CN115040685A - 一种包载生长因子的抗菌伤口敷料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包载生长因子的抗菌伤口敷料及其制备方法与应用。所述抗菌伤口敷料为具有三层结构的复合纳米纤维，纳米复合纤维的内层结构含有明胶、季铵化磺化壳聚糖和生长因子，纳米复合纤维的中层结构为聚己内酯，纳米复合纤维的外层结构为聚多巴胺涂层。本发明制备的敷料具有抗菌抗炎、缓释生长因子、促进愈合等多重功能。

Description

一种包载生长因子的抗菌伤口敷料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医疗材料领域，特别涉及一种包载生长因子的抗菌伤口敷料及其制备方法与应用。
背景技术
创伤修复一直是临床亟需解决的重点和难点问题。由于创伤产生后创面修复时间长、创面环境复杂，若创伤修复不及时或者不彻底会严重影响机体健康，甚至发生重症感染、脓毒血症以及溃疡癌变等并发症，更有甚者可能会面临截肢甚至危及患者生命。创面愈合是机体对皮肤组织缺陷的修复反应。正常的皮肤创伤愈合是四个不同但连续重叠的阶段，分别为止血期、炎症期、增殖期和重塑期。创面愈合的四个阶段不能平稳进行时，将产生慢性难愈创面。
生长因子作为一种伤口修复中不可或缺的信号分子，几乎参与了伤口愈合全过程，其能够促进细胞迁移、增殖和分化，使得缺损处逐步再生。生长因子的多样性为皮肤修复创造了良好的条件，并且不同的生长因子能够在不同的阶段展现出独特的修复作用，从而使得损伤组织实现完美重塑。在临床上，已经通过外源性引入生长因子来治疗压疮、烧伤、糖尿病溃疡等慢性伤口愈合，并且取得了较为理想的效果。
包载生长因子的高级生物活性敷料可对于急慢性创面发挥较好修复作用，同时多种技术的使用使得伤口敷料更加多功能化以及可定制化，很好的解决不同伤口创面带来的健康问题。巨大的市场需求使得高级伤口敷料开发显得十分迫切。临床上，具有抗菌性能的功能材料成为最佳选择，然而现用的伤口敷料等医疗器械要么抗菌活性不够，要么功能单一，导致创伤感染频发、创伤愈合效果差，银离子相关抗菌医疗器械虽然能有效解决感染问题，但应用所带来的安全问题使其被逐步淘汰。
发明内容
发明目的：针对以上问题，本发明以季铵化磺化壳聚糖、明胶、聚己内酯此三种生物相容性良好的高分子材料为基材，结合同轴静电纺丝技术和聚多巴胺涂层技术，搭载重组人生长因子，制备得到包载生长因子的抗菌伤口敷料，该抗菌伤口敷料具备三层复合膜层，制备成型的敷料具有“抗菌抗炎-缓释生长因子-促进愈合”等多重功能。
技术方案：本发明所述的一种包载生长因子的抗菌伤口敷料，所述抗菌伤口敷料为具有三层结构的复合纳米纤维，纳米复合纤维的内层结构含有明胶、季铵化磺化壳聚糖和生长因子，纳米复合纤维的中层结构为聚己内酯，纳米复合纤维的外层结构为聚多巴胺涂层。
作为本发明的一种优选实施方式，所述抗菌伤口敷料通过以下方法制备：采用同轴静电纺丝方法制备纳米复合纤维的内层结构以及中层结构，得到内中层核壳结构纳米纤维，将制备的内中层核壳结构纳米纤维浸泡在含有盐酸多巴胺的(三羟甲基氨基甲烷)Tris溶液中，得到具有三层结构的纳米复合纤维。
作为本发明的一种优选实施方式，所述内层结构的纺丝液中，明胶的质量浓度为10wt％-15wt％，季铵化磺化壳聚糖的质量浓度为0.5wt％-1.5wt％，生长因子浓度为1000-5000ng/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述中层结构的纺丝液中，聚己内酯的浓度为5wt％-10wt％。
作为本发明的一种优选实施方式，所述Tris溶液中，所述盐酸多巴胺粉末的浓度为1～3mg/mL；所述Tris粉末的浓度为1～10mM。
作为本发明的一种优选实施方式，所述季铵化磺化壳聚糖的结构如下所示：
Figure BDA0003746622590000021
其中，n为季铵化磺化壳聚糖的聚合度。
本发明对季胺化壳聚糖进行磺化，提高了壳聚糖溶解性和生物相容性，并且进一步改善了季胺化壳聚糖因为氨基存在导致抗菌效果较差的问题，获得的季铵化磺化壳聚糖具备可靠的抗菌性，且通过磺化获得较好细胞相容性。
本发明所述的季铵化磺化壳聚糖的制备方法通过以下方法制备：
(1)磺化壳聚糖的制备：惰性气体保护下，取壳聚糖、碳酸钠溶解于蒸馏水中形成混合溶液，再向其中加入三氧化硫·吡啶，在60℃-70℃下反应12-20小时，冷却，调节pH值至中性，透析，将透析液冷冻干燥，得到磺化壳聚糖；
(2)季铵化磺化壳聚糖的制备：将步骤(1)得到的磺化壳聚糖加入去离子水中，搅拌分散，分别加入NaOH溶液以及对甲基苯磺酸酯季铵盐，将反应体系置于70-80℃搅拌48-60h，冷却后，将调节pH至中性，透析，将透析液冷冻干燥，得到季铵化磺化壳聚糖。
其中，三氧化硫·吡啶加入量为壳聚糖摩尔数的3.0～5.0倍。
其中，对甲基苯磺酸酯季铵盐来源于CN104672348A的十二烷基取代的对甲基苯磺酸酯季铵盐，具体为采用CN104672348A公开文本说明书[0017]～[0019]段公开的方法合成十二烷基取代的对甲基苯磺酸酯季铵盐。
作为本发明的一种优选制备方式，本发明所述的季铵化磺化壳聚糖通过以下方法制备：
(1)磺化壳聚糖的制备：惰性气体(氩气或氮气)保护下，在干燥的实验装置中，取适量壳聚糖、碳酸钠溶解于蒸馏水中形成混合溶液，再向其中加入适量的三氧化硫·吡啶，在60-70℃下反应12-20小时，所得溶液冷却至室温后，调节pH值至中性，将液体转移到截留分子量为1000MW透析袋儿中用去离子水透析两天，每2h换液一次，最后将透析液冷冻干燥即可得到目标产物磺化壳聚糖；
(2)季铵化磺化壳聚糖的制备：称取1.00g磺化壳聚糖粉末加入到150mL的去离子水中，搅拌分散。随后再分别加入10mL 40％NaOH溶液以及5.00g对甲基苯磺酸酯季铵盐。将反应体系置于80℃搅拌48h-60h，冷却后，将液体转移到烧杯中用浓盐酸将pH调整为中性，后将液体装入截留分子量为1000MW的透析袋中用去离子水透析3天，每2h换液一次，最后将透析液冷冻干燥即可得目标产物季铵化磺化壳聚糖。
作为本发明的一种优选实施方式，所述生长因子包含有重组人表皮生长因子以及重组人碱性成纤维细胞生长因子；和/或所述重组人表皮生长因子以及重组人碱性成纤维细胞生长因子的摩尔比为1～2:1～2。
作为本发明的一种具体应用方式，重组人表皮生长因子(rh-EGF)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)，两种生长因子的摩尔数比例为1:1、1:2、2:1。
本发明所述的抗菌伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)内中层核壳结构制备：称取明胶、生长因子、季铵化磺化壳聚糖溶解于蒸馏水中，超声脱除气泡，得到内层纺丝溶液；称取聚己内酯溶解于六氟异丙醇溶液中，超声脱除气泡，得到中层纺丝溶液；同轴静电纺丝，得到内中层核壳结构；
(2)外层结构制备：称取盐酸多巴胺粉末、Tris粉末溶解于蒸馏水中，超声脱除气泡，得到外层制备溶液；
(3)伤口敷料的制备：将步骤(1)中制备成型的内中层核壳结构灭菌后，置于步骤(2)制备的外层制备溶液中浸泡、干燥，得到抗菌伤口敷料。
作为本发明的一种优选实施方式，同轴静电纺丝的参数为：电压18KV，内层纺丝溶液流速0.045mL/h，中层溶液流速0.45mL/h，接收距离15-18cm，环境参数温度37±2℃，湿度10±2％。
作为本发明的一种你具体实施方式，内中层核壳结构通过以下方法制备：称取明胶、生长因子、季铵化磺化壳聚糖溶解于灭菌蒸馏水中，所述明胶、重组人生长因子、季铵化磺化壳聚糖含量浓度分别为10％-15％wt、1000-5000ng/ml、0.5wt％-1.5wt％，超声脱除溶解过程存在气泡，得到内层纺丝溶液。
作为本发明的一种具体实施方式，中层纺丝溶液为含有质量浓度为5wt％-10wt％的聚己内酯六氟异丙醇溶液。
作为本发明的一种具体实施方式，所述聚己内酯的分子量为8万。
作为本发明的一种具体实施方式，外层结构的制备方法为：称取盐酸多巴胺粉末、Tris粉末溶解于灭菌蒸馏水中，盐酸多巴胺粉末、Tris粉末含量浓度为2mg/mL、5mM，并向其中滴加1M盐酸溶解调节pH值为8.5，超声脱除溶解过程存在的气泡，即为外层制备溶液。
作为本发明的一种具体实施方式，所述伤口敷料通过以下方法制备：将制备成型的核壳结构经紫外线照射半小时灭菌后，置于外层制备溶液中避光37℃浸泡4-8h，灭菌蒸馏水清洗3-5次，37℃烘箱干燥，得到伤口敷料。
本发明还提供了上述的包载生长因子的抗菌伤口敷料在抗菌材料、伤口敷料、组织工程敷料、医疗器械和组织修复或瘢痕修复中的应用。
有益效果：(1)本发明的纳米纤维伤口敷料含有季铵化磺化壳聚糖、明胶、人重组生长因子、生物相容性良好的高分子聚合物PCL以及多巴胺涂层，既能改变壳聚糖抗菌性不足缺陷，又能达到抗菌抗炎-缓释生长因子-创伤愈合等功效；(2)本发明的伤口敷料中多种组分协调作用，既能保证膜的亲水性、通透性和抗菌性能，又能缓慢释放生长因子，改变伤口缺损处微环境，多方面协调作用为伤口修复提供优良条件；(3)本发明采用同轴静电纺丝技术和多巴胺涂层技术制备的伤口敷料具有三层结构，具有物理化学性能和生物学性能优良：一方面该纳米纤维敷料的纤维直径在纳米级，与天然细胞外基质形态相似，有利于皮肤等软体组织的加速修复，加之复合纳米纤维敷料具有比表面积大、孔隙率高等优良的特性，进一步提升了创伤修复的效果、生物化学相容性及生物可降解性；另一方面该复合纳米纤维伤口敷料具有三层结构，复合膜所包含的有效组分具备抗菌抗炎作用，并能缓慢释放生长因子，聚多巴胺涂层还有利于细胞粘附爬行，协同抗菌止血性能，具有多重功能。
附图说明
图1为实施例1聚合物改性后的红外图谱分析；
图2为实施例2制备的核-壳结构纳米纤维的扫描电镜纤维形貌，为5.0k倍数照片；
图3为实施例2制备的核-壳结构纳米纤维的透射电镜纤维形貌(显现出核-壳结构)，为10.0k倍数照片；
图4为实施例2生长因子释放曲线；
图5为伤口敷料增殖性能综合考察结果；
图6为伤口敷料抗菌性能综合考察结果，其中，A图为金黄色葡萄球菌，B图为大肠杆菌；
图7为伤口敷料伤口修复性能综合考察结果。
具体实施方式
实施例1：季铵化磺化壳聚糖的制备方法包括以下步骤：
(1)磺化壳聚糖的制备：惰性气体(氮气)保护下，在干燥的实验装置中，取1.0g壳聚糖(CS)、3.3g碳酸钠溶解于蒸馏水中形成混合溶液，再向其中加入壳聚糖摩尔数3.0倍的三氧化硫·吡啶，在60℃下反应12小时，所得溶液冷却至室温后，调节pH值至中性，将液体转移到截留分子量为1000MW透析袋中用去离子水透析两天，每2h换液一次。最后将透析液冷冻干燥即可得到目标产物磺化壳聚糖(SCS)；
(2)季铵化磺化壳聚糖的制备：称取1.00g步骤(1)制备的磺化壳聚糖粉末加入到150mL的去离子水中，搅拌分散。随后再分别加入10mL 40％NaOH溶液以及5.00g对甲基苯磺酸酯季铵盐(甲基苯磺酸酯季铵盐的结构为CN104672348A中披露的十二烷基取代的对甲基苯磺酸酯季铵盐)。将反应体系置于80℃搅拌48h，冷却后，将液体转移到烧杯中用浓盐酸将pH调整为中性，后将液体装入截留分子量为1000MW的透析袋中用去离子水透析3天，每2h换液一次。最后将透析液冷冻干燥即可得目标产物季铵化磺化壳聚糖(QAS-SCS)。
对两步反应中的每步终产物进行了红外图谱测定，结果如图1所示，磺化壳聚糖(SCS)和季铵化磺化壳聚糖(QAS-SCS)在1030cm-1吸收峰为O＝S＝O基团产生，证明磺化成功，并且季铵化磺化壳聚糖(QAS-SCS)在2925cm-1和2853cm-1吸收峰为-CH3、-CH2基团产生，证明季铵化接枝成功，特征官能团的出现证明化合物改性接枝成功。
实施例2：季铵化磺化壳聚糖/明胶/生长因子的多组分纳米复合纤维伤口敷料的制备
(1)内中层核壳结构制备：称取明胶、生长因子、季铵化磺化壳聚糖溶解于灭菌蒸馏水中，使得明胶、季铵化磺化壳聚糖含量浓度分别为15wt％、1wt％，生长因子添加为重组表皮生长因子(rh-EGF)和重组碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)，其中rh-EGF：rh-bFGF摩尔比为1:2，总浓度为2500ng/mL。超声脱除溶解过程存在气泡，即为内层纺丝溶液；称取聚己内酯溶解于六氟异丙醇溶液中，使得聚己内酯浓度为8wt％，超声脱除溶解过程存在的气泡，即为中层纺丝溶液；同轴静电纺丝中参数为：电压18KV，内层溶液用量为2mL，流速0.045mL/h，中层溶液用量为6mL，流速0.45mL/h，接收距离15-18cm，环境参数温度37±2℃，湿度10±2％，制备内层含有生长因子的核-壳结构(P-GQT)。
(2)外层结构制备：称取盐酸多巴胺粉末、Tris粉末溶解于灭菌蒸馏中，盐酸多巴胺粉末、Tris粉末含量浓度分别为2mg/mL、5mM，并向其中滴加1M盐酸溶解调节pH值为8.5，超声脱除溶解过程存在的气泡，即为外层制备溶液；将制备成型的核-壳结构经紫外线照射半小时灭菌后，置于外层制备溶液中避光37℃浸泡4h，灭菌蒸馏水清洗3次，37℃烘箱干燥，得到抗菌伤口敷料(P-GQT-D)。
经力学性能测试结果显示，制得的P-GQT-D伤口敷料的断裂伸张率为48.12±3.21％，与人体的断裂伸张率(54±17％)相近。P-GQT-D伤口敷料的扫面电镜可以观察到纤维形貌良好，直径分布均一(如图2所示)，该敷料的透射电镜可观察出核-壳结构(如图3所示)。
通过配置磷酸缓冲液(pH＝7.2-7.4)来模拟体液环境，将伤口敷料P-GQT-D灭菌后并裁剪为1cm×1cm大小浸泡于灭菌处理好的磷酸缓冲液中，于37℃环境150r/min培养箱中定时采集浸提液，并采用酶联免疫吸附实验的方法对两种生长因子浓度进行测定，结果显示两种生长因子稳定释放，表明该敷料具有一定的生长因子缓释性能(如图4所示)，展现了该伤口敷料伤口治疗修复的良好潜力。
实施例3：本发明方法制备的伤口敷料生物医学性能测试
(1)本发明的伤口敷料体外细胞毒性合格
P-GQT-D伤口敷料通过NIH 3T3细胞存活率间接反映其毒性。设置4个组别对伤口敷料进行综合考察，其中设置空白组作为参照，PCL为按照实施例2的纺丝方法制备的聚己内酯纳米纤维，P-GQT组为内中层制备成型的核壳结构，根据《GB/T16886.5》中细胞毒性评价等级表中的毒性等级划分，PCL为1级细胞毒性，属于合格；P-GQT-D伤口敷料细胞存活率为106.42±3.39％，属于0级细胞毒性，合格(表1)。以上结果显示出P-GQT-D伤口敷料及其组分伤口敷料的毒性均属于合格，表明了良好的细胞相容性。
表1复合膜的NIH 3T3细胞毒性研究
Figure BDA0003746622590000071
(2)本发明的伤口敷料具备抗菌能力
根据《GB/T 20944.3-2008，纺织品抗菌性能的评价第3部分：振荡法》中的要求和方法对本发明所制备的伤口敷料进行了抗菌能力测验。本次实验设置4组平行组，其中包含一组空白组，另3组伤口敷料为PCL、P-GQT、P-GQT-D，通过统计不同组别生长菌落数，对伤口敷料抗菌性进行描述表征，所得结果如图6所示。其中P-GQT-D伤口敷料中的季铵化磺化壳聚糖组分具备抗菌性能，同时聚多巴胺涂层能够与季铵化磺化壳聚糖产生抗菌协同作用。P-GQT-D伤口敷料抗菌率达到90％以上，并且明显高于其他实验组，因此具有良好的抗菌性。
(3)本发明的伤口敷料具有较好的体外细胞增殖活力
本实验考察NIH 3T3细胞在不同伤口敷料共培养的增殖情况，采用CCK-8试剂盒测试培养1d、3d、7d后细胞数量，由此来评定不同伤口敷料促进NIH 3T3细胞增殖能力，阴性对照组以不含其他药液的空白培养基与细胞相互接触，其他实验组均为复合膜与细胞共培养，由此计算不同时间段实验组相对于空白组的细胞存活率。实验结果如图5所示，由此可以得出P-GQT-D伤口敷料具有良好的促进细胞增殖的能力。
(4)本发明的伤口敷料溶血性合格
根据《GB/T 16886.4-2003/ISO 10993-4：2002，医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》中的要求，测试了3种伤口敷料的溶血性(表2)，实验结果各组敷料显示均无溶血作用。
表2伤口敷料的溶血率
Figure BDA0003746622590000081
(5)本发明的伤口敷料具备积极的凝血性能
本实验采用体外血液钙复凝实验对3种伤口敷料进行了凝血指数(BCI)测定，BCI数值越小表明其凝血性能越好。共设置4组实验组(每组n＝4)，其中阳性对照组的设定为100μL枸橼酸抗凝血液(含10μl 0.1M CaCl2)溶解于25mL灭菌蒸馏水，其他实验组为100μL枸橼酸抗凝血液(含10μL 0.1M CaCl2)滴加于伤口敷料表面37℃孵育5min后加入25mL灭菌蒸馏水，收集各组上清液200μL于96孔板中并于545nm处测定吸光度值，设定阳性对照组吸光度值为参比值100。测定收集结果见表3所示，结果显示三组伤口敷料差别不大，对血液凝固都能产生积极的作用，其中PCL组凝血指数(BCI)数值较小，因其疏水性能较强，使得血液凝固相对较好，P-GQT-D伤口敷料为亲水敷料但仍可以表现出较为理想的凝血性能，因此可判断本发明制备伤口敷料具有积极的凝血性能。
表3伤口敷料的凝血指数(BCI)
Figure BDA0003746622590000082
(6)P-GQT-D促伤口愈合性能
促伤口愈合实验以市售3M TegadermTM Film阳性对照组，设置空白对照组，以Balb/C小鼠作为伤口敷料治疗效果实施的动物模型。在手术创伤后的3d、7d、10d、14d分别纪录伤口实时图片(如图7)，并通过Image J图形处理软件对收集所得图片进行处理，计算并统计伤口的愈合率(表4)。在伤口处理后的第3天，P-GQT-D伤口敷料伤口愈合率为32.01％±2.87％，明显优于其他组别，尤其是在伤口处理的第14天，P-GQT-D伤口敷料伤口愈合率达到了93.79％±3.21％，而其他组别均在90％以下。由此证明P-GQT-D伤口敷料展现出良好的伤口愈合能力。
表4不同敷料对于伤口的愈合率(n＝4,x±s,％)
Figure BDA0003746622590000091
从以上结果可以看出，本发明制备的伤口敷料作为新型抗菌创伤修复产品，具备抗菌抗炎、缓释生长因子以及伤口愈合等多重功能。

Claims (10)

1.一种包载生长因子的抗菌伤口敷料，其特征在于，所述抗菌伤口敷料为具有三层结构的复合纳米纤维，纳米复合纤维的内层结构含有明胶、季铵化磺化壳聚糖和生长因子，纳米复合纤维的中层结构为聚己内酯，纳米复合纤维的外层结构为聚多巴胺涂层。
2.根据权利要求1所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料，其特征在于，所述抗菌伤口敷料通过以下方法制备：采用同轴静电纺丝方法制备纳米复合纤维的内层结构以及中层结构，得到内中层核壳结构纳米纤维，将制备的内中层核壳结构纳米纤维浸泡在含有盐酸多巴胺的Tris溶液中，得到具有三层结构的纳米复合纤维。
3.根据权利要求1所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料，其特征在于，所述内层结构的纺丝液中，明胶的质量浓度为10wt％-15wt％，季铵化磺化壳聚糖的质量浓度为0.5wt％-1.5wt％，生长因子浓度为1000-5000ng/mL。
4.根据权利要求1所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料，其特征在于，所述中层结构的纺丝液中，聚己内酯的浓度为5wt％-10wt％。
5.根据权利要求2所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料，其特征在于，所述Tris溶液中，所述盐酸多巴胺粉末的浓度为1～3mg/mL；所述Tris粉末的浓度为1～10mM。
6.根据权利要求1所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料，其特征在于，所述生长因子包含有重组人表皮生长因子以及重组人碱性成纤维细胞生长因子；和/或所述重组人表皮生长因子以及重组人碱性成纤维细胞生长因子的摩尔比为1～2:1～2。
7.一种季铵化磺化壳聚糖，其特征在于，所述磺化壳聚糖的结构如下所示：
Figure FDA0003746622580000011
8.根据权利要求7所述的季铵化磺化壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)磺化壳聚糖的制备：惰性气体保护下，取壳聚糖、碳酸钠溶解于蒸馏水中形成混合溶液，再向其中加入三氧化硫·吡啶，在60℃-70℃下反应12-20小时，冷却，调节pH值至中性，透析，将透析液冷冻干燥，得到磺化壳聚糖；
(2)季铵化磺化壳聚糖的制备：将步骤(1)得到的磺化壳聚糖加入去离子水中，搅拌分散，分别加入NaOH溶液以及对甲基苯磺酸酯季铵盐，将反应体系置于70-80℃搅拌48-60h，冷却后，将调节pH至中性，透析，将透析液冷冻干燥，得到季铵化磺化壳聚糖。
9.一种如权利要求1所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)内中层核壳结构制备：称取明胶、生长因子、季铵化磺化壳聚糖溶解于蒸馏水中，超声脱除气泡，得到内层纺丝溶液；称取聚己内酯溶解于六氟异丙醇溶液中，超声脱除气泡，得到中层纺丝溶液；同轴静电纺丝，得到内中层核壳结构；
(2)外层结构制备：称取盐酸多巴胺粉末、Tris粉末溶解于蒸馏水中，超声脱除气泡，得到外层制备溶液；将步骤(1)中制备成型的内中层核壳结构灭菌后，置于外层制备溶液中浸泡、干燥，得到抗菌伤口敷料。
10.如权利要求1所述的包载生长因子的抗菌伤口敷料在抗菌材料、伤口敷料、组织工程敷料、医疗器械和组织修复或瘢痕修复中的应用。
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