CN115135330A - 修饰的干细胞及其使用方法 - Google Patents

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D·巴塔查里亚
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Abstract

本发明提供了修饰的干细胞(SC)和SC治疗疾病的用途。

Description

修饰的干细胞及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求根据35 U.S.C.§119(e)于2019年10月10日提交的美国临时专利申请序列号62/913,568的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
政府支持声明
本发明是根据美国国立卫生研究院授予的R21 AI132910在政府支持下进行的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明总体上涉及医学领域，并且更具体地涉及基因修饰的(geneticallymodified)干细胞(SC)如基因修饰的人胚胎干细胞(hESC)以及它们治疗疾病的用途。
背景技术
细胞移植形式的再生医学是治疗顽固性医学状况诸如糖尿病、心脏病和神经退行性疾病的的最有前途的疗法之一。然而，在临床上实施细胞移植的主要障碍是供体细胞的免疫排斥，特别是当这些源自外源宿主时。虽然通过施用免疫抑制剂药物来部分解决免疫排斥是可能的，但这些通常带来严重的不良副作用。
器官移植为治疗患有某些疾病的人提供了机会，并且可以让器官受体过上完整的生活。例如，对于终末期肝病、肺病和心脏病，移植总体上是唯一可用的治疗选择。在免疫抑制药物和辅助护理方面取得了进步，从而提高了患者和移植物的短期存活率。然而，这种成功受到几个问题的阻碍，如移植物长期存活率低、需要持续的免疫抑制药物、以及器官供需之间的差异。
已经开发了同种异体移植以增加供体组织的供应。然而，限制同种异体应答是主要挑战。除非受体的免疫***被下调，否则同种异体移植不会成功。现行临床标准是使用全身性免疫抑制药物，这降低了移植物的功效并且大大增加感染的风险。
在了解免疫监视以及基因修饰细胞(如SCs)的能力方面的进展，使得能够产生避免免疫排斥的细胞。然而，仍然需要开发用于细胞移植疗法的改进技术。
发明内容
本发明提供了基因修饰的SC、以及其产生方法和治疗疾病如1型糖尿病(T1D)的用途。
因此，在实施方式中，本发明提供了产生基因修饰的SC的方法。在一个方面，方法包括：a)修饰SC，以相对于野生型SC的HLA-I、HLA-II或其组合减少表达；和b)引入外源构建体，以表达包括CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA-E-单链三聚体中的一种或多种的免疫逃避基因(immune evasion gene)。
在一些方面，免疫逃避基因包括CR1和CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA-E-单链三聚体中一种或多种。
在一些方面，SC可以被进一步修饰，以表达PDL1和/或HLA-G-单链三聚体中的一种或多种。
在一些方面，免疫逃避基因包括CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体。
在另一实施方式中，本发明提供了由本发明的方法产生的基因修饰的SC。
在又一实施方式中，本发明提供了修饰的SC，其中：(i)HLA-I和HLA-II的表达被消除；并且(ii)SC被基因修饰，以表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA-E-单链三聚体中一个或多个。
在再一实施方式中，本发明提供了源自本发明的基因修饰SC的细胞系。
在另一实施方式中，本发明提供了通过分化本发明的基因修饰的SC而产生的分化细胞或组织。在各个方面，细胞或组织是小胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、足细胞、角质形成细胞、心肌细胞、多巴胺能神经元、皮层神经元、感觉神经元、NGN2导向的神经元、中间神经元、基底前脑胆碱能神经元、胰腺β细胞、神经干细胞、自然杀伤细胞、调节T细胞、肺细胞谱系、肾细胞谱系或血细胞谱系。
在另一实施方式中，本发明提供了通过分化本发明的基因修饰的SC而产生的β细胞。
在又一实施方式中，本发明提供了用本发明的基因修饰的SC、或基因修饰的SC的后代治疗需要其的受试者的疾病或障碍的方法。
在另一实施方式中，本发明提供了治疗受试者中的T1D的方法，方法通过将本发明的基因修饰的SC或β细胞施用于受试者，从而治疗受试者中的T1D。
附图说明
图1A描述了HLA缺陷型hES细胞系的产生。显示的是基因组编辑工作流程。Cas9和三个靶向HLA表达所必需基因的gRNA被核转染到H1 hES细胞中。两轮亚克隆和MiSeqTM分析产生克隆突变细胞系。
图1B描绘了HLA缺陷型hES细胞系的产生。显示的是目标基因的MiSeqTM分析的实例。在6个等位基因中的5个中引入了移码突变。
图1C描绘了HLA缺陷型hES细胞系的产生。显示了WT或HLA-KO hES细胞的图形数据，有或没有IFNg处理的情况下这些细胞被针对HLA-I表达染色。在b2m和TAP1缺陷型细胞中不存在HLA-I表达。
图2A示例了显示脐带血人源化小鼠不排斥异种畸胎瘤的数据。显示的是代表移植脐带血CD34+细胞20周后NSG-W41小鼠的脾嵌合体的数据。
图2B示例了显示脐带血人源化小鼠不排斥异种畸胎瘤的数据。图形数据显示了移植未修饰的或HM-KO hES细胞后，人源化或对照NSG-41受体中畸胎瘤的生长。
图3是图解示例，显示表达免疫逃避基因允许免疫活性小鼠中畸胎瘤生长。用列出的小鼠免疫逃避基因慢病毒转导HLAI/IIKO hES细胞。大约30％的细胞被任何给定的慢病毒感染，导致细胞表达所有4个基因的相对低频率。将这些或对照细胞大量移植到5只WTC57B16/N小鼠中，并且在8周内测量了畸胎瘤的生长。只有接受慢病毒的细胞表现出生长。
图4是一系列与表达免疫逃避基因的HM-KO细胞选择相关的图表。首先用编码Crry、mCD55、mCD59、和Kb单链三聚体的慢病毒转导了HM-KO细胞。接下来对细胞进行分类，使得它们一致地表达Crry、mCD59、和Kb-单链三聚体。大约60％的这些细胞也表达mCD55。这些细胞被用于产生用于异种移植的β细胞(左图，分选前)。培养这些细胞，进一步用mCD47转导，然后针对mCD55表达±CD47进行分选。这些是将用于异种移植的下一代细胞。显示了分选前和分选后的流式细胞仪概况。
图5是描绘如在实例中使用的分化方案的阶段4和7中通过NKX6.1表达水平测量的WT、HM-KO、和HM-KO-Lenti ECS的分化效率的图表。
图6A是一系列图像，显示在移植后1周在免疫活性小鼠中HM-KO-Lenti干细胞来源的假胰岛移植物的存活，如由GFP IHC所示的。
图6B是一系列图像，显示在移植后2个月在免疫活性小鼠中HM-KO-Lenti干细胞来源的假胰岛移植物的存活，如由GFP IHC所示的。
图7是来自图6A和图6iB所示相同区段的天然乳腺的图像。GFP的缺失突出了图6A和图6B中信号的特异性。
图8是显示移植有基因修饰假胰岛的小鼠中人C肽血液水平的图表。
图9A是显示校正AAVS靶向的图像。显示的是描绘相对于腺相关病毒整合的实际位点，所有当前AAVS靶向载体被设计以靶向的基因座。
图9B是显示校正AAVS靶向的图像。示意图显示了被设计以将小鼠免疫逃避基因靶向实际AAV整合位点的示例性修饰载体。为了进一步减少沉默的机会，在hEF1a启动子的上游包括上游染色质开放元件。
图9C是显示校正AAVS靶向的图像。显示的是与用Cas9和gRNAS以及编码mCD59、mCrry、mQa1-SCT和新霉素抗性的原始或修饰的AAVS靶向构建体一起转染的HM-KO或HUES2细胞相关的数据。在新霉素中选择细胞2周，并且分析了耐药细胞的mCD59表达。
图9D是显示正确靶向AAVS基因座的图像。显示了对mCD59呈阳性的细胞的数据，这些细胞被分选为单细胞用于扩增。在培养中进行了>8周的再分析。
图10A是显示AAVS构建体介导免疫逃避的图像。显示了用表达人CD55、CD46和HLA-E的AAVS靶向构建体转染的CHO细胞的数据。用a-CHO抗体，然后用C7缺陷型人血清染色转染子。测试细胞的C3c、C3d、和C4c补体沉积。
图10B是显示AAVS构建体介导免疫逃避的图像。显示了用与图10A中相同的构建体转染的721.221细胞的数据，这些构建体与原代人NK细胞一起培养。NK细胞脱粒被测量作为CD107a表达的函数。
图11A描绘了显示通过多轮实验设计(DoE)优化对β细胞分化方案进行改进的数据。
图11B是显示通过多轮DoE优化对β细胞分化方案进行改进的图像。
图11C描绘了显示通过多轮DoE优化对β细胞分化方案进行改进的数据。
图12是显示确定逃避基因构建体的最佳组合、在WT和NOD小鼠中进行实验、以及通过AAVS靶向产生稳定表达选定的逃避基因构建体的HM-KO细胞系的实验工作流程的图像。
具体实施方式
本发明是基于可用于产生对治疗疾病有用的修饰的SC的免疫逃避因子的发现。
在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明不限于本文所述的特定细胞、方法、和/或实验条件，因为这些细胞、方法、和条件可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而非意在限制，因为本发明的范围将仅限于所附权利要求中。
除非上下文另有明确规定，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用。因此，例如，对“该细胞”的引用包括一种或多种细胞，并且对“该方法”的引用包括本文所述类型的一种或多种方法、和/或步骤，本领域技术人员在阅读本公开等后将明白这些方法和/或步骤。
本发明至少部分基于免疫逃避因子的发现，免疫逃避因子可用于产生修饰的SC。在一些方面，本发明依赖于对SC进行遗传改造(基因工程化，genetically engineering)，以包括基因突变(例如，使用CRISPR/Cas9)，该基因突变导致用于移植的基本上非免疫原性或最低限度的免疫原性SC，和表达防止补体沉积的基因以消除免疫原性的主要决定因素。本发明的修饰的SC提供可规模化的现成疗法(off-the-shelf therapy)用于治疗许多疾病如自身免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症、和传染病，以及使用被改变以避免免疫排斥的细胞的基于SC疗法的一般应用。
因此，在实施方式中，本发明提供了产生基因修饰的SC的方法。方法包括：a)修饰SC，以相对于HLA-I、HLA-II或其组合的野生型SC减少表达；和b)引入外源构建体，以表达包括CR1和/或CD24和任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA-E-单链三聚体中的一种或多种的免疫逃避基因。
在相关的实施方式中，本发明提供了修饰的SC，其中：(i)HLA-I和HLA-II的表达被消除；并且(ii)SC被基因修饰，以表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA-E-单链三聚体中一种或多种。
如本文所述，已经开发了用于修饰人SC以使其避开免疫***的几个臂(分支部分，arm)识别的方法和靶标。本公开提供了产生可用于再生医学疗法而没有宿主免疫抑制的最小免疫原性供体SC系的方法，以及通过这样的方法产生的细胞。
本文描述了用于移植的基本上或最低免疫原性的SC(例如，hESC)，特别是用于各种疾病的基于SC的免疫疗法。用于移植的此类细胞和细胞系的创建使可规模化的现成细胞疗法成为可能。这对于私营企业正在开发的大多数基于SC的疗法来说是期望的。此类细胞还可以促进对自身免疫破坏的组织如T1D中的胰腺β细胞和多发性硬化症中的少突胶质细胞进行再生医学治疗。
如本文所讨论和实例中示例的，SC被基因修饰，使得细胞逃避被免疫***的几个臂(分支部分，arm)识别。含有本发明所述修饰的SCs，单独或与前述修饰组合，可逃避被CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、补体、或吞噬细胞识别。此外，这些细胞可以含有可诱导的***基因和耐药性盒。这允许在不良反应的情况下选择性地消除移植物，并且在培养中容易药物选择以识别克隆细胞系。过程共同允许生成用于移植的具有显著减少的免疫原性的SC。
破坏特定的免疫受体并且将特定的转基因引入SC(例如，通过基因缺失和/或转基因(cDNA)***被修饰)中可产生通用供体SC。在一些方面，本文提供了遗传改造(基因工程化，genetically engineered)的SC，其中HLA-I表达被减少或消除，以防止被同种异体CD8+T细胞直接识别；和/或HLA-II表达被消除，从而逃避被CD4+T细胞直接识别；和/或NKG2D配体编码基因被基因修饰，以逃避NK细胞识别。
在一些方面，β2微球蛋白和/或TAP1编码基因被基因修饰，以抑制或消除HLA-I表达。
在一些方面，CD74和/或CIITA编码基因被基因修饰，以抑制或消除HLA-II表达。
在一些方面，MICA和/或MICB编码基因被基因修饰，以逃避NK细胞识别。
在一些方面，β2微球蛋白、TAP1和CD74被基因修饰，以抑制或消除HLA-I和HLA-II表达。
在一些方面，β2微球蛋白、TAP1、CD74和CIITA被基因修饰，以抑制或消除HLA-I和HLA-II表达。
在一些方面，经基因修饰以逃避NK细胞识别的NKG2D配体编码基因包括MICA、MICB、Raet1e、Raet1g、Raet11、Ulbp1、Ulbp2、和/或Ulbp3中的一种或多种。在一些方面，经基因修饰的NKG2D配体编码基因是MICA或MICB；或MICA与MICB的组合。
本文还提供了制备基因工程化SC的方法，包括将构建体递送至SC中的AAVS基因座，以表达以下基因(或免疫逃避因子)中的一个或多个：CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E-单链三聚体、PDL1和/或HLA-G-单链三聚体。将理解，可以使用一种或多种构建体，使得在SC中实现基因的任何组合的表达。在一些方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1和/或CD24。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1和CD47。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CD24、CD46、CD55和CD59。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1、CD24、HLA-E-单链三聚体、PDL1和HLA-G-单链三聚体。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E-单链三聚体和PDL1。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1、CD47、HLA-E-单链三聚体和PDL1。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CD24、CD46、CD55、CD59、HLA-E-单链三聚体和PDL1。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E-单链三聚体、PDL1和HLA-G-单链三聚体。在一方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA-E-单链三聚体中的一种或多种。在一个方面，构建体(一种或多种)可被设计以表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E-单链三聚体、PDL1和/或HLA-G-单链三聚体中的一种或多种。
在一些方面，本发明提供了对β2微球蛋白和TAP1编码基因的基因修饰。这消除了HLA-I表达并且防止被同种异体CD8+T细胞直接识别。如本文所述，基因修饰可以是失活突变。
在一些方面，本发明进一步提供了编码CD74和任选地CIITA的基因中的突变。这消除了HLA-II表达并且逃避被CD4+T细胞的直接识别。
如本文所述，失活突变可以是基因中导致HLA-I或HLA-II表达减少或消除的任何突变。失活突变可以包括改变阅读框并且阻止功能性蛋白质翻译的核苷酸***或缺失。
本公开的实例进一步显示，这些HLA缺陷型细胞在用同种异体人免疫***重建的异种嵌合小鼠中产生畸胎瘤。如本文所示，已经证明了细胞缺乏HLA-I和HLA-II的表达。本公开进一步证明AAVS靶向构建体适当地表达所有预期基因并且赋予对自然杀伤细胞识别和补体沉积的抗性。
本发明进一步提供了待递送至SC中的AAVS基因座的构建体的设计和验证。这些构建体编码导致逃避NK细胞识别和吞噬作用的基因。这些基因的表达大大降低了NK细胞的活化。这些构建体同时编码可诱导***基因和耐药性盒。这允许在不良反应的情况下选择性地消除移植物，并且在培养中容易药物选择以识别克隆细胞系。过程共同允许产生用于移植的具有显著减少的免疫原性的人类多能干细胞。
本发明进一步提供了待递送至SC细胞中的AAVS基因座导致逃避补体结合(complement fixation)的构建体的设计和验证。
提供以下定义和方法以更好地限定本发明并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，否则相关领域的普通技术人员将根据常规用法来理解术语。
如本文所用，术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”、或“异源核酸”各自指源自对特定宿主细胞而言外源的、或如果来自相同来源则从原来的形式被修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞是内源的、但已经通过例如使用DNA改组(shuffling)而被修饰的基因。术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，术语是指对细胞而言是外来的或异源的，或与细胞同源但在宿主细胞核酸内一般未发现元件的位置中的DNA区段。表达外源DNA区段以产生外源多肽。“同源”DNA序列是与被引入的宿主细胞自然相关的DNA序列。
表达载体、表达构建体、质粒、或重组DNA构建体通常被理解为是指经由人为干预(包括通过重组方式或直接化学合成)已经产生的核酸，具有允许例如宿主细胞中的特定核酸的转录或翻译的一系列特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。典型地，表达载体可以包括与启动子可操作地连接的待转录核酸。
“启动子”通常被理解为指导核酸转录的核酸控制序列。诱导型启动子通常理解为响应特定刺激或活化剂，介导可操作连接的基因的转录的启动子(例如，强力霉素或四环素诱导型启动子)。启动子可以包括靠近转录起始位点的必要核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子可以任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。
如本文所用，“可转录核酸分子”是指能够被转录成RNA分子的任何核酸分子。已知用于将构建体引入细胞中的方法，其方式为可转录的核酸分子被转录成功能性mRNA分子，功能性mRNA分子被翻译并且因此表达为蛋白质产物。构建体也可被构建以能够表达反义RNA分子，从而抑制特定目的RNA分子的翻译。对于本公开的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)ShortProtocols in Molecular Biology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology 167,747-754)。
“转录开始位点”或“起始位点”是围绕作为转录序列一部分的第一个核苷酸的位置，也定义为位置+1。基因的所有其他序列及其控制区都可以关于这个位点编号。下游序列(例如，在3’方向上的其他蛋白质编码序列)可命名为正数，而上游序列(5’方向上的控制区的大部分)命名为负数。
“可操作地连接”或“功能连接”优选是指在单个核酸片段上的核酸序列的关联(association)，从而一个核酸片段的功能被另一个影响。例如，如果调节DNA序列与编码RNA或多肽的DNA序列的位置使得调节DNA序列影响编码DNA序列(即，编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)的表达，则调节DNA序列被称为“可操作地连接”编码RNA或多肽的DNA序列或与其“相关联”。编码序列可以有义或反义取向可操作地连接到调节序列。两个核酸分子可以是单个连续核酸分子的部分并且可以是相邻的。例如，如果启动子在细胞中调节或介导目的基因的转录，则启动子与目的基因可操作地连接。
“构建体”通常理解为任何重组核酸分子如质粒、粘粒、病毒、自主复制的核酸分子、噬菌体、或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，其源自能够进行基因组整合或自主复制的任何来源，包含其中一个或多个核酸分子已被可操作地连接的核酸分子。
本公开的构建体可以含有可操作地连接到可转录核酸分子的启动子，可转录核酸分子可操作地连接到3’转录终止核酸分子。此外，构建体可以包括但不限于来自例如3’-非翻译区(3’UTR)的其他调节核酸分子。构建体可以包括但不限于mRNA核酸分子的5’非翻译区(5’UTR)，其可以在翻译起始中起重要作用并且也可以是表达构建体中的遗传组分。这些其他上游和下游调节核酸分子可源自相对于启动子构建体上存在的其他元件是天然或异源的来源。
术语“转化”是指将核酸片段转化到宿主细胞的基因组中，导致基因稳定的遗传。含有转化核酸片段的宿主细胞称为“转基因”细胞，并且包含转基因细胞的生物称为“转基因生物”。
“转化的”、“转基因的”、和“重组的”是指已经引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体如细菌、蓝细菌、动物或植物。如本领域公知和公开的，核酸分子可以稳定地整合到基因组中(Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis&Gelfand 1999)。已知的PCR方法包括但不限于方法使用配对引物、嵌套引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物和类似引物。术语“未转化的”是指未经过转化过程的正常细胞。
“野生型”是指在自然界中发现的没有任何已知突变的病毒或生物体。
具有上述所需百分比同一性并且保留所表达蛋白质所需活性的变体核苷酸及其编码多肽的设计、产生、和测试在本领域技术范围内。例如，突变体的定向进化和快速分离可以根据参考文献中描述的方法，包括但不限于Link等人(2007)Nature Reviews 5(9),680-688；Sanger等人(1991)Gene 97(1),119-123；Ghadessy等人(2001)Proc Natl AcadSci USA98(8)4552-4557。因此，本领域技术人员可以产生大量核苷酸和/或多肽变体，其具有例如与本文所述的参考序列至少95-99％的同一性，和根据本领域常规方法筛选的期望表型。
核苷酸和/或氨基酸序列同一性百分比(％)被理解为当比对两个序列时，候选序列中与参考序列核苷酸或氨基酸残基相比相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了确定同一性百分比，对序列进行比对，并且如有必要，引入空位以实现最大百分比序列同一性。确定同一性百分比的序列比对程序是本领域技术人员熟知的。使用经常公开可用的计算机软件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件以比对序列。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大程度比对所需的任何算法。当序列被比对时，可以计算给定序列A与、和、或相对给定序列B的序列同一性百分比(其可选地表述为给定序列A具有或包含与、和、或相对给定序列B一定百分比序列同一性)。
通常，只要保留所需的活性，就可以在任何位置进行保守替换。可以进行所谓的保守交换，其中被替换的氨基酸与原始氨基酸具有相似的性质，例如Glu交换为Asp、Gln交换为Asn、Val交换为Ile、Leu交换为Ile、和Ser交换为Thr。例如，具有相似性质的氨基酸可以是脂肪族氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、含羟基或硫/硒氨基酸(例如，丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；环状氨基酸(例如，脯氨酸)；芳香族氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；碱性氨基酸(例如，组氨酸、赖氨酸、精氨酸)；或酸性及其酰胺(例如，天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)。缺失是用直接键(直接键合，direct bond)替换氨基酸。缺失的位置包括多肽的末端和各个蛋白质结构域之间的连接。***是将氨基酸引入多肽链中，直接键在形式上被一个或多个氨基酸替换。可以借助本领域已知的计算机模拟程序来调节氨基酸序列，计算机模拟程序可以产生具有例如改进的活性或改变的调节的多肽。在这种人工产生的多肽序列的基础上，可以使用所期望的宿主细胞的特定密码子惯用法在体外合成编码这种调节多肽的相应核酸分子。
可以使用本领域已知的多种标准技术转化宿主细胞(参见例如,Sambrook andRussel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)ShortProtocols in Molecular Biology,5th ed.,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology 167,747-754)。此类技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的递送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔和类似方法。可以选择和增殖转染的细胞以提供重组宿主细胞，其包含稳定整合在宿主细胞基因组中的表达载体。
可以引入宿主细胞的示例性核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或者甚至起源于或存在于同一物种中但通过基因工程方法并入受体细胞中的基因或序列。术语“外源的”还意指在正被转化的细胞中通常不存在的、或可能只是不以转化DNA片段或基因中发现的形式、结构等存在的基因，或通常存在而人们期望以不同于自然表达模式的方式表达(例如，过度表达)的基因。因此，术语“外源的”基因或DNA意指被引入受体细胞中的任何基因或DNA片段，而不管类似基因是否可能已经存在于这种细胞中。包括在外源DNA中的DNA的类型可以包括已经存在于细胞中的DNA、来自相同类型生物体的另一个体的DNA、来自不同生物体的DNA、或外部产生的DNA，如含有基因的反义信息的DNA序列、或编码基因的合成或修饰版本的DNA序列。
根据本文所述的方法开发的宿主菌株可以通过本领域已知的许多方法评估(参见例如,Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207-234；Gellissen,ed.(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic ExpressionSystems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein ExpressionTechnologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
下调或沉默基因的方法是本领域已知的。例如，可以使用反义寡核苷酸、蛋白质适体(适配体，aptamer)、核苷酸适体、和RNA干扰(RNAi)(例如，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、和微RNA(miRNA))下调或消除表达的蛋白质活性(参见例如,Fanning andSymonds(2006)Handb Exp Pharmacol.173,289-303G,describing hammerhead ribozymesand small hairpin RNA；Helene,C.,等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36；Maher(1992)Bioassays 14(12):807-15,describing targeting deoxyribonucleotidesequences；Lee等人(2006)Curr Opin Chem Biol.10,1-8,describing aptamers；Reynolds等人(2004)Nature Biotechnology 22(3),326-330,describing RNAi；Pushparaj and Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology andPhysiology 33(5-6),504-510,describing RNAi；Dillon等人(2005)Annual Review ofPhysiology 67,147-173,describing RNAi；Dykxhoorn and Lieberman(2005)AnnualReview of Medicine 56,401-423,describing RNAi)。RNAi分子可从多种来源商业可获得(例如,Ambion,TX；Sigma Aldrich,MO；Invitrogen)。使用多种算法的若干siRNA分子设计程序是本领域已知的(参见例如，Cenix algorithm,Ambion；BLOCK-iTTM RNAi Designer,Invitrogen；siRNA Whitehead Institute Design Tools,Bioinofrmatics&ResearchComputing)。对限定最佳siRNA序列有影响的性状包括在siRNA末端的G/C含量、siRNA特定内部结构域的Tm、siRNA长度、靶序列在CDS(编码区)内的位置、以及3’突出部分的核苷酸含量。
在各个方面，本发明的修饰SC是诱导多能SC(iPSC)或胚胎SC。在各个方面，SC是哺乳动物，例如人或小鼠。在一方面，SC源自待治疗的受试者。例如，可以从受试者收获体细胞并且重新编程以产生iPSC，然后使用本发明的方法对iPSC进行修饰。
如本文所用，“成体的”意指胎儿期后的，例如从新生儿期到生命末期的生物体，并且包括例如从分娩的胎盘组织、羊水、和/或脐带血获得的细胞。
如本文所用，术语“成体分化细胞”涵盖范围从成体生物体获得的广泛的分化细胞类型，其适用于使用本文描述的自动化***产生iPSC。优选地，成体分化细胞是“成纤维细胞”。成纤维细胞来源于间充质，在其活性较低的形式中也称为“纤维细胞”。它们的功能包括分泌细胞外基质组分的前体包括例如胶原蛋白。组织学上，成纤维细胞是高度支化的细胞，而纤维细胞通常较小并且经常被描述为纺锤形。源自任何组织的成纤维细胞和纤维细胞可用作本发明的自动化工作流程***的起始材料。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或IPSC意指干细胞由已被诱导或改变的分化成体细胞产生，例如，重编程为能够分化为所有三个胚层或真皮层(中胚层、内胚层和外胚层)组织的细胞。产生的IPSC并不是指自然界中发现的细胞。
如本文所使用的术语“干细胞”或“未分化细胞”是指具有自我更新的特性并且具有分化成多个细胞类型的发育潜能的处于未分化或部分分化状态的细胞，没有关于发育潜能(即，全能(totipotent)、多能(pluripotent)、多潜能(专能，multipotent)等)的具体暗示的含义。干细胞能够增殖并且产生更多这样的干细胞，同时维持其发育潜能。从理论上来说，自我更新可通过两种主要机制中任一种发生。干细胞可以不对称地***，这称为强制性的不对称分化，其中一个子代细胞保留了亲代干细胞的发育潜能，而另一个子代细胞表达一些与母细胞截然不同的其他特定功能、表型和/或发育潜能。子代细胞自身可经诱导而增殖并且产生随后分化成一种或多种成熟细胞类型的后代，同时还使一个或多个细胞保留了亲代发育潜能。分化细胞可源自多潜能细胞，该多潜能细胞自身源自多潜能细胞等。虽然这些多潜能细胞中的每种均可以视为干细胞，但是每种这样的干细胞可产生的细胞类型范围例如它们的发育潜能可有相当大的差异。可选地，群体中的一些干细胞中可对称地***成两个干细胞，称作随机分化，从而维持群体中的一些干细胞作为一个整体，而群体中的其他细胞仅产生分化的后代。因此，术语“干细胞”是指具有在特定环境下分化成更特化或分化的表型的发育潜能并且保留了在某些环境下增殖的能力而基本上不分化的情况细胞的任何子集。在一些实施方式中，术语干细胞通常是指天然存在的亲代细胞，其子系体(后代细胞)通过分化，例如通过获取完全个体化的特征经常在不同方向上特化，如在胚胎细胞和组织的渐进多元化中发生的。一些分化细胞还具有产生具有更高发育潜能的细胞的能力。此种能力可以是天然的或者可以是在用各种因子处理后人工诱导的。作为干细胞开始的细胞可能继续朝向分化表型发展，但是然后可经诱导而“逆转”和重表达干细胞表型，这一术语经常被本领域技术人员称为“去分化”或“重编程”或“逆分化”。
术语“分化细胞”涵盖其天然形式并非多能(该术语如本文所定义)的任何体细胞。因而，术语“分化细胞”也涵盖使用本文所描述的任何组合物和方法产生的部分分化的细胞，诸如多潜能细胞、或稳定的非多能部分重编程的细胞、或部分分化的细胞。在一些实施方式中，分化细胞是稳定的中间细胞，诸如非多能的部分重编程细胞。分化细胞(包括稳定的非多能部分重编程细胞中间体)向多能性的转变需要超过导致在置于培养物中后分化特征部分丧失的刺激的重编程刺激。重编程细胞，以及在一些实施方式中，部分重编程细胞，也具有能够经受长时间传代而不丧失生长潜能的特征，而具有较低发育潜能的亲代细胞与之相比，一般只具有在培养物中经受有限次***的能力。在一些实施方式中，术语“分化细胞”还指由特化程度较低的细胞类型(例如，发育潜能增加)(例如，来自非分化细胞或重编程细胞)的细胞衍生出的特化程度较高的细胞类型(例如，发育潜能降低)的细胞，其中细胞已经经受细胞分化过程。
如本文所使用的术语“重编程”是指使细胞或细胞群体(例如，体细胞)的发育潜能逆转的过程。换句话说，重编程是指驱使细胞到达具有较高发育潜能的状态，例如，驱使细胞退回到分化程度较低的状态的过程。将要重编程的细胞在重编程之前可以是部分分化或终末分化的。在本文所描述的方面的一些实施方式中，重编程涵盖使分化状态完全或部分逆转，例如，使细胞的发育潜能增加至具有多能状态的细胞的发育潜能。在一些实施方式中，重编程涵盖驱使体细胞达到多能状态，使得细胞具有胚胎干细胞的发育潜能，例如，胚胎干细胞表型。在一些实施方式中，重编程也涵盖使细胞诸如体细胞或单能细胞的分化状态部分逆转或发育潜能部分增加至多潜能状态。重编程还涵盖使细胞的分化状态部分逆转成这样的状态，其使得细胞在经受其他的操纵如本文所描述的那些时更容易完全重编程成多能状态。此类操纵可导致细胞或细胞后代特定基因的内源表达，其表达有助于重编程或维持重编程。在某些实施方式中，使用本文所描述的合成的、经修饰RNA及其方法进行的细胞重编程导致细胞呈现多潜能状态(例如，成为多潜能细胞)。在一些实施方式中，使用本文所描述的合成的、经修饰RNA及其方法进行的细胞(例如，体细胞)重编程导致细胞呈现多能样状态或胚胎干细胞表型。由此产生的细胞在本文称为“重编程细胞”、“体多能细胞(somatic pluripotent cells)”、和“RNA-诱导的体多能细胞”。如本文所指出的术语“部分重编程的体细胞”是指这样的细胞，其已用如本文所公开的方法从具有较低发育潜能的细胞重编程，使得部分重编程的细胞尚未完全重编程成多能状态而是重编程成非多能的稳定中间状态。此种部分重编程细胞可以具有低于多能细胞，但是高于多潜能细胞(这些术语如本文所定义)的发育潜能。部分重编程的细胞可以例如分化成三个胚层中的一个或两个，但是不能分化成所有三个胚层。
如本文所使用的术语“重编程因子”是指发育潜能改变因子(该术语如本文所定义)如基因、蛋白、RNA、DNA、或小分子，其表达有助于细胞例如体细胞重编程为分化程度较低或未分化的状态，例如重编程为多能状态或部分多能状态的细胞。重编程因子可为，例如，可将细胞重编程为多能状态的转录因子如SOX2、OCT3/4、KLF4、NANOG、LIN-28、c-MYC和类似物，包括可在体外重编程细胞的方法中取代这些中的一种或多种的任何基因、蛋白、RNA、或小分子。在一些实施方式中，使用本文所描述的合成的经修饰RNA及其方法的重编程因子的外源表达诱导一种或多种重编程因子的内源表达，使得处于重编程或部分重编程状态的细胞的稳定维持不再需要一种或多种重编程因子的外源表达。
如本文所使用的术语“分化因子”是指诱导细胞分化成期望细胞类型的发育潜能改变因子(该术语如同本文所定义)如蛋白质、RNA、或小分子，例如，分化因子降低细胞的发育潜能。在一些实施方式中，分化因子可为细胞类型特异性多肽，然而这不是必需的。分化成特定细胞类型可能需要多于一种分化因子的同时和/或连续表达。在本文所描述的一些方面，首先使用如本文所描述的合成的经修饰RNA经由重编程或部分重编程来增加细胞或细胞群体的发育潜能，然后通过与一种或多种编码分化因子的合成的经修饰RNA接触或引入一种或多种编码分化因子的合成的经修饰RNA来诱导由此种重编程产生的细胞或其后代细胞经受分化，使得细胞或其后代细胞具有降低的发育潜能。
在细胞个体发育学的背景下，术语“分化(differentiate或differentiating)”是相对的术语，是指细胞与其直接前体细胞相比沿着发育途径向下进一步发育的发育过程。因而，在一些实施方式中，重编程细胞(该术语如同本文所定义)可分化成谱系限制性前体细胞(如中胚层干细胞)，前体细胞进而可沿着该途径向下进一步分化成其他类型的前体细胞(如组织特异性前体，例如，心肌前体)，然后分化成终末期分化细胞，其在某些组织类型中发挥特征性作用并且可能保留或不保留进一步增殖的能力。
治疗应用和制剂(配方，formulaition)
如本文所讨论的，本发明进一步提供了治疗受试者的疾病或障碍的方法。在一些方面，方法包括向受试者施用本发明的基因修饰的SC。在一些方面，方法包括施用本发明的基因修饰SC的后代，如部分或终末分化的细胞或组织。在一方面，子代是从本发明的SC产生的祖细胞。祖细胞是生物细胞，它与SC一样，具有分化为特定类型细胞的倾向，但已经比SC更具特异性并且被推动分化为其“目标”细胞。例如，祖细胞可以是造血祖细胞(例如，造血内皮细胞)或造血祖细胞。
本文所述的药剂和组合物可以通过任何常规方式使用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂进行配制，如在例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro,Ed.),21st edition,ISBN:0781746736(2005)中所述，其通过引用全部并入本文。这样的制剂将含有治疗有效量的可以是纯化的形式的本文所述的生物活性剂以及合适量的载体，以提供适合施用给受试者的形式。
术语“制剂”是指将药物制备成适合施用于受试者如人的形式。因此，“制剂”可以包括药学上可接受的赋形剂，包括稀释剂或载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的”可以描述不导致不可接受的药理活性损失或不可接受的不良副作用的物质或组分。药学上可接受的成分的实例可以是在美国药典(USP29)和国家处方集(NF24)，United States Pharmacopeial Convention,Inc,Rockville,Md.,2005(“USP/NF”)或更新版本中具有专论的那些药学上可接受的成分，和FDA不断更新的非活性成分搜索在线数据库(Inactive Ingredient Search onlinedatabase)中列出的组分。也可以使用未在USP/NF等中描述的其他有用组分。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”可包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、或吸收延迟剂。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的(一般参见Remington's Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro,Ed.),21st edition,ISBN:0781746736(2005))。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则可预期其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以并入组合物中。
“稳定的”制剂或组合物可以指这样的组合物，其具有足够稳定性，以允许在方便的温度下如约0℃和约60℃之间储存持续商业上合理的时间段，如至少约一天、至少约一周、至少约一个月、至少约三个月、至少约六个月、至少约一年、或至少约两年。
制剂应适合施用方式。当前公开内容中使用的药剂可通过已知方法配制，用于使用几种途径向受试者施用，这些途径包括但不限于肠胃外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼用、颊、和直肠。单独的剂也可以与一种或多种其他的剂组合或与其他生物活性或生物惰性剂一起施用。这种生物活性或惰性试剂可以与剂(一种或多种)流体或机械连通，或通过离子、共价、范德华力、疏水力、亲水力、或其他物理力与剂(一种或多种)缔合(attached)。
可以配制控释(或缓释)制剂以延长剂(一种或多种)的活性并且降低施用频率。控释制剂也可用于影响起效时间或其他特征，如剂的血液水平，因此影响副作用的发生。控释制剂可被设计以最初释放一定量的产生所期望的治疗效果的剂(一种或多种)，并且逐渐和持续释放其他量的剂以在延长的时间段内维持治疗效果水平。为了维持体内剂的接近恒定的水平，剂可以从剂型中以一定速率被释放，其将取代正在代谢或从体内***的剂的量。可以通过各种诱导剂例如pH变化、温度变化、酶、水、或其他生理条件或分子来刺激剂的控释。
本文所述的剂或组合物也可以与其他治疗方式组合使用。因此，除了本文所述的疗法之外，还可以向受试者提供已知对治疗疾病、障碍或状况有效的其他疗法。
如本文所述，本发明提供了用基于细胞的疗法(例如，基因工程干细胞的分化后代)治疗需要其的受试者的疾病(例如，自身免疫性疾病、被自身免疫性疾病破坏的组织、病原体、癌症、酶缺乏症、或神经退行性疾病)并且施用治疗有效量的基于细胞的疗法的方法，从而用SC或其后代治疗疾病，同时逃避自然杀伤细胞识别。
进一步，使用本发明的方法修饰以避免免疫排斥的本发明的SC可用于产生目前正在开发用于患者治疗的任何其他细胞类型。将此类分化的细胞施用给需要此类细胞的患者，同时减少或不需要免疫抑制剂。
本文所述的方法通常在需要其的受试者上进行。需要本文所述的治疗方法的受试者可以是患有疾病、被诊断患有疾病、怀疑患有疾病或处于患疾病的风险的受试者。受试者可以是动物受试者，包括哺乳动物，如马、牛、狗、猫、羊、猪、小鼠、大鼠、猴子、仓鼠、豚鼠、和鸡、以及人类。例如，受试者可以是人类受试者。
根据本文所述的方法，施用可以是肠胃外、肺、口服、局部、皮内、听小骨、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼用、颊、或直肠施用。
任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；采用具体化合物的活性；采用的具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；采用组合物的***率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素(参见例如，Koda-Kimble等人(2004)Applied Therapeutics:The Clinical Use of Drugs,Lippincott Williams&Wilkins,ISBN 0781748453；Winter(2003)Basic ClinicalPharmacokinetics,4.sup.th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,ISBN 0781741475；Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/Appleton&Lange,ISBN 0071375503)。例如，组合物的剂量开始在低于达到所期望治疗效果所需的水平并且逐渐增加剂量直至达到期望的效果，这完全在本领域的技术范围内。如果期望，可以将有效日剂量分成多个剂量用于施用目的。因此，单剂量组合物可以含有这样的量或其约数以构成每日剂量。然而，将理解，本公开的化合物和组合物的总每日使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
在一些方面，细胞、组织、组合物和方法可用于治疗神经退行性疾病或障碍。例如，神经退行性疾病或障碍可以是阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亚历山大病、阿耳珀氏病、阿耳珀氏-胡腾洛赫综合征(Alpers-Huttenlocher syndrome)、α-甲基酰基-CoA消旋酶缺乏症、安德曼症候群、Arts综合征、共济失调神经病变谱(ataxia neuropathyspectrum)、共济失调(例如，伴有动眼运动运用不能、常染色体显性小脑性共济失调、耳聋、和发作性睡眠)、Charlevoix-Saguenay型常染色体隐性痉挛性共济失调(autosomalrecessive spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay)、巴腾氏病、β-螺旋蛋白相关性神经变性、大脑-眼-颜面-骨骼综合征(COFS)、皮质基底节变性、CLN1病、CLN10病、CLN2病、CLN3病、CLN4病、CLN6病、CLN7病、CLN8病、认知功能障碍、先天性无痛无汗症、痴呆、家族性脑病伴神经递质包涵体(familial encephalopathy with neuroserpin inclusionbodies)、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、脂肪酸羟化酶相关性神经变性、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、GM2-神经节苷脂沉积症(例如，AB变体)、HMSN7型(例如，患有色素性视网膜炎)、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、婴儿发病的上行性遗传性痉挛性麻痹(infantile-onset ascending hereditary spastic paralysis)、亨廷顿病(HD)、婴儿发病的脊髓小脑性共济失调、青少年原发性侧索硬化、肯尼迪氏病、库鲁病、利氏病、马-斯二氏综合征、轻度认知障碍(MCI)、线粒体膜蛋白相关神经变性、运动神经元病、单肢肌萎缩、运动神经元病(MND)、多***萎缩、多***萎缩伴随***性低血压(希-德二氏综合征)、多发性硬化症、多***萎缩、唐氏综合征(NDS)中的神经变性、衰老的神经变性(neurodegeneration of aging)、脑组织铁沉积的神经变性、视神经脊髓炎、泛酸激酶相关的神经变性、眼阵挛肌阵挛(Opsoclonus Myoclonus)、朊蛋白病、进行性多灶性脑白质病、帕金森病(PD)、PD相关疾病、多囊性脂膜性样骨发育不良伴硬化性脑白质病(polycysticlipomembranous osteodysplasia with sclerosing leukoencephalopathy)、朊蛋白病、进行性外眼肌麻痹、核黄素转运蛋白缺乏性神经元病(riboflavin transporterdeficiency neuronopathy)、山德霍夫氏病、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓小脑性共济失调(SCA)、纹状体黑质变性、传染性海绵状脑病(朊蛋白病)、或华勒氏样变性。
在一些方面，细胞、组织、组合物和方法可用于治疗癌症。例如，癌症可以是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；肾上腺皮质癌；艾滋病相关癌症；卡波西肉瘤(软组织肉瘤)；艾滋病相关淋巴瘤(淋巴瘤)；原发性中枢神经***淋巴瘤(淋巴瘤)；***癌；阑尾癌；胃肠类癌瘤；星形细胞瘤；非典型畸胎瘤/横纹肌瘤，儿童期，中枢神经***(脑癌)；皮肤基底细胞癌；胆管癌；膀胱癌；骨癌(包括尤因肉瘤、骨肉瘤、和恶性纤维组织细胞瘤)；脑瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤(胃肠道的)；儿童类癌瘤；心脏(心脏)肿瘤；中枢神经***癌症；非典型畸胎瘤/横纹肌瘤，儿童期(脑癌)；胚胎肿瘤，儿童期(脑癌)；生殖细胞瘤，儿童期(脑癌)；原发性中枢神经***淋巴瘤；***；胆管癌；胆管癌脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓细胞性白血病(CML)；慢性骨髓增生性肿瘤；结直肠癌；颅咽管瘤(脑癌)；皮肤T细胞；乳腺导管内原位癌(DCIS)；胚胎肿瘤，中枢神经***，儿童期(脑癌)；子宫内膜癌(子宫癌)；室管膜瘤，儿童期(脑癌)；食道癌；成感觉神经细胞瘤；尤因肉瘤(骨癌)；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；眼癌；眼内黑色素瘤；眼内黑色素瘤；视网膜母细胞瘤；输卵管癌；骨、恶性或骨肉瘤的纤维组织细胞瘤；胆囊癌；胃癌(胃癌)；胃肠类癌瘤；胃肠间质瘤(GIST)(软组织肉瘤)；生殖细胞瘤；中枢神经***生殖细胞瘤(脑癌)；儿童期颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；睾丸癌；妊娠滋养细胞疾病；毛细胞白血病；头颈癌；心脏肿瘤；肝细胞(肝)癌；组织细胞增多病，朗格汉斯细胞；何杰金淋巴瘤；下咽癌(头颈癌)；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；胰腺神经内分泌肿瘤；卡波西肉瘤(软组织肉瘤)；肾(肾细胞)癌；朗格罕细胞组织细胞增生病；喉癌(头颈癌)；白血病；唇癌和口腔癌(头颈癌)；肝癌；肺癌(非小细胞和小细胞)；淋巴瘤；男性乳腺癌；骨或骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤；黑色素瘤；眼内(眼)；美克耳细胞癌(皮肤癌)；间皮瘤，恶性；转移癌；原发灶隐匿转移性鳞状颈癌(头颈癌)；涉及NUT基因的中线癌(Midline Tract CarcinomaInvolving NUT Gene)；口腔癌(头颈癌)；多发性内分泌腺瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样霉菌病(淋巴瘤)；骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤；骨髓性白血病，慢性(CML)；髓细胞性白血病(AML)，急性；骨髓增生性肿瘤；鼻腔和鼻窦癌(头颈癌)；鼻咽癌(头颈癌)；成神经细胞瘤；非何杰金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌、唇癌或口腔癌；口咽癌(头颈癌)；骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌胰腺癌；胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)；***状瘤病；神经节细胞瘤；鼻窦和鼻腔癌(头颈癌)；甲状旁腺癌；***癌；咽癌(头颈癌)；嗜铬细胞瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；乳腺癌；原发性中枢神经***(CNS)淋巴瘤；原发性腹膜癌；***癌；直肠癌；复发性癌症肾细胞(肾)癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童期(软组织肉瘤)；唾液腺癌(头颈癌)；肉瘤；儿童期横纹肌肉瘤(软组织肉瘤)；儿童期血管瘤(软组织肉瘤)；尤因肉瘤(骨癌)；卡波西肉瘤(软组织肉瘤)；骨肉瘤(骨癌)；子宫肉瘤；赛塞利综合征(淋巴瘤)；皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；皮肤鳞状细胞癌；原发灶隐匿转移性(头颈癌)的鳞状颈癌；胃(胃)癌；T细胞淋巴瘤，皮肤的；淋巴瘤；蕈样霉菌病和赛塞利综合征；睾丸癌；喉癌(头颈癌)；鼻咽癌；口咽癌；下咽癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺瘤；肾盂和输尿管的移行细胞癌(肾(肾细胞)癌症)；输尿管和肾盂；移行细胞癌(肾(肾细胞)癌)；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；***癌；血管瘤(软组织肉瘤)；外阴癌；或威尔姆斯肿瘤。
在一些方面，细胞、组织、组合物和方法可用于治疗自身免疫疾病或障碍。例如，自身免疫性疾病或障碍可以是失弛缓性；阿狄森病；成人斯提耳病；无γ球蛋白血症；局限性脱发；淀粉样变性病；强直性脊柱炎；抗GBM/抗TBM肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性自主神经功能异常；自身免疫性脑脊髓炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳病(AIED)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性***；自身免疫性***；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病(AMAN)；巴布病(Babdisease)；贝切特病；良性粘膜类天疱疮；大疱性类天疱疮；卡斯尔曼病(CD)；乳糜泻；恰加斯病；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)；慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)；丘-施二氏综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)；瘢痕性类天疱疮；寇甘综合征；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇病毒性心肌炎；CREST综合征；克罗恩病；疱疹样皮炎；皮肌炎；Devic病(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；德雷斯勒综合征；子宫内膜组织异位；嗜酸性食管炎(EoE)；嗜酸性筋膜炎；结节性红斑，特发性混合型冷沉淀球蛋白血症；伊凡斯综合征；纤维肌痛；纤维性肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肺出血-肾炎综合征；肺出血-肾炎综合征；肉芽肿性多血管炎；格雷夫斯病；格-巴二氏综合征；桥本甲状腺炎；溶血性贫血；过敏性紫癜(HSP)；妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)；化脓性汗腺炎(HS)(逆向性痤疮)；低丙种球蛋白血症，IgA肾病；IgG4相关的硬化性疾病；免疫性血小板减少性紫癜(FTP)；包涵体肌炎(IBM)；间质性膀胱炎(IC)；少年关节炎；青少年糖尿病(1型糖尿病)；幼年型肌炎(JM)；川崎病；朗-伊二氏综合征；白细胞破碎性血管炎；扁平苔藓；硬化性苔藓，木样结膜炎；线性IgA疾病(LAD)；狼疮；莱姆病慢性；美尼尔病；显微镜下多血管炎(MPA)；混合性***病(MCTD)；莫伦溃疡；穆-哈二氏病；多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB，多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；发作性睡眠；新生儿狼疮；视神经脊髓炎；中性白细胞减少症；眼瘢痕性类天疱疮；视神经炎；复发性风湿病(PR)；PANDAS；副肿瘤性小脑变性(POD)；阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)；帕-罗二氏综合征；扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)；巴-特二氏综合征(Parsonnage-Turner syndrome)；天疱疮；周围神经病变；外周脑脊髓炎；恶性贫血(PA)；POEMS综合征；结节性多动脉炎；I、II、III型多腺体综合征；风湿性多肌痛；多发性肌炎；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征；原发性胆汁性肝硬变；原发性硬化性胆管炎；***皮炎；牛皮癣；牛皮癣性关节炎；纯红细胞再生障碍(PRCA)；坏疽性脓皮症，雷诺现象；反应性关节炎；反射交感性营养不良；复发性多软骨炎；腿多动综合征(RLS)；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿性关节炎；结节病；施密特综合征；巩膜炎；硬皮病；干燥综合征；***和睾丸自身免疫；僵人综合症(SPS)；亚急性细菌性心内膜炎(SBE)；苏萨克综合征；交感性眼炎(SO)；高安动脉炎；颞动脉炎/巨细胞动脉炎；血小板病性紫癜(TTP)；托-亨二氏综合征(THS)；横贯性脊髓炎；1型糖尿病；溃疡性结肠炎(UC)；未分化***病(UCTD)；眼葡萄膜炎；血管炎；白癜风；伏-小柳-原田三氏综合征；或韦格纳肉芽肿病(或肉芽肿伴多血管炎(GPA))。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。术语“一”(或“一个”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”可以互换使用。
此外，“和/或”将被视为对两个指定特征或组分中的每个的具体公开，具有或不具有另一个。因此，在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意在包括A和B、A或B、A(单独)、和B(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意在包括A、B、和C；A、B、或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Dictionary of Cell and Molecular Biology(5thed.J.M.Lackie ed.,2013)、Oxford Dictionary of Biochemistry and MolecularBiology(2d ed.R.Cammack et al.eds.,2008)、以及Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology，P-S.Juo,(2d ed.2002)可以为技术人员提供本文使用的一些术语的一般定义。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方式的限制，其可以通过整体参考说明书来获得。因此，以下紧接定义的术语通过参考说明书的全部内容得到更充分的定义。
要么用语言“包含”来描述实施方式，否则就包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”所描述的类似实施方式。
提供以下实例以进一步示例本发明的优点和特征，但它们并非意在限制本发明的范围。尽管这些实例是可以使用的那些实例的典型实例，但是可选地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实施例一
产生修饰的干细胞。
通过基于CRISPR的靶向突变和免疫逃避盒的慢病毒表达产生了一系列连续的H1人胚胎干细胞(hESC)的遗传变体。具体地，优化了工作流程以在人ES细胞中产生靶向突变。将Cas9表达构建体和上至3个不同的gRNA编码载体共转染到H1人ES细胞中。人工挑选单个菌落并且使之经受目标基因的MiSeqTM分析，以识别携带由非同源末端连接错误引入的移码突变的克隆。然后通过荧光激活细胞分选(FACS)将候选克隆以恰好1个细胞/孔平皿铺平板，并且再次进行MiSeqTM分析以确认突变和嵌合现象缺乏(图1A)。接下来，对克隆进行扩增、核型分析，并且确认它们的分化潜力。通过基于CRISPR/Cas9的靶向突变，已生成了缺乏HLA表达的核型正常的hES细胞系。通过靶向区域的MiSeqTM分析，鉴定出了在β2m和TAP1的两个等位基因以及CD74的一个等位基因中携带失活突变的一个克隆(图1B)。在这个克隆中，干扰素-γ诱导的HLA-I表达被完全消除(图1C)，并且确认了正常的核型。源自这个HLA-I缺陷系的单核细胞未能刺激同种异体原发性CD8+T细胞增殖。随后使用CRISPR重新靶向这个HLA-I缺陷系，以消除CD74的剩余等位基因和CIITA的两个等位基因、HLA-II表达所需的转录因子。也确认了这个克隆具有正常的核型。由于缺乏HLA-I可能使靶细胞对NK细胞介导的细胞溶解敏感，因此发明人还通过CRISPR/Cas9靶向了NKG2D配体MICA和MICB。RNA-seq分析表明，这些是胰腺β细胞表达的仅有的两种NKG2D配体。对大约400个核转染克隆的测序揭示了一个系在MICA和MICB的所有4个等位基因中携带移码突变。这个克隆已被验证为正常核型和缺乏MICA/MICB表达。HLA、MICA/B缺陷型hES细胞此后将被称为HM-KO hES。
实施例二
人源化小鼠无法重现(recapitulate)正常的免疫排斥应答。
为了在体内用这个系测试免疫逃避，通过将2×105个脐带血CD34+细胞移植到非条件化(unconditioned)NSG W41小鼠中，使用了人源化小鼠方法。这些小鼠中的B和T细胞重建是稳健的(图2A)。然而，当这些人源化小鼠被皮下注射时，即使是用未修饰的WT H1hES细胞(106)，畸胎瘤生长也很稳健，并且与对照非人源化NSG小鼠中的畸胎瘤生长相当(图2B)。此外，在人源化NSG动物中HM-KO细胞的生长与未修饰的H1细胞相同。因此，这些脐带血人源化小鼠不能排斥异种畸胎瘤，并且也不是正常人类免疫应答的可靠替代物。甚至不能排斥未经修饰的细胞可能涉及抗体应答差、功能性NK细胞缺失、以及抗原呈递细胞是与源自胸腺的T细胞不匹配的HLA。
实施例三
异种免疫活性小鼠排斥HLA缺陷型移植物。
使用了更严格的测定以测试体内细胞的免疫原性。异种应答是对移植已知最急剧(steepest)的免疫屏障之一。由于异种反应性T细胞和介导急性异种排斥(xenorejection)的预形成的抗体的高频率和效力，免疫应答异常迅速地发生。有理由认为，如果细胞能克服异种反应，则有信心认为这些细胞也可以克服T1D患者中对β细胞的同种异体反应和自身免疫。因此，HLA-I-KO、HLA-I/II-KO和HM-KO细胞被移植到完全免疫活性C57B16/J小鼠中。在任何时间点，任何受体中均未观察到畸胎瘤生长。因此，HLA和NKG2D配体缺乏不足以跨越异种屏障。
实施例四
HLA缺陷型移植物中免疫逃避基因的表达允许畸胎瘤生长。
除了T细胞的直接识别外，许多其他因素也可介导排斥。例如，可以通过吞噬外源移植物的抗原呈递细胞间接引发CD4+T细胞。然后，这些间接引发的T细胞可以帮助B细胞产生针对外源目标的抗体应答。反过来，移植物反应性抗体可以引发巨噬细胞吞噬作用、NK细胞活化、和补体沉积，所有这些都可以导致移植物清除。表达的基因预计减轻这些移植排斥机制中的每种。生成了编码GFP标记物和Crry、CD55、CD59的小鼠直系同源物，和Kb-单链三聚体的单个慢病毒构建体。Crry、CD55和CD59抑制补体激活和沉积，并且Kb-单链三聚体与NK细胞上的抑制性Ly49C受体结合。转导了HM-KO细胞，使得约30％的细胞被任何给定的慢病毒感染。然后将细胞混合物移植到完全免疫活性C57B16/J小鼠中。8周后，2/5的小鼠显示了小而清晰的畸胎瘤(图3)。几只小鼠在监测期间也显示了短暂的生长。相反，在移植了亲本HM-KO细胞的任何时间点都没有检测到生长。这些数据表明，免疫逃避基因表达的组合可能使HM-KO细胞避免排斥并且在异种受体中生长。值得注意的是，在这些实验中未包括已被提出足以用于HLA-I缺陷型细胞的同种异体移植的CD47，并且因此CD47对于畸胎瘤生长不是必需的。
实施例五
免疫逃避基因表达不影响细胞分化。
为了扩展这些结果，发明人对这些慢病毒转导的HM-KO细胞进行了分类，使得100％表达Crry、CD59和Kb-单链三聚体。这些细胞中大约有一半也表达了CD55，并且在其他转导后，20％表达了CD47(图4)，CD47降低巨噬细胞的吞噬作用。这种细胞混合物称为HM-KO-Lenti细胞，使用自动化程序将HM-KO和HM-KO-Lenti细胞分化为胰腺β细胞。先前已显示HM-KO基因缺失不影响hESC H1的分化效率。在这里，进一步显示小鼠逃避基因(HM-KO-Lenti)的慢病毒过表达也不影响分化效率(图5)。
实施例六
源自最小免疫原性人干细胞的β细胞在野生型(WT)小鼠中持续存在。
据推测，将人细胞移植到完全免疫活性WT小鼠中将是更相关和更严格的测试，以确定这些细胞是否可以在临床上作为移植物存活。这些异种屏障代表相当大的挑战，并且可能超过了在T1D患者中替换β细胞时遇到的实际屏障。因此，假设如果细胞可跨过这个屏障，那么当移植到同时具有自身免疫和同种异体排斥屏障的患者中时，它们可能潜在地在体内存活。事实上，由于目前人源化小鼠模型(见上文)的局限性，这种异种屏障被认为是可以在体内测试这些细胞的免疫逃避能力的唯一有意义的方式。在本实验中，将源自HM-KO和HM-KO-Lenti细胞的100个干细胞来源的假胰岛皮下移植到6-8周龄的雌性小鼠(n＝4)中。作为阳性对照，还将100个假胰岛移植到免疫缺陷型NSG小鼠(n＝2)中。为了评估假胰岛的存活，在移植后1周，每个实验组处死一只小鼠。在移植有HM-KO-Lenti来源的假胰岛的小鼠中，移植物在移植部位清晰可见(图6A)，并且通过免疫组织化学(IHC)抗GFP抗体染色确认了它们的人类来源。移植后两个月，处死了剩余的小鼠。移植有HM-KO细胞的小鼠都没有可见的移植物；然而，移植有HM-KO-Lenti细胞的3只小鼠中有1只具有小而明确的移植物(图6B)。也通过GFP IHC确认了该组织的人干细胞来源(图6B)。图7显示了对GFP呈阴性的邻近乳腺的染色。这些数据表明，表达上述免疫逃避基因的一些组合允许异种排斥的持续逃逸。发明人对先前报道过这种结果的任何现有文献并不知晓。
实施例七
最小免疫原性人干细胞来源的β细胞在体内是有功能的。
移植有HM-KO和HM-KO-Lenti细胞的NSG小鼠在其血液中具有可检测到的人C肽，进一步证明了基因修饰不阻碍细胞分化(图8)。移植有任一类型细胞的WT小鼠在两个相对较早的测试时间点均未显示出显著的人C肽水平。正在确认这些移植物正如被移植到NSG小鼠体内的它们的对应物一样表达胰岛素。然而，对于WT小鼠中没有可检测到的人C肽最可能的解释是，相对于这些细胞移植物的免疫缺陷型受体，假胰岛的数量明显减少了。总之，数据表明，免疫逃避基因的某种组合允许移植物在免疫活性异种受体中持续存在，而缺乏这种理想组合的假胰岛仍可能被拒绝。
实施例八
重新设计的抗沉默AAVS1靶向构建体以表达免疫逃避和***基因。
虽然上述慢病毒研究有助于限定免疫逃避基因的必需组合，但这不是临床上可行的方法。慢病毒的随机整合可激活癌基因和/或沉默表达，从而导致免疫逃避丧失和移植物丢失。如果出现此类未预料到的不良事件，则包含可诱导***盒(如mTK和iCasp9)将允许药理学消除移植物。此外，表达必要的免疫逃避和***基因的限定基因座将避免随机整合和沉默的问题。几项研究已经报道了，位于PPPR12C的内含子区域的内源性AAV整合位点是人多能干细胞中外源基因表达的“安全港”。然而，已经显示了，所有报道的AAVS1构建体和Cas9/gRNA***都靶向可以高度甲基化的区域，而不是免于沉默的内源性AAV整合位点(图9A)。因此，产生了新的免疫逃避构建体以靶向这个更合适的位点(图9B)。在这些载体中，在暴露于更昔洛韦或AP1903时诱导细胞死亡的可诱导***基因mTK或iCasp9通过病毒2A序列与免疫逃避基因和耐药盒连接。此外，发明人还包括了A2UCOE绝缘子元件，以最小化转录沉默的机会。HM-KO细胞以及HUES2细胞(具有强内层胚分化潜能的替代HES细胞系)现在已被这些构建体靶向。结果显示，与较旧构建体相比，当用新构建体靶向时，更大部分的抗药性hES细胞表达免疫逃避基因(图9C)。即使在用较旧的AAVS构建体靶向抗新霉素的HM-KO细胞时，抗新霉素的HM-KO细胞也无法可检测地表达任何免疫逃避基因，但是当用较新的构建体转染时，这些细胞中的一部分保留了mCD59的表达(图9C)。HUES2细胞——单独的hES细胞系——保留了优于HM-KO细胞的免疫逃避基因的表达(图9C)。然而，即使在HUES2系中，较新的AAVS靶向盒也导致免疫逃避基因的更好表达(图9C)。发明人选择了耐药细胞，分选和扩增了表达免疫逃避盒的克隆，并且确认了它们在几个月内维持转基因的稳定表达(图9D)。还选择并且扩增了稳定表达这些免疫逃避基因的人同系物的HM-KO细胞。当这些表达人CD55、CD46和HLAE(Qal的同系物)单链三聚体的AAVS构建体转染到CHO或721.221细胞中时，NKG2A+NK细胞的补体沉积和脱粒显著减弱(图10A和图10B)，从而确认了这些目标构建体的功能。
实施例九
自动化β细胞分化方案的优化。
对于本研究，采用了与之前用于促进数据直接比较的相同分化方案，但与此同时，已经对β细胞分化方案进行了显著改进，导致NKX6.1表达超过90％并且5个细胞系的平均效率为84％(图11A)。代表性假胰岛的IHC染色显示了显著的胰岛素表达和分离的胰高血糖素表达(图11B)。实验设计(DoE)的显著努力进一步确定了成熟培养基条件，这些条件导致假胰岛在仅10天的成熟后，具有稳健的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)应答(图11C)。这将允许对基因组编辑的细胞系进行详细的功能表征和与未修饰的细胞进行比较。展望未来，将应用这些方案。
实施例十
使用修饰的干细胞治疗T1D。
基于本文呈现的结果，发明人寻求开发用于糖尿病细胞替代疗法的通用供体细胞。这将通过生成和确认逃避基因构建体的使用、在WT和NOD小鼠中进行原理实验的临床前证明、以及通过AAVS靶向产生稳定地表达选定的逃避基因构建体的新HM-KO细胞系来实现(图12)。
目标1.证明免疫逃避基因表达防止WT和NOD小鼠中对人干细胞来源的β细胞的排斥。
这将通过将一致地表达免疫逃避基因的细胞移植到WT小鼠中来实现。剩余的免疫屏障将经由抗体耗竭实验被限定。然后，NOD小鼠将被移植有一致地表达免疫逃避基因的细胞。
目标2.限定防止NOD小鼠中对人干细胞来源的细胞的排斥的最小基因组合。
这将通过体内选择测定来限定免疫逃避基因的功能必需类别而实现。也将通过限制慢病毒感染和体内竞争测定来限定免疫逃避基因的最小组合。将产生稳定地表达小鼠免疫逃避和可诱导***基因的组合的新HM-KO细胞系。将通过稳定表达人免疫逃避基因的HM-KO细胞的体外测定来测试免疫原性。
基本原理
T1D是由复杂的自身免疫反应引起的。T1D是自身免疫性障碍，其中T细胞消除朗格罕胰岛中产生胰岛素的胰腺β细胞。通过人类遗传学、移植、尸体研究、和稳健的T1D小鼠模型的结合，现在对β细胞的自身免疫破坏背后的机制有了很多了解。HLA-DQβ的特定等位基因容易诱发T1D，强烈暗示CD4+T细胞与疾病发作有关。携带I-Ag7的类似MHC II等位基因的小鼠也发展为自发性T1D，呈现许多与HLA-DQ相同的肽并且模仿人疾病的关键方面。在人T1D中，许多胰腺***T细胞对胰岛素本身有反应。在NOD小鼠中，通过胰岛素突变来防止T1D，使得抗原肽不能在MHC II上呈递。第一胰岛素反应性CD4+T细胞浸润胰腺并且引流***，以与特化的巨噬细胞群和呈递抗原性胰岛素肽的交叉呈递的树突状细胞相互作用。当这些CD4+T细胞被局部激活，自身免疫应答就逐步变得更复杂。CD4+T细胞浸润之后是自身反应性CD8+T细胞浸润，伴随着胰岛素反应性B细胞和抗体。尽管胰岛素反应性细胞占主导地位，但CD4+和CD8+T细胞识别的自身抗原数量开始扩散，最终涵盖数百种自身肽。这些自身反应的淋巴细胞和抗体在胰腺β细胞被破坏后仍然长时间存在，使得即使是来自非糖尿病同卵双胞胎的胰岛移植也被排斥。因此，对β细胞的预存在的免疫应答是异常复杂的，并且代表了基于多能干细胞(PSC)的替代疗法的主要障碍。
多能干细胞是可移植的β细胞的可规模化来源。尽管已经建立了控制T1D的护理标准(通过每日注射胰岛素)，但迄今为止尚未开发出治愈方法。具有里程碑意义的研究已经证明，胰岛移植的尸体捐赠恢复β细胞功能并且逆转受体中的T1D。由于胰腺器官捐赠的短缺，除了免疫抑制疗法带来的副作用外，已经做出了巨大的努力来从替代和可规模化的来源产生β细胞。人PSC的定向分化代表了这些方法中最先进的方法，因为这些细胞可以在培养中无限扩增，从而提供可移植到大的群体的可靠β细胞来源。现在存在几种稳健的方案来从人PSC中开发大量β细胞。重要的是，已显示这些细胞可以在糖尿病动物模型中恢复正常的血糖水平。然而，T1D患者中移植β细胞的植活和持续存在的自身免疫和同种异体免疫障碍尚未被解决。鉴于此类程序的候选患者必然将排斥他们自己的β细胞，因此必须开发策略以允许多能干细胞来源的替代移植物，从而避免类似的免疫清除。由于对于大多数T1D患者来说不太可能接受全身免疫抑制疗法，因此可选的方法是对移植物进行基因修饰以逃避宿主免疫应答。这种方法的增加的优势将是创建“通用”供体细胞系，从而显著降低细胞替代疗法的成本。
在克服T1D免疫障碍方面取得了前所未有的进展。最近的研究报道了通过基因修饰降低人ES细胞的免疫原性。然而，这些努力已被限制到相对少数主要聚焦于HLA-I表达的免疫识别途径。这些努力不太可能覆盖预先存在移植的T1D中应答的广度。这些研究中的一个通过表达HLA-E(非多态性非经典HLA-I分子)进行了其他修饰。HLA-E与NK细胞上的抑制性NKG2A相互作用，代表了吸引人的第一种方法。然而，只有约20-50％的NK细胞典型地表达NKG2A。因此，HLA-E的表达极不可能克服HLAI缺陷型细胞的其他免疫屏障。第二项研究报告了在HLA缺陷型人源化小鼠模型中，ES细胞中CD47的过表达足以克服同种异体障碍。尽管很有趣，但是CD47过表达介导免疫逃避的机制尚不清楚。提出了自然杀伤(NK)细胞逃避，但NK细胞是对移植排斥不是必要的并且不表达CD47的配体Sirpa。第三项研究测试了更广泛的分子，包括HLA-G和PD-L1；然而，由此产生的细胞仅在人源化小鼠模型中进行了测试，已经显示这些细胞在反映正常免疫应答的能力方面非常有限。总之，这些努力似乎不足以限定基于多能干细胞的替代疗法的T1D免疫屏障。相反，免疫应答的多个方面——包括直接T细胞识别、吞噬作用和间接抗原呈递、抗体效应器功能、和NK细胞识别——的更全面消除，提供了更多希望。实际上，本文描述的观察——细胞亚群和移植物可在异种受体中存活——是前所未有的。
干细胞的基因工程能够安全和可持续地超越T1D免疫屏障。正如初步数据将预测的那样，在克服了NOD小鼠中的异种和自身免疫屏障后，下一步将是限定克服这些屏障的最小必需组分。对于此有几个原因。首先，免疫逃避基因的过度表达可能容易诱发移植物被机会性病原体感染，或因缺乏免疫监视的肿瘤发生。此外，抗吞噬基因的过度表达可能限制垂死细胞的正常清除，导致旁观者炎症和免疫病理学。其次，如果这些非免疫原性细胞和移植策略要进入临床，限定待表达的必需基因的最小组合可能简化监管审批过程。CRISPR基因组编辑将用于对H1 hES细胞进行上述的靶向突变。此外，将在每轮之间进行全基因组测序，以确保没有出现有害突变。因为慢病毒可以通过传代和分化而变得沉默，并且因为这些载体可以整合到原癌基因中，所以免疫逃避基因将在限定的基因座上表达。因此，目标2中限定的免疫逃避基因的最小组合将与抗沉默AAVS1靶向盒中的可诱导***基因一起表达。如果意外的不良事件发生，则这些***基因可能对消除移植物很重要。
研究设计和方法
目标1.证明免疫逃避基因表达防止WT和NOD小鼠中对人干细胞来源的β细胞的排斥。
将一致表达免疫逃避基因的β细胞移植到WT小鼠中。
本文的数据表明，HM-KO-Lenti细胞中的免疫逃避基因表达可至少部分地避免异种移植排斥。如上所述，只有一半的移植细胞表达了CD55，并且只有20％的这些移植细胞表达了CD47(图4)。因此，移植物仅部分持续存在的可能原因是只有-10％的输入HM-KO-Lenti细胞表达了所有5种免疫逃避基因。此外，在ES细胞传代和分化期间，一定程度的慢病毒沉默是不可避免的。因此，发明人已经开始针对那些除了Crry、CD59和Kb-单链三聚体之外表达CD55和CD47的细胞分选HM-KO-Lenti细胞。这些细胞和对照HM-KO将分化为β细胞，并且平行移植到免疫活性C57B16/J和免疫缺陷型NSG小鼠中。人C肽的血清水平将在8-12周的过程中被量化。在最后一周，将对小鼠进行葡萄糖耐量试验，处死小鼠，并且对假胰岛进行切片。将量化剩余移植物中的GFP和胰岛素表达，并且用IHC评估宿主来源的细胞向移植物中的浸润。每次分化后，将使HM-KO-Lenti和未修饰的对照假胰岛经受详细的功能和组成评估，以确保基因修饰不对β细胞功能产生不利影响。
经由抗体耗竭实验限定剩余的免疫屏障。
如果相对于NSG受体，在C57B16/J受体中观察到较少的假胰岛和人C肽，发明人将进行抗体耗竭和基因实验，以定义剩余的免疫屏障。在移植HM-KO-Lenti细胞前一天，将通过耗竭针对CD4和CD8的抗体以移除T细胞、NK1.1抗体以消除NK细胞、CD20抗体以耗竭β细胞、或CSF1阻断抗体以消除巨噬细胞和单核细胞，来处理C57B16/J受体。平行地，C3-/-补体缺陷型受体将移植有HM-KO-Lenti来源的β细胞。如上所述，将随着时间的推移测量血清C肽水平，并且量化假胰岛的持续存在。如果需要T细胞和/或CSF1耗竭以允许移植物持续存在，则发明人将进一步用编码PDL1和CD24的病毒转导HM-KO-Lenti细胞。除了直接抑制T细胞外，PDL1还阻止吞噬作用和通过巨噬细胞将抗原呈递给T细胞；CD24发挥类似的作用。如果移植物排斥需要NK细胞，发明人将表达Qa1-单链三聚体，其接合NK细胞上的抑制性NKG2A受体。此外，发明人将消除NKG2D配体的ULBP家族，以进一步减弱NK细胞活化。最后，如果CD20消除和/或C3缺陷允许移植物接受，则发明人将在HM-KO-Lenti细胞上表达CR1。CR1是非常有效的补体激活抑制剂，比Crry、CD55和CD59具有更高的效率和更快速的动力学。在这些抗体耗竭实验的指导下，一旦表达其他免疫逃避基因，将如上所述在C57B16/J小鼠中进行β细胞移植实验。
将一致表达免疫逃避基因的β细胞移植到NOD小鼠中。
在最大化免疫活性小鼠中的植入时，发明人将提高测定的生物学严格性。在临床情况下，仅将β细胞移植物给予患有活性T1D的患者。在这种情况下，预形成的β细胞反应性抗体、记忆T细胞、和相关的炎症状况将预先存在于移植物中。在小鼠中，这种情况在NOD小鼠中被最好地模拟。诸如胰岛素本身的自体抗原在小鼠和人类之间高度保守，这使得NOD小鼠中的抗体很可能与人β细胞移植物发生交叉反应。此外，移植物来源的抗原的间接呈递可导致进一步的T细胞活化、炎症、和移植物丢失。为了测试这些可能性，发明人将使用上述限定的HM-KO-Lenti细胞的最佳组合来产生β细胞。这些细胞将被移植到获自杰克逊实验室(Jackson Labs)的8周龄的雌性NOD小鼠中。这些小鼠在30周龄时可靠地发展为T1D，其中早在4周时就出现胰腺免疫浸润和胰岛素抗体。移植后，将监测血清人C肽和葡萄糖水平。预期HM-KO-Lenti来源的移植物将持续存在，产生人胰岛素并且预防T1D。
预期结果。
预期表达CR1、CD55、CD47、CD59、Crry、Qal-和Kb-单链三聚体、PDL1和CD24的HM-KO来源的β细胞将有效地移植并且持续存在于C57B16/J和NOD小鼠中。预期这些移植物将抵抗NOD小鼠中的自身免疫排斥；因此，这些移植物的受体不显现T1D。
目标2.限定防止NOD小鼠中对人干细胞来源的细胞的排斥的最小基因组合。
通过体内选择测定来限定免疫逃避基因的功能必需类别。
发明人将采用***方法来识别和排除非必需免疫逃避基因。发明人将首先将基因分类为如表1所示的功能不同的类别。将用这些基因的特定组合转导H1 hES细胞、HLA-I缺陷型细胞、HLA-I/II缺陷型细胞、和HM-KO细胞，使得一种功能类别被排除。例如，将用除CD47、PDL1和CD24之外的所有上述免疫逃避基因转导HM-KO细胞，以确定防止吞噬作用的重要性。其他多能干细胞将被转导有除Qa1-和Kb-单链三聚体之外的所有免疫逃避基因，以测试NK细胞介导的排斥的重要性。这些细胞池将混合在一起并且分化为β细胞。将分离小的假胰岛样本，并且通过流式细胞术测试每个细胞池的相对贡献。剩余的假胰岛将被移植到NOD小鼠中。在移植后8周，将回收移植物，并且将相对于移植前频率对细胞的每个慢病毒池的表示进行量化。通过这些测定，将限定对移植物持续存在和免疫逃避必需的基因类别。
表1.免疫逃避途径和基因
途径/抑制的细胞类型 基因
NK细胞 Qa1/HLA-E单链三聚体、K<sup>b</sup>/HLA-G单链三聚体
补体和抗体 CR1、CD46/Crry、CD55、CD59
吞噬作用和T细胞致敏(priming) CD47、PDL1、CD24
通过限制慢病毒感染和体内竞争测定来限定免疫逃避基因的最小组合。
当发明人已经限定了逃避异种排斥所必需的基因的功能类别，他们将限定该类别中的必需基因。例如，如果发现补体逃避对于植入和持续存在是必需的，则发明人将首先慢病毒表达除CR1、Crry、CD55和CD59之外的所有免疫逃避基因。然后将用每个单独的补体逃避基因转导这些细胞，使得约30％被感染。这个细胞池将分化为细胞，通过流式细胞术分析这些补体逃逸基因的表达，并且移植。如上所述，发明人将量化表达这些补体逃避因子的细胞的富集和损失。例如，如果表达CR1的细胞在移植后相对于输入细胞被富集，但表达Crry的细胞没有，则可以得出结论，CR1是必需的，而Crry不是。通过这个迭代过程，发明人将限定待表达的免疫逃避基因和待突变的HLA/NKG2D配体基因的最小组合，以允许移植物持续存在。
通过AAVS靶向生成稳定表达小鼠免疫逃避和诱导***基因的最佳组合的新的HM-KO细胞系。
如上所述，慢病毒过表达不是表达免疫逃避或***基因的临床可行解决方案。相反，利用来自这些慢病毒实验的信息，发明人将使用CRISPR基因组编辑来生成如图9所示的AAVS1靶向构建体，AAVS1靶向构建体表达小鼠免疫逃避基因、新霉素抗性盒、和HSV胸苷激酶或iCasp9中的任意一个的可诱导***基因——所有这些都通过核糖体跳跃病毒2A序列连接在一起——的最小组合。如图9所示，这些靶向构建体将与Cas9和靶向正确AAVS基因座的gRNA一起转染到HM-KO细胞中。将选择新霉素抗性细胞，并且将对稳定表达小鼠免疫逃避基因的细胞进行克隆分选和扩增。在核型分析和外显子组测序以确认不存在致癌突变后，发明人将这些多能干细胞分化成细胞并且移植到8周龄的NOD雌性小鼠中。将随时间测量葡萄糖和人C肽的血清水平，以确认AAVS靶向细胞的行为与慢病毒转导的细胞相似。
通过对稳定表达人免疫逃避基因的最佳组合的HM-KO细胞进行体外测定来测试免疫原性。
对于此点，所有的测定都聚焦在小鼠异种移植上，作为免疫逃避的体内测量物(量度，measure)。然而，在同种异体移植的实际临床环境中，屏障可能不同。这难以完全建模，但可以使用一组相关的体外测定以获得对策略的进一步信心。将通过AAVS1靶向产生表达必需免疫逃避基因的人同系物的HM-KO细胞。这些细胞将分化成细胞并且用于体外免疫识别测定。
预期的结果。
预期每个免疫逃避功能类别中的1-2个基因对于移植物的持续存在将是必需的。发明人期望将通过AAVS1靶向稳定表达这些基因和可诱导***盒，这将阻止体内和体外的免疫识别。进一步，预期在表达人类免疫逃避基因的HM-KO细胞中，免疫识别的体外测量物将急剧减少。
实施例十一
CR1和/或CD24在干细胞和多种衍生组织中改善免疫逃避的能力。
目标
测试CR1和/或CD24在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中改善免疫逃避的能力，其中HLA-I和HLA-II表达减少以及CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体表达增加。
实验1
CR1和/或CD24将在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中表达增加，其中HLA-I和HLA-II表达减少以及CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体表达增加。将进行体外测定，以评估CR1通过经典的抗体依赖性途径减少补体沉积的能力，以及CD24减少巨噬细胞对抗体包被细胞的吞噬作用的能力。
实验2
CR1和/或CD24的表达将在干细胞和各种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；视网膜色素上皮细胞。星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中表达增加，其中HLA-I和HLA-II表达减少以及CD47、CD55、CD46(Crry)、CD59、和HLA-E-单链三聚体(Qal)的小鼠同系物表达增加。对于小鼠实验，HLA-G单链三聚体(Kb-单链三聚体)将被包括在内。将评估这些细胞在移植到免疫活性的WT C57BL6小鼠后的存活以及CR1和/或CD24对各自组织的存活和功能的影响。
预期结果
CR1和/或CD24将增加免疫逃避能力，从而增加异种移植组织的存活。重复体外测定。
实施例十二
CR1和/或CD24替换免疫因子的能力。
目标
测试CR1和/或CD24在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中替换以下因子中的任何一种的能力：CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体，其中HLA-I和HLA-II表达减少，同时在体内移植到免疫活性WT C57BL6小鼠后维持或改善存活和功能。
实验1
CD24的表达将在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中增加，其中HLA-I和HLA-II表达减少以及CD55、CD46(Crry)、CD59和HLA-E-单链三聚体(Qal)的小鼠同系物(无CD47-吞噬作用)表达增加，并且将评估这些细胞在移植到免疫活性WT C57BL6小鼠后的存活以及CR1和/或CD24对各自组织的存活和功能的影响。
实验2
CR1的表达将在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中增加，其中HLA-1和HLAII表达减少以及CD47、CD46(Crry)和HLA-E-单链三聚体(Qal)的小鼠同系物(无CD55、CD59-补体)表达增加，并且将评估这些细胞在移植到免疫活性WTC57BL6小鼠后的存活以及CR1和/或CD24对各自组织的存活和功能的影响。
预期结果
在没有这些因子CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体的不同组合的情况下，CR1和/或CD24将能够在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中诱导免疫逃避。特别地，发明人特别期望CR1能够替换因子CD55、CD46、和/或CD59并且CD24替换CD47。重复体外测定。
实施例十三
CR1和/或CD24替换免疫因子的能力。
目标
测试CR1和/或CD24在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中替换以下因子中的任何一个的能力：CD47、CD55、CD46、CD56和HLA-E-单链三聚体，其中HLA-I和HLA-II表达减少，同时在体外补体沉积和吞噬作用测定后维持或改善存活和功能。
实验1
CD24的表达将在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；视网膜色素上皮细胞。星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中增加，其中HLA-I和HLA-II减少表达以及CD55、CD46(Crry)、CD59和HLA-E-单链三聚体(Qal)的小鼠同系物(无CD47-吞噬作用)表达增加。将进行体外测定以评估CD24减少巨噬细胞对抗体包被细胞的吞噬作用的能力。
实验2
CR1的表达将在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中增加，其中HLA-I和HLA-II表达减少以及CD47、CD46(Crry)、和HLA-E-单链三聚体(Qal)的小鼠同系物(无CD55、CD59-补体)表达增加。将进行体外测定以评估CR1通过经典的抗体依赖性途径减少补体沉积的能力。
预期结果
在没有这些因子CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体的不同组合的情况下，CR1和/或CD24将能够在干细胞和多种衍生组织(包括但不限于：小胶质细胞；视网膜色素上皮细胞；星形胶质细胞；少突胶质细胞；肝细胞；足细胞；角质形成细胞；心肌细胞；多巴胺能神经元；皮层神经元；感觉神经元；NGN2定向神经元；中间神经元；基底前脑胆碱能神经元；胰腺β细胞；神经干细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞；肺细胞谱系；肾细胞谱系；血细胞谱系)中诱导免疫逃避。特别地，发明人期望CR1能够替换因子CD55、CD46、和/或CD59并且CD24替换CD47。重复体外测定。
尽管本发明已参照上述实施例进行了描述，但应理解修饰和变化涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由以下权利要求限制。

Claims (32)

1.产生干细胞(SC)的方法，包括：
a)修饰SC，以相对于野生型SC的HLA-I、HLA-II或其组合减少表达；和
b)引入外源构建体，以表达包括CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体中的一种或多种的免疫逃避基因。
2.权利要求1所述的方法，其中所述免疫逃避基因包括CR1和CD24。
3.权利要求1所述的方法，其中所述免疫逃避基因包括CR1、CD24以及CD46、CD47、CD55、CD59和HLA-E-单链三聚体中的一种或多种。
4.权利要求1所述的方法，其中所述免疫逃避基因包括CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59和任选地HLA-E-单链三聚体。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括引入外源构建体以表达PDL1和HLA-G-单链三聚体中的一种或多种。
6.权利要求1所述的方法，其中HLA-I的表达通过消除TAP1或β2M的表达而降低。
7.权利要求1所述的方法，其中HLA-II的表达通过消除CD74和CIITA的表达而降低。
8.权利要求1所述的方法，其中修饰包括使用CRISPR/Cas9靶向突变的基因组编辑。
9.权利要求1的方法，其中引入外源构建体是通过慢病毒转导进行的。
10.权利要求1所述的方法，其中引入外源构建体是使用腺相关病毒(AAV)构建体进行的。
11.权利要求10所述的方法，其中所述AAV构建体是修饰的AAVS构建体，所述AAV构建体靶向位于PPPR12C的内含子区域中的内源性AAV整合位点。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括将所述SC分化为β细胞。
13.通过权利要求1至11中任一项所述的方法产生的干细胞(SC)。
14.权利要求13所述的SC，其中：
(i)HLA-I和HLA-II的表达被消除；和
(ii)所述SC表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体中的一种或多种。
15.权利要求14所述的SC，其中所述SC进一步表达PDL1和HLA-G-单链三聚体。
16.权利要求13至15中任一项所述的SC，其中所述SC是小鼠或人SC。
17.权利要求16所述的SC，其中所述SC是胚胎SC或诱导多能SC。
18.用权利要求13至17中任一项所述的SC、或权利要求13至17中任一项所述的SC的后代治疗需要其的受试者中的疾病或障碍的方法。
19.权利要求18所述的方法，其中所述疾病或障碍是自身免疫性疾病或神经退行性疾病。
20.权利要求18所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
21.权利要求18所述的方法，其中所述疾病或障碍是1型糖尿病。
22.权利要求12所述的方法产生的β细胞。
23.治疗受试者中1型糖尿病(T1D)的方法，包括向所述受试者施用权利要求22所述的β细胞，从而治疗所述受试者中的T1D。
24.干细胞(SC)，其中：
(i)HLA-I和HLA-II的表达被消除；和
(ii)所述SC被基因修饰以表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和HLA-E-单链三聚体中的一种或多种。
25.权利要求24所述的SC，其中所述SC被进一步基因修饰以表达PDL1和HLA-G-单链三聚体。
26.权利要求24至25中任一项所述的SC，其中所述SC是小鼠或人SC。
27.权利要求26所述的SC，其中所述SC是胚胎SC或诱导多能SC。
28.源自根据权利要求24至27中任一项所述的SC的细胞系。
29.权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括使所述SC分化以产生分化的细胞或组织。
30.权利要求29所述的方法，其中所述细胞或组织选自小胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、足细胞、角质形成细胞、心肌细胞、多巴胺能神经元、皮层神经元、感觉神经元、NGN2定向神经元、中间神经元、基底前脑胆碱能神经元、胰腺β细胞、神经干细胞、自然杀伤细胞、调节T细胞、肺细胞谱系、肾细胞谱系和血细胞谱系。
31.通过权利要求29所述的方法产生的细胞或组织。
32.权利要求31所述的细胞或组织，其中所述细胞或组织选自小胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、足细胞、角质形成细胞、心肌细胞、多巴胺能神经元、皮层神经元、感觉神经元、NGN2导向的神经元、中间神经元、基底前脑胆碱能神经元、胰腺β细胞、神经干细胞、自然杀伤细胞、调节T细胞、肺细胞谱系、肾细胞谱系和血细胞谱系。
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