CN115068496A - Dna四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物及其制备治疗急性肾损伤的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了香蒲新苷治疗急性肾损伤的新用途，并公开了DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物，DNA四面体框架核酸和香蒲新苷具有协同增效减少肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡，减少肾脏组织坏死、恢复肾功能的作用，并能防治肾纤维化，阻止急性肾损伤向慢性肾病的发展，为临床提供了新的选择。

Description

DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物及其制备治疗急性 肾损伤的药物的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物及其制备治疗急性肾损伤的药物的用途。
背景技术
急性肾损伤(AKI)是全球发生率最高的综合征之一，是一个有害的全球性问题，与慢性肾脏疾病(CKD)和各地区的医院死亡率关系密切。急性肾损伤住院患者的死亡率通常为10～20％，ICU病人为44.7％～53％。并且，即使是轻微的肾功能损伤也会导致不良预后并影响长期肾功能。急性肾损伤患者发生慢性肾病的风险增加了6倍，初期慢性肾病进展到终末期慢性肾衰的风险增加了28倍。急性肾损伤既是发生慢性肾病的危险因素，也是慢性肾病进展的启动因素。目前针对急性肾损伤有许多的临床研究，然而，目前尚无特异性和无肾毒性的治疗可用于在早期阶段逆转急性肾损伤从而改善预后。因此，迫切需要开发新颖的，有效的急性肾损伤治疗方法。
香蒲的花粉被称为“蒲黄”，是一种广泛分布的水生植物，具有降血脂及抗动脉粥样硬化、抗凝血、心肌缺血保护、镇痛等药理作用。类黄酮成分香蒲新苷(Typhaneoside，Typ，CAS：104472-68-6)是蒲黄的主要提取物，在心脏缺血再灌注损伤等疾病中表现出良好抗氧化应激作用。但目前，香蒲新苷对急性肾损伤的作用尚未见报道。同时，正如大多数中药单体一样，香蒲新苷受到其水溶性差、全身生物利用度低和在生理介质中的不稳定性的限制，严重制约了其治疗效果。
DNA纳米结构具有天然的生物相容性、稳定的结构、高生物利用度的特点，近年来已成为一个热门的研究课题。其中，DNA四面体框架核酸(tFNAs)可由四个单链DNA(ssDNA)通过退火组装，易于制备且稳定性极佳，适用于广泛的应用。值得注意的是，得益于DNA材料的双链结构和化学特性，tFNAs能够搭载种寡核苷酸药物，如反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、抗菌肽等多肽，以及白藜芦醇、姜黄素等小分子药物。基于表面负电荷和独特的四面体框架，tFNAs能够通过小窝蛋白介导表现出优良的入胞效果，可以增加tFNAs携带的药物在细胞内的累积。同时，此前有中国专利CN112587542A公开了tFNA对急性肾损伤的治疗作用。而将tFNA与香蒲新苷复合后的药理作用，尚有待进一步探索研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可治疗急性肾损伤的DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物。
本发明提供了香蒲新苷在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。
本发明还提供了一种复合物，它是DNA四面体框架核酸和香蒲新苷复合而成；所述DNA四面体框架核酸是由序列分别如SEQ ID NO.1～4所示的4条单链DNA分子经过碱基互补配对形成。
进一步地，上述复合物中香蒲新苷的含量为10wt～70wt％。
进一步地，上是将DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的混合溶液搅拌、超滤后制得；
优选地，所述DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的摩尔比为1:(80～200)；更优选地，所述DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的摩尔比为1:200。
本发明还提供了上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别配制DNA四面体框架核酸的溶液和香蒲新苷溶液；
(2)香蒲新苷溶液添加到DNA四面体框架核酸的溶液中搅拌，超滤，即得；优选地，所述搅拌是在20～30℃搅拌5～7小时。
进一步地，上述DNA四面体框架核酸的溶液是通过如下方法制成：将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于足以使其变性的温度下维持至少10min，再将温度降低到2～8℃维持至少20min；
优选为将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于95℃维持10min，再将温度降低到4℃维持20min。
本发明还提供了上述的复合物在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。、进一步地，上述药物是减少肾脏组织坏死和/或恢复肾功能的药物。
更进一步地，上述药物是减少肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡的药物。
进一步地，上述药物是阻止急性肾损伤发展为慢性肾病药物；优选为防治肾纤维化的药物。
本发明的有益效果：本发明提供了香蒲新苷治疗急性肾损伤的新用途，并公开了DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物，DNA四面体框架核酸和香蒲新苷具有协同增效减少肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡，减少肾脏组织坏死、恢复肾功能的作用，并能防治肾纤维化，阻止急性肾损伤向慢性肾病的发展，为临床提供了新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为tFNA-Typ的合成表征和入胞。(a)tFNA和TTC合成示意图。(b)tFNA和TTC的PAGE图像。(c)GelRed(λex＝312nm)在tFNAs(250nM)或TTC(tFNA-OD值，统计分析：****p<0.0001vs Gel-Red，####p<0.0001vs tFNAs(n＝5)。(d，e)Typ、tFNA和TTC的尺寸分别为2.4170±0.1417nm、11.77±1.909nm和16.93±3.727nm；Zeta(ζ)电位分别为-0.338±2.28mV，-2.51±3.7mV，-9.74±3.71mV。(f)TTC的吸收峰(tFNAs～262nm，Typ～378nm)。(g)TTC的原子力显微镜图像。(h)TTC的透射电镜图像。(i)共聚焦显微镜观察TTC在6h后入胞情况。红色：TTC；蓝色：细胞核；绿色：细胞骨架。(j)流式细胞术观察HK-2细胞在4小时和6小时后对tFNAs和TTC的摄取情况。蓝色：tFNAs；橙色：TTC。
图2为tFNA-Typ在体外的抗凋亡能力。(a)I/R损伤导致肾小管上皮细胞凋亡示意图。(b)通过CCK-8测定分析的tFNAs，Typ和TTC对健康和I/R HK-2细胞的细胞活力的影响(n＝3)。(c)使用流式细胞术测定各组细胞的凋亡：对照组，I/R组，I/R+tFNAs组，I/R+Typ组和I/R+TTC组。(d)(c)组的凋亡统计，包括细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。(e)使用共聚焦显微镜和蛋白质印迹检测tFNAs，Typ和TTC处理后HK-2中细胞色素C的表达。通过ImageJ计算的相关蛋白的定量(n＝3)。(f)使用共聚焦显微镜和蛋白质印迹检测tFNAs，Typ和TTC处理后HK-2中Caspase-3的表达。通过ImageJ计算的相关蛋白的定量(n＝3)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(*：对照，#：I/R，@：tFNAs，&：Typ)。
图3为tFNA-Typ恢复肾功能并防止肾小管损伤。(a)建立鼠I/R损伤AKI模型示意图。(b)TTC在健康和AKI小鼠中的生物分布以及从AKI小鼠的肾脏荧光分布。(c)TTC靶向肾小管的能力。绿色：肾小管；红色：Cy5-TTC；蓝色：细胞核。(d、e)通过PAS染色和HE染色来评估AKI组织病理学损伤。黑色箭头表示刷状缘消失，红色箭头表示脱落细胞，红色星号表示透明管型。(f)Kim-1标记的损伤肾小管。红色：Kim-1；绿色：肾小管；蓝色：细胞核。(g)五组小鼠血肌酐和尿素氮水平：对照组，I/R组，I/R+tFNAs组，I/R+Typ组和I/R+TTC组。(h，i)在十个随机HE或PAS染色组织切片上计算肾小管损伤评分，对每只小鼠的结果进行平均(n＝5)。(j)Kim-1相对荧光强度的半定量分析(n＝5)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(*：对照，#：I/R，@：tFNAs，&：Typ)。
图4为tFNA-Typ减少凋亡细胞，有助于肾功能的恢复。对五组凋亡细胞进行TUNEL测定：对照组，I/R组，I/R+tFNAs组，I/R+Typ组和I/R+TTC组。绿色:TUNEL；蓝色：细胞核。
图5为tFNA-Typ阻止急性肾损伤向慢性肾病的进展。(a)WB和免疫荧光染色的ColI蛋白质水平。红色：Col I；蓝色：细胞核；绿色：细胞骨架。通过ImageJ计算的蛋白的WB相对定量(n＝3)。(b)WB和免疫荧光染色的α-SMA蛋白质水平。红色：α-SMA；蓝色：细胞核；绿色：细胞骨架。通过ImageJ计算的蛋白的WB相对定量(n＝3)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(*：对照，#：I/R，@：tFNAs，&：Typ)。
图6为Typ的标准曲线以及tFNA-Typ的包封率，载药量。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明复合物tFNA-Typ的合成和表征
如图1a所示的示意图，tFNA-Typ的合成分为两个步骤。
(1)tFNA合成：将四种序列特异性单链DNA(ssDNA)(Sangon，上海，中国)添加到等摩尔量的由Tris-HCl和MgCl2组成的TM缓冲液中，然后加热(95℃，10分钟)并冷却(4℃，20分钟)，即自组装形成tFNA。
四条单链的具体序列
Figure BDA0003720750560000041
(2)Typ和tFNA的复合：将不同浓度的Typ(20μM、40μM、80μM、160μM、240μM、320μM、600μM、900μM)与250nM tFNA，等体积混合并搅拌6小时。然后，通过超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)去除残留的ssDNA和Typ，即得不同Typ含量的tFNA-Typ。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明复合物的表征
1、实验方法
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)验证了tFNA-Typ的成功合成并显示了其大小和形状。动态光散射DLS(Nano ZS,Malvern,England)用于测量tFNA和tFNA-Typ的粒径和Zeta电位。tFNA、Typ和tFNA-Typ的吸光度曲线用超微分光光度计描绘。GelRed的荧光由Varioskan LUX酶标仪(Thermo Scientific，USA)检测。包封率和载药量的计算公式如下：
Figure BDA0003720750560000042
2、实验结果
首先，tFNA由四个等摩尔量的ssDNA自组装，并且通过PAGE检测到成功合成(图1b)。随后，tFNA通过搅拌6h与Typ复合。tFNA-Typ的成功合成也在PAGE中得到验证(图1b)，其中显示tFNA-Typ的位置相对tFNA上移。Typ可以通过嵌入结合模式与DNA相互作用。因此，当tFNA和tFNA-Typ在PAGE中用GelRed染料染色时，与核酸结合的GelRed被Typ取代。为了进一步验证这一假设，应用了GelRed染料竞争测定。简而言之，当tFNA与1x GelRed孵育20分钟时，荧光被激发，而tFNA-Typ与GelRed一起孵育，GelRed的荧光强度降低(图1c)。这意味着Typ与tFNA相互作用的位置是与GelRed相同的双链DNA双螺旋槽区。
此外，通过DLS检测tFNA和tFNA-Typ的大小和zeta电位，也证实了tFNA-Typ的成功合成。在图1d中，tFNA的大小为11.77±1.91nm，Typ的大小为2.417±0.142nm，而tFNA-Typ的大小为16.93±3.73nm。tFNA的zeta电位为-2.51±3.70mV，Typ的zeta电位为-0.338±2.280mV，而tFNA-Typ的zeta电位为-9.74±3.71mV(图1e)。这些差异表明新的纳米颗粒tFNA-Typ已产生，并且与tFNA比较相对稳定。此外，图1f中的光谱表明tFNA-Typ的特征吸收峰接近tFNA(260nm)和Typ(260、385nm)，这表明Typ被tFNA成功搭载，没有副产物。为了表征tFNA-Typ的形状和大小，进行了AFM和TEM(图1g，h)。AFM图像显示tFNA-Typ约为20nm。从TEM图像中获得了相同的结果，并且通过TEM观察到三角形结构。总的来说，这些现象表明我们首次构建了一种新型纳米药物***tFNA-Typ，其中Typ通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。
此外，我们通过应用Typ和tFNAs的不同投料比来检测Typ到tFNAs中的包封率和载药量(图6)。随着包封率(encapsulation efficiency，EE)的下降，载药量(loadingefficiency，LE)提高。我们选择了EE和LE交点处投料比，其中tFNAs的浓度为250nM,Typ浓度为50μM，按比例投料后得到的EE约为50％，LE约为34％。在随后的实验中，均采用相应的投料比(10μg tFNAs：5.51μg Typ；即摩尔比1:200)。
实验例2、Cy5标记的tFNA和tFNA-Typ的细胞摄取
1、实验方法
为了检查tFNA和tFNA-Typ的细胞进入性能，首先用Cy5标记的tFNA和tFNA-Typ处理HK-2细胞4小时或6小时。然后收集细胞并用PBS冲洗3次。最终，通过流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman Coulter Inc.，Brea，USA)获得具有荧光Cy5的细胞占所有细胞的比例。此外，通过共聚焦显微镜(N-SIM，Nikon，Tokyo，Japan)获得了Cy5标记的tFNA和tFNA-Typ分散在细胞中的图像。
2、实验结果
多项研究已经证明，tFNA是一种出色的载体，它具有出色的入胞性能，这也是其最显著的优势之一。我们使用流式细胞术和共聚焦显微镜检验了Cy5标记的tFNA和tFNA-Typ进入HK-2细胞的情况。根据流式细胞术的结果(图1i)，可检测到tFNA-Typ和tFNA荧光的细胞比例均达到95％以上，tFNA和tFNA-Typ之间没有统计学差异。从激光共聚焦显微镜的图像(图1j)中可以得到类似的结果，观察到Cy5标记的tFNA和tFNA-Typ广泛分布在细胞的细胞质中。该现象表明添加Typ不会干扰tFNA的优异的入胞性能，这有助于tFNA和Typ发挥生物学功能。综上所述，这些结果表明，在tFNA-Typ纳米载药***中，tFNA是一种极具前途的载体，可以提高Typ的稳定性和释放能力，并保持出色的进入细胞的能力。
实验例3、tFNA-Typ在体外的抗凋亡能力
1、实验方法
1.1HK-2细胞处理后的细胞活力
人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2细胞在含有高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基、10％胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，USA)和1％青霉素-链霉素溶液(HyClone，Logan，USA)的完全培养基中培养。根据先前的研究以及造模探索，采取低氧/复氧模型：将HK-2细胞接种在96孔板中(8000个细胞/孔)。先于低氧培养箱中无血清无糖培养基中培养6小时(1％O2，5％CO2，94％N2)，再复氧完全培养基下培养24小时。细胞复氧同时用实施例1制备的不同投料比例的tFNA-Typ(投料摩尔比tFNA:Typ＝1:80,1:120，1:160，1:200，根据先前的研究，tFNA的浓度为250nM)培养细胞24h，I/R组不加入药物，对照组在正常氧气浓度下完全培养基培养。然后将细胞在10％CCK-8溶液(KeyGEN Biotech)中于37℃培养1小时。通过450nm处的OD值测量细胞活力。
为了验证tFNA-Typ、Typ和tFNA处理对低氧/复氧诱导的HK-2细胞活力的影响，细胞先于低氧培养箱中培养6小时(1％O2，5％CO2，94％N2)，再复氧24小时并加入tFNA(250nM)、Typ(50μM)、tFNA-Typ(tFNA:250nM；Typ:50μM，未经超滤)。如上述过程进行细胞活力测定。
1.2细胞凋亡测定
流式细胞仪检测细胞凋亡，将HK-2细胞接种在6孔板上。不同处理后，我们用不含EDTA胰蛋白酶消化细胞，并用PBS洗涤两次。通过PI和膜联蛋白V染色，通过流式细胞仪检测细胞凋亡(Millipore Guava,MA,USA)。
1.3蛋白质印迹分析
在不同处理之后，用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗Caspase3一抗(1:1000；Abcam，英国剑桥)、抗Cytochrome C一抗(1:1000；CST，美国波士顿)和抗β-Actin一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、)在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime,上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测***(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
1.4免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。如前所述处理后，将样品在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％Triton X-100处理10分钟。然后，将样品在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(A1R MP+，Nikon，Tokyo，Japan)观察所有样品。
2、实验结果：图2a为急性肾损伤的肾小管上皮细胞凋亡示意图。近端肾小管上皮细胞凋亡，导致肾小管衰竭和血尿屏障损伤，进而导致肾小球滤过率(GFR)下降和肾功能损伤。因此，有研究证明了在减少近端肾小管上皮细胞凋亡是治疗急性肾损伤的有效方法。为了验证tFNA-Typ的抗凋亡性能，我们应用了低氧/复氧细胞模型作为体外模型。首先，我们进行了细胞活力测定，以确保tFNA-Typ的生物安全性，这是用于细胞实验的前提。如图2b所示，tFNA-Typ组促进了HK-2细胞的活力，特别是与I/R组相比。该结果证实了tFNA-Typ良好的生物安全性。值得注意的是，tFNA-Typ对细胞活力的促进呈现出一定的浓度剂量依赖性。具体而言，当tFNA浓度为250nM，Typ浓度为40～50μM时，制备的复合物细胞活力最佳，以上两种浓度无统计学差异。进而我们测定了不同药物处理后细胞的凋亡情况，如图2c所示，tFNA-Typ与其他组相比可以明显减少细胞的早期和晚期凋亡，并有显著统计学意义，且tFNA和Typ表现出协同增效的作用。
在正常生理条件下，细胞色素c大部分存在于线粒体内膜中，参与ATP的合成，当线粒体受到氧化应激损伤后，线粒体外膜通透性增加，细胞色素c游离到细胞质中，促进Caspase-3上调从而导致细胞凋亡。本研究通过蛋白质印迹分析和免疫荧光染色研究了细胞色素c和Caspase-3的表达,如图2d,e,f所示，tFNA-Typ与其他组相比可以明显下调细胞色素c和Caspase-3的表达。结果表明tFNA-Typ具有比单纯tFNA和Typ更好的抗凋亡特性，与前述结果一致，tFNA和Typ表现出协同增效的作用。
实验例4、tFNA-Typ恢复肾功能并防止肾小管损伤
建立小鼠缺血性再灌注(I/R)急性肾损伤(AKI)模型，动物实验获得四川大学伦理委员会的批准。我们选择了6-8周的雄性C57小鼠，首先分离两个肾脏，将双侧肾蒂夹住缺血30分钟。30分钟后再灌注，静脉注射100μL生理盐水，等剂量的100μL的tFNAs，Typ或tFNA-Typ(投料比1:200)溶液，最后，24小时后处死小鼠，收集血清以测量血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)，取心、肺、脾、肝、肾进行苏木精和伊红(H&E)染色，肾进行PAS染色，组织免疫荧光染色KIM-1，TUNEL染色(图3a)。
肾脏靶向能力是AKI治疗的基础。为了获得tFNA-Typ在健康和AKI小鼠中的生物分布，将Cy5标记的tFNA-Typ静脉注射并由IVIS Spectrum成像***(PerkinElmer)检测。如图3b所示，AKI组的荧光主要分布在肝脏和肾脏中，与健康组相比，荧光明显增加且维持时间更长，表明tFNA-Typ被健康肾脏迅速消除，但被AKI肾脏高度吸收。收获的肾脏显示，tFNA-Typ注射后2h荧光达到峰值。近端肾小管损伤是急性肾损伤最显著的表现。为了研究tFNA-Typ的肾小管靶向能力，我们用LTL标记肾小管，用Cy5标记tFNA-Typ。Cy5和LTL的荧光高度重叠(图3c)，验证了tFNA-Typ的肾小管靶向能力。肾小管的损伤可诱发肾小管功能障碍，GFR下降，从而降低肾功能。因此，tFNA-Typ在肾小管中的积聚表明tFNA-Typ是AKI治疗的有效潜在药物。
为了获得tFNA-Typ的治疗效果，将I/R损伤AKI模型小鼠分为四组，分别注射盐水，tFNA，Typ和tFNA-Typ。24h后，我们收集血清并检测血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)(图3g)，tFNA-Typ组显著降低，接下来，通过H&E染色(图3d)和PAS染色(图3e)评估AKI组织病理学损伤。为了评估肾小管损伤评分，在H&E或PAS染色上评估每只小鼠10个随机组织切片，并进行半定量评分如下：0，无损伤；1，<25％；2，25至50％；3，50至75％；4，>75％。对每只小鼠的结果进行平均(图3h，i)。健康组显示肾脏结构正常。在AKI组中观察到坏死，透明和脱落的细胞填充了小管。在tFNAs和Typ组中观察到局灶性坏死，而tFNA-Typ治疗组的损伤显著减少，并且在近端小管刷缘形态良好。我们进一步用KIM-1标记损伤小管(图3f)，在健康和tFNA-Typ治疗组中KIM-1荧光很少，这与肾小管损伤评分一致(图3j)。
我们结果说明tFNA-Typ可分布在肾脏中，尤其是AKI损伤肾脏，并可靶向肾小管，显著降低肾小管损伤，对急性肾损伤治疗效果好。
2.tFNA-Typ减少凋亡细胞，有助于肾功能的恢复。
AKI诱导的氧化应激通常会导致凋亡细胞死亡。进行TUNEL测定以测量AKI损伤肾脏中的凋亡细胞。与AKI组相比，tFNAs、Typ和tFNA-Typ组的凋亡细胞明显降低。tFNA-Typ组仍然显示出最低的凋亡细胞，表明tFNA-Typ的抗凋亡作用最佳(图4)。
实验例5、tFNA-Typ阻止急性肾损伤向慢性肾病的进展
1、实验方法
1.1蛋白质印迹分析
讲HK-2细胞接种于6孔板上，I/R组，tFNAs组，Typ组，TTC组先于低氧培养箱中无血清无糖培养基中培养6小时(1％O2，5％CO2，94％N2)，再复氧完全培养基下培养24小时。细胞复氧同时加入tFNAs(250nM)，Typ(50μM)，TTC(tFNAs-Typ(投料比250nM-50μM)培养细胞24h，I/R组不加入药物，对照组在正常氧气浓度下完全培养基培养。用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗α-SMA一抗(ab124964,1:1000,Abcam),抗Col I一抗(EPR7785,1:1000,Abcam),抗GAPDH一抗(2118,1:1000,CST),抗β-Actin一抗(4970,1:1000,CST),在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime,上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测***(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
1.2免疫荧光染色·
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。如前所述处理后，将样品在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％Triton X-100处理10分钟。然后，将样品在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(A1R MP+，Nikon，Tokyo，Japan)观察所有样品。
2、实验结果：事实证明，AKI后不完全修复可引起肾纤维化，肾纤维化是细胞外基质(ECM)蛋白(主要是胶原蛋白)的病理积累。结果显示(图5a，5b)，tFNA-Typ处理后α-SMA和Col I与WB和免疫荧光染色的蛋白质水平下调，表示tFNA-Typ的抗纤维化能力。这表明tFNA-Typ可以通过抑制调节性纤维化因子(细胞中α-SMA和Col)的表达来降低胶原蛋白的沉积，中断慢性肾病的进展。
综上，本发明提供了香蒲新苷治疗急性肾损伤的新用途，并公开了DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物，DNA四面体框架核酸和香蒲新苷具有协同增效减少肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡，减少肾脏组织坏死、恢复肾功能的作用，并能防治肾纤维化，阻止急性肾损伤向慢性肾病的发展，为临床提供了新的选择。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物及其制备治疗急性肾损伤的药物的
用途
<130> GYKH1118-2022P0115470CC
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 63
<212> DNA
<213> S1
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atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> S2
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
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<212> DNA
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<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
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<213> S4
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63

Claims (10)

1.香蒲新苷在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。
2.一种复合物，其特征在于，它是DNA四面体框架核酸和香蒲新苷复合而成；所述DNA四面体框架核酸是由序列分别如SEQ ID NO.1～4所示的4条单链DNA分子经过碱基互补配对形成。
3.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述复合物中香蒲新苷的含量为18wt％～34wt％，优选为34wt％。
4.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，它是将DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的混合溶液搅拌、超滤后制得；
优选地，所述DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的摩尔比为1:(80～200)；更优选地，所述DNA四面体框架核酸和香蒲新苷的摩尔比为1:200。
5.权利要求2～4任一项所述的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别配制DNA四面体框架核酸的溶液和香蒲新苷溶液；
(2)香蒲新苷溶液添加到DNA四面体框架核酸的溶液中搅拌，超滤，即得；优选地，所述搅拌是在20～30℃搅拌5～7小时。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述DNA四面体框架核酸的溶液是通过如下方法制成：将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于足以使其变性的温度下维持至少10min，再将温度降低到2～8℃维持至少20min；
优选为将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于95℃维持10min，再将温度降低到4℃维持20min。
7.权利要求2～4任一项所述的复合物在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物是减少肾脏组织坏死和/或恢复肾功能的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物是减少肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡的药物。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物是阻止急性肾损伤发展为慢性肾病药物；优选为防治肾纤维化的药物。
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