CN115074390A

CN115074390A - 高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用

Info

Publication number: CN115074390A
Application number: CN202210758278.XA
Authority: CN
Inventors: 祖尧; 王宏杰
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-09-20

Abstract

本发明公开了高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用，在基因簇中确定基因删除的靶点序列，设计特异性CRISPR gRNA靶点序列和扩增引物，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，纯化，体外转录，gRNA与Cas9蛋白显微注射并提取基因组进行PCR扩增，依次经过T7E1酶切和琼脂糖凝胶电泳得到的胶图检测条带灰度值，得到每个条带的亮度体积计算敲除效率，组成最优靶点组合进行显微注射并提取基因组，经过双外侧引物PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，稳定培养即得。本发明首次采用CRISPR单位点敲除效率评估，筛选CRISPR靶点组合产生高效的基因组大片段删除，可用于脊椎动物的基因组中基因大片段的高效删除。

Description

高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用，特别是利用CRISPR***在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，高效构建用于研究由基因组大片段缺失导致的疾病动物模型。

背景技术

CRISPR/Cas***是细菌和古细菌进化出的RNA介导的适应性防御***，其主要功能是保护生物免受入侵病毒和质粒的侵害，利用向导RNA核酸酶对外源基因进行切割。相比于锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)，CRISPR***通过导致修复错误的非同源末端连接，引起小的***和删除(indels)从而破坏靶基因，已被广泛用于各种生物体中进行突变。CRISPR/Cas9***具有操作简单、易于合成、打靶效率高、靶向精确和细胞毒性低等优势，而且在确保体细胞内对基因进行突变的同时，也能造成生殖细胞的突变，从而将突变基因传递到下一代。

然而，***删除标记(indel)诱变并不适合所有目标：同一基因中可能存在多个转录变体或替代起始密码子(无论是否注释)，使得难以确定功能性蛋白质产物是否被有限的局部突变破坏；对于非编码RNA(ncRNA)基因、非翻译区或调控区，局部突变无力破坏这些基因或顺式元件的功能，仅通过靶向单个基因座也难以同时去除染色体上多个基因或一组相邻基因，通过CRISPR组合删除基因组长片段为实现编码基因和非编码基因的功能提供有效工具。

目前大片段删除技术已经应用于哺乳动物、鱼类、植物、细菌、真菌等生物体中(图12)。在CRISPR/Cas9介导的片段删除中，采用的普遍方法是在预删除片段两端各设置一个靶点，少数采取两端各设两对的方法，David等人在哺乳动物小鼠中针对TYR色素基因的上游关键调控序列设计1.2kbp的删除，通过不同浓度的一对gRNA和Cas9对小鼠受精卵进行显微注射，成功构建色素减少的小鼠并验证该调控序列的功能，同时发现在提升Cas9 mRNA和gRNA的浓度时片段删除的效率从23％提升到了36％。Xiao等人针对斑马鱼基因组，通过一对CRISPR或两对TALENs注射至斑马鱼胚胎中获得突变体及其后代，但很多未检测删除效率。除此之外，在兔中使用Cas9 mRNA与2对gRNA靶点混合的方法对105kbp的TYR基因进行删除，效率最高达到25％。在水稻中通过转入表达包含Cas9蛋白和一对gRNA的质粒，其中以16.7％的效率删除了245kbp的片段。由于细菌对于双链断裂的修复能力较差，Standage-Beier等人使用切割单链的Cas9 Nickase删除大肠杆菌基因，该核酸酶成本较高，打靶一个位点需要配合两个互补的gRNA，通过混合针对两个位点的2对gRNA和Cas9 Nickase，在大肠杆菌中删除了36和97kb的片段，删除成功率分别为20％和1％。此外，在大豆中也有大片段删除的相关报道。综上基因组大片段删除在各物种中的情况，片段删除距离在几百个碱基对到接近一兆左右，片段删除的效率位于1％-36％之间。在小鼠、兔、斑马鱼、大肠杆菌、大豆、水稻等模式生物中进行的片段删除平均效率在25％以下，效率普遍较低。并且上述工作采用注射Cas9和2对以下的gRNA进行大片段删除，缺少评估优化gRNA组合的操作步骤。

基因组片段缺失的疾病数量占总疾病数的比例约为17.7％，片段删除可以用于研究基因家族、调控元件等功能，从而揭示疾病机制。利用模式生物构建突变体在满足基础研究的同时，还可以进行药物筛选帮助寻找可能的药物。编码肌联蛋白的ttn1、ttn2基因突变与人类骨骼和心脏肌病有关，hox基因簇编码一个转录调控家族，在发育过程中塑造动物的头尾轴，hox基因突变或缺失会导致一系列发育障碍疾病。利用CRISPR进行单位点敲除可以实现引入局部的基因突变，从而使基因表达异常，不能合成正常的蛋白质。但是，生物体的DNA中存在大量基因或者说调控元件不直接表达蛋白质，而是通过间接方式影响蛋白质的合成。单位点敲除有时起不到敲除这些调控元件的作用，想要对这些调控元件或者基因簇进行编辑，需要使用片段删除的手段。在植物和动物中，片段删除可用于研究作物性状基因，删除反向调控元件等来实现精准的分子育种。在微生物工业领域中，利用细菌、真菌自身次生代谢产物可以制造抗生素、杀虫剂等，片段删除一些特定基因可以使其更耐储存或提高产量。医学上，片段删除可以用于研究长片段或成簇基因家族的功能。因此，不管是医疗、农业或工业生产等领域，提升基因编辑的效率均具有重要意义，目前片段删除的效率还普遍偏低，需要进一步开发高效的基因组片段删除手段。

发明内容

为解决现有技术中基因组大片段删除效率低的问题，本发明的主要目的在于提供高效构建基因组大片段删除突变体的方法，特别是通过CRISPR***在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，大大提高基因组大片段删除效率。

本发明的另一目的在于提供上述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在高效构建用于研究由基因组大片段缺失导致的疾病动物模型中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，包括以下步骤：

S1、在处理对象的基因簇中确定基因删除的靶点序列，在符合CRISPR PAM区的条件下待删除基因片段两端分别设计不少于三个特异性CRISPR gRNA靶点序列；

S2、根据步骤S1设计的特异性CRISPR gRNA靶点序列分别设计扩增引物；

S3、以gRNA骨架质粒为模板，采用引物T7-gRNA target作为正向引物和gRNA反向引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

S4、步骤S3得到的PCR产物进行纯化，体外转录，获得若干gRNA；

S5、步骤S4中gRNA与Cas9蛋白分别显微注射导入到所述处理对象的一细胞期受精卵中；

S6、挑选步骤S5中所述处理对象胚胎期的卵提取基因组，分别用敲除靶点检测引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

S7、步骤S6得到的PCR产物依次经过酶切和琼脂糖凝胶电泳，得到的胶图根据Image Lab软件定量工具检测条带灰度值，得到a、b和c每个条带的亮度体积，根据公式indel％＝(a+b)/(a+b+c)×100％计算得到敲除效率；

S8、从待删除基因片段两端的特异性CRISPR靶点组成若干组最优靶点组合；

S9、选取步骤S8中不少于三组最优靶点组合分别进行显微注射导入到所述处理对象的一细胞期受精卵中；

S10、挑选步骤S9中所述处理对象胚胎期的卵提取基因组，经过双外侧引物PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，进行稳定培养，得到基因组大片段删除突变体。

作为优选，步骤S8中，从待删除基因片段两端的特异性CRISPR靶点中选择T7E1酶切活性高且相似的特异性CRISPR靶点作为最优靶点组合。

作为优选，所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法同时满足：

(1)所述处理对象的基因组大片段删除效率与其单个特异性CRISPR靶点的诱变效率呈正相关，与所述待删除基因片段两端gRNA效率之差呈负相关；

(2)任意两个特异性CRISPR靶点之间的基因长度对大片段删除效率没有显著影响；

(3)与同时显微注射不少于两个特异性CRISPR靶点相比步骤S9中显微注射具有高诱变效率的最优靶点组合的基因组大片段删除效率高。

作为优选，步骤S6中，所述敲除靶点检测引物为可扩增出包含所述靶点的特异性引物。

作为优选，步骤S5中，gRNA的终浓度为100～200ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为800ng/μL，Cas9 mRNA的终浓度为400ng/μL，注射量为1nL。

作为优选，通过上述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，包括以下步骤：

(1)在斑马鱼的ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中确定基因敲除的靶点序列，在符合CRISPR PAM区的条件下其待删除基因片段两端分别设计不少于三个特异性CRISPRgRNA靶点序列；

(2)根据步骤(1)设计的特异性CRISPR gRNA靶点序列分别设计扩增引物；

(3)以gRNA骨架质粒为模板，采用引物T7-gRNA target作为正向引物和gRNA反向引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(4)步骤(3)得到的PCR产物进行纯化，体外转录，获得gRNA；

(5)步骤(4)得到的gRNA与Cas9蛋白显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中；

(6)挑选步骤(5)中斑马鱼48h胚胎期的鱼卵提取基因组，用敲除靶点检测引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(7)步骤(6)得到的PCR产物依次进行T7E1酶切检测和琼脂糖凝胶电泳，得到的胶图根据Image Lab软件定量工具检测条带灰度值，得到a、b和c每个条带的亮度体积，根据公式indel％＝(a+b)/(a+b+c)×100％计算得到敲除效率；

(8)从待删除基因片段两端的特异性CRISPR靶点中选取不少于三组特异性CRISPR靶点组成最优靶点组合；

(9)步骤(8)中得到的最优靶点组合分别显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中；

(10)挑选步骤(9)中斑马鱼48h胚胎期的鱼卵提取基因组，依次经过双外侧引物PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，稳定培养得到得斑马鱼基因组大片段删除突变体。

优选地，步骤(1)中，所述靶点序列如下表所示：

优选地，步骤(2)中，所述扩增引物的序列如下表所示：

本发明还提供所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在脊椎动物的基因组内基因大片段删除中的应用。

本发明还提供所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在构建用于由基因组大片段缺失导致的疾病治疗和药物筛选的动物模型中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

一、本发明首先筛选出拥有高突变效率的gRNA，随后选择效率差值较小的gRNA进行组合显微注射至一细胞期的斑马鱼受精卵中，首次采用CRISPR单位点效率评估筛选出CRISPR组合产生高效的基因组大片段删除，同时满足：1)基因组大片段删除效率与单个特异性CRISPR靶点的诱变效率呈正相关，与待删除基因片段两端gRNA效率之差呈负相关；2)任意两个特异性CRISPR靶点之间的基因长度对大片段删除效率没有显著影响；3)显微注射具有高诱变效率的最优靶点组合与同时显微注射不少于两个特异性CRISPR靶点相比基因组大片段删除效率高。

二、本发明通过设计针对斑马鱼不同基因组位点的gRNA，将针对特定基因簇的一对gRNA和Cas9蛋白共注射到一个细胞期的胚胎中，利用CRISPR/Cas***在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，删除的基因组片段长度范围为5-340kb，平均效率达到64.5％，最高效率达到100％(20/20)，同时成功以95％的高效率删除340kb的ttn1-ttn2簇超长片段，大大提高基因组大片段删除效率。而现有报道片段删除距离在几百个碱基对到接近一兆左右，片段删除的效率位于1％-36％之间，在小鼠、兔、斑马鱼、大肠杆菌、大豆、水稻等模式生物中进行的片段删除平均效率在25％以下，效率普遍较低，且采用注射Cas9和2对以下的gRNA进行大片段删除，缺少评估优化gRNA组合的操作步骤。

三、本发明的方法在斑马鱼的hoxab(33.3kb)、hoxca(138.1kb)、hoxcb(48.3kb)、hoxda(53.3kb)、nppb-nppa基因簇实现高效片段删除，得到的斑马鱼基因组大片段删除突变体可以作为动物模型用于研究基因组大片段缺失疾病。此外，本发明首次在斑马鱼中获得hoxca基因簇删除突变体且产生相应的鱼背鳍缺失表型，为鱼类背鳍发育研究提供模型。

附图说明

图1是实施例中斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除的模式示意图。

图2是实施例中CRISPR介导的斑马鱼基因组大片段删除方法中琼脂糖凝胶电泳和ImageLab灰度值(亮度体积)定量示意图，单位点酶切效率计算公式为indel％＝(a+b)/(a+b+c)×100％。

图3是实施例中ttn1、ttn2、hoxa13b、hoxa2b、hoxc1a、hoxc4a、hoxc6a、hoxc9a、hoxc11a、hoxc13a、hoxc6b、hoxc13b、nppb和nppa基因靶点效率T7E1酶切的检测胶图。

图4是hoxcb删除示意图和hoxcb簇单位点效率和片段删除效率统计柱状图，单位点效率：T7E1 efficiency，片段删除效率：knockout efficiency；其中：(A)hoxc6b-hoxc13b基因簇和靶点示意图；(B)hoxc6b T1，hoxc13b T2的单位点效率及均值和片段删除效率；(C)hoxc6b T1，hoxc13b T1的单位点效率及均值和片段删除效率；(D)hoxc6b T2，hoxc13b T2的单位点效率及均值和片段删除效率；(E)hoxc6b T2，hoxc13b T1的单位点效率及均值和片段删除效率。从(B)到(E)片段删除效率随单位点效率均值增加而增加，呈正相关。

图5是实施例中tn1-ttn2基因簇的删除结果；其中：(a)ttn1-ttn2簇片段删除效率(fra-del efficiency)和靶点效率之差(indel efficiency difference)柱状图，在ttn1-ttn2簇的两种片段删除中，片段删除效率与靶点效率之差呈现负相关；(b)tt1-ttn2靶点敲除效率的检测胶图；(c)ttn1-ttn2簇各片段敲除效率的的检测胶图。

图6是实施例中hoxab基因簇删除结果；其中：(a)hoxab簇片段删除效率和靶点效率之差柱状图，在hoxab簇的两种片段删除中，片段删除效率与靶点效率之差呈现负相关；(b)hoxab靶点敲除效率检测胶图；(c)hoxab簇各片段敲除效率的检测胶图。

图7是hoxca不同片段长度删除结果：(A)hoxca基因簇和55.7Kb、71.4Kb、91.6Kb、133.9Kb四种删除方式的靶点示意图；(B)hoxca四种靶点组合产生的片段删除结果胶图。(C)hoxca五个靶点的单位点删除效率统计柱状图；(D)hoxca簇四种片段删除效率统计图；(E)hoxca簇片段删除效率与删除长度折线图，片段删除效率与片段删除长度不相关。

图8是实施例中多个靶点与一对靶点片段删除效率的比较图；其中：(A)不同靶点组合进行片段删除模式图，第一行：靶点A1位于gene1的5’端，靶点A2位于基因n的3’端；第二行：靶点A1位于gene1的5’端，靶点A3、A2位于基因n的3’端；第三行：靶点A1、A4位于gene1的5’端，靶点A2位于基因n的3’端；第四行：靶点A1、A4位于gene1的5’端，靶点A3、A2位于基因n的3’端；(B)hoxca簇四种靶点组合片段删除效率柱状图，从上到下四种组合分别对应(A)模式图中的第一行至第四行；(C)ttn簇四种靶点组合片段删除效率柱状图，从上到下四种组合分别对应(A)模式图中的第一行至第四行。

图9是实施例中hoxca簇删除的F1代突变体斑马鱼产生无背鳍表型图片；其中：(A)hoxca簇删除模式图，前端靶点位于hoxc13a的第一个外显子CDS上，后端靶点位于hoxc1a的第二个外显子CDS上；(B)hoxca片段删除突变体与野生型外交产生的后代整体照片，三月龄，图示均为雄鱼，有背鳍(左)，基因型后续鉴定为WT sibling；无背鳍表型，基因型后续鉴定为hoxca^+/-；(C)无背鳍表型的鱼剪尾后使用hoxca簇双外侧引物PCR扩增电泳图，无背鳍鱼1-5：呈一条条带(标星)，有背鳍sibling C1、C2、C3无条带；(D)测序结果，Ref为NCBI参考野生型序列，#3为(C)中3号鱼测序结果。

图10是实施例中hoxcb簇片段删除结果；其中：(A)hoxc13b T1和hoxc6b T1片段删除电泳图，效率为14/20；(B)随机挑取(A)中扩增产物进行测序结果；(C)hoxc13b T2和hoxc6b T2片段删除电泳图，效率为13/20；(D)hoxc13b T2和hoxc6b T1片段删除电泳图，效率为13/20；下方为随机挑取(D)中扩增产物进行测序的结果。

图11是实施例中高效率删除340kb ttn1-ttn2超长片段的结果；(A)ttn1 T5和ttn2 T3的T7E1酶切检测敲除效率的琼脂糖凝胶电泳图；(B)ttn1 T5和ttn2 T3靶点共注射产生的片段删除结果效率检测胶图；(C)各物种长片段删除效率的统计结果。

图12是各物种片段删除效率统计图，其中*为通过本发明的方法进行斑马鱼片段删除效率，其余为统计的苏云金杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、水稻、大豆、小鼠、兔中的片段删除效率。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中按照如图1所示通过本发明中高效构建基因组大片段删除突变体的方法在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，以ttn基因簇为例进行反片段敲除，剪刀表示Cas9切割的位置，图上标出基因簇的长度以及两个基因之间的距离(图1，A)；以Hox基因簇为例，其敲除模式完整标出Hox各基因簇的长度以及各基因簇两端基因之间的距离(图1，B)；以nppa-nppb为例，其敲除模式完整标出长度以及基因簇两端基因之间的距离(图1，C)

实施例1

本实施例按照图1所述的方法构建斑马鱼基因组大片段删除突变体，具体如下：

(一)实验对象。所用的野生型斑马鱼为AB型，各突变体鱼系均为发明人构建，按照上海海洋大学动物伦理相关规定进行(IACUC SHOU-DW-2021-042)，实验条件：拥有完善的斑马鱼养殖设备，斑马鱼生活的环境是经过UV及曝气处理过的循环水***，水温为28.5℃，pH值和电导率均在正常指标内，光照也是严格按照要求每天黑暗10h+光照14h。斑马鱼在专门的产卵缸中交配产卵，将收集的斑马鱼鱼卵放于28.5℃的恒温培养箱培养，一般在48h左右开始破膜，在破膜前早晚各换水一次并吸掉死卵，破膜后每天换水一次，5天后投喂草履虫，20天后开始喂丰年虫，一个月左右进入循环***中饲养，一个半月分缸饲养，注意性别分化。

(二)质粒。所用的gRNA骨架质粒来自于文献：Chang N,Sun C,Gao L,Zhu D,Xu X,Zhu X,Xiong JW,Xi JJ.Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease inzebrafish embryos，Cell Res,2013,23(4):465-472。

(三)主要试剂。实验试剂如表1所示：

表1

试剂	来源及货号
		Taq酶	Vazyme，P213-03
内切酶XbaⅠ酶	NEB，R0145S
		T7E1内切酶	Vazyme，EN303-01
MAXIscript T7	invitrogen，00688273
		mMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA kit	invitrogen，AM1345
GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease	GenScript，Z03389-100

(四)主要仪器。紫外分光光度计(Thermo Scientific company—Nanodrop2000C)、纯水仪(默克密理博company—Milli-Q Direct 8)、-40℃低温冰箱(Haier—DW-40L508)、大离心机(eppendorf company—Centrifuge 5810R)、恒温培养箱(SANYOcompany—MIR-262)、高压蒸汽灭菌锅(SANYO company—MLS-3780)、电泳仪(BIO-RAD—PowerPac Basic)、4℃冰箱(Haier—HYC-610)、照胶仪(BIO-RAD company—Gel Doc EZImager)、震荡混匀仪(VORTEX-GENIE company—G560E)、PCR扩增仪(BIO-RAD company—C1000 Touch)、-80℃超低温冰箱(Panasonic company—MDF-U53V)、恒温水浴锅(品牌：精宏，型号：H1401438，DK-8D)玻璃毛细管(品牌：WPI，型号：TW100F-4)，垂直拉针仪(品牌：NARISHIGE，型号：PC-10)。

(五)构建斑马鱼基因组大片段删除突变体

1、gRNA合成

(1)靶点设计

在Ensembl网站上搜索斑马鱼基因的序列，在ZIFIT网站上查找合适的gRNA，gRNA设计完成后，首先到NCBI网站上进行BLAST检测特异性。送公司合成靶点引物时，确认靶点是正义链还是反义链，避免设计错误。靶点序列信息如表2所示，5’端加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATA，3’端加入gRNA骨架反向引物序列GTTTTAGAGCTAGAAAT，送至公司合成引物。

表2

(2)设计检测引物

检测引物包含两端靶点，上游检测引物位于上游靶点前端200bp开外，下游检测引物位于下游靶点后端200bp开外，保证PCR扩增产物有大于400bp的长度以清楚区分不同条带。检测大片段效率时选用双外侧引物，例如上游靶点的F和下游靶点的R组成一对引物。引物在上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息如表3所示。

表3

(3)合成gRNA体外转录模版

a、以gRNA骨架质粒为模板，与表2靶点对应的正向引物、gRNA反向引物进行PCR反应。

b、PCR反应条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火65℃，30s；延伸72℃，30s；进行35个循环；再72℃，10min；最后保温在4度冰箱。

c、120V，20min，2％琼脂糖凝胶电泳(Gel EP)检测PCR产物，条带略高于100bp长度的marker条带。

d、先用DNA纯化试剂盒进行纯化，再用RNase-Free的水进行溶解洗脱。

e、取0.5-1uL溶液，用Nanodrop分光光度计检测浓度。

(4)体外转录

RNase-Free条件下，分别将上述PCR纯化产物进行体外转录得到gRNA，转录体系参考体外转录试剂盒说明书，如表4所示，其中T7 enzyme mix最后添加；反应条件为：37℃水浴，90min；后加入TURBO DNase 1μL，37℃水浴，15min。

表4

RNase free water	to 20μL
		gRNA plasmid Template	1μg
10×Transcription Buffer	2μL
		10mM ATP	1μL
10mM CTP	1μL
		10mM GTP	1μL
10mM UTP	1μL
		T7 Enzyme Mix	2μL

混匀并短暂离心后，37℃孵育80min；之后向体系中加入1μL TURBO DNase并混匀，短暂离心后37℃孵育15min。

(5)沉淀并纯化gRNA

体外转录后，用LiCl沉淀法对gRNA进行纯化，步骤为：

a、向上述反应产物中加入2μL的4M LiCl，再加入200μL的100％乙醇；放置-80℃冰箱存放2-12小时(可以过夜处理)。

b、4℃、12000rpm、离心30min，倾倒或用移液枪除去上清。

c、用移液枪吸取预冷的70％乙醇清洗沉淀，轻轻吹打沉淀使其悬浮。随后4℃、12000rpm、离心10min，除去上清，重复该步骤一次，目的是为了去除杂质，在超净台中室温通风晾干5min。

d、加入10μL RNase-free水溶解。

e、Nanodrop检测浓度；150V，15min，1％琼脂糖凝胶电泳检测合成质量。

2、显微注射

将Cas9蛋白或者Cas9 mRNA与gRNA按照一定比例预先配成混合溶液，终浓度为：gRNA 100～200ng/μL，Cas9蛋白800ng/μL，Cas9 mRNA为400ng/μL，注射到斑马鱼胚胎1细胞时期的动物极，注射1nL，24h后即可检测，注射时需要留有一部分未注射的鱼卵作为对照。

3、T7E1酶切检测敲除效率

a、24h后取3组，5枚胚胎一组放入PCR小管中，利用碱裂法提取基因组：向每管中加入50uL 50mM NaOH溶液，95℃，10min后取出，在震荡仪上充分震碎组织后；继续95℃，10min；加入5uL 1M Tris-HCl(pH＝8)后，震荡混匀，离心10000rpm，5min。

b、PCR扩增包含靶点的DNA片段

使用表3中注射组对应双外侧引物扩增目的片段，PCR反应体系如下表5所示：

表5

ddH<sub>2</sub>O	9.5μL
		PCR mix 2×	12.5μL
F	1μL
		R	1μL
Template	1μL

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃再延伸10min；12℃保存。2％琼脂糖凝胶120V电泳25min。

c、T7E1酶进行敲除效率检测

T7E1酶切检测反应体系如表6所示：

表6

PCR产物	5μL
		Reaction Buffer	1.1μL
ddH<sub>2</sub>O	up to 10μL

反应条件为：95℃，30s；85℃，5min；4℃，5min；反应后加0.25μL T7E1酶37℃，45min。120V，25min，2％琼脂糖凝胶电泳检测。

d、琼脂糖凝胶电泳

电泳结果使用Bio-Rad照胶仪进行成像，观察条带数量，WT应为一条，实验组(酶切组)应当为2至3条条带；将电泳图使用ImageLab软件进行灰度值分析，计算敲除效率(图2)。

4、实验结果

(1)ttn1、ttn2、hoxa13b、hoxa2b、hoxc1a、hoxc4a、hoxc6a、hoxc9a、hoxc11a、hoxc13a,hoxc6b、hoxc13b、nppb、nppa基因靶点效率T7E1酶切如图3所示，从上至下为ttn1(T2,T3,T4,T5)、ttn2(T1,T2,T3,T4)、hoxa13b(T1,T2)、hoxa2b(T1,T2)、hoxc1a(T1)、hoxc4a(T2)、hoxc6a(T2)、hoxc9a(T2)、hoxc11a(T1)、hoxc13a(T1,T2),hoxc6b(T1,T2)、hoxc13b(T1,T2)、nppb(T1,T2)、nppa(T1,T2)的靶点效率酶切图。

(2)hoxc6b-hoxc13b片段删除效率和单位点效率统计结果

hoxc6b上设置了T1，T2两个靶点，hoxc13b上设置了T1，T2两个靶点(图4，A)。将这四个靶点的四种组合进行片段删除，获得删除效率。hoxc6b T1,hoxc13b T2组合的单位点效率均值为41％，片段删除效率为55％(图4，B)，hoxc6b T1,hoxc13b T1组合的单位点效率均值为47％，片段删除效率为60％(图4，C)，hoxc6b T2,hoxc13b T2组合的单位点效率均值为57.5％，片段删除效率为65％(图4，D)，hoxc6b T2,hoxc13b T1组合的单位点效率均值为63.5％，片段删除效率为70％(图4，E)。通过统计结果发现，片段删除的效率与单位点效率的均值呈现正相关。

(3)ttn1-ttn2片段删除结果

首先在我们设计的ttn簇靶点中随机挑选6个来验证单位点的敲除效率。选用靶点分别是ttn1 T1、ttn1 T2、ttn1 T3、ttn2 T1、ttn2 T2、ttn2 T5。其中ttn1 T1,ttn2 T5为无效率靶点；ttn1 T3对照组有杂带。因此选用ttn1 T2、ttn2 T1、ttn2 T2进行片段敲除。ttn1-ttn2簇片段删除效率和靶点效率之差柱状比较如图5，a所示，ttn1 T2、ttn2 T1、ttn2T2的酶切效率分别为46.2％、33.3％、44.2％(图5，b)。ttn1-ttn2簇各片段敲除效率进行统计，发现ttn1 T2-ttn2 T1片段敲除效率是11/22(50％)，ttn1 T2-ttn2 T2则是14/22(63.6％)(图5，c)。

(4)hoxa13b-hoxa2b片段删除结果

由于hoxab基因簇第一个外显子和最后一个外显子较短，无法找到更多的靶点来精确删除整个基因簇，因此在两端各设置两个靶点进行筛选，靶点分别是hoxa2b T1、hoxa2b T2、hoxa13b T1、hoxa13b T2。hoxa13b-hoxa2b簇片段删除效率和靶点效率之差柱状比较如图6，a所示，hoxa2b T1、hoxa2b T2、hoxa13b T1、hoxa13b T2的酶切效率分别为84.8％、54.5％、59.5％、65.8％(图6，b)，hoxa13b-hoxa2b簇各片段敲除效率进行统计，发现hoxa13b T1,hoxa2b T1片段敲除效率是9/20(45％)，hoxa13b T2,hoxa2b T1则是15/20(75％)，hoxa13b T2,hoxa2b T2则是17/20(85％)，hoxa13b T1,hoxa2b T2则是20/20(100％)(图6，c)。

(5)hoxca基因簇不同长度片段删除效率统计结果

对hoxca基因簇设置了55.7Kb、71.4Kb、91.6Kb、133.9Kb四种删除方式(图7，A)，双外侧引物PCR后检测了片段删除效率(图7，B),片段删除效率分别是hoxc1a-hoxc4a:65％，hoxc1a-hoxc6a:70％,hoxc1a-hoxc9a:35％,hoxc1a-hoxc13a:60％。同时统计了hoxc1a,hoxc4a,hoxc6a,hoxc9a,hoxc13a基因上使用的五个靶点的单位点效率(图7，C)，hoxc1a:57％,hoxc4a:88％,hoxc6a:56％,hoxc9a:69％,hoxc13a:72％。统计了不同片段删除的柱状图(图7，D)。通过折线图统计的方式发现，片段删除长度不影响片段删除效率，即片段删除效率与片段删除长度不相关(图7，E)。

(6)多个靶点与一对靶点片段删除效率比较不同靶点组合进行片段删除模式(图8，A)，第一行：靶点A1位于gene1的5’端，靶点A2位于基因n的3’端；第二行：靶点A1位于gene1的5’端，靶点A3、A2位于基因n的3’端；第三行：靶点A1、A4位于gene1的5’端，靶点A2位于基因n的3’端；第四行：靶点A1、A4位于gene1的5’端，靶点A3、A2位于基因n的3’端。

hoxca簇四种靶点组合片段删除效率(图8，B)，从上到下四种组合分别对应(A)模式图中的第一行至第四行。ttn簇四种靶点组合片段删除效率柱状图(图8，C)。从上到下四种组合分别对应(A)模式图中的第一行至第四行。

(7)hoxca簇删除的突变体斑马鱼产生无背鳍表型

hoxca簇删除模式前端靶点位于hoxc13a的第一个外显子CDS上，后端靶点位于hoxc1a的第二个外显子CDS上(图9，A)。

hoxca片段删除突变体与野生型外交产生的后代整体照片，三月龄，图示均为雄鱼(图9，B)，有背鳍(左)，基因型后续鉴定为WT sibling；无背鳍表型，基因型后续鉴定为hoxca^+/-。

无背鳍表型的鱼剪尾后使用hoxca簇双外侧引物PCR扩增电泳图(图9，C)。无背鳍鱼1-5:呈一条条带(标星)，有背鳍sibling C1、C2、C3无条带。

Ref为NCBI参考野生型序列(图9，D)，#3为(C)中3号鱼测序结果(图9)。

(8)hoxcb簇片段删除结果

hoxc13b T1和hoxc6b T1片段删除电泳的效率为14/20(图10，A)，随机挑取扩增产物进行测序结果(图10，B)；hoxc13b T2和hoxc6b T2片段删除电泳的效率为13/20(图10，C)；hoxc13b T2和hoxc6b T1片段删除电泳的效率为13/20(图10，D)，D图下方为随机挑取扩增产物进行测序结果。

(9)340kb ttn1-ttn2簇高效片段删除结果

ttn1 T5的酶切效率为89.2％，ttn2 T3的酶切效率为75.1％(图11，A)。将ttn1 T5和ttn2 T3与Cas9蛋白共注射后，随机取48h的胚胎进行双外侧引物PCR扩增，检测敲除效率为95％(20/20)(图11，B)。该片段删除是本发明中最长的片段删除，片段删除长度(即两个靶点间的距离)达到340kb(图11，C，*标注的柱子)，长于其它物种中进行的片段删除，且片段删除效率高于它们(图11，C)。

(10)统计片段删除效率结果

本发明中片段删除最长片段ttn1-ttn2长度达到340Kb，删除效率为100％(图11，C)；片段删除平均效率达到64.5％(图12，*)，高于其它物种中进行片段删除的平均效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用

<141> 2022-06-30

<160> 153

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggaggccctg gcaacagaag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggaagcagca gctccggggg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggggaaggct ggatcgcata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cattgatctc cattacaacc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggcggaaaga gaagtaaagg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ggggtgtttc gggagcaaac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggaagacagt aaaaaaaggg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gggtagtgct gcaacgttcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccaatggtgc tggacaagcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ggatggtgat ttggctcata 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atcagaccag tgaagtctcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gggcccaacc gttctcacct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gggccatgat gtctttttaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ggatagatta aacctgaggt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

caacaggtag agaggctccc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tattgagaca accgaggacc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ggtgtgaaag agaccgatgc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gagcgctgtt tgcatttacc 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aaattcctcc ataacacc 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ggttcattgt atacagtgcg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggtgtttcct agcgtggtgc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

aacccgtcac ccactgttcc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gcttacacct ctcagatgcc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

ggttctgctt gggccggctg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ccattcccgc tggattgacc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

agacatgaat ctctactgcc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

acacgcacag catcagttcc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

ggcaagacac ttagaaaaat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

atgatttgac ccgccatccc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

ggcccacggc tctcaatatt 20

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

ggctgttaga gctctttac 19

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

ggaactcttc gttcaggtga 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

ggggattttc ccgcctgacc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

tgcaagggac agtggctacc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

ccccttcggc tgcatcttcc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

acatgccact gaactcgacc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

aaaaccggat ttacgcgtcc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

atatcctcca gctcacgccc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

ggagactgtt tgggctcgaa 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

ggtcctgcat ccacgctggg 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

ggcaccatag cgactcacca 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

cgtcacgatg cattgatccc 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

agacgagcag cgctttgccc 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

ctttaagaat ggctgtctcc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

cttagcttga atccttcccc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

atgcctgggc aacgaaaacc 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

ggcaagacta tggaaccgaa 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

ggtaggagct ggccaagaca 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

gggagcctcg cgagtcacca 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

ggcctcgtcg gggacttcac 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

tctttgtcta cgtttccacc 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

accagccgcg atcaatcata 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

ggttagctgc aatacgcgga 20

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

agaaaccagc cgcgatcaa 19

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

gctgcaatac gcggatacag 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

accgcttagt catgttgggg 20

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

cgcatcaaga taagtgcaca aa 22

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

cattcccgct tcaaagcaca 20

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

caggtcccaa gaagaactga ag 22

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

ttcacattcc cgtagtcggc 20

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

aggtcccaag aagaactgaa gt 22

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

agccgacaaa tctgaaccga 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

acaaacgacg acatgggtgt 20

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

gctgggggtg caagtgatt 19

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

ccagttccag aggtgagctg 20

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

aggggcatat aagagcaagc a 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

acacaaggga gccaagtgag 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

cgccaggcta gggttgaaaa 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

tacaaacaag cagcccaggg 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

gctaccaaga cttgcacgag 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

ccccagaatt attagcgccc 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

ccaattggga gtggcttgga 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 73

taagggaatg ggcagcagag 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 74

attgttgctg aggcgctaga 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 75

aagtcatgct gtgggcaatg 20

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 76

gctgtgggca atgtgtcaat g 21

<210> 77

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 77

tagacaaacg cagtgacttg aa 22

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 78

agccgaagtt aacggttatg g 21

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

aatcctgtgg gcatgtgcac 20

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 80

cccttcacag tgctcaaggt a 21

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 81

caccccttcc tacgttaagc a 21

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 82

gttcttaccg tggcttgtgc 20

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 83

gccgaagtta acggttatgg a 21

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 84

agccgaagtt aacggttatg g 21

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 85

aatcctgtgg gcatgtgcac 20

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 86

cttgcaaaag gtgcaaggtg a 21

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 87

attaaagccg gaggcctcac 20

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 88

aggattggcc tctcctggaa 20

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 89

acggtttgag tttgagggct 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 90

aggattggcc tctcctggaa 20

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 91

acggtttgag tttgagggct 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 92

gactcagaac ggcgtacact 20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 93

tttgtatcgc tcgacggcaa 20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 94

acaatgtatc aggggcgctt 20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 95

tttgtatcgc tcgacggcaa 20

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 96

tacgaattcg agcgagagac g 21

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 97

gtatagtgga ccagggtcgg 20

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 98

gtgcctgctc tcgtccaata 20

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 99

cggcagctat tacccgtgta 20

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 100

tgttcggccg tgcaaaatac 20

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 101

cggagacaca ccattgtgtt 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 102

tgcatgtctc gcttgtgcat 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 103

agcactcagc acttctagcc 20

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 104

agcactcagc acttctagcc 20

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 105

catagaacca cccaccacca 20

<210> 106

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 106

cacttcaaag tggtccttct gtg 23

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 107

tgtcacccaa caatgcagag a 21

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 108

actgtcaccc aacaatgcag a 21

<210> 109

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 109

ttgtctcttt ccacaaatgg ct 22

<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 110

atagcatacc tgccaacaca ct 22

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 111

agcaagacaa ccagagcatg 20

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 112

aaacagctgt cagtggagca 20

<210> 113

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 113

gttagcactt ttgcaatccc tga 23

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 114

acaccgaaag cagcaagtca 20

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 115

tttacgacag gccatgacgg 20

<210> 116

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 116

ctttacaggg ttgctcgcta gt 22

<210> 117

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 117

taactctctc tctccgtctg cc 22

<210> 118

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 118

gcgtcagtat aactgtgcaa gc 22

<210> 119

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 119

aggcattggt aattacaccc ac 22

<210> 120

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 120

acaagctcga tattcctccg ta 22

<210> 121

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 121

gaggaccgta cgagtatgga tc 22

<210> 122

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 122

gagagggcga taggaaaggt at 22

<210> 123

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 123

ttttatggcc tcgtaaacca ct 22

<210> 124

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 124

ggatgcatgt aaaagagaag gg 22

<210> 125

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 125

agccgtcgac attagagaaa ag 22

<210> 126

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 126

tccatacact caccaacctc ac 22

<210> 127

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 127

tctcctaaga agccaagtct gg 22

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 128

aacccactct cttcgggcta 20

<210> 129

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 129

tctgagttac ggctacccct 20

<210> 130

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 130

aacccactct cttcgggcta 20

<210> 131

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 131

gctcttacca ggctgttcca 20

<210> 132

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 132

gttacggcta cccctttgga 20

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 133

acaggttatg actgcgcatc c 21

<210> 134

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 134

tcaccaggga tccgtgtact 20

<210> 135

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 135

cgcatccact agctctgcat 20

<210> 136

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 136

tcgagctgtt attgtatcca ctc 23

<210> 137

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 137

tatgacgact tcgctggtcc 20

<210> 138

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 138

tcgagctgtt attgtatcca ctc 23

<210> 139

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 139

tatgacgact tcgctggtcc 20

<210> 140

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 140

tcgagctgtt attgtatcca ctc 23

<210> 141

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 141

tatgacgact tcgctggtcc 20

<210> 142

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 142

ctatgacccg gtgcgacatt 20

<210> 143

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 143

aacgtcttga tgccttgcag 20

<210> 144

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 144

ctcacaggag ttggctatgg g 21

<210> 145

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 145

gtgtgttgct tcgccactt 19

<210> 146

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 146

agcatcgaca acccatgacc 20

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 147

tggctatttg gacgtcccag 20

<210> 148

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 148

tgggcggaca cactgattta 20

<210> 149

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 149

atccaggcat gaagcgttgt 20

<210> 150

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 150

caaagagcgt tcgtgttggt ag 22

<210> 151

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 151

gcttcttttg gtaacgtcga aact 24

<210> 152

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 152

accagccgcg atcaatcata 20

<210> 153

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 153

acaatccagc ctgatctcac g 21

Claims

1.高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S5、步骤S4中gRNA与Cas9蛋白或Cas9 mRNA分别显微注射导入到所述处理对象的一细胞期受精卵中；

S7、步骤S6得到的PCR产物依次经过酶切和琼脂糖凝胶电泳，得到的胶图根据ImageLab软件定量工具检测条带灰度值，得到a、b和c每个条带的亮度体积，根据公式indel％＝(a+b)/(a+b+c)×100％计算得到敲除效率；

2.根据权利要求1所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，步骤S8中，从待删除基因片段两端的特异性CRISPR靶点中选择T7E1酶切活性高且相似的特异性CRISPR靶点作为最优靶点组合。

3.根据权利要求1所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法同时满足：

4.根据权利要求1所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，步骤S6中，所述敲除靶点检测引物为可扩增出包含所述靶点的特异性引物。

5.根据权利要求1所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，步骤S5中，gRNA的终浓度为100～200ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为800ng/μL，Cas9 mRNA的终浓度为400ng/μL，注射量为1nL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，通过权利要求1-5任一项所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，包括以下步骤：

(1)在斑马鱼的ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中确定基因敲除的靶点序列，在符合CRISPR PAM区的条件下其待删除基因片段两端分别设计不少于三个特异性CRISPR gRNA靶点序列；

(4)步骤(3)得到的PCR产物进行纯化，体外转录，获得gRNA；

(5)步骤(4)得到的gRNA与Cas9蛋白或Cas9 mRNA显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中；

7.根据权利要求6所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述靶点序列如下表所示：

8.根据权利要求6所述的高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增引物的序列如下表所示：

9.权利要求1-8任一项所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在脊椎动物的基因组内基因大片段删除中的应用。

10.权利要求1-8任一项所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在构建用于由基因组大片段缺失导致的疾病治疗和药物筛选的动物模型中的应用。