CN115078738A - 一种l1cam蛋白n979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的应用 - Google Patents

一种l1cam蛋白n979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的应用，涉及生物医药技术领域。一种检测L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平的试剂在制备诊断肝癌转移可能性的产品中的应用。本发明还提供一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明研究发现可通过检测L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平预测肝癌转移的可能性。本发明针对L1CAMN979位点及该位点糖基化修饰设计了一种siRNA，可以通过使L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化下调，从而抑制肝癌细胞转移。

Description

一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的应用。
背景技术
L1CAM(CD171)是免疫球蛋白(Ig)超家族的200-220kDa跨膜高度糖基化蛋白，由六个Ig样结构域和五个纤连蛋白III型重复序列组成，构成一个跨膜区和一个高度保守的细胞质尾部。L1CAM拥有21个潜在的N-糖基化位点，位于外域的Ig结构域和FNIII结构域。L1CAM是神经细胞粘附分子(CAM)L1家族密切相关的原型成员。该家族包括脊椎动物中的四个不同成员：L1CAM、L1的密切同源物(CHL1)、NrCAM和Neurofascin。虽然最初在小鼠中鉴定发现，但同源蛋白存在于人类(L1CAM)、鸡(NgCAM)、大鼠(NILE)和果蝇(Neuroglian)中。L1CAM因其在神经发育中的作用而广为人知。已知作用包括调节神经树突生长、成束、细胞粘附、细胞迁移、髓鞘形成和细胞存活等过程。除神经***之外，研究也揭示了L1CAM在胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和肝癌中的异常表达。肿瘤细胞利用L1CAM调节细胞粘附、迁移的作用来增强细胞的迁移侵袭能力。而这些作用主要取决于L1CAM可以以顺式(在同一质膜内)或反式(在相邻细胞上)与各种分子相互结合。L1CAM能够与自身(同源性)或异源性与其他神经细胞粘附分子、整合素、CD24、neurocan和神经纤毛蛋白结合。L1CAM的细胞质尾部可以与细胞骨架蛋白锚蛋白、肌动蛋白、血影蛋白和ezrin蛋白相互作用，它们通过内吞作用控制其在膜上的表达，介导与细胞骨架的相互作用，并激活下游信号通路。除了作用于膜结合通路外，L1CAM蛋白受几类酶介导而裂解。这几类蛋白酶包括解聚素和金属蛋白酶10(ADAM10)、ADAM17或基质金属蛋白酶16(MMP-16)、β-分泌酶1(BACE1)、纤溶酶和髓鞘碱性蛋白(MBP)。纤溶酶在第三个FNIII结构域内的两个位点K842或K845上进行切割，产生140kDa的可溶性片段和80kDa的细胞内片段。而BACE1在Y1086和E1087之间切割L1cam，产生约180kDa的可溶性片段，其中包含大部分细胞外结构域，包括所有Ig结构域和五个FNIII结构域。ADAM10和ADAM17裂解L1CAM的位置邻近于跨膜结构域的BACE1裂解位点。纤溶酶的切割会损害L1CAM促进血管共同选择和转移性生长的能力。而ADAM10裂解生成的可溶性L1CAM片段促进了癌细胞的侵袭或迁移。
肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌类型，与预后不良有关。它是肝硬化患者最常见的死亡原因，并且在不同的研究中被证明是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。每年，大约有50万人被诊断出患有HCC。近几十年来，由于早期诊断和治疗的病例越来越多，HCC患者的预后得到了改善，但肝外转移仍是预后不良的因素。晚期肝细胞癌最常见的转移部位是肺(44％)，门静脉(35％)和门静脉***(27％)。此外，腹内***和骨骼也是常见部位。这些转移通常发现于肿瘤晚期阶段。转移性肝癌在很大程度上仍然是一种无法治愈的疾病。确定肝癌转移的决定性因素是有效控制肿瘤进展的关键步骤。异常糖基化通常被视为癌症的标志，不仅是结果，也是恶性表型的驱动因素，是直接影响肿瘤进展和转移的关键过程。研究发现异常糖基化影响了机体包括细胞粘附、运动、侵袭和免疫逃避等一系列生物学过程。糖基化受糖基转移酶和糖苷酶对糖蛋白的作用控制。糖基转移酶和糖苷酶在癌症中的差异表达会产生位点特异性异常糖基化的蛋白。这些糖蛋白的位点特异性糖链信息中具有特定的癌症相关特征。目前，少有关于位点特异性糖链特征信息的***性研究。迄今为止对癌症的糖基化蛋白质组学研究缺乏精确定位的异常聚糖基序以及相关糖蛋白探索。由于糖基化分析困难和生物合成途径复杂等问题，糖基化仍然是癌症生物学中未被充分研究的部分。
发明内容
本发明的目的是提供一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的siRNA可以抑制FUT8表达，从而抑制L1CAM蛋白上的岩藻糖基化，进而减少肝癌细胞迁移和侵袭。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平的试剂在制备诊断肝癌转移可能性的产品中的应用。
进一步地，所述L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平上调，肝癌转移可能性增加。
本发明还提供一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
进一步地，所述抑制剂为如SEQ ID NO.1-2所示的siRNA。
进一步地，所述药物为抑制肝癌转移的药物。
进一步地，所述抑制肝癌转移是通过抑制FUT8的表达实现
本发明公开了以下技术效果：
本发明研究发现，可通过检测L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平预测肝癌转移的可能性，并且L1CAM N979位点特异性核心岩藻糖基化下调对转移性肝癌细胞具有抑制转移作用。本发明针对L1CAM N979位点及该位点糖基化修饰设计了一种siRNA和质粒突变体pL1CAM(N979Q)-FLAG。该siRNA，可以将肝癌细胞中的FUT8敲低，从而使得L1CAM上核心岩藻糖基化减少，进而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力；该质粒突变体pL1CAM(N979Q)-FLAG，与野生型质粒相比，具有相同蛋白量的N979位点突变L1CAM的过表达没有显示出促进97L细胞的转移作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同转移性HCC细胞系的蛋白质组和N-糖基化蛋白质组的大规模定量分析；其中，a为实验工作流程，b为分别从蛋白质组学(Proteins)和完整N糖肽(Intact N-glycopeptides)定量实验中定量到的蛋白质和完整糖肽的数量(深色条表示在两个以上重复中定量到的蛋白质/糖肽的数量)，c为关于6435个可靠定量的完整N糖肽的信息，d和e分别为三种细胞系中差异蛋白和完整糖肽的火山图，f和g分别是用于定量蛋白质和完整糖肽的四次重复方框图，h和i分别是三种细胞系之间差异蛋白和差异完整糖肽的主成分分析(PCA)图；
图2为三种细胞系中蛋白质组定量结果的高重复性；其中a为正态分布拟合线，b为不同重复之间蛋白质组定量比的相关性热图；
图3为三种细胞系中完整糖肽定量结果的高重复性；其中a为正态分布拟合线，b为不同重复之间完整糖肽定量比的相关性热图；
图4为随着三种HCC细胞系转移潜能的增加，L1CAM N979位点特异性核心岩藻糖基化上调；其中a为三种HCC细胞系中L1CAM的位点特异性N糖基化，b为位于L1CAM特定位点和结构域的五个已识别糖位点的图形视图，左6个条形块代表Ig样C2型，右5个条形块代表纤连蛋白III型，c为三种HCC细胞系中L1CAM蛋白、L1CAM N979位点特异性糖链Hex[5]HexNAc[4]NeuAc[1]Fuc[1](L1CAM-N979-5411)和蛋白FUT8，随着转移潜能的变化而改变的趋势，d为三种HCC细胞系中L1CAM和FUT8的蛋白质表达水平的蛋白质印迹验证，e和f分别为三种HCC细胞系中的L1CAM和FUT8的蛋白表达水平；
图5为未进行和进行蛋白质丰度标准化的完整糖肽分析结果；其中a和b分别是差异完整糖肽的火山图，c和d是四次重复用于定量完整糖肽的箱形图，e不同HCC细胞系中，在未进行或进行L1CAM蛋白丰度标准化后L1CAM N979位点岩藻糖基化的变化；
图6为L1CAM N979位点是HCC转移的潜在调节剂的体外验证；其中a中左图是过表达对照载体Vector、L1CAM-OE和L1CAM-N979Q在97L细胞中L1CAM水平的蛋白质印迹实验结果，右图是蛋白质印迹结果的定量分析(ImageJ测定灰度值，bar图代表目标条带/内参条带)；b中左图是97L过表达细胞(对照载体Vector，L1CAM-OE和L1CAM-N979Q)的划痕实验测定，用倒置显微镜(10×)检测细胞的划痕区域，右图是划痕实验的伤口愈合百分比统计；c和d的显微图是Transwell迁移试验和基质胶侵袭试验(比例尺＝100μm)，柱形图是迁移(c)和侵袭(d)的细胞数量统计；显示的数据代表三个独立实验，并表示为平均值±SD；P值由双尾非配对t检验确定，与对照(n＝3)相比，***p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；c和d中的比例尺均为100μm；
图7为L1CAM N979位点特异性岩藻糖基化对HCC转移的潜在调节作用的体外验证；其中a中上图是阴性对照(siCtrl)和FUT8 siRNA(siFUT8)转染的97L细胞中L1CAM水平的Western印迹，下图是蛋白质印迹结果的定量分析(ImageJ测定灰度值，bar图代表目标条带/内参条带)；b是Ctrl或FUT8 siRNA转染的97L细胞裂解物的凝集素富集，然后用L1CAM抗体进行蛋白质印迹，Input显示FUT8敲低对L1CAM的表达没有影响；图中的PSA和LCA代表用于特异性富集核心岩藻糖基化糖蛋白的琼脂糖结合的豌豆凝集素和琼脂糖结合的扁豆凝集素；c中左图为97L敲低细胞(siCtrl和siFUT8)的划痕实验，用倒置显微镜(10×)检测细胞的划痕区域，右图为划痕实验的伤口愈合百分比统计；d和e中显微图是Transwell迁移试验和基质胶侵袭试验(比例尺＝100μm)，柱形图是迁移(d)和侵袭(e)的细胞数量统计；与对照(n＝3)相比，***p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，肝细胞癌细胞系Hep3B、97L和LM3受赠于中山医院：
实例1L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化在评估诊断肝癌转移潜能中的应用
(1)实验方法
a.HCC细胞系的细胞培养。
肝细胞癌97L和LM3细胞系在添加了10％胎牛血清(FBS，Gibco，Grand Island，NY，USA)和10U/mL青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，HyClone，Logan，UT，USA)(Gibco by Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的培养。肝细胞癌Hep3B细胞系培养于含10％FBS及1％双抗的Minimum Essential Medium培养基中。培养环境为37℃的加湿5％CO2培养箱。
b.HCC细胞系的SILAC样品制备
SILAC标记采用三种肝细胞癌细胞系Hep3B、97L和LM3。含有DMEM并添加10％FBS的K0R0培养基用作标记97L的轻标培养基。K4R6培养基含有含有L-赖氨酸(D4，99％)和L-精氨酸(13C6，99％)并辅以10％FBS的DMEM，用作标记Hep3B的中标培养基。K8R10培养基含有DMEM和L-赖氨酸(13C6，99％；15N2，99％)和L-精氨酸(13C6，99％；15N4，99％)，辅以10％FBS，用作标记LM3的重标培养基。Hep3B、97L和LM3细胞分别分成独立的盘子，每个盘子分别包含各自标记培养基。细胞在加湿的5％CO2培养箱中于37℃培养。当细胞>80％生长密度时，用PBS冲洗细胞，用胰蛋白酶/EDTA消化细胞，然后将细胞分成新的培养皿。三种细胞系分别在各自标记培养基中完成八次细胞***的生长。SILAC标记后，收集三种细胞。分别从盘子中取出培养基，用预冷的PBS清洗两次，然后完全去除PBS。将细胞收集在试管中并在含有蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，1mM Cocktail)的五倍体积裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris/HCl，pH 8.0)中裂解，然后在100℃下煮沸10min，超声处理20min并在18℃下以12000g离心30min以收集蛋白质提取物。蛋白质浓度采用BCA法测定。然后将从三个细胞系中提取的蛋白质以1：1：1的比例(质量比)混合。将蛋白质混合物在10mM二硫苏糖醇中于37℃还原1小时，然后在室温下用20mM碘乙酰胺在黑暗中烷基化30min。之后，加入六倍体积的预冷丙酮，在-20℃下沉淀蛋白质至少3小时。在用50mM NH4HCO3稀释10倍后，将沉淀物溶解在变性缓冲液(50mM NH4HCO3中的8M尿素)中。将胰蛋白酶添加到最终酶与底物的比例为1：50(w：w)并在37℃下孵育过夜。加入终浓度为0.5％的三氟乙酸终止反应。最后，将所有消化物以16000g离心10min，并使用Sep-Pak C18小柱对上清液进行脱盐。然后将脱盐的肽冻干用于后续处理。
酶解产物通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)使用Waters UPLC***与HILIC柱(Welch，Ultimate HILIC Amide，4.6×250mm，5μm)进行分级分离。将酶解产物重新溶解在A相中(10mmol/L甲酸铵，H2O，pH4.5，FA调节pH)。梯度如下：100％B(75％ACN和10mmol/L甲酸铵)5min，100-90％B 3min，90-40％B 56min，40-20％B 3min，在0.1min内返回100％B，并保持到梯度结束。流速为1mL/min，柱温保持在45℃。收集从第4min开始到第70min，依次为1min，并按以下条件合并：馏分1(1-11)、馏分2(12-19)、馏分3(20-27)、馏分4(28-35)、馏分5(36-43)、馏分6(44-51)、馏分7(52-59)和馏分8(60-67)。然后，将每个洗脱分级物脱盐并分成两部分。一部分用于蛋白质组鉴定和定量的LC-MS/MS分析。另一部分用于糖肽富集和完整糖肽鉴定和定量的LC-MS/MS分析。
c.糖肽富集
通过两性离子亲水相互作用液相色谱(ZIC-HILIC)方法富集糖肽。简而言之就是将500μg-1mg的脱盐肽重悬于含有80％ACN和1％TFA的300μL上样缓冲液中，然后上样到含有50mg ZIC-HILIC颗粒(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)的自制微柱上(C8膜固定)。收集流出物并将其重新加载到柱子上，重复操作四次。然后，用200μL上样缓冲液洗涤柱子4次，最后用140μL 0.1％TFA洗脱。收集洗脱液并冻干。
d.LC-MS/MS分析和数据处理
所有LC-MS/MS分析均在配备EASY-nLC TM1100***(Thermo Fisher Scienticic，Waltham，MA，USA)的Orbitrap Fusion Tribrid***(Thermo Fisher Scientic，Waltham，MA，USA)上进行。***包括一个没有捕集柱的反相分析柱。运行一次LC-MS时，将样品加载到C18柱(50cm×75μm柱)上。溶剂A是0.1％甲酸水溶液。溶剂B是含0.1％甲酸的乙腈。
蛋白质组样品的梯度为2小时：以200nL/min的流速进行分离，3％-8％B进行4min，增加至24％B进行80min，24％-35％B进行24min后，2min内增加至90％，在90％B持续4min后，10s内还原至3％B，3％B进行5分50s。采用HCD-MS/MS分析样品。蛋白质组分析的参数如下所示：(1)MS：扫描范围(m/z)＝350-1550；分辨率＝240000；含电荷态＝2-6；n次后动态排除，n＝1；动态排除持续时间＝60s；对每个所选前体分别用HCD-MS/MS进行检测；(2)HCD-MS/MS：探测器类型＝Orbitrap；分辨率＝30000；最大注入时间＝64ms；碰撞能量＝36％。
糖肽样品的梯度为4h：以200nL/min的流速进行分离，1％-20％B进行180min，20％-30％B进行42min，增加至90％B进行3min，在90％B持续7min后，然后还原至1％B进行7分50s。采用SCE-HCD-MS/MS分析样品。SCE-HCD-MS/MS的样本进行了分析。用于完整糖肽分析的参数如下所示：(1)MS：扫描范围(m/z)＝350-2000；分辨率＝120000；含电荷态＝2-6；n次后动态排除，n＝1；动态排除持续时间＝15s；对每个所选前体分别用HCD-MS/MS进行检测；(2)HCD-MS/MS：探测器类型＝Orbitrap；分辨率＝15000；最大注入时间＝250ms；碰撞能量＝30％；步进碰撞模式，能量差为±10％(轨道阱融合中的绝对值为10％)。
使用Open-pFind软件分析SILIAC标记的HCC细胞系的蛋白质组数据，以开放搜索模式进行鉴定，然后使用pGlycoQuant的SILAC模式进行定量。pGlyco3分析SILIAC标记的HCC细胞系的完整糖肽数据，然后使用pGlycoQuantSILAC模式进行定量。pGlyco3参数设置：可变修饰：氧化[M]、乙酰基[ProteinN-term]、固定修饰：半胱氨酸碘乙酰化[C]、最大漏切数：2、母离子质量偏差：4ppm、碎片质量偏差：20ppm、酶：胰蛋白酶KR(赖氨酸、精氨酸)-C端。错误发现率(FDR)定为1％，并将其应用于所有数据。从UniProt下载人蛋白数据库(已审核的人类蛋白)(2018年8月，人类，20386项)。
e.Westernblot实验
收集细胞裂解物并在预冷的RIPA裂解和提取缓冲液(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)中制备，并补充有完整的蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics，Penzberg，Germany)。通过SDS-PAGE分离总细胞蛋白并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用含有5％脱脂牛奶的TBS/T(0.1％)阻断非特异性结合1小时后，将膜与以下不同的一抗孵育：anti-FUT8(66118-1-lg，1：1000)、anti-β-Actin(66009-1-lg，1：10000)(Proteintech，Rosemont，IL，USA)，anti-L1CAM(ab182407，1：1000)。用TBS/T洗膜四次以去除未结合的抗体，然后与二抗(HRP-偶联山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG，1：10000；Affinity Bioscience，江苏，中国)孵育室温下1小时。用ECL试剂盒(BeyoECL Plus，Beyotime Institute of Biotechnology，Shanghai，China)观察蛋白质条带。
(2)结果与讨论
pGlycoQuant对具有不同转移潜能的三种HCC细胞系(无转移潜能的Hep3B、具有低转移潜能的97L和具有高转移潜能的LM3)中的蛋白质组和完整N糖肽进行定量分析，每个MS定量分析重复四次(图1a)。共定量到11312种蛋白和11001种完整N糖肽。结果表明，分别从蛋白质组学和完整N糖肽定量实验中可靠地鉴定和定量到共9154种蛋白质和6435种完整N糖肽(图1b)。6435个完整N-糖肽归源于769个糖蛋白，具有1357个N糖位点和143个N糖链(图1c)。三种细胞系之间的定量比显示出高度相关性，证明了定量的准确性和良好的重复性(图2、图3)。采用比率≥2或≤0.5和矫正p值<0.01的标准，经过多次检验校正作为显着差异表达，进一步过滤定量结果，得到1429个蛋白质和1940个完整糖肽。
然后，我们使用火山图和箱线图直观地显示了差异蛋白和完整糖肽的分布和分散程度。在三种细胞系中，糖肽的差异比蛋白质中的差异更为分散(图1d-g)。进一步的主成分分析(PCA)表明，与蛋白质组相比，完整糖肽的差异更有可能区分具有不同转移潜能的三种HCC细胞系(图1h，i)。继而，我们分析了核心岩藻糖基化糖蛋白，并筛选鉴定了一种糖蛋白L1CAM。其糖位点N979的核心岩藻糖基化在三个细胞系中随着转移潜力增加而上调。在L1CAM中总共定量到35个位点特异性糖链，包括5个糖位点和20个糖链(图4a，b)。L1CAM是一种高度糖基化的蛋白质，已知可调节多种癌症中的细胞附着、侵袭和迁移，并且与预后不良相关。例如，Mahal和Hernando等人证明在黑色素瘤转移过程中，FUT8的糖蛋白靶标富集于细胞迁移蛋白，包括粘附分子L1CAM蛋白。然而，我们对于与细胞侵袭和转移相关的L1CAM位点特异性糖基化知之甚少。经过细胞系内的标准化处理后，在所有三种细胞系中，N979位点处的糖链Hex[5]HexNAc[4]NeuAc[1]Fuc[1]的核心岩藻糖基化在L1CAM中显着升高(表1)。同时，L1CAM N979位点的所有岩藻糖基化糖链都随着细胞系转移潜能的增加而持续上调(表2)。从蛋白质组学定量数据中进一步分析L1CAM和FUT8的蛋白质表达水平表明，随着转移潜能的增加，L1CAM的979位点岩藻糖基化的上调是由不同的原因引起的(图4c)：从无转移潜能到低转移潜能，N979位点的岩藻糖基化增加是由FUT8的表达增加引起的；从低转移潜能到高转移潜能，N979位点的岩藻糖基化增加主要是由于L1CAM的蛋白质含量增加。比较未进行蛋白质丰度标准化和进行标准化处理的差异完整糖肽结果表明，N979位点的岩藻糖基化丰度增加是由蛋白质丰度从低转移潜力变为高转移潜力引起的(图5)。蛋白质印迹结果与基于MS的蛋白质组学定量结果一致(图4d-f)。因此，通过检测L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平，可有效地判断生物样品对象肝癌转移的可能性。
表1细胞系中位点特异性糖链强度与位点特异性糖链总强度的百分比(％)
Figure BDA0003723383330000091
Figure BDA0003723383330000101
表2三个细胞系中位点特异性糖链强度占位点特异性糖链总强度百分比(％)
Figure BDA0003723383330000102
Figure BDA0003723383330000111
实例2L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化作为抑制肝癌转移的潜在靶标的应用
(1)实验方法
a.HCC细胞系的细胞培养。
肝细胞癌97L和LM3细胞系在添加了10％胎牛血清(FBS，Gibco，Grand Island，NY，USA)和10U/mL青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，HyClone，Logan，UT，USA)(Gibco by Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的培养。培养环境为37℃的加湿5％CO2培养箱。
b.Westernblot实验
收集细胞裂解物并在预冷的RIPA裂解和提取缓冲液(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)中制备，并补充有完整的蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics，Penzberg，Germany)。通过SDS-PAGE分离总细胞蛋白并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用含有5％脱脂牛奶的TBS/T(0.1％)阻断非特异性结合1小时后，将膜与以下不同的一抗孵育：anti-FUT8(66118-1-lg，1：1000)、anti-β-Actin(66009-1-lg，1：10000)(Proteintech，Rosemont，IL，USA)，anti-L1CAM(ab182407，1：1000)。用TBS/T洗膜四次以去除未结合的抗体，然后与二抗(HRP-偶联山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG，1：10000；Affinity Bioscience，江苏，中国)孵育室温下1小时。用ECL试剂盒(BeyoECL Plus，Beyotime Institute ofBiotechnology，Shanghai，China)观察蛋白质条带。
c.凝集素富集和免疫印迹实验
将1000μg细胞裂解液分别与320μL琼脂糖结合Pisum Sativum凝集素(PSA)以及琼脂糖结合Lens Culinaris凝集素(LCA)(Vector laboratories,Burlingame,CA,USA)混合在含2mM MnCl2、2mM CaCl2和1mM NaCl2的650μL结合缓冲液中，在4℃旋转孵育过夜，以特异性富集核心岩藻糖糖蛋白。然后，将珠子用结合缓冲液洗涤3次，随后用SDS-PAGE样品缓冲液在99℃提取10min。样品通过4-20％Bis-Tris-PAGE分离，并用anti-L1CAM(ab182407，1：1000)进行免疫印迹。对于凝集素印迹，通过Bis-Tris-PAGE分离后，将样品转移到PVDF膜上。用TBS/T洗膜四次以去除未结合的抗体，然后与二抗(HRP-偶联山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG，1：10000；Affinity Bioscience，江苏，中国)孵育室温下1小时。用ECL试剂盒(BeyoECLPlus，Beyotime Institute of Biotechnology，Shanghai，China)观察蛋白质条带。
d.划痕实验
将细胞接种到24孔培养板中，细胞数为1×105个/孔。当细胞密度达到90％时，用无菌移液器吸头轻轻刮擦细胞单层。用PBS洗涤两次后，加入新鲜培养基。在显微镜(DMi8，Leica，Wetzlar，Germany)下观察细胞迁移，并在不同时间点进行成像。
e.小室迁移实验
使用孔径为8μm的Transwell小室(Corning，NY，USA)进行Transwell实验，以估计细胞迁移能力。将总共5×104个细胞悬浮在100μL无血清培养基中，然后加入上室，而在下室中加入600μL 10％FBS培养基。37℃、5％CO2孵育36小时后，用棉签除去上室未迁移的细胞，迁移的细胞用甲醇固定，0.1％结晶紫染色。随机选取5个视野，在显微镜下计数迁移细胞数。
f.基质胶侵袭实验
对于Transwell侵袭测定，上室膜涂有基质胶(Corning，NY，USA)。1×105细胞加入无血清培养基的上室，其余同迁移试验。
g.siRNA
FUT8(岩藻糖基转移酶8)特异性siRNA(序列：
5'-GUGGAGUGAUCCUGGAUAUTT-3'(SEQ ID NO.1)、
5'-AUAUCCAGGAUCACUCCACTT-3'(SEQ ID NO.2))和阴性对照siRNA(序列：
5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.3)、
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'(SEQ ID NO.4))购自GenePharma(中国上海)
h.质粒定点诱变
pCMV3(空)载体和pCMV3-L1CAM-FLAG载体(在C端带有FLAG标签)购自汉兴生物(中国北京)。
以pCMV3-L1CAM-FLAG质粒为模板，通过定点诱变方法产生
pL1CAM(N979Q)-FLAG突变体。简而言之，使用模板特异性诱变引物(正向：5'-CGAACTTCGGACACACCAGCTGACCGATCTCAGCC-3'(SEQ ID NO.5)，反向：5'-GGCTGAGATCGGTCAGCTGGTGTCCGAAGTTCG-3'(SEQ ID NO.6))，使用Phanta DNA聚合酶(Vazyme，P501)通过PCR扩增pCMV3-L1CAM-FLAG质粒。在50μLPCR反应体系中加入10μL PhantaDNA聚合酶配套的5×SFBuffer(含有10mM MgSO4)，1μL dNTPMix(10mM each)，上下游引物(10Μm)各2μL，1μLPhanta Super-Fidelity DNA Polymeras和3μL模板DNA(100ng/μL)，最后用灭菌超纯水补至50μL反应条件。设置为预变性95℃，反应时间为5min；循环反应：变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s/kb；共35个循环；彻底延伸72℃。PCR产物用DpnI限制性内切酶消化，转化TOP10感受态细胞(购自于上海普赛生物科技有限公司)，挑取阳性克隆，通过DNA测序确认pL1CAM(N979Q)-FLAG突变体的序列。
pL1CAM(N979Q)-FLAG突变体DNA测序结果(SEQ ID NO.7)：
NNNNNNNTGNNNGTCTGCAGANNNNCATNNNCNTGNNNTNNNNGATTGAGANNNNANGCGCCGNATGTACAGTCTGGGNNNNNNAGGNNNNAGACTCTNCCACCTCAGCTGTNNCNNATGNCCACTACNCTTAGGTACTGCCATAAACAAATATGGCCCCGGGAGCCCAGCCCGGTCTCTGAGACTGTGGTCACACTGAGGCAGCCCCAGAGAAGAACCCTGTGGATGTGAAGGGGGAAGGAAATGAGACCACCAATATGGTCATCACGTGGAAGCCGCTCCGGTGGATGGACTGGAACGCCCCCCAGGTTCAGTACCGCGTGCAGTGGCGCCCTCAGGGGACACGAGGGCCCTGGCAGGAGCAGATTGTCAGCGACCCCTTCCTGGTGGTGTCCAACACGTCCACCTTCGTGCCCTATGAGATCAAAGTCCAGGCCGTCAACAGCCAGGGCAAGGGACCAGAGCCCCAGGTCACTATCGGCTACTCTGGAGAGGACTACCCCCAGGCAATCCCTGAGCTGGAAGGCATTGAAATCCTCAACTCAAGTGCCGTGCTGGTCAAGTGGCGGCCGGTGGACCTGGCCCAGGTCAAGGGCCACCTCCGCGGATACAATGTGACGTACTGGAGGGAGGGCAGTCAGAGGAAGCACAGCAAGAGACATATCCACAAAGACCATGTGGTGGTGCCCGCCAACACCACCAGTGTCATCCTCAGTGGCTTGCGGCCCTATAGCTCCTACCACCTGGAGGTGCAGGCCTTTAACGGGCGAGGATCGGGGCCCGCCAGCGAGTTCACCTTCAGCACCCCAGAGGGAGTGCCTGGCCACCCCGAGGCGTTGCACCTGGAGTGCCAGTCGAACACCAGCCTGCTGCTGCGCTGGCAGCCCCCACTCAGCCACAACGGCGTGCTCACCGGCTACGTGCTCTCCTACCACCCCCTGGATGAGGGGGGCAAGGGGCAACTGTCCTTCAACCTTCGGGACCCCGAACTTCGGACACACCAGCTGACCGATCTCAGCCCCCACCTGCGGTACCGCTTCCAGCTTCAGGCCACCACCAAAGAGGGCCCTGGTGAAGCCATCGTACGGGAAGGAGGCACTATGGCCTTGTCTGGGATCTCAGATTTTGGCAACATCTCAGCCACAGCGGGTGAAAACTACAGTGTCGTCTCCTGGGTCCCCAAGGAGGCCAGGCAGTGGCANNCCNC。
上述序列中，下划线部分为突变位点；N代表4兼并碱基(ATGC)中的任意一个，常用在测序结果的gap中。
pL1CAM(N979Q)-FLAG突变体按照预期设计，原密码子为AAC(编码979的N)，突变后变为CAG(编码Q)，即N979Q。DNA测序结果发现AAC已突变为CAG，突变成功。
i.siRNA和质粒转染
根据制造商的方案，使用Lipofectamine3000试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行siRNA和质粒的转染，具体是将上述的FUT8特异性siRNA(siFUT8)及其阴性对照siRNA(siCtrl)、L1CAM蛋白的N979位点突变体pL1CAM(N979Q)-FLAG(L1CAM-N979Q)及其野生型质粒(L1CAM-OE)，分别转染到97L细胞系中，研究L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。
(2)结果与讨论
为了证实L1CAM的N979位点特异性核心岩藻糖基化在体外对于HCC细胞转移的作用，我们研究了有或没有N979位点突变的L1CAM过表达情况下，其对HCC细胞的转移是否具有相同的促进能力以及核心岩藻糖基化是否有助于L1CAM产生这种效果。使用L1CAM蛋白的N979位点突变体pL1CAM(N979Q)-FLAG(L1CAM-N979Q)及其野生型质粒(L1CAM-OE)，分别转染到97L细胞系中，Westernblot实验验证得知质粒构建成功(图6a)。利用已转染的97L细胞进行划痕实验，小室迁移实验和基质胶侵袭实验。实验结果表明，L1CAM过表达在体外触发了97L细胞的迁移和侵袭能力的显着增加，而具有相同蛋白量的N979位点突变L1CAM并没有显示出促进转移的作用(图6b-d)，且DNA测序结果确认pL1CAM(N979Q)-FLAG突变体序列与预期设计一致，突变成功。接下来，我们进一步利用FUT8特异性siRNA，将97L细胞中的FUT8敲低(图7a)，导致了L1CAM上核心岩藻糖基化的减少(图7b)。同时划痕实验、小室迁移以及基质胶侵袭实验都发现了FUT8的降低，抑制了97L细胞的迁移和侵袭能力(图7c-e)。这些结果表明N979位点特异性核心岩藻糖基化对HCC细胞系中的转移表型至关重要。因此，该位点的糖基化修饰对转移性肝癌细胞的抑制转移作用，可能为后期靶向药物的研发提供了糖基化后修饰方向的新思路。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
guggagugau ccuggauaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auauccagga ucacuccact t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaacttcgg acacaccagc tgaccgatct cagcc 35
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctgagatc ggtcagctgg tgtccgaagt tcg 33
<210> 7
<211> 1207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(25)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(31)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(38)
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(43)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(55)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(64)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(84)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(91)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(99)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(114)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(117)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (121)..(121)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (129)..(129)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (1202)..(1203)
<223> n=a或t或g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (1206)..(1206)
<223> n=a或t或g或c
<400> 7
nnnnnnntgn nngtctgcag annnncatnn ncntgnnntn nnngattgag annnnangcg 60
ccgnatgtac agtctgggnn nnnnaggnnn nagactctnc cacctcagct gtnncnnatg 120
nccactacnc ttaggtactg ccataaacaa atatggcccc gggagcccag cccggtctct 180
gagactgtgg tcacactgag gcagccccag agaagaaccc tgtggatgtg aagggggaag 240
gaaatgagac caccaatatg gtcatcacgt ggaagccgct ccggtggatg gactggaacg 300
ccccccaggt tcagtaccgc gtgcagtggc gccctcaggg gacacgaggg ccctggcagg 360
agcagattgt cagcgacccc ttcctggtgg tgtccaacac gtccaccttc gtgccctatg 420
agatcaaagt ccaggccgtc aacagccagg gcaagggacc agagccccag gtcactatcg 480
gctactctgg agaggactac ccccaggcaa tccctgagct ggaaggcatt gaaatcctca 540
actcaagtgc cgtgctggtc aagtggcggc cggtggacct ggcccaggtc aagggccacc 600
tccgcggata caatgtgacg tactggaggg agggcagtca gaggaagcac agcaagagac 660
atatccacaa agaccatgtg gtggtgcccg ccaacaccac cagtgtcatc ctcagtggct 720
tgcggcccta tagctcctac cacctggagg tgcaggcctt taacgggcga ggatcggggc 780
ccgccagcga gttcaccttc agcaccccag agggagtgcc tggccacccc gaggcgttgc 840
acctggagtg ccagtcgaac accagcctgc tgctgcgctg gcagccccca ctcagccaca 900
acggcgtgct caccggctac gtgctctcct accaccccct ggatgagggg ggcaaggggc 960
aactgtcctt caaccttcgg gaccccgaac ttcggacaca ccagctgacc gatctcagcc 1020
cccacctgcg gtaccgcttc cagcttcagg ccaccaccaa agagggccct ggtgaagcca 1080
tcgtacggga aggaggcact atggccttgt ctgggatctc agattttggc aacatctcag 1140
ccacagcggg tgaaaactac agtgtcgtct cctgggtccc caaggaggcc aggcagtggc 1200
annccnc 1207

Claims (6)

1.一种检测L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平的试剂在制备诊断肝癌转移可能性的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化水平上调，肝癌转移可能性增加。
3.一种L1CAM蛋白N979位点特异性核心岩藻糖基化的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为如SEQ ID NO.1-2所示的siRNA。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制肝癌转移的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制肝癌转移是通过抑制FUT8的表达实现。
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