CN115135667A

CN115135667A - 获得α-1蛋白酶抑制剂的方法

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Publication number: CN115135667A
Application number: CN202180014889.7A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·雷贝尔; 杰弗里·A·尤齐乌克; 乔治·格雷迪; 丹尼斯·麦克布莱德
Original assignee: Grifols Worldwide Operations Ltd
Current assignee: Grifols Worldwide Operations Ltd
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2022-09-30
Also published as: AU2021225310A1; KR20220145352A; CA3168165A1; UY39091A; AR121391A1; WO2021170531A1; BR112022016234A2; MX2022010087A; IL295661A; JP2023515431A; TW202139973A; EP4110808A1

Abstract

用于获得高度浓缩的α‑1蛋白酶抑制剂(A1PI)的方法，所述方法包括藉由切向流过滤(TFF)相对于水浓缩A1PI初始溶液来制备A1PI溶液的步骤，其中在浓缩溶液中A1PI的最终浓度为至少110mg/ml。

Description

获得α-1蛋白酶抑制剂的方法

描述

背景

领域

本公开内容涉及医药产品领域。本文某些实施方案涉及用于获得高度浓缩的α-1蛋白酶抑制剂(Alpha-1 Proteinase Inhibitor；A1PI)的方法，该抑制剂可用于许多治疗适应症。

相关技术的描述

α-1-蛋白酶抑制剂(A1PI)亦称为α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-Antitrypsin，AAT)或α₁-抗胰蛋白酶，是作用于多种细胞蛋白酶上的蛋白酶抑制剂。A1PI通过抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶作用且通过其他机制而在组织稳态中起主要作用。

A1PI的先天性缺乏使得嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性不受控制及赋予组织(特别为肺)弹性的必需蛋白弹性蛋白随后降解。弹性蛋白的不存在可能导致呼吸***并发症诸如肺气肿及肝硬化。

长期静脉内(Chronic intravenous)(IV)施用A1PI以治疗AAT缺乏症是负担繁重的，需要专业辅助(在患者家中或在诊所、医院等中施用)，且可引起即刻过敏反应。为了克服所述问题，本发明人已对于包含高度浓缩A1PI的新产品开发出新浓缩方法及新制剂。本发明中详述的浓缩制剂实现更广效的胃肠外施用，其可包括静脉内、皮下、喷雾剂及皮内施用。此产品可满足长期存在的使患者在家施用而无需辅助健康护理专家来更容易给药的未满足需要，从而降低治疗成本，且适用于长期治疗。

存在现有技术中已知的若干A1PI纯化方法，其中起始材料为Cohn级分IV-1糊剂且添加沉淀剂如PEG及ZnCl₂以使杂质及A1PI沉淀。除了在过程中包括过滤或离心形式的附加步骤以使沉淀与上清液分离以外，沉淀方法深受低产率及较低比活性困扰。使用亲和层析的方法由于强配体浸出可能性而不适用于治疗性蛋白质制备。

Cohn氏乙醇分级分离或亲和层析已广泛用于以高产率纯化此蛋白。更高效过程有助于确保最佳使用稀少且有价值的商品如人类血浆来产生治疗级的最终产物。

用于产生A1PI的已知方法之一包括使用切向流过滤(tangential flowfiltration；TFF)超滤，然而，仅获得了至多100mg/mL(10％w/v)的A1PI浓度。尝试使用常规TFF超滤来增加A1PI的浓度，即使使用少量的缓冲液及盐，也会导致产生不可接受的高水平聚集体。为了达成A1PI的更大浓度，在常规TFF超滤之后必须进行另一个步骤。在一种已知方法中，此另一步骤可以是单程切向流过滤(single-pass tangential flow filtration；SPTFF)，其导致A1PI的浓度大于200mg/mL(20％w/v)。

本案发明人出乎意料地发现，使用常规TFF超滤，相对于(against)注射用水(WFI)，可以获得至少110mg/mL的A1PI的浓度，而无需使用缓冲液及盐，其允许省去进一步浓缩A1PI的后期阶段。此后，用一种或更多种不带电荷的赋形剂配制A1PI至100mg/mL与200mg/mL之间的最终浓度。这能够以不带电荷的赋形剂配制经浓缩A1PI以调节渗透压，同时解决先前使用带电荷的赋形剂时的较差稳定性能。

概述

本发明的实施方案在于，使用常规TFF超滤可相对于水浓缩A1PI到至少110mg/mL，且然后配制A1PI至最终浓度为100mg/mL及200mg/mL。

在一些实施方案中，用于藉由常规TFF超滤制备A1PI溶液的方法相对于注射用水(WFI)进行。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法包括在TFF步骤之后用选自由以下组成的列表的一种或更多种不带电荷的赋形剂配制：山梨醇、丝氨酸、海藻糖、丙氨酸、蔗糖及甘露醇，及其组合。优选地，该一种或更多种不带电荷的赋形剂为丙氨酸、山梨醇或海藻糖及其组合。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法包括在TFF步骤之后用一种或更多种不带电荷的赋形剂以0.01M与0.3M之间的浓度配制。优选地，一种或更多种不带电荷的赋形剂的浓度在0.10M与0.20M之间。更优选地，一种或更多种不带电荷的赋形剂的浓度为0.17M.

无需使用缓冲液而通过添加一种或更多种配制赋形剂来控制pH至近中性(约6.6至7.4)，且使其在整个储存过程中保持稳定。优选地，组合物的pH为7.0。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法，其中该溶液的渗透压在200mOsm/Kg与410mOsm/Kg之间。在一些实施方案中，溶液的渗透压为约200mOsm/Kg、240mOsm/Kg、270mOsm/Kg、300mOsm/Kg、330mOsm/Kg、360mOsm/Kg、390mOsm/Kg或410mOsm/Kg，或在由任两个前述值限定之范围内。优选地，溶液的渗透压为300mOsm/Kg。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法包括配制步骤。在一些实施方案中，A1PI在配制之后的浓度在100mg/mL与200mg/mL之间。

详细描述

目前，A1PI溶液可商购获得(Prolastin-C，Grifols；Glassia，Shire；Zemaira，CSL；Aralast，Baxter)，以治疗人类先天性蛋白缺乏症(α-1抗胰蛋白酶缺乏症，Alpha-1Antitrypsin Deficiency；AATD)。所有这些产品共同具有的一个限制在于，其含有相对低浓度(约20mg/ml至50mg/ml)的A1PI。出于此原因，其作为治疗剂的唯一合适施用途径是每周静脉内注射。

长期静脉内施用A1PI以治疗AATD是负担繁重的，需要专业辅助，且可引起即刻过敏反应。因此，长期存在使患者在家施用而无需辅助健康护理专家来更容易给药的未满足需要，这显著地降低治疗成本且使其适用于长期治疗。为了实现更广泛范围的胃肠外施用途径，应增加产品中A1PI的浓度。然而，根据当前的A1PI纯化方法，使用现有制剂不可能产生稳定的浓缩液体A1PI。

出乎意料地，本案发明人发现相对于水使用常规TFF超滤允许在不使用缓冲液及盐或诸如SPTFF的其他步骤的情况下产生至少110mg/ml的高度浓缩A1PI。该过程的此步骤的新颖性在于，其必须在缓冲液及盐不存在的情况下、在WFI存在的情况下进行，且稍后藉由添加选自由以下组成之列表的一种或更多种不带电荷的赋形剂来配制：山梨醇、丝氨酸、海藻糖、丙氨酸、蔗糖及甘露醇，及其组合，更优选为丙氨酸、山梨醇或海藻糖及其组合。重要的是，所得组合物适用于人类施用，因为其与管理机构所要求的渗透压、稳定性及黏度的值相符。

制备浓缩A1PI溶液的方法

本发明的实施方案公开了一种用于制备A1PI组合物的方法。方法包括藉由切向流过滤(TFF)相对于水浓缩A1PI初始溶液来制备A1PI溶液的步骤，其中在该浓缩溶液中A1PI的最终浓度为至少110mg/ml。

本发明的实施方案公开了一种用于制备A1PI组合物的方法，其中所述TFF的步骤相对于注射用水(WFI)进行。

在一些实施方案中，方法包括将A1PI溶液浓缩，其中浓缩溶液中A1PI的最终浓度在110mg/ml与220mg/ml之间。在一些实施方案中，该浓缩溶液中A1PI的最终浓度为约110mg/ml、130mg/ml、150mg/ml、180mg/ml、200mg/ml或220mg/ml，或在由任两个前述值限定之范围内。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法包括在该TFF步骤之后用选自由以下组成的组的一种或更多种不带电荷的赋形剂配制A1PI溶液：氨基酸、糖类及多元醇，包括山梨醇、丝氨酸、海藻糖、丙氨酸、蔗糖及甘露醇，及其组合。优选地，用选自由以下组成的组的一种或更多种不带电荷的赋形剂配制A1PI溶液：丙氨酸、山梨醇或海藻糖及其组合。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法包括在该TFF步骤之后用一种或更多种不带电荷的赋形剂以0.01M与0.3M之间的浓度配制。优选地，一种或更多种不带电荷的赋形剂的浓度在0.10M与0.20M之间。更优选地，一种或更多种不带电荷的赋形剂的浓度为0.17M。

不使用缓冲液而通过添加一种或更多种配制赋形剂来控制pH至近中性(约6.6至7.4)，且在整个储存过程中保持稳定。优选地，组合物的pH为7.0。

在一些实施方案中，用于制备A1PI浓缩溶液的方法，其中该溶液的渗透压为200mOsm/Kg与410mOsm/Kg之间。在一些实施方案中，溶液的渗透压为约200mOsm/Kg、240mOsm/Kg、270mOsm/Kg、300mOsm/Kg、330mOsm/Kg、360mOsm/Kg、390mOsm/Kg或410mOsm/Kg，或在由任两个前述值限定的范围内。优选地，溶液的渗透压为300mOsm/Kg。

实施例

实施例1-根据现有技术的高浓度A1PI工艺流程。

α-1MP(US 6,462,180 B1)、液体α(US 9,616,126 B1)和α-1HC(US20110237781A1)工艺使用典型再循环(TFF)UF步骤进行浓缩，随后以水进行透析(DF)步骤以去除缓冲盐，从而制备用于最终制剂且调节至50mg/ml的蛋白的主体(bulk)来制成多至50mg/ml的A1PI。制剂由20mM维持pH的磷酸钠缓冲液及调节渗透压至200-410mOsm/kg等渗状态的盐(α-1MP及α-1HC；分别地，100mM或150mM NaCl)或氨基酸(液体α；200mM至300mM丙氨酸)组成。同样，类似地制备其他A1PI制剂(表1)。

表1-若干具有各种浓度及配方的A1PI制备物的并列比较。

与现有技术方法相反，在本发明中，不必使用缓冲液及盐来在配制之后获得>100mg/ml的A1PI的浓度。在超滤之后，A1PI的浓度大于110mg/ml，且在后续添加并混合赋形剂并进行pH调节后，可获得>100mg/ml的A1PI的浓度。

实施例2–使用单程切向流过滤(SPTFF)及常规TFF超滤产生A1PI的方法的特征。

表2显示藉由本发明的方法使用TFF超滤来获得A1PI组合物的特征不同于使用另一个SPTFF步骤所获得的那些组合物的特征。举例而言，藉由两种方法所获得的A1PI的效价及比活性是类似的。另一方面，在所有情况下，pH为约7且渗透压为约300mOsm/kg。在另一方面，使用两种方法，聚集体的百分比低于0.1。因此，藉由使用另一个SPTFF步骤及本发明的方法所获得的A1PI制备物不存在显著差异。

表2-用于获得A1PI制备物的SPTFF及常规TFF超滤的并列比较。

*该值表示N＝3的平均值

实施例3–藉由TFF超滤所获得的高度浓缩A1PI。

获得包含高度浓缩A1PI的组合物的方法包括应用常规TFF超滤，该组合物可用于许多治疗适应症。

在表3中，在WFI中使用常规TFF超滤制备前三列(批次P14-26；P15-10及P15-22)，而最后一列表示在配制前藉由在WFI中使用另一个SPTFF步骤获得的三个批次的A1PI的平均值。使用常规TFF超滤所获得的A1PI的浓度显著不同于使用SPTFF所获得的那些浓度。此外，藉由两种方法所获得的A1PI的效价、比活性及分子量极其类似。

表3-用于获得A1PI制备物的SPTFF及常规TFF超滤的并列比较。

*分析数据，对于N＝3，平均值±1SD，范围±3SD

实施例4–在根据本发明的方法的配制步骤中使用丙氨酸作为不带电荷的赋形剂得到的A1PI的蛋白浓度。

在本发明的方法中，在TFF步骤之后，使用实现渗透压及pH调节并以一种或更多种不带电荷的赋形剂配制的浓缩赋形剂溶液将A1PI溶液精确稀释至靶标浓度(至少10％(w/v))。此工艺能够实现高A1PI浓度，同时在不使用缓冲液、盐或表面活性剂的情况下得到液体药物产物的稳定制剂。

表4显示含有不同浓度的丙氨酸的配制之后的A1PI制备物。评估一些参数，诸如渗透压、总蛋白及未折叠蛋白的DLS温度及折叠蛋白的DLS半径。

根据表4的结果，在较低蛋白浓度使用丙氨酸的渗透压控制得以补偿，这表明一定浓度的A1PI(142mg/mL)的渗透压对比所添加丙氨酸的量之间的直接及线性关系。在所测试的丙氨酸范围内，DLS显示出对A1PI稳定性无作用。

表4–具有各种浓度及配方的含有丙氨酸作为不带电荷的赋形剂的A1PI制备物。

*N/A＝不适用；N/T＝未测试

**分析数据，对于N＝3，平均值±1SD

定义

如本文所用，章节标题仅用于组织目的，且不应视为以任何方式限制所描述的主题。本申请中引用的所有文献及类似材料(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文、及因特网网页)明确地出于任何目的以其全文引用的方式并入。当并入的参考文献中术语的定义显示不同于本教导中提供的定义时，应以本教导中提供的定义为准。应理解，在本教导中讨论的温度、浓度、时间等之前存在暗示性的“约”，使得轻微且不显著的偏离处于本文教导的范畴内。

在本申请中，除非另外明确说明，否则使用单数包括复数。而且，使用“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“包含(contains)、“包含(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”不旨在为限制性的。

如本说明书及权利要求书中所使用，除非内容另外清楚地指定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该(the)”包括复数个提及物。

如本文所用，“约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

尽管本公开内容在某些实施方案及实施例的上下文中，但本领域技术人员应理解，本公开内容延伸超出所特定公开的实施方案至其他替代性实施方案及/或实施方案的用途及其明显修改及等效物。另外，虽然已经显示并且详细描述实施方案的若干变化形式，但是基于本公开内容，在本发明的范畴内的其他修改对本领域技术人员而言将是容易清楚的。

亦涵盖的是，可作出实施方案的特定特征及方面的各种组合或子组合，且其仍落在本公开内容的范畴内。应了解，所公开的实施方案的各种特征及方面可彼此组合或彼此取代，以形成本公开内容的不同模式或实施方案。因此，预期本文的公开内容的范畴不应限于上述特定公开的实施方案。

然而，应了解，此详细描述虽然指示本公开内容的优选实施方案，但其仅以说明方式给出，因为本公开内容的精神及范畴内的各种更改及修改对本领域技术人员而言将是明显的。

本文呈现的描述中所用的术语不旨在以任何受限或限制性方式解释。相反，术语仅与***、方法及相关组分的实施方案的详细描述结合使用。此外，实施方案可包含若干新颖特征，其中并无一个特征单独造成其合乎需要的属性或据信为实践本文描述的实施方案所必需。

在本文件中，术语切向流过滤(TFF)是指通过减小体积来浓缩产物及通过透析来进行缓冲液交换的步骤。TFF通常利用范围从1kDa-1000kDa标称分子量限度(NMWL)的超滤膜来保留不同尺寸分子。传统TFF需要通过***进行多程，使用泵驱动进料通过过滤器且发送渗余物回到罐中以通过该***进行另一程。

在本文件中，术语单程切向流过滤(SPTFF)是指利用更长进料通道路径以在一次泵程后达到期望的转化的过滤方法。再循环回路的不存在允许渗余物流向下游且因此减少滞留体积、消除池罐要求且实现连续处理。

Claims

1.一种用于制备A1PI的组合物的方法，所述方法包括藉由切向流过滤(TFF)相对于水浓缩A1PI初始溶液来制备A1PI溶液的步骤，其中在浓缩溶液中A1PI的最终浓度为至少110mg/ml。

2.根据权利要求1所述的用于制备组合物的方法，其中所述TFF的步骤相对于注射用水(WFI)进行。

3.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中在所述浓缩溶液中所述A1PI的最终浓度在110mg/ml与220mg/ml之间。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中在所述浓缩溶液中A1PI的最终浓度为110mg/ml、130mg/ml、150mg/ml、180mg/ml、200mg/ml或220mg/ml，或在由任两个前述值限定的范围内。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中在所述TFF的步骤之后，用选自由以下组成的列表的一种或更多种不带电荷的赋形剂配制所述A1PI溶液：山梨醇、丝氨酸、海藻糖、丙氨酸、蔗糖和甘露醇，及其组合。

6.根据权利要求5所述的用于制备组合物的方法，其中在所述TFF的步骤之后，用山梨醇、海藻糖、丙氨酸或其组合配制所述A1PI溶液。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中一种或更多种不带电荷的赋形剂的浓度在0.01M与0.3M之间。

8.根据权利要求7所述的用于制备组合物的方法，其中一种或更多种不带电荷的赋形剂的浓度在0.10M与0.20M之间。

9.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述pH在6.6与7.4之间。

10.根据权利要求9所述的用于制备组合物的方法，其中所述pH为7.0。

11.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述渗透压在200mOsm/Kg与410mOsm/Kg之间。

12.根据权利要求11所述的用于制备组合物的方法，其中所述渗透压为300mOsm/Kg。

13.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述方法包括配制步骤。

14.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中在配制后A1PI的浓度在100mg/mL与200mg/mL之间。