胞仪(Nexcelom Bioscience LCC，美国)对细胞进行筛选和分析。
(3)活/死染色
钙黄绿素(CalceinAM)/碘化丙啶(PI)染色按照说明书(Beyotime，中国)进行。简单地说，用2μMCalceinAM溶液在磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.4,PBS)中染色活细胞，然后用4.5μM PI溶液染色死细胞。随后用Celigo图像细胞仪(Nexcelom Bioscience LCC，美国)捕获并计数细胞。
(4)免疫荧光染色
细胞用PBS洗涤两次，在4％多聚甲醛(Biosharp,China)中室温固定10分钟，然后在含0.1％Triton X-100的PBS中渗透10分钟，然后在含1％BSA和0.1％Tween-20的PBS中封闭。直接染色时，荧光团偶联抗体用0.1％Tween-20和1％BSA的PBS稀释，与样品在室温黑暗中孵育2小时。间接染色时，一抗用含0.1％Tween-20和1％BSA的PBS稀释，4℃孵育过夜，然后用需要的荧光团在室温黑暗中孵育二抗。成像前，样品用10μg/mL DAPI复染(Solarbio，中国)，并在抗褪色贴片介质(Solarbio，中国)中贴片。每一步用含0.1％Tween-20的PBS冲洗样品3次。共聚焦激光扫描显微镜(FV3000,Olympus,Japan)采集图像。
本发明中使用的抗体及相应浓度为Alexa
Figure BDA0003655414740000111
647偶联兔多克隆组蛋白H2A.X(Phospho-Ser139)抗体(C11268,Sabbiotech，中国，1:200稀释)，Alexa
Figure BDA0003655414740000112
594偶联兔Paxillin多克隆抗体(C48774,Sabbiotech，中国，1:200稀释)，Alexa
Figure BDA0003655414740000113
555偶联兔IBSP多克隆抗体(C37446,Sabbiotech，中国，1:200稀释)，Alexa
Figure BDA0003655414740000114
555偶联兔FABP4多克隆抗体(C49511,Sabbiotech，中国，1:200稀释)，Lamin A/C多克隆抗体(10298-1-AP,Proteintech，美国，1:400)，Alexa
Figure BDA0003655414740000115
488标记山羊抗兔IgG二抗(L3016,Sabbiotech，中国，1:200稀释)。肌动蛋白用FITC偶联的phalloidin(CA1620,Solarbio，中国)染色。核仁用核仁鲜红(N512，Dojindo，日本)进行反染。
(5)细胞内蛋白和与衰老相关的β-半乳糖苷酶测定
细胞内western检测细胞周期蛋白相关蛋白。通过一抗，p21兔多克隆抗体(10355-1-AP,Proteintech，美国，1:500稀释)和鼠肌动蛋白单克隆抗体(44030，Sabbiotech，中国，1:200稀释)，带有远红色荧光团的二抗，DyLightTM800 4X PEG偶联抗兔IgG(H+L)(5151，Cell Signaling Technology，美国)和DyLightTM680偶联的抗小鼠IgG(H+L)(5470,CellSignaling Technology，美国)。然后由Odyssey CLx成像***(LI-COR Inc.，美国)对样品进行扫描和分析。衰老相关的β-半乳糖苷酶按说明书(Dojondo，日本)进行分析。简单地说，用裂解缓冲液裂解细胞，与SPiDER-βgal工作液孵育30分钟。在用荧光计分析(SpectraMaxiD,Molecular Devices，美国)之前加入停止液。
(6)多向分化性检测
(6.1)成骨分化
在含50μg/mL L-抗坏血酸(A8960；Sigma-Aldrich,美国)，10nM***(D4902；Sigma-Aldrich，美国)和10mMβ-甘油磷酸(G9422；Sigma-Aldrich；美国)。第3天，进行BCIP/NBT染色(Beyotime，中国)和碱性磷酸酶(ALP)定量。ALP结果与BCA法计算的蛋白浓度一致。第14天，对钙节点进行茜素红S染色，并对整合素结合唾液蛋白进行免疫荧光染色。图像是用立体显微镜(SZX16，奥林巴斯，日本)拍摄的。然后，将茜素红S溶解在10％的氯化十六烷基吡啶中，用微孔板阅读器(Multiskan sky,Thermofisher,美国)进行测试。
(6.2)成脂分化
将细胞诱导到成骨培养基(Procell，中国)中，根据生产厂家的说明使用成骨培养基。第21天，分别用尼罗红染色细胞内的唇滴液，并用共聚焦激光扫描显微镜成像。采用免疫染色法分析FABP4。油红O平行染色，然后用异丙醇溶解，用微孔板阅读器(Multiskansky,Thermofisher,美国)检测。
2.实验结果
前述实验证明了本发明Ru-CN材料具有良好的金属酶模拟ROS清除特性，本实验进一步仔细评估了其在高ROS环境中保护干细胞的细胞功能方面的应用潜力。首先，用DCFH-DA探针来量化了在含H2O2(100μM)的培养基中材料对hMSC细胞内ROS的清除效率，如图11a所示，阳性对照(100μMH2O2)中可见明显的绿色胞形物，表明细胞内ROS水平较高，而Ru-CN人工生物催化剂处理后ROS信号下降，尤其是RuNC-CN和RuNP-CN，几乎检测不到绿色信号。通过流式对其定量分析显示RuNC-CN和RuNP-CN组的ROS水平最低，且两者之间没有显著差异(图11b,c)。
由于高水平的ROS可能会对DNA造成不可逆的损伤，因此，本发明在不同培养条件下***地筛选了hMSCs的细胞核。首先，本发明检测了γ-Histone 2A(γ-H2Ax)的磷酸化，这是一个触发DNA损伤修复的生物过程。如图12a所示，可清晰观察到γ-H2Ax信号在hMSCs的细胞核内共定位。Ru-CN组与阳性组相比，信号强度明显降低，RuNC-CN组的γ-H2Ax荧光水平与阴性组相似(图12c)。此外，通过彗星实验在单细胞水平验证了DNA损伤差异。如图12b所示，RuSA-CN呈现出一条由DNA片段组成的长尾，表明其DNA有一定程度的损伤，这可能与其ROS消除能力有限有关。相反，RuNC-CN观察到一个紧凑的圆形信号，表明DNA仅有轻微损伤。为了进一步研究与ROS相关的细胞膜破裂情况，本发明将细胞在含有100μM H2O2的培养基中孵育，随后进行活/死实验。如图12d和图13所示，阳性组中约有14％的细胞被杀死，RuSA-CN组约9％，而RuNC-CN和RuNP-CN中的细胞死亡率不超过5％，与阴性组的死亡率相似。
由于ROS的存在会导致干细胞衰老，细胞周期停滞以及低分化能力，因此本发明对其进行了检测。如图14所示，p21蛋白和β-半乳糖苷酶(与衰老相关的生物分子)维持在与阴性组相同的水平。因此，RuNC-CN和RuNP-CN具有良好的ROS清除活性，从而促进hMSCs在高ROS水平微环境下的生存，这也可能保证其粘附行为和分化功能。
在验证Ru-CN人工生物催化剂可以保护hMSCs免受ROS攻击后，本发明从细胞扩散、粘附和多系分化等方面评价了干细胞功能。首先，评估干细胞的扩散和细胞骨架组织，这对调节干细胞命运至关重要。如图15a，H2O2阳性组干细胞形态分布差、呈圆形、形态异常，很少有骨架组织和突起。相反，RuNC-CN和RuNP-CN孵育的细胞呈现出扩张、扁平、纺锤状的形态，细胞骨架和突起组织良好。本发明通过对核骨架和核仁进行的检测表明，Ru-CN组与阳性组相比，可以有效地挽救细胞核和核仁的收缩和褶皱(图15b)。此外，本发明还研究了桩蛋白在局灶性粘连(FA)中的作用，因为它可以改变hMSC的形态和细胞骨架。如图15c-e所示，桩蛋白在高ROS水平下的表达下降，主要分布在细胞核周围，很少分布在外周，然而，加入RuNC-CN和RuNP-CN后，观察到FA的空间分布，特别是在突起的前缘(图15e)。这些结果表明RuNC-CN和RuNP-CN对细胞骨架重塑、细胞核形态维持和细胞粘附具有有效的拯救能力。
除干细胞粘附外，本发明还验证了hMSCs在高ROS水平培养基中对成骨和脂肪形成的多向分化潜能，进一步证实Ru-CN人工生物催化剂在组织修复中的应用前景。在成骨过程中，碱性磷酸酶(ALP)已被用作早期标志物。如图16所示，阳性组ALP和钙节点的信号都非常有限。然而，在RuNC-CN和RuNP-CN组中，蓝色强信号分布在整个井中，这与阴性组相似。对于后期标记物(图17a-d)，RuNC-CN组也呈现出与阴性组相似的红色节点水平，而RuSA-CN组和阳性组的节点数量要少得多。然后，本发明在细胞水平上比较了RuNC-CN和RuSA-CN的晚期标记物、整合素结合唾液蛋白(IBSP)的表达(图17e)。显然，在RuNC-CN组中，IBSP在细胞核周围表达更多。综上所述，RuNC-CN具有高效的ROS消除能力，在含ROS的培养基中培养的hMSCs可以表现出与阴性组相似的成骨潜能。
之后，本发明还***地研究了生物催化剂在脂肪形成中的应用潜力。脂滴(NileRed，图18a)和脂肪酸结合蛋白(FABP4，图18b)的荧光染色图像表明，Ru-CN可以有效促进高ROS水平下的hMSCs成脂。RuNC-CN处理组的统计分析(图18c,d)显示出与阴性组几乎相同的脂肪生成标志物的表达，说明其具有良好的干细胞功能恢复能力。此外，通过尼罗红染色观察到分化的干细胞。如图18e所示，RuNC-CN处理组细胞质中分布有许多大而丰满的液滴，而RuSA-CN处理组细胞质中仅有少量小而堆积不良的液滴。脂肪生成标志物清晰地表明，Ru-CN人工生物催化剂能够在高ROS水平条件下有效挽救hMSCs的脂肪生成功能。
上述实验结果表明，本发明合成的Ru-CN人工生物催化剂可以在高ROS水平条件下为间充质干细胞的生存、粘附和分化功能(成骨和脂肪生成)提供有效的拯救能力。Ru-CN通过显著下调细胞内ROS浓度，从而使间充质干细胞与微环境形成充分牢固的局灶性粘连，并保持健康状态。随着干细胞功能的恢复，可以很好地保存多功能分化，如骨形成和脂肪形成等。相反，没有Ru-CN人工生物催化剂的干细胞会受到ROS相关的膜损伤和DNA断裂，即使有干细胞存活下来，也会随着细胞功能障碍、细胞周期阻滞和分化抑制而衰老。本发明提供的Ru-CN人工生物催化剂可以用来制备治疗与ROS相关疾病的生物材料和用于干细胞治疗的生物材料。
综上，本发明提供了一种仿金属酶生物催化材料Ru-CN及其制备方法和用途。本发明提供的Ru-CN材料可以有效清除ROS，并能持续产生氧气缓解组织乏氧，它比许多天然抗氧化剂以及最近报道的先进的生物催化剂具有更强的ROS清除能力。本发明提供的Ru-CN材料可以有效保护干细胞，可以在高ROS水平条件下为干细胞的生存、粘附和分化功能(成骨和脂肪生成)提供有效的拯救能力。本发明提供的Ru-CN材料在制备治疗与ROS相关疾病的生物材料和用于干细胞治疗的生物材料中具有广阔的应用前景。

Claims (7)

1.一种生物催化材料在制备清除活性氧和/或保护干细胞的生物材料中的用途，所述生物催化材料是以氮化碳纳米片和RuCl3•3H2O为原料，在溶剂中反应得到的；所述溶剂为水、醇类试剂中的一种或两种的混合，所述氮化碳纳米片、RuCl3•3H2O的质量比为20：1。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述氮化碳纳米片是按照以下方法制得的：将块状氮化碳加入氧化剂的水溶液中反应，反应结束后过滤，取固体水洗，加入水并超声处理，形成均质溶液，静置，取静置后的上清液离心，取离心后的上清液干燥，得到氮化碳纳米片。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述氧化剂为次氯酸盐；
和/或，所述反应的温度为30-50℃，时间为4-6天；
和/或，所述块状氮化碳是按照以下方法制得的：将三聚氰胺升温至530-570℃，在空气中保持1-3小时，然后自然冷却至室温，水洗，干燥，得到块状氮化碳。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述氧化剂为次氯酸钠；
和/或，所述反应的温度为40℃，时间为5天。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述反应的温度为60-80℃，时间为3-7小时。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述反应的温度为70℃，时间为5小时。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于：所述生物催化材料的制备方法包括以下步骤：将氮化碳纳米片加入溶剂并超声处理，得到氮化碳纳米片均质溶液；将RuCl3•3H2O的溶液滴入氮化碳纳米片均质溶液中，搅拌下反应，反应结束后过滤，取固体，洗涤，干燥，得到生物催化材料。
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