CN115068594A - 一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶及其制备方法，包括以下步骤：S1采用含有羧基的聚合物与含氨基且具有苯硼酸结构的化合物制备侧链含有苯硼酸结构的功能聚合物；S2将水溶性生物活性物质或载药纳米胶束溶解于含两个及以上邻苯二酚结构的化合物溶液中，制得溶液b；S3将步骤S1制得的功能聚合物制备成溶液a，并与步骤S2得到的溶液b混合，制得基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶。本发明制备的基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶不仅可以起到机械支撑的作用，还具有明显的促细胞生长功能和抗氧化活性，能够有效促进受损心脏部位血管的生成及受损心肌组织修复。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及到一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶及其制备方法。
背景技术
心力衰竭简称心衰，主要是继发于心血管疾病而出现的一个综合症，包括由于心肌出现一些损伤、心脏的收缩功能和舒张功能发生障碍、心脏有效射血的减少而导致的心脏循环障碍的症状。心肌梗死及相关心力衰竭是导致死亡的主要原因，尽管直接经皮冠状动脉介入治疗提高了心梗早期生存率，但是约有50％的患者仍会出现心力衰竭。心衰治疗的主要困难来自于心脏组织自身再生能力的有限，目前的心衰治疗手段的选择非常有限，主要可分为药物治疗和非药物治疗两大类，其中药物是目前使用的标准策略，能够有效地提高心肌收缩力、降低心脏负荷，但无法遏制左心室功能的持续衰减。传统的非药物治疗包括心脏再同步治疗、心脏复律除颤器、心脏移植等，虽然能在一定程度上弥补药物治疗的缺陷，但具有价格昂贵、持续疗效时间短、供体来源有限、手术风险高、多种临床并发症等局限，因此，迫切需要新的治疗药物来修复心肌梗死后的心脏。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶及其制备方法，该水凝胶在生理条件下具有良好的生物相容性、降低活性氧水平和促进受损心脏部位相关细胞增殖、迁移、血管再生的优点，因此可以用于实现受损心脏的功能修复的目的。
为达上述目的，本发明提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：采用含有羧基的聚合物与含氨基且具有苯硼酸结构的化合物制备侧链含有苯硼酸结构的功能聚合物；
S2：将水溶性生物活性物质或载药纳米胶束溶解于含两个及以上邻苯二酚结构的化合物溶液中，制得溶液b；
S3：将步骤S1制得的功能聚合物制备成溶液a，并与步骤S2得到的溶液b混合，制得基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶。
进一步地，步骤S1中具体包括以下步骤：
S1.1、将含有羧基的聚合物溶解于pH值为4.6～6.0的缓冲液中得到聚合物溶液，向聚合物溶液中加入混合的活化试剂搅拌3～6h；
S1.2、于步骤S1.1制得的产物中加入含氨基且具有苯硼酸结构的化合物，于30～40℃以及惰性气体保护的反应条件下反应24～48h，将反应产物经去离子水透析后冷冻干燥，即可制得侧链含有苯硼酸结构的功能聚合物。
进一步地，含有羧基的聚合物为海藻酸钠、透明质酸、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶或它们的改性产物；含氨基且具有苯硼酸结构的化合物为4-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸或它们的衍生物；混合的活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，含羧基的聚合物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1～3:0.5。
进一步地，步骤S1中含有羧基的聚合物与含氨基且具有苯硼酸结构的化合物的质量比为0.8～2:1。
进一步地，水溶性生物活性物质为重组Ⅰ型人源化胶原蛋白、重组Ⅲ型人源化胶原蛋白、抗炎药、生长因子、基因药物或促血管生成药物。
优选的，重组II型人源化胶原蛋白是指：由DNA重组技术制备的人III型胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
其中重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的氨基酸序列如下：
GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。
优选的，重组I型人源化胶原蛋白是指：由DNA重组技术制备的人I型胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
重组I型人源化胶原蛋白的氨基酸序列如下：
GEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS。
优选的，含两个及以上邻苯二酚结构的化合物为原花青素、单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、鞣花酸、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、棉酚或它们的衍生物。
进一步地，载药纳米胶束通过以下方法制备得到：
将两亲性聚合物与疏水性药物溶解于良性溶剂中，持续搅拌的同时滴加去离子水，搅拌2～4h后，于去离子水中透析，制得；
两亲性聚合物与疏水性药物的质量比为5～7:1。
上述疏水性药物为抗炎药、促细胞增殖药或促细胞迁移药；其中，优选为姜黄素、MMP-9激动剂吡唑啉酮衍生物等。
上述良性溶剂为二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺、甲醇或丙酮。
优选的，载药纳米胶束制备过程中两亲性聚合物通过以下方法制备得到：将亲水性聚合物和疏水分子在室温条件下完全溶解于水和二甲基亚砜的混合溶剂中，并向其中加入N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，连续搅拌45～50h，将混合物在水中透析2～3天，最后进行冻干备用；其中，亲水性聚合物、疏水分子、N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为4～6:3～5:2～4:1。
上述两亲性聚合物制备方法中，亲水性聚合物为透明质酸、海藻酸钠、葡聚糖、壳聚糖、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺；疏水分子为胆固醇、对醛基苯甲酸、对羟基甲基苯甲醛、聚乳酸、磷脂或疏水性多肽。
进一步地，步骤S2的混合溶液中，水溶性生物活性物质或载药纳米胶束的浓度均为0.1～8.0g/L，含两个及以上邻苯二酚结构的化合物的浓度为5～20wt％。
进一步地，步骤S3中溶液a与溶液b的混合体积比为2～6:1。
进一步地，步骤S3混合后的溶液中，含有苯硼酸结构的功能聚合物的质量浓度为2～15wt％。
本发明还提供了一种采用上述制备方法制备得到的基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶。上述水凝胶是在无菌环境下，将含有生物活性物质的含两个或多个邻苯二酚结构的化合物溶液与含苯硼酸的功能聚合物溶液均匀混合成胶，接着灌装于注射器或传输***中，直接多位点注射至心室壁内进行治疗。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明的制备方法中，如原花青素等含两个或多个邻苯二酚结构的天然多酚化合物具有良好的抗氧化活性，且能与含苯硼酸的功能聚合物交联制备可注射水凝胶，并能负载多种活性物质，富有促受损心脏心肌组织修复的潜力。
本发明的制备方法中，基于硼酸酯键、含邻苯二酚结构的水凝胶具有良好的生物相容性，不易引起机体免疫反应，并具有良好的可注射性能和抗氧化活性，能够有效装载生物活性物质(包括重组Ⅰ型人源化胶原蛋白、重组Ⅲ型人源化胶原蛋白和生长因子)，在心脏损伤修复、促进心脏血管再生、提升心脏功能方面发挥重要作用。
2、本发明的制备方法利用苯硼酸基团和邻苯二酚基团之间的动态硼酸酯键交联，成胶迅速；并且制备方法简单，水凝胶具有优越的流变学性能和可注射性能。
3、本发明制备的基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的注射性能和抗氧化性能良好，同时装载有生物活性物质重组人源化胶原蛋白等，能够在生理条件下具有良好的生物相容性，可以降低活性氧水平和促进受损心脏部位相关细胞增殖、迁移、血管再生，最终实现受损心脏的功能修复的目的。
4、本发明制备的基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶不仅可以起到机械支撑的作用，还具有明显的促细胞生长功能和抗氧化活性，能够有效促进受损心脏部位血管的生成及受损心肌组织修复。
附图说明
图1为本发明实施例1中水凝胶的凝胶图像；
图2为本发明实施例1中水凝胶的心肌细胞毒性结果；
图3为本发明实施例1中水凝胶的动物治疗超声实验结果；
图4为本发明实施例1中水凝胶的动物治疗切片结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将4mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(2wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例2
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将5mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例3
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载血管内皮生长因子的原花青素溶液配制
将1.0mg的血管内皮生长因子溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载血管内皮生长因子的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例4
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载去铁胺(促血管生成药物)的原花青素溶液配制
将1.0mg的去铁胺溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载去铁胺的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例5
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2载药纳米胶束的制备
将10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和1mg姜黄素溶于DMSO(二甲基亚砜10mL)中，然后在缓慢搅拌的情况下，将其逐滴加入到10mL水中，最终，混合物在水中透析2天，制得载药纳米胶束。本实施例中的PLGA为常规市售可得，不需要单独制备。
S3装载载药纳米胶束的原花青素溶液配制
将0.1mg载药纳米胶束溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，室温下充分溶解。
S4水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载载药纳米胶束的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例6
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰透明质酸(HA-BA)的合成
S1.1将1g透明质酸溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化透明质酸中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到HA-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的HA-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例7
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰羧甲基壳聚糖(CMCS-BA)的合成
S1.1将1g羧甲基壳聚糖溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化羧甲基壳聚糖中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到CMCS-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的CMCS-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例8
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰羧甲基纤维素(CMC-BA)的合成
S1.1将1g羧甲基纤维素溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化羧甲基纤维素中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到CMC-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的CMC-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例9
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰明胶(GL-BA)的合成
S1.1将1g明胶溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化明胶中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到GL-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的GL-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例10
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的4-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL原花青素溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的原花青素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例11
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的单宁酸溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL单宁酸溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的单宁酸溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例12
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL表没食子儿茶素没食子酸酯溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例13
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的鞣花酸溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL鞣花酸溶液(10wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的鞣花酸溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例14
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的表没食子儿茶素溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL表没食子儿茶素溶液(12wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的表没食子儿茶素溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例15
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的表儿茶素没食子酸酯溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL表儿茶素没食子酸酯溶液(12wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的表儿茶素没食子酸酯溶液中，立即交联形成水凝胶。
实施例16
本实施例提供了一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1苯硼酸修饰海藻酸钠(ALG-BA)的合成
S1.1将1g海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，并将溶液保持在N2的保护氛围中。
S1.2将575mg的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和345mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到pH为5.0的MES缓冲溶液中，再加入步骤S1.1制得的溶液并搅拌3h以活化海藻酸钠中的羧基。
S1.3然后将569mg的3-氨基苯硼酸加入步骤1.2制备的混合溶液中，反应在室温下持续36h。
S1.4反应结束后，将溶液在酸性条件下透析3天并冻干，得到ALG-BA。
S2装载重组III型人源化胶原蛋白的棉酚溶液配制
将4.0mg的重组III型人源化胶原蛋白溶解于1mL棉酚溶液(12wt％)中，于室温下充分溶解。
S3水凝胶的制备
室温下将1mL的ALG-BA(10wt％)溶液缓慢加入到搅拌状态下的1mL装载重组III型人源化胶原蛋白的棉酚溶液中，立即交联形成水凝胶。
性能测试
以实施例1制得的物质为例，进行检测，具体操作过程及结果如下(如无特殊说明，水凝胶组1-4组分别代表以下组合)：
水凝胶组1(Hydrogel 1)：空白水凝胶；
水凝胶组2(Hydrogel 2)：水凝胶包载姜黄素；
水凝胶组3(Hydrogel 3)：水凝胶包载重组人源化III型胶原蛋白；
水凝胶组4(Hydrogel 4)：水凝胶包载姜黄素和重组人源化III型胶原蛋白。
一、对水凝胶进行成胶性能检测
图1为水凝胶的制备及可注射性结果图，水凝胶能从1mL注射器里被注射出来，证明了水凝胶具有良好的可注射性。
二、对水凝胶进行生物相容性检测
采用大鼠心肌细胞(H9C2)对水凝胶的生物相容性进行评价。将紫外灭菌后的水凝胶在细胞培养基(0.2g/mL)中浸提48h，制备材料浸提液，分别在96孔板接种H9C2细胞，接种密度为每孔8000个。24h后，移出细胞培养液，用水凝胶浸提液替代不同的水凝胶样品加入孔板中。培养72h的H9C2细胞的增殖率采用CCK-8来进行检测。孵育72h后，每孔加入新鲜培养基(90μL)和稀释的CCK-8溶液(10μL)。2h后，通过用酶标仪测定450nm处的吸收值来计算细胞增殖率。
水凝胶对大鼠心肌细胞的存活率结果如图2所示，结果表明，所有水凝胶组对细胞在72h显示无毒性，表明水凝胶具有良好的细胞相容性。此外，水凝胶在负载生物活性物质重组Ⅲ型人源化胶原蛋白后，细胞存活率高于对照组和空白水凝胶组，表明重组Ⅲ型人源化胶原蛋白有效地促进了细胞的增殖，表明水凝胶具有良好的生物相容性。
三、对水凝胶进行体内有效性检测
利用永久结扎心脏左前降支的方法构建大鼠急性心肌梗死的疾病模型，结扎后立即在心梗区域注射生理盐水或水凝胶，注射3-5个位点，每点注射20μL。在术后第14、28天对建模成功的心肌梗死大鼠进行超声心动图检测(利用M型图直接观察心室壁的运动情况)；在第14、28天取得大鼠心脏样本进行切片染色：利用Masson染色观察心脏左心室壁厚及纤维化程度。
术后第14及28天心梗大鼠M型超声心动图检测结果如图3所示，假手术组(SHAM)大鼠左心室壁收缩舒张正常、呈标准的M型；心梗组(MI)的心室壁停止收缩舒张、呈一条直线；空白水凝胶(Hydrogel 1)的心室壁比心梗组有较小提升，与水凝胶的机械支撑有关；水凝胶载姜黄素、重组人源化III型胶原蛋白(Hydrogel 2、3、4)较空白水凝胶组也有较大提升，其中Hydrogel 4治疗效果最为明显。
术后第14及28天心梗大鼠MASSON染色结果如图4所示，SHAM组大鼠左心室壁厚度正常；MI组的左心室负性扩张、心室壁变薄；空白水凝胶、水凝胶载姜黄素、重组人源化III型胶原蛋白组心室壁依次增厚、纤维面积依次减少，Hydrogel 4治疗效果最为明显。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：采用含有羧基的聚合物与含氨基且具有苯硼酸结构的化合物制备侧链含有苯硼酸结构的功能聚合物；
S2：将水溶性生物活性物质或载药纳米胶束溶解于含两个及以上邻苯二酚结构的化合物溶液中，制得溶液b；
S3：将步骤S1制得的功能聚合物制备成溶液a，并与步骤S2得到的溶液b混合，制得基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中具体包括以下步骤：
S1.1、将含有羧基的聚合物溶解于pH值为4.6～6.0的缓冲液中得到聚合物溶液，向所述聚合物溶液中加入混合的活化试剂搅拌3～6h；
S1.2、于步骤S1.1制得的产物中加入含氨基且具有苯硼酸结构的化合物，于30～40℃以及惰性气体保护的反应条件下反应24～48h，将反应产物经去离子水透析后冷冻干燥，即可制得侧链含有苯硼酸结构的功能聚合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述含有羧基的聚合物为海藻酸钠、透明质酸、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶或它们的改性产物；所述含氨基且具有苯硼酸结构的化合物为4-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸或它们的衍生物；所述混合的活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，所述含羧基的聚合物与所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1～3:0.5。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中含有羧基的聚合物与含氨基且具有苯硼酸结构的化合物的质量比为0.8～2:1。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性生物活性物质为重组Ⅰ型人源化胶原蛋白、重组Ⅲ型人源化胶原蛋白、抗炎药、生长因子、基因药物或促血管生成药物；
所述含两个及以上邻苯二酚结构的化合物为原花青素、单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、鞣花酸、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、棉酚或它们的衍生物。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载药纳米胶束通过以下方法制备得到：
将两亲性聚合物与疏水性药物溶解于良性溶剂中，持续搅拌的同时滴加去离子水，搅拌2～4h后，于去离子水中透析，制得；
所述两亲性聚合物与疏水性药物的质量比为5～7:1。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的混合溶液中，水溶性生物活性物质或载药纳米胶束的浓度均为0.1～8.0g/L，含两个及以上邻苯二酚结构的化合物的浓度为5～20wt％。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中溶液a与溶液b的混合体积比为2～6:1。
9.如权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3混合后的溶液中，含有苯硼酸结构的功能聚合物的质量浓度为2～15wt％。
10.采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的基于重组人源化胶原蛋白的可注射心衰治疗水凝胶。
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