CN115044492B - 一株恶臭假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株恶臭假单胞菌，所述恶臭假单胞菌分类命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，YT‑1，革兰氏阴性，2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.22872。本发明可以实现砷在土壤中迁移转化过程的控制和生物有效性的降低，利用该恶臭假单胞菌对砷的吸附和耐受性以及铁(氢)氧化物和土壤中砷形成配合物，控制土壤中砷的迁移转化和降低生物有效性。
Description
技术领域
本发明属于土壤微生物原位修复处理技术领域，具体涉及一株恶臭假单胞菌及其应用。
背景技术
砷(As)是一种剧毒的类金属元素，国际癌症研究机构将As归为I类致癌物，可通过大气沉降、废水排放以及施用含砷化肥和农药等形式进入陆地生态***。水稻土是我国面积最大的耕作土壤，农业区域土壤重金属As浓度空间分布与致癌风险成正比，污染土壤中砷可通过食物链进入人体，影响公众健康。
目前水稻土中As污染修复的生物处理方式可分为两类：一种是利用超富集植物去除土壤As。其原理是通过植物的代谢作用将As从土壤中提取出来，储存在植物的根茎叶中，通过接种砷氧化还原菌群、筛选抗砷内生菌等手段提高超富集植物的吸收效率。另一种是利用微生物修复砷污染土壤。其原理是通过微生物表面的官能团与金属离子发生络合、配位及离子交换、生物吸附等反应，到达固定重金属的作用。
实验条件下，土壤微生物原位修复技术对砷的吸附能力有限，利用铁锰 (氢)氧化物比表面积大、表面电荷高等特点，专性吸附/非专性吸附土壤中的砷酸根形成配合物，能有效降低土壤砷的有效态。水稻土中筛选出的对砷具有较高耐受性和吸附能力的土著菌株，在Fe(OH)3诱导下有效降低土壤砷的生物有效态。目前，有关恶臭假单胞菌通过吸附、Fe(OH)3诱导降低土壤砷的迁移能力和生物有效性的应用未见报道。
因此，有必要研究一株恶臭假单胞菌及其应用来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株恶臭假单胞菌及其应用，可以实现砷在土壤中迁移转化过程的控制和生物有效性的降低，利用该恶臭假单胞菌对砷的吸附和耐受性以及铁(氢)氧化物和土壤中砷形成配合物，控制土壤中砷的迁移转化和降低生物有效性。
一方面，本发明提供一株恶臭假单胞菌，所述恶臭假单胞菌分类命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，YT-1，革兰氏阴性，2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为：CGMCCNo.22872。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述恶臭假单胞菌在筛选过程中使用的培养基配方为营养肉汤培养基。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一株恶臭假单胞菌的应用，包括所述的恶臭假单胞菌，所述恶臭假单胞菌用于修复砷污染水稻土。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述应用方法具体为使用所述恶臭假单胞菌对待测砷污染水稻土进行处理。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述应用方法中还包括在使用所述恶臭假单胞菌对待测砷污染水稻土进行处理过程中加入Fe(OH)3固定土壤中的砷，降低砷在土壤中的生物有效态。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
(1)本发明的恶臭假单胞菌为革兰氏阴性菌，对高浓度砷具有良好的耐受性，同时菌株胞内对砷的吸附能力较强；
(2)菌株的培养条件简单，培养基易得，菌株易保存，对于工业化应用具有一定的开发潜力；
(3)Fe(OH)3促进恶臭假单胞菌对土壤砷的固定作用，降低迁移性和生物有效性，提供了一种环境友好型砷污染水稻土的原位修复技术。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例1恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1菌落形态特征；
图2是本发明实施例1是恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1革兰氏染色后激光共聚焦显微镜40×10菌株形态观察图；
图3是本发明实施例2不同浓度As(V)培养下Pseudomonas putida YT-1的生长曲线图；
图4是本发明实施例3基因组抽提电泳检测图；
图5是本发明实施例3恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1基于16S rRNA序列对比结果的***发育树；
图6是本发明实施例4恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1在培养基中砷含量变化百分比和菌株砷含量累积率；
图7是本发明实施例5恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1结合Fe(OH)3修复前后土壤砷TCLP含量变化示意图；
图8是本发明实施例5恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1结合Fe(OH)3修复前后土壤砷的存在形态变化示意图。
其中，图4中：Marker为DL9000，从上至下条带依次为9000bp、5000bp、 3000bp、2000bp、1000bp和500bp，上样量为3uL，亮带为30ng/uL，其余条带均为10ng/uL。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本发明提供了一株恶臭假单胞菌及其应用，所述恶臭假单胞菌分类命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，YT-1，革兰氏阴性，2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为：CGMCCNo.22872。所述恶臭假单胞菌在筛选过程中使用的培养基配方为营养肉汤培养基。
本发明还提供一株恶臭假单胞菌的应用，包括所述的恶臭假单胞菌，所述恶臭假单胞菌用于修复砷污染水稻土。实现砷在土壤中迁移转化过程的控制和生物有效性的降低。利用该恶臭假单胞菌对砷的吸附和耐受性以及铁(氢)氧化物和土壤中砷形成配合物，控制土壤中砷的迁移转化和降低生物有效性。应用方法包括使用所述恶臭假单胞菌在30℃培养条件下对样品的预处理。应用方法还包括使用铁(氢)氧化物为人工合成Fe(OH)3加入至反应体系中。
实施例1
砷耐受性较高的恶臭假单胞菌YT-1的分离筛选
本发明的菌株属于恶臭假单胞菌属，Pseudomonas putida YT-1。该菌株是从江西省鹰潭市重金属污染的农田土壤分离筛选获得，具体通过在含砷培养基中接种培养后平板划线分离纯化筛选获得。
具体方法及过程描述如下：称取1g土壤样品，加入10mL无菌水中震荡1h，静置1min后，吸取1mL土壤悬液接种到LB培养基中30℃培养24h。转接1mL 培养液至新鲜含砷(50mg/LNa2HAsO4·7H2O)100mL中培养基中30℃培养24h；采用系列稀释涂布法分离细菌，挑选单菌落后，固体培养基(100mg/L Na2HAsO4·7H2O)划线纯化，培养条件威30℃，获得纯化菌株。恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida YT-1菌落形态的平板菌落图为图1，恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1在激光共聚焦显微镜下，放大40×10倍时菌株的形态观察为图2，经API试剂盒进行生理生化特征测定和16SrDNA序列分析，鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，即本发明的Pseudomonas putidaYT-1。该菌株的分离纯化培养条件、检测存活性条件均为营养肉汤培养基(10g蛋白胨，3g 牛肉膏粉，5g NaCl，蒸馏水1000mL，1mol/L NaOH调节pH至7.0)；培养温度 30℃。
实施例2
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1的砷耐受性能测试
将恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1菌悬液分别接种到含40mg/L、60 mg/L、80mg/L、100mg/L Na2HAsO4·7H2O的LB培养基中，置于摇床中180rpm30℃培养，每组设置三个重复。细菌生长曲线测定采用分光光度计法在600nm记录不同培养时间OD600nm值，不同浓度As(V)培养下Pseudomonas putida YT-1的生长曲线测定结果如图3所示。图中，横坐标为培养时间(h)，纵坐标为细菌在600 nm下测定的光密度，曲线为Pseudomonas putida YT-1的生长曲线。
实施例3
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1的分子即生理生化鉴定
(1)本实施例采用16S rRNA序列对本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaYT-1进行测试分析。
16S rRNA鉴定方法：细菌基因组抽提，16S V1-V9区PCR扩增、测序，采用蛋白酶K裂解的方法进行基因组DNA抽提，取3uL进行电泳检测，如图4所示。
使用16S rRNA保守序列的上游引物8F和下游引物1492R,，对筛选菌株的16S rRNA基因片段进行PCR扩增、克隆、测序。测序后获得约1500bp的片段，经过测序得到该菌属于恶臭假单胞菌，扩增片段的测序结果见序列表。
其中上游引物8F为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
下游引物1492R为TACGGYTACCTTGTTAYGACTT。
本发明所述恶臭假单胞菌PseudomonasputidaYT-1的16SrRNA基因测序 BLAST比对结果中相似性最高的前10位及物种分类信息统计结果如表1所示。
表1 BLAST对比结果
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida YT-1)菌株的***发育属见图5，基因测试结果表明，与Pseudomonas putida strain NBRC 14164和Pseudomonas putida strainATCC 12633两者的相似度达到99.717％，鉴定为Pseudomonas putida sp.(恶臭假单胞菌属)
(2)恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1的生理生化特性，结果如表2所示。
表2菌株生理生化特性
| Test items | Detection results |
| NO3硝酸盐还原到亚硝酸盐 | - |
| TRP吲哚 | - |
| GLU酸化葡萄糖 | + |
| ADH精氨酸双水介酶 | + |
| URE脲酶 | + |
| ESCβ-葡萄糖苷酶 | + |
| GEL蛋白酶 | + |
| PNPGβ-半乳糖苷酶 | - |
| GLU同化葡萄糖 | + |
| ARA同化***糖 | - |
| MNE同化甘露糖 | - |
| MAN同化甘露醇 | - |
| NAG同化N-乙酰-葡萄糖胺 | - |
| MAL同化麦芽糖 | - |
| GNT同化葡萄糖酸盐 | + |
| CAP同化癸酸 | + |
| ADI同化己二酸 | - |
| MLT同化苹果酸 | + |
| CIT同化柠檬酸 | + |
| PAC同化苯乙酸 | - |
+；阳性反应；-：阴性反应
实施例4
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1对培养基中砷的去除和生物积累LB培养基中加入Na2HAsO4·7H2O，浓度为100mg/L，灭菌冷却后无菌操作接种1％Pseudomonasputida YT-1菌悬液，置于摇床中150rpm30℃培养，每24h 进行生物积累和砷去除测定。具体方法为每24h收集50mL培养液10,000rpm离心10min，收集细胞菌体沉淀物后加入10mL[HCl:HNO3(3:1)]的消解液，待细胞沉淀物溶解后采用AFS-230E双道氢化物发生原子荧光测定细胞中生物积累砷含量；离心后培养液上清液用来测定砷的去除量，分别测定细胞沉淀物及培养液中 As(V)浓度，绘制浓度曲线，结果如图6。将不接种菌株含100mg/LNa2HAsO4·7H2O 的LB培养基作为非生物去除对照样品。砷去除百分比公式为：
IC:initial arsenate concentration(mg/L)初始砷含量
FC:final arsenate concentration(mg/L)最终砷含量
实施例5
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1在砷污染水稻土治理中的应用示范
Fe(OH)3的比表面积大、活性高，称取38.07g FeCl3·6H2O搅拌溶解于1000mL 去离子水中，滴加1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0～7.6，制得红褐色悬浮物即为 Fe(OH)3原液。
选用恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1接种到LB培养基中，培养至对数期。将富集好的恶臭假单胞菌以及10mL新制得的Fe(OH)3悬浮液添加到50g 砷污染土壤样品中，调节土壤含水量为田间最大持水量(Water Holding Capacity, WHC)70％，置于恒温培养箱中30℃避光培养14d，同时设置一组不接种菌株的样品作为对照。恶臭假单胞菌不仅能细胞吸附As(V)，对于高活性的Fe(OH)3亦有较高的吸附能力，诱导铁氧化物和As(V)在菌株的作用下产生络合沉淀。由图7 可知，修复后的固体废物浸出毒性(TCLP)明显降低，未修复时TCLP提取的重金属含量为4.16mg/kg，修复14d后TCLP提取的重金属含量为1.68mg/kg。通过 Wenzel顺序提取分别测定土壤中不同形态砷如图8所示，修复后土壤中弱吸附态砷F1、强吸附态砷F2的含量分别下降了47.7％和49.7％，而残渣态砷F5的含量提高了14.8％。未添加Fe(OH)3土壤样品接种菌株后，弱吸附态砷F1含量明显增加，恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YT-1砷吸附作用较强，减弱As与土壤固相之间的结合能力，从土壤中释放出来。当添加Fe(OH)3后利用菌株对铁(氢) 氧化物和砷的吸附力，残渣态砷F5含量明显提高。
从上述实施例的实验结果表明，本发明所筛选出的恶臭假单胞菌 Pseudomonasputida YT-1具有较强的砷吸附能力，结合铁(氢)氧化物能够有效降低弱吸附态砷F1和强吸附态砷F2的含量，减弱土壤中砷的可迁移性和生物有效性，同时铁(氢)氧化物作为良好的土壤修复剂能提高微生物原位修复土壤砷的效率，该工艺具有方法简单有效，环境友好的优点。
以上对本申请实施例所提供的一株恶臭假单胞菌及其应用，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者***不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者***所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者***中还存在另外的相同要素。
应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。
序列表
<110> 华北水利水电大学
<120> 一种恶臭假单胞菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> pseudomonas sp.
<400> 1
ccatgcagtc gagcggatga gaagagcttg ctcttcgatt cagcggcgga cgggtgagta 60
atgcctagga atctgcctgg tagtggggga caacgtttcg aaaggaacgc taataccgca 120
tacgtcctac gggagaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt 180
cggattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag 240
aggatgatca gtcacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc 360
ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggcatt aacctaatac gttagtgttt 420
tgacgttacc gacagaataa gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga 480
gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt ttgttaagtt 540
ggatgtgaaa gccccgggct caacctggga actgcatcca aaactggcaa gctagagtac 600
ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac 660
cagtggcgaa ggcgaccacc tggactgata ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc 720
aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag ccgttggaat 780
ccttgagatt ttagtggcgc agctaacgca ttaagttgac cgcctggggg agtacggccg 840
caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 900
attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg ccttgacatg cagagaactt tccagagatg 960
gattggtgcc ttcgggaact ctgacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020
gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt ccttagttac cagcacgtaa 1080
tggtgggcac tctaaggaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacggc ctgggctaca cacgtgctac aatggtcggt acagagggtt 1200
gccaagccgc gaggtggagc taatctcaca aaaccgatcg tagtccggat cgcagtctgc 1260
aactcgactg cgtgaagtcg gaatcgctag taatcgcgaa tcagaatgtc gcggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc accagaagta 1380
gctagtctaa ccttcgggag gacggtacca 1410
Claims (4)
1.一株恶臭假单胞菌，其特征在于，所述恶臭假单胞菌分类命名为恶臭假单胞菌Pseudomonasputida，YT-1，革兰氏阴性，2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.22872。
2.如权利要求1所述的一株恶臭假单胞菌的应用，其特征在于，所述恶臭假单胞菌用于修复砷污染水稻土。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为使用所述恶臭假单胞菌对待测砷污染水稻土进行处理。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用还包括在使用所述恶臭假单胞菌对待测砷污染水稻土进行处理过程中加入Fe(OH)3固定土壤中的砷，降低砷在土壤中的生物有效态。
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2022
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Patent Citations (2)
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Also Published As
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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