CN115040657A - 一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 - Google Patents
一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115040657A CN115040657A CN202210654534.0A CN202210654534A CN115040657A CN 115040657 A CN115040657 A CN 115040657A CN 202210654534 A CN202210654534 A CN 202210654534A CN 115040657 A CN115040657 A CN 115040657A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tfna
- que
- dna
- quercetin
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 title claims abstract description 68
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title description 5
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 74
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 208000037890 multiple organ injury Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 23
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 7
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 claims description 7
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 claims description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 35
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 35
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 30
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 abstract description 4
- LMRJHNFECNKDKH-UHFFFAOYSA-N 4-(trifluoromethyl)nicotinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CN=CC=C1C(F)(F)F LMRJHNFECNKDKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 64
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 20
- 102000002737 Heme Oxygenase-1 Human genes 0.000 description 19
- 108010018924 Heme Oxygenase-1 Proteins 0.000 description 19
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 13
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 13
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 13
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 13
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 13
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 11
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 11
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 11
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 9
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 9
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 9
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 9
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 9
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 9
- 101000588302 Homo sapiens Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Proteins 0.000 description 8
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 8
- 102100031701 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Human genes 0.000 description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 8
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 8
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 8
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 8
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 7
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 6
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 6
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 5
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000903210 Bryconamericus alpha Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 3
- 235000013290 Sagittaria latifolia Nutrition 0.000 description 3
- 102100029064 Serine/threonine-protein kinase WNK1 Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 3
- 235000015246 common arrowhead Nutrition 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 102100025621 Cytochrome b-245 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101710165567 Extracellular signal-regulated kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710165576 Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101150018665 MAPK3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024192 Mitogen-activated protein kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010082739 NADPH Oxidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710083073 NF-kappa-B inhibitor alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101150033527 TNF gene Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- -1 flavonoid compound Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000008383 multiple organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001931 thermography Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
- A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供了一种DNA四面体‑槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途,属于医药技术领域。本发明DNA四面体‑槲皮素复合物是由DNA四面体框架核酸和槲皮素混合后形成的复合物。本发明DNA四面体‑槲皮素(tFNA‑Que)复合物以tFNA为载体进行槲皮素的协同递送。本发明tFNA‑Que复合物具有合成简单、性能稳定、缓释、水溶性好、生物相容性好等特点;此外,本发明tFNA‑Que复合物具有优异的抗炎和抗氧化作用,通过显著降低炎症水平和消除ROS,有效减弱了脓毒症的全身炎症和多器官损伤等并发症。本发明tFNA‑Que复合物中tFNA和Que发挥了协同增效作用,能有效预防和/或治疗脓毒症及脓毒症的并发症,为脓毒症的免疫预防提供新策略,具有成为脓毒症新药的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途。
背景技术
脓毒症(Sepsis)作为全球最致命的综合征之一,已成为重症监护病房(ICU)的主要死因之一,其死亡率约为50%。脓毒症是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征。据报道,脓毒症通常涉及感染的免疫反应失调,导致全身破坏性炎症和严重并发症,这些并发症包括多器官衰竭或多器官功能障碍综合征(MODS)。尽管过去十年对脓毒症引起的免疫功能障碍的机制探索有所深入,但对于其大部分并发症,尤其是多器官衰竭仍难以对其提供满意的治疗。因此,迫切需要开发新颖的、有效的脓毒症及其并发症的治疗方法。根据研究报道,脓毒症不受控制的严重炎症通常与革兰氏阴性(G-)细菌外膜的主要成分脂多糖(LPS)有关。具体而言,先天免疫***是宿主抵御病原体入侵的主要防御机制。当机体受到病原微生物的严重感染时,被称为先天免疫***前哨细胞的巨噬细胞参与炎症细胞因子风暴以消除病原体。病原体表面的LPS被巨噬细胞的Tolly样受体识别并通过核因子κ-轻链增强子(NF-κB)家族和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等转录因子传递信号,以诱导负责促炎介质合成和释放的基因表达,包括趋化因子、活性氧(ROS)、细胞因子,特别是白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)。然后过度的先天性和适应性炎症和氧化成分导致***性炎症风暴,进而导致细胞、组织甚至肺、肝、肾等多器官损伤。因此,有效抑制过度的全身性炎症是治疗脓毒症的关键问题。
天然化合物已被用于预防和治疗各种炎症和免疫相关疾病,例如特应性皮炎、类风湿性关节炎和脓毒症。它们因其潜在的治疗效果、低成本、被人群广泛接受而引起了极大的关注。槲皮素(Que)是一种广泛存在于植物中的类黄酮化合物。它因其抗癌、抗炎、抗衰老和相对安全性(低毒性)等多效生物学特性而被广泛研究。多项研究表明,槲皮素可以抑制免疫细胞的氧化应激和过度炎症反应,从而抑制LPS引起的全身炎症和包括肾脏、心脏、肺等在内的多器官功能障碍。其具体机制涉及槲皮素通过抑制LPS诱导的NF-κB激活和核转位、细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)和c-Jun N-末端激酶的磷酸化,从而降低炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的水平。此外,槲皮素通过抑制NOX2和促进Nrf2产生来减少LPS诱导的ROS。遗憾的是,由于槲皮素水溶性差、生物利用度低和在生理介质中的不稳定性,其应用受到严重限制。因此,有必要开发新型纳米材料来改善槲皮素的递送,以提高槲皮素的功效。
四面体框架核酸(tetrahedral framework nucleic acid,tFNA)又称DNA四面体(tetrahedral DNA,TDN)、四面体DNA纳米结构,它由4条单链DNA通过链间碱基互补配对形成,形态类似四面体。这种纳米结构合成效率高,合成步骤简单,具有良好的生物安全性和生物相容性。DNA四面体框架核酸已是一种研究较为深入的纳米材料,结构具有许多优点,包括可忽略的免疫原性,天然生物相容性,结构稳定性和无与伦比的可编程性,这是有效药物载体的先决条件。同时研究表明DNA四面体具有一定的生物活性,如具有抗炎作用等。因此DNA四面体有望成为一种重要的药物载体。
但是由于DNA四面体的结构特殊,且具有一定活性,因此DNA四面体负载小分子药物后两者相互作用如何,是发挥协同作用还是拮抗作用,这是未知的,不同小分子药物效果可能会出现较大的不同。目前尚未见DNA四面体载槲皮素,DNA四面体能否成功负载槲皮素,使其发挥更好的效果需要进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途。
本发明提供了一种DNA四面体-槲皮素复合物,它是由DNA四面体框架核酸和槲皮素混合后形成的复合物。
进一步地,所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时,DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:20~1:160。
进一步地,所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时,DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:40~1:160。
进一步地,所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时,DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:80。
进一步地,所述DNA四面体框架核酸由四条DNA单链自组装合成;所述四条DNA单链的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、和SEQ ID NO.4所示。
进一步地,所述DNA四面体框架核酸的合成方法包括以下步骤:将四条DNA单链加入到TM缓冲液中,95℃维持10min,快速降温到4℃维持20min以上,即得。
进一步地,所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。
本发明还提供了一种制备前述的DNA四面体-槲皮素复合物的方法,它包括如下步骤:
将DNA四面体框架核酸和槲皮素加入溶剂中混合反应后超滤,即得;
优选地,所述溶剂为PBS、DMSO中的一种或多种;
和/或,所述反应的温度为20~30℃;
和/或,所述反应的时间为4~6h;
和/或,所述超滤使用30KDa分子量膜。
本发明还提供了前述的DNA四面体-槲皮素复合物在制备抗炎和/或抗氧化的药物中的用途。
进一步地,所述药物为预防和/或治疗脓毒症和/或脓毒症并发症的药物;
优选地,所述脓毒症并发症为多器官损伤;
更优选地,所述多器官损伤为多器官衰竭或多器官功能障碍综合征。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1、首次构建了一种DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物,其中槲皮素通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。
2、tFNA-Que复合物提高了Que的稳定性和释放能力,并保持出色的进入细胞的能力。
3、tFNA-Que复合物通过调节ERK/NF-Kb通路,发挥协同增效作用,有效增强Que和tFNA的抗炎作用。
4、tFNA-Que复合物通过调节Nrf2/HO-1通路,同样发挥协同增效作用,有效增强Que和tFNA的抗氧化作用。
5、tFNA-Que复合物治疗减少了LPS诱导的全身炎症,并保护包括肺、肝和肾在内的多个器官受脓毒症损伤。
本发明的目的是制备一种DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物,其以tFNA为载体进行槲皮素的协同递送。本发明tFNA-Que复合物具有合成简单、性能稳定、缓释、水溶性好、生物相容性好等特点;此外,本发明tFNA-Que复合物具有优异的抗炎和抗氧化作用,通过显著降低炎症水平和消除ROS,有效减弱了脓毒症的全身炎症和多器官损伤等并发症。本发明tFNA-Que复合物中tFNA和Que发挥了协同增效作用,能有效预防和/或治疗脓毒症及脓毒症的并发症,为脓毒症的免疫预防提供新策略,具有成为脓毒症新药的巨大潜力。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为tFNA-Que复合物的合成及表征:A为tFNA-Que复合物合成过程的示意图;B为通过PAGE验证tFNA的成功合成,泳道1为S1,泳道2为S1+S2,泳道3为S1+S2+S3,泳道4为tFNA;C为通过PAGE验证tFNA-Que复合物的成功合成,泳道1为tFNA,泳道2为tFNA:Que摩尔比=1:40的tFNA-Que复合物(实施例2),泳道3为tFNA:Que摩尔比=1:80的tFNA-Que复合物(实施例3),泳道4为tFNA:Que摩尔比=1:160的tFNA-Que复合物(实施例4);D为不同tFNA、Que摩尔比合成的tFNA-Que复合物与Gel-Red染料(λex=312nm)结合后激发的荧光与单纯tFNA结合Gel-Red染料激发荧光的比值;E为Que、tFNA和tFNA-Que复合物(tFNA:Que摩尔比=1:80,实施例3)在200nm波长和500nm波长之间的光谱;F为tFNA和tFNA-Que复合物(tFNA:Que摩尔比=1:80,实施例3)的粒径尺寸;G为tFNA和tFNA-Que复合物(tFNA:Que摩尔比=1:80,实施例3)的Zeta电位;H为tFNA-Que复合物(tFNA:Que摩尔比=1:80,实施例3)的原子力显微镜(AFM)图像,比例尺:200nm;I为tFNA-Que复合物(tFNA:Que摩尔比=1:80,实施例3)的透射电镜(TEM)图像,比例尺:50nm;J为图I的放大图像,比例尺:20nm;数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n=3)。
图2为tFNA、Que和tFNA-Que复合物的大体照片;等浓度、等体积的tFNA(250nM)、Que(40μM)和tFNA-Que复合物(制备时tFNA为250nM、Que为40μM)溶解在PBS中的大体照片。
图3为tFNA-Que复合物的稳定性检测和释放试验:A为等浓度和体积的Que(40μM)和tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成,tFNA:250nM,Que:40μM)在PBS(pH=7.4,37℃)中的稳定性测定;B为tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成,tFNA:250nM,Que:40μM)在PBS(pH=7.4,37℃)中Que的体外释放试验;C为等浓度和体积的tFNA和tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成,tFNA:250nM,Que:40μM)在胎牛血清(2%,37℃)中的稳定性;数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n=3)。
图4为tFNA-Que复合物的入胞性能检测:A为通过共聚焦显微镜检测Cy5-tFNA和Cy5-tFNA-Que复合物进入细胞的性能(Cy5:红色;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色);B为通过流式细胞仪检测Cy5-tFNA和Cy5-tFNA-Que复合物进入细胞的性能(control:绿色;Cy5-tFNA:红色;Cy5-tFNA-Que:蓝色);C为对图B各组带有Cy5荧光的细胞占全部细胞占比百分数进行统计;数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n=3);统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns,无意义。
图5为tFNA-Que的细胞活性试验和NO浓度筛选试验:A为用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(tFNA:250nM,Que:20μM)预处理然后用LPS处理的RAW264.7细胞的细胞活力结果;B为用不同摩尔比制备的tFNA-Que复合物预处理然后用LPS处理的RAW264.7细胞的细胞活力结果;C为不同tFNA-Que复合物预处理然后用LPS处理的RAW264.7细胞的NO结果;数据表示为平均值±SD(n=3);统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns,无意义。
图6为tFNA-Que减少LPS诱导的炎症的结果:A为不同处理后RAW264.7细胞的NO水平;B-D分别为TNF-α、IL-6和IL-1β表达的RT-PCR分析结果;E为ELISA检测到的炎性细胞因子分泌,包括TNF-α(i)和IL-6(ii);F为免疫印迹结果和iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平的定量分析;G为不同处理后细胞中iNOS表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;iNOS:红色;3D热图:重建iNOS的荧光强度;比例尺:20μm;H为不同处理后细胞中TNF-α表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;TNF-α:红色;3D热图:重建TNF-α的荧光强度;比例尺:20μm;I为不同处理后细胞中IL-6表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;IL-6:红色;3D热图:重建IL-6的荧光强度;比例尺:20μm;J为不同处理后细胞中IL-1β表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;IL-1β:红色;3D热图:重建IL-1β的荧光强度;比例尺:20μm;数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n=3);统计分析:*p<0.05,**p 0.01,和***p<0.001。
图7为tFNA-Que对关键炎症信号分子的调节结果:A为参与tFNA-Que复合物抗炎作用的关键炎症信号分子示意图;B为磷酸-p65(p-p65)、IκBα、总-ERK 1/2(t-ERK 1/2)和磷酸-ERK1/2(p-ERK 1/2)表达水平的蛋白质印迹结果;C为对图B中蛋白质的表达水平进行定量分析;D为不同处理后细胞中总p65表达和核转位的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;p65:红色;比例尺:20μm;E为不同处理后细胞中p-p65表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;p-p65:红色;3D热图:重建p-p65的荧光强度;比例尺:20μm;F为不同处理后细胞中IκBα表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;IκBα:红色;3D热图:IκBα荧光强度的重建;比例尺:20μm;G为不同处理后细胞中磷酸-ERK1/2(p-ERK1/2)表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;p-ERK1/2:红色;3D热图:重建p-ERK1/2的荧光强度;比例尺:20μm;数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n=3);统计分析:*p<0.05,**p 0.01和***p<0.001。
图8为tFNA-Que复合物通过Nrf2/HO-1途径减少LPS诱导的ROS结果:A为细胞内ROS水平通过荧光显微镜观察和热图呈现;比例尺:100μm;绿色:ROS;B为流式细胞仪定量检测(i)和分析(ii)细胞内ROS水平;C为RAW264.7细胞不同处理后的SOD水平;D为Nrf2和HO-1表达水平的蛋白质印迹结果;E为Nrf2(i)和HO-1(ii)的蛋白质印迹结果的统计分析;F为不同处理后细胞中HO-1表达的免疫荧光图像;细胞骨架:绿色;细胞核:蓝色;HO-1:红色;3D热图:重建HO-1的荧光强度;比例尺:20μm;数据表示为平均值±SD(n=3);统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图9为tFNA-Que复合物减弱LPS诱导的全身炎症并分散在多个器官中:A为tFNA、Que或tFNA-Que复合物预处理及体内动物模式建立示意图;B为ELISA检测血清中的炎症细胞因子,包括TNF-α(i)、IL-6(ii)分泌;C为ELISA检测包括TNF-α(i)、IL-6(ii)腹膜液分泌的炎症细胞因子;D为Cy5标记的tFNA-Que复合物在1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后腹腔注射后在主要器官中的分布;E为肺中H&E染色的图像;比例尺:50μm;箭头:炎症细胞浸润;F为肝脏中H&E染色的图像;比例尺:50μm;箭头:炎症细胞浸润;圆圈:细胞坏死(染色质颜色增强,核固缩);G为肾脏H&E染色图像;比例尺:50μm;箭头:炎症细胞浸润;数据表示为平均值±SD(n=4);统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns,无意义。
图10为tFNA-Que复合物治疗对LPS诱导的多器官损伤的保护作用:A为各组小鼠血清中BUN水平;B为各组小鼠血清中CRE水平;C为各组小鼠血清中ALT水平;D为各组小鼠血清中AST水平;E为各组小鼠肺中HO-1表达的免疫荧光图像和HO-1相对荧光强度的定量分析;比例尺:200μm;细胞核:蓝色;HO-1:绿色;F为各组小鼠肺、肝、肾中CD68表达的免疫荧光图像和CD68相对荧光强度的定量分析;比例尺:200μm;细胞核:蓝色;CD68:红色;数据表示为平均值±SD(n=6);统计分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
实施例1、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)是由独特设计的四条DNA单链(S1,S2,S3,S4)通过一个PCR程序(95℃维持10min,快速降温到4℃维持20min以上)自组装合成的。具体制备方法如下:
四条DNA单链S1、S2、S3和S4(具体序列如表1所示)按照等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH 8.0)中,使得四条DNA单链的终浓度分别为1000nM,充分混匀后迅速加热至95℃维持10min,之后迅速降温至4℃并维持20min以上,即自组装合成得到DNA四面体框架核酸(tFNA)。
表1.本发明四条DNA单链的具体序列
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为5μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:20)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
实施例2、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为10μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:40)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
实施例3、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为20μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:80)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
实施例4、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为40μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:160)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
实施例5、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为60μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:240)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
实施例6、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为80μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:320)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
实施例7、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解,并混合均匀,使得溶液中Que的浓度为160μM,tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:640)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时,然后,通过在25℃的条件下,以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜,Millipore,USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que,得到tFNA-Que复合物。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
细胞培养和处理
巨噬细胞系RAW264.7细胞在含有高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基、10%胎牛血清(FBS,HyClone,Logan,USA)和1%青霉素-链霉素溶液(HyClone,Logan,USA)的完全培养基中培养。添加到培养基中的脂多糖(LPS,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)的浓度为1μg/mL,以引发巨噬细胞的炎症。为了验证药物的抗炎和抗氧化作用,细胞用Que、tFNA或tFNA-Que复合物预处理2小时,然后用或不用LPS处理24小时。
试验例1、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的相关表征
1、表征方法
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)验证tFNA-Que复合物是否成功合成,并观察其大小和形状。动态光散射DLS(Nano ZS,Malvern,England)用于测量tFNA和tFNA-Que复合物的粒径和Zeta电位。tFNA、Que和tFNA-Que复合物的吸光度曲线用超微分光光度计描绘。GelRed的荧光由Varioskan LUX酶标仪(Thermo Scientific,USA)检测。
2、表征结果
如图1A所示的示意图,tFNA-Que复合物的合成分为两个步骤:(1)tFNA由四个等摩尔量的ssDNA自组装,并且通过PAGE检测到tFNA成功合成(图1B);(2)tFNA通过震荡6h与Que复合,得到tFNA-Que复合物,tFNA-Que复合物的成功合成也在PAGE中得到验证(图1C)。
同时通过改变溶液中Que的用量,使制备tFNA-Que复合物的溶液中tFNA和Que的摩尔比分别为1:40、1:80和1:160,按照实施例方法制备不同Que含量的tFNA-Que复合物,图1C中显示tFNA-Que复合物的位置随着Que比例的增加而逐渐上移。应用GelRed染料竞争测定Que和tFNA之间的结合方法。当tFNA与1x GelRed孵育20分钟时,荧光被激发,而由不同摩尔比tFNA和Que制备的tFNA-Que复合物与GelRed一起孵育,GelRed的荧光强度随着Que浓度的增加而降低(图1D)。这意味着Que与tFNA相互作用的位置是与GelRed相同的双链DNA双螺旋槽区。
此外,图1E中的光谱表明tFNA-Que复合物的特征吸收峰接近tFNA(260nm)和Que(260nm、377nm),这表明Que被tFNA成功搭载,没有副产物。通过DLS检测tFNA和tFNA-Que复合物的粒径和zeta电位,也证实了tFNA-Que复合物的成功合成。在图1F中,tFNA的大小为10.7±3.2nm,而tFNA-Que复合物的大小为15.7±2.3nm。在图1G中,tFNA的zeta电位为-7.41±0.68mV,而tFNA-Que复合物的zeta电位为-13.2±0.55mV。这些差异表明新的纳米颗粒tFNA-Que复合物已生成。
为了表征tFNA-Que复合物的形状和大小,进行了AFM和TEM。AFM图像显示tFNA-Que复合物约为20nm(图1H)。从TEM图像中获得了相同的结果,并且通过TEM观察到类三角形的结构(图1I和图1J)。
除了微观水平的变化外,tFNA-Que复合物、tFNA和Que之间还存在一些肉眼明显的差异。更具体地说,图2中所示的tFNA-Que复合物是透明的黄色液体,而带有未溶解颗粒的单纯Que液体黄色程度明显低于tFNA-Que复合物。同时tFNA是无色透明液体。三种颗粒外观的差异表明tFNA-Que复合物比单纯的Que具有更好的水溶性,这对于溶解性差的Que的利用非常有利。
总的来说,上述结果表明本发明首次构建了一种新型纳米药物***tFNA-Que复合物,其中Que通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。制备得到的tFNA-Que复合物稳定性更好,且溶解率提高。
试验例2、体外和稳定性释放测定
1、实验方法
在释放实验中,释放介质PBS(0.01M,pH 7.4)通过透析膜(30kDa;Solarbio,Beijing,China)分为内液(3mL)和外液(30mL)。tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成,tFNA:250nM,Que:40μM)溶解在内液中。将整个***置于37℃,在几个时间点通过波长377nm处的OD值测量外液中Que的释放量。类似地,在稳定性测试中,将等浓度、体积的Que(40μM)和tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成,tFNA:250nM,Que:40μM)置于等量的PBS中,在不同时间点通过测量波长377nm处的OD值以检测溶解于PBS后Que和tFNA-Que复合物中的残留的Que。
2、实验结果
由于缺乏稳定性,Que的广泛应用受到了很大限制。如图3A所示,当置于PBS中时,大量单纯Que在前1小时内迅速降解,6小时后Que的残留量仅不到40%。而tFNA-Que复合物在6h后可以维持在60-70%左右,比单纯Que更稳定。此外,tFNA-Que复合物在血清中的稳定性通过PAGE显示在图3C中,这表明tFNA-Que复合物作为一种基于核酸的材料可以持续存在至12-24小时,稳定性优异。释放能力方面,tFNA搭载的Que释放缓慢。24h后tFNA-Que复合物的释放效率达到62.0±2.6%(图3B),这有利于Que的充分利用。
试验例3、Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物的细胞摄取
1、实验方法
使用Cy5荧光标记后的S1单链(S1-Cy5),按照本发明实施例所述方法制备Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物(制备tFNA-Que复合物的溶液中tFNA:250nM,Que:20μM)。
为了检查tFNA和tFNA-Que复合物的细胞进入性能,首先用Cy5标记的tFNAs和tFNA-Que复合物处理RAW264.7细胞3小时。然后收集细胞并用PBS冲洗3次。最终,通过流式细胞仪(CytoFLEX,Beckman Coulter Inc.,Brea,USA)获得具有荧光Cy5的细胞占所有细胞的比例。此外,通过共聚焦显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)获得了Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物分散在细胞中的图像。
2、实验结果
使用流式细胞术和共聚焦显微镜检验了Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物进入RAW264.7细胞的情况。从激光共聚焦显微镜的图像(图4A)中可以观察到Cy5标记的tFNAs和tFNA-Que复合物广泛分布在细胞的细胞质中。根据流式细胞术的结果(图4B和4C),可检测到tFNA-Que复合物和tFNA荧光的细胞比例均达到90%以上,tFNA和tFNA-Que复合物之间没有统计学差异。该现象表明将tFNA与Que复合后不会干扰tFNA的优异的入胞性能。上述结果表明,tFNA-Que复合物中,Que的稳定性和释放能力显著提高,并保持出色的进入细胞的能力。
试验例4、tFNA-Que在体外降低LPS诱导的炎症
1、实验方法
(1)RAW264.7细胞处理后的细胞活力
将RAW264.7细胞接种在96孔板中(8000个细胞/孔)。然后用tFNA、Que以及不同tFNA和Que摩尔比制备的tFNA-Que复合物(tFNA和Que摩尔比分别为1:40、1:80、1:160、1:240、1:320,如实施例2~6,tFNA的浓度为250nM,Que对应的浓度分别是10μM,20μM,40μM,60μM,80μM)预培养细胞2h,然后除对照组(正常细胞组)外用1μg/mL LPS处理24h。然后将细胞在10%CCK-8溶液(KeyGEN Biotech)中于37℃培养1小时。通过450nm处的OD值测量细胞活力。
为了验证tFNA-Que复合物、Que和tFNA处理对LPS诱导的RAW264.7细胞活力的影响,用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理24h。如上述过程进行细胞活力测定。
(2)NO水平检测测定
Griess检测试剂盒(Beyotime,上海,中国)用于检测NO水平。具体而言,将RAW264.7细胞接种在96孔板中(8000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理24h,将处理后的巨噬细胞上清液(50μL)加入新的96孔板中,然后与Griess测定试剂盒试剂1(50μL)和试剂2(50μL)混合。测量540nm处的吸光度以计算NO水平。
(3)逆转录-PCR(RT-PCR)
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(10000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理24h,提取巨噬细胞总RNA,并获得cDNA。在ABI QuantStudio 6实时PCR***(Thermo Scientific,美国)中通过Green I PCR预混液检测靶mRNA的表达。将所有靶mRNA(表2)的表达与作为对照的GAPDH进行比较。
表2.靶基因引物序列
(4)蛋白质印迹分析
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(10000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理24h,用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech,南京,中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime,上海,中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后,PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime,Shanghai,China)封闭20分钟,并与包括抗TNF-α一抗(1:1000;Abcam,英国剑桥)、抗IL-6一抗(1:1000;CST,美国波士顿)、抗IL-1β一抗(1:1000;CST,美国波士顿)、抗iNOS一抗(1:1000;CST,美国波士顿)和抗GAPDH一抗(1:1000;CST,美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后,将膜与二抗(1:5000;Beyotime,上海,中国)一起孵育1小时。最后,通过化学发光检测***(Bio-Rad,Hercules,USA)检测膜上的蛋白质条带。
(5)免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达,进行免疫荧光染色。将RAW264.7细胞接种在6孔板中(10000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理24h,将样品在冷的4%多聚甲醛中固定20分钟,随后用0.5%Triton X-100处理10分钟。然后,将样品在5%山羊血清中封闭1小时,并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后,将样品与二抗(1:500;Invitrogen,Carlsbad,USA)一起孵育1小时。然后,细胞核用DAPI染色,细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后,使用共焦激光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察所有样品。
2、实验结果
脓毒症以先天免疫***紊乱为特征,与大量促炎细胞因子直接相关,包括TNFα、IL-1β、IL-6、NO等。因此,有研究证明了在急性炎症动物模型中阻断或消除这些细胞因子的保护性策略是治疗脓毒症的有效方法。为了验证tFNA-Que复合物的抗炎性能,本发明应用了LPS刺激RAW264.7细胞作为体外模型。首先,本发明进行了细胞活力测定,以确保tFNA-Que复合物的生物安全性,这是用于细胞实验的前提。如图5A和5B所示,tFNA-Que复合物组促进了RAW264.7细胞的活力,特别是与LPS组相比。该结果证实了tFNA-Que复合物良好的生物安全性。值得注意的是,tFNA-Que复合物对细胞活力的促进呈现出一定的浓度剂量依赖性。具体而言,制备tFNA-Que复合物时,当tFNA浓度为250nM,Que浓度为20μM或40μM时(即制备tFNA-Que复合物时,tFNA和Que摩尔比为1:80或1:160时),细胞活力最佳,以上两种浓度无统计学差异。
在正常生理条件下,少量的NO作为重要的信使和效应分子对机体有益。然而,组织中的过量产生也会导致组织损伤,甚至败血症休克等。因此,抑制NO的产生对于治疗败血症至关重要。浓度相关性同样适用于tFNA-Que复合物对NO的抑制作用。具体而言,制备tFNA-Que复合物时,当tFNA浓度为250nM,Que浓度范围为5μM至40μM时,均会产生一定的NO抑制作用,而Que浓度为20μM是抑制NO的最佳浓度(图5C)。因此,后续的实验均采用该浓度进行处理。
此外,如图6A所示,tFNA组和Que组对NO的产生有轻微的抑制作用,而tFNA-Que复合物组的抑制作用明显强于上述两组。研究报道,iNOS与LPS诱导的NO的产生有关。LPS处理增加了iNOS的表达,从而调节NO的产生。本研究通过蛋白质印迹分析和免疫荧光染色研究了iNOS的表达,发现iNOS的表达趋势与NO相同(图6F和6G)。除了NO和iNOS蛋白的变化外,每个表达水平还检测到炎症因子的变化。RT-PCR检测基因水平,如图6B、6C和6D所示。经LPS刺激后,TNFα、IL-1β、IL-6基因表达水平显着升高,tFNA组和Que组能轻微抑制LPS组相关基因的增加。但与LPS组、tFNA组和Que组相比,tFNA-Que复合物的抗炎作用显着提高。这一发现在蛋白质水平上也得到了支持。通过western blot分析和免疫荧光染色检测上述炎症因子的细胞内表达,ELISA试剂盒检测细胞外分泌情况。如图6E、6F、6H、6I、6J所示,一致的结果表明tFNA-Que复合物具有比单纯tFNA和Que更好的抗炎特性,tFNA负载Que得到的tFNA-Que复合物抗炎发挥了协同增效作用。
试验例5、关键炎症信号分子的调节
1、实验方法
(1)蛋白质印迹分析
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(100000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h,用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech,南京,中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime,上海,中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后,PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime,Shanghai,China)封闭20分钟,并与包括抗GAPDH一抗(1:1000;CST,美国波士顿)、抗-phospho-p65一抗(1:1000;CST,美国波士顿),抗-IκBα一抗(1:1000;CST,美国波士顿),抗-total ERK一抗(1:1000;CST,美国波士顿),抗-phoso-ER一抗K(1:1000;CST,美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后,将膜与二抗(1:5000;Beyotime,上海,中国)一起孵育1小时。最后,通过化学发光检测***(Bio-Rad,Hercules,USA)检测膜上的蛋白质条带。
(2)免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达,进行免疫荧光染色。将RAW264.7细胞接种在12孔板中(50000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h,将样品在冷的4%多聚甲醛中固定20分钟,随后用0.5%Triton X-100处理10分钟。然后,将样品在5%山羊血清中封闭1小时,并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后,将样品与二抗(1:500;Invitrogen,Carlsbad,USA)一起孵育1小时。然后,细胞核用DAPI染色,细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后,使用共焦激光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察所有样品。
2、实验结果
在LPS诱导的脓毒症中,NF-κB在炎症中起关键调节作用。当NF-κB处于静息状态时,它由P50和P65的异源二聚体组成,由于NF-κB的核定位信号被抑制剂IκBα覆盖,它始终保留在细胞质中。一旦NF-κB被LPS激活,IKK对IκBα的磷酸化和降解会触发NF-κB(尤其是p65亚基)的磷酸化,并促进p65进入细胞核并与炎症相关基因发生反应,从而导致各种促炎细胞因子的表达,包括IL-6、IL-1β和TNF-α。ERK作为MAPKs之一在炎症过程中多种炎症相关基因的上调和NF-κB的激活中起着至关重要的作用。在LPS激活其受体TLR之后,ERK发生磷酸化,这种变化可促进TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。如图7A所示,假设tFNA-Que复合物抑制炎症的出色能力与抑制LPS诱导的NF-κB活化、核转位和ERK磷酸化有关。通过蛋白质印迹分析和免疫荧光染色研究了NF-κB、IκBα、total-ERK1/2和phospho-ERK1/2的表达,发现tFNA和Que抑制NF-κB的活化和向细胞核的传递,以及ERK磷酸化,而tFNA-Que复合物的抑制作用与两者相比显着增加(图7B、7C、7D、7E、7G)。此外,本发明证实了NF-κB抑制剂IκBα表达的变化。免疫印迹分析和免疫荧光染色结果表明,tFNA和Que可以略微阻止IκBα的降解,而tFNA-Que显着增加IκBα的表达(图7B、7C、7F)。总之,上述结果证实了tFNA-Que复合物是通过调节ERK/NF-κB途径来抑制LPS诱导的炎症。
试验例6、TFNA-Que在体外通调节Nrf2/HO-1途径降低LPS诱导的ROS
1、实验方法
(1)ROS水平检测测定
DCFH-DA检测试剂盒用于检测活性氧(ROS)的水平。将RAW264.7细胞接种在12孔板中(50000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h,用PBS冲洗3次。然后将各组与DCFH-DA一起孵育20分钟。最后,通过显微镜捕获ROS的荧光图像。此外,定量的荧光强度检测可以通过流式细胞仪和热图获得。
(2)蛋白质印迹分析
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(100000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h,用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech,南京,中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime,上海,中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后,PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime,Shanghai,China)封闭20分钟,并与包括抗GAPDH一抗(1:1000;CST,美国波士顿),抗Nrf2一抗(1:1000;剑桥,英国),抗HO-1一抗(1:1000;CST,美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后,将膜与二抗(1:5000;Beyotime,上海,中国)一起孵育1小时。最后,通过化学发光检测***(Bio-Rad,Hercules,USA)检测膜上的蛋白质条带。
(3)免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达,进行免疫荧光染色。将RAW264.7细胞接种在12孔板中(50000个细胞/孔),用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得,tFNA:250nM,Que:20μM)预处理细胞2h,然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h,将样品在冷的4%多聚甲醛中固定20分钟,随后用0.5%Triton X-100处理10分钟。然后,将样品在5%山羊血清中封闭1小时,并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后,将样品与二抗(1:500;Invitrogen,Carlsbad,USA)一起孵育1小时。然后,细胞核用DAPI染色,细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后,使用共焦激光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察所有样品。
2、实验结果
LPS刺激机体后会发生大量内源性活性氧(ROS),这是由多种来源引起的,包括血小板和来自血管内皮的细胞,活化的炎症细胞,如巨噬细胞、中性粒细胞。过多的氧化物会导致细胞损伤,这可能会成为打破免疫的稳态,导致败血症。因此,对过度氧化应激使用抗氧化疗法可能是一种治疗选择。为了检测对RAW264.7细胞的氧化损伤程度,本发明使用荧光显微镜测定了ROS的荧光强度。如图8A所示,巨噬细胞在LPS刺激下产生大量ROS。tFNA、Que或tFNA-Que复合物预处理2h后,tFNA和Que呈现一定的抗氧化作用,而tFNA-Que复合物显著降低ROS。流式细胞术也验证了类似的结果,与LPS组、tFNA组和Que组相比,tFNA-Que组中ROS荧光细胞的比例显著降低(图8B)。同时,本发明发现超氧化物歧化酶(SOD)和血红素加氧酶-1(HO-1)这两种清除ROS的蛋白质的表达也发生了变化(图8C、8D、8E、8F)。具体而言,通过western blot分析和免疫荧光染色检测,LPS组HO-1蛋白的表达受到抑制,而tFNA和Que可以略微缓解这种抑制作用,tFNA-Que组可以显着提高HO-1的表达(图8D、8E、8F)。在SOD中也检测到类似的趋势(图8C)。western blot分析证实Nrf2表达的趋势与HO-1和SOD相似,这表明tFNA、Que和tFNA-Que复合物的抗氧化性能可能与Nrf2的活化有关(图8D、8E)。
试验例7、tFNA-Que治疗对LPS诱导的体内全身炎症和多器官损伤的保护作用
1、实验方法
(1)动物模型的建立和治疗
体内实验选用C57BL/6J小鼠(8周龄,成都,中国),动物实验获得四川大学伦理委员会的批准。将小鼠随机分为五组(每组6只):对照组(正常小鼠)、LPS组、LPS-Que组、LPS-tFNA组和LPS-tFNA-Que组。用盐水、tFNA、Que或tFNA-Que复合物(按照实施例所述方法制备而得,制备时溶液中tFNA浓度为1μM,Que浓度为80μM)分别对小鼠进行腹腔内连续给药3天,每天给药1次,每次给药等体积盐水、tFNA、Que或tFNA-Que复合物溶液,tFNA浓度为1μM,Que浓度为80μM。然后LPS组、LPS-Que组、LPS-tFNA组和LPS-tFNA-Que组小鼠腹腔注射LPS 1次(5mg/kg)。最后,24小时后处死小鼠,取肺、肝、肾进行苏木精和伊红(H&E)染色,组织免疫荧光染色CD68或HO-1。收集血清和腹腔液以测量细胞因子的产生和BUN、CRE、ALT、AST的水平。
(2)细胞因子产生的测量
利用市售的ELISA试剂盒(MULTI SCIENCES,杭州,中国)在体外和体内测量TNF-α和IL-6的分泌。在LPS注射后24小后获得小鼠血清和腹膜液。用ELISA试剂盒所述处理细胞、血清和腹膜液的上清液。
2、实验结果
为了验证药物在体内的保护作用,将等体积的生理盐水、tFNA、Que或tFNA-Que复合物腹腔注射给C57BL/6J小鼠(8周龄),持续3天。然后在第3天给小鼠腹腔注射LPS,建立脓毒症动物模型。最后,在24小时后收集器官、血清和腹膜液(图9A)。本发明发现LPS组血清中TNF-α、IL-6较对照组明显升高,提示动物模型建立成功。提前注射tFNA或Que后,炎症细胞因子水平下降,但作用非常有限。与上述各组相比,tFNA-Que组炎性细胞因子水平明显下降,这与体外实验结果一致(图9B)。大量炎性细胞聚集的腹膜液是衡量炎性细胞因子的关键指标。同样,tFNA-Que组在腹膜液中的抗炎作用在所有治疗组中也是最佳的(图9C)。上述结果表明tFNA-Que复合物可以有效缓解LPS引起的全身炎症,与单独使用tFNA或Que相比,tFNA-Que复合物抗炎发挥了协同增效作用。
然后,本发明在图9D中观察了腹腔注射后主要器官中Cy5标记的tFNA-Que复合物的分布。结果表明,Cy5-Labeled tFNA-Que复合物可以到达小鼠的多个器官,包括肝脏、肾脏、肺、脾脏,尤其是肝脏和肾脏。这些器官正是脓毒症的靶向损伤器官。而tFNA-Que复合物可以在肝脏、肾脏维持12-24小时,有利于tFNA-Que长期有效保护小鼠免受LPS引起的多器官损伤。之后进行组织学染色分析,观察炎性细胞因子对器官的损害。
如图9E所示,HE染色显示LPS处理引起肺泡壁增厚、急性出血和肺部炎症细胞浸润。与LPS组、tFNA组和Que组相比,tFNA-Que复合物对这些损伤有明显的抑制作用。此外,tFNA-Que复合物还可以减轻由全身炎症引起的肝脏和肾脏的严重损伤。更具体地说,与其他组相比,tFNA-Que复合物治疗的小鼠表现出较少的急性出血、细胞坏死和募集到肝脏血管的炎症细胞(图9F);tFNA-Que复合物减轻肾脏急性出血、细胞坏死、炎性细胞浸润(图9G)。H&E染色的差异进一步支持了tFNA-Que复合物对多器官损伤的保护作用。
血清中BUN和CRE的水平被认为是反映肾脏功能的标志。同时,血清ALT、AST水平反映肝功能。血清中BUN、CRE、ALT、AST的定量分析如图10A-10D所示,LPS治疗组的BUN、CRE、ALT、AST水平显著升高,代表小鼠的肾脏和肝脏受到LPS的严重损害。然而,这些损伤可以通过tFNA、Que或tFNA-Que复合物治疗得到缓解,并且tFNA-Que组的这种效果最为显著。此外,免疫荧光染色检测肺中抗氧化蛋白HO-1的表达,其趋势也证明了tFNA-Que复合物可以增加HO-1的表达。该结果表明tFNA-Que复合物发挥了良好的抗氧化作用并防止了LPS对肺的损伤(图10E)。
脓毒症炎症期间的过量细胞因子包括TNF-α和IL-1β是单核细胞/巨噬细胞的关键化学引诱物。在激活细胞因子后,它们可以启动单核细胞/巨噬细胞的局部浸润,这是脓毒症初期的重要特征之一。本发明通过免疫荧光染色研究了特异性标志物CD68的表达,以观察肺、肝和肾中单核细胞/巨噬细胞的局部浸润。值得注意的是,与LPS组、tFNA组、Que组相比,tFNA-Que组在肝脏、肺和肾脏中局部单核细胞/巨噬细胞浸润明显减少(图10F)。总之,tFNA-Que复合物作为一种新型核酸纳米***,通过调节巨噬细胞保护小鼠免受LPS诱导的全身炎症和多器官损伤,与单独使用tFNA或Que相比,tFNA-Que复合物抑制全身炎症和多器官损伤效果优异,发挥了协同增效作用。
综上,本发明的目的是制备一种DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物,其以tFNA为载体进行槲皮素的协同递送。本发明tFNA-Que复合物具有合成简单、性能稳定、缓释、水溶性好、生物相容性好等特点;此外,本发明tFNA-Que复合物具有优异的抗炎和抗氧化作用,通过显著降低炎症水平和消除ROS,有效减弱了脓毒症的全身炎症和多器官损伤等并发症。本发明tFNA-Que复合物中tFNA和Que发挥了协同增效作用,能有效预防和/或治疗脓毒症及脓毒症的并发症,为脓毒症的免疫预防提供新策略,具有成为脓毒症新药的巨大潜力。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途
<130> GYKH1118-2022P0115133CC
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccctcacact cagatcatct tct 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctacgacgt gggctacag 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tagtccttcc taccccaatt tcc 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttggtcctta gccactcctt c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caaccacaca agtgatattc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggatccacac tctccagctg 20
Claims (10)
1.一种DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:它是由DNA四面体框架核酸和槲皮素混合后形成的复合物。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时,DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:20~1:160。
3.根据权利要求2所述的DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时,DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:40~1:160。
4.根据权利要求3所述的DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时,DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:80。
5.根据权利要求1~4任一项所述的DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:所述DNA四面体框架核酸由四条DNA单链自组装合成;所述四条DNA单链的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求5所述的DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:所述DNA四面体框架核酸的合成方法包括以下步骤:将四条DNA单链加入到TM缓冲液中,95℃维持10min,快速降温到4℃维持20min以上,即得。
7.根据权利要求6所述的DNA四面体-槲皮素复合物,其特征在于:所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。
8.一种制备权利要求1~7任一项所述的DNA四面体-槲皮素复合物的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
将DNA四面体框架核酸和槲皮素加入溶剂中混合反应后超滤,即得;
优选地,所述溶剂为PBS、DMSO中的一种或多种;
和/或,所述反应的温度为20~30℃;
和/或,所述反应的时间为4~6h;
和/或,所述超滤使用30KDa分子量膜。
9.权利要求1~7任一项所述的DNA四面体-槲皮素复合物在制备抗炎和/或抗氧化的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:所述药物为预防和/或治疗脓毒症和/或脓毒症并发症的药物;
优选地,所述脓毒症并发症为多器官损伤;
更优选地,所述多器官损伤为多器官衰竭或多器官功能障碍综合征。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210654534.0A CN115040657B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210654534.0A CN115040657B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115040657A true CN115040657A (zh) | 2022-09-13 |
CN115040657B CN115040657B (zh) | 2023-03-31 |
Family
ID=83160857
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210654534.0A Active CN115040657B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115040657B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115919816A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-04-07 | 四川大学 | 姜黄素-四面体框架核酸载药***在制备预防或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112007044A (zh) * | 2019-09-10 | 2020-12-01 | 四川大学 | 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 |
CN113736776A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-03 | 四川大学 | 一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途 |
-
2022
- 2022-06-10 CN CN202210654534.0A patent/CN115040657B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112007044A (zh) * | 2019-09-10 | 2020-12-01 | 四川大学 | 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 |
CN113736776A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-03 | 四川大学 | 一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115919816A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-04-07 | 四川大学 | 姜黄素-四面体框架核酸载药***在制备预防或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途 |
CN115919816B (zh) * | 2022-09-27 | 2024-04-09 | 四川大学 | 姜黄素-四面体框架核酸载药***在制备预防或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115040657B (zh) | 2023-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wu et al. | Biodegradable polymeric micelle-encapsulated quercetin suppresses tumor growth and metastasis in both transgenic zebrafish and mouse models | |
Wang et al. | Intelligent Gold Nanoparticles with Oncogenic MicroRNA‐Dependent Activities to Manipulate Tumorigenic Environments for Synergistic Tumor Therapy | |
US20240139228A1 (en) | Pharmaceutical composition and applications thereof | |
CN113583178B (zh) | 一种支化含糖聚合物基纳米粒子及其的制备方法和用途 | |
Zou et al. | Structural characterization and antitumor effects of chitosan oligosaccharides against orthotopic liver tumor via NF-κB signaling pathway | |
Li et al. | A macromolecular prodrug strategy for combinatorial drug delivery | |
CN115040657B (zh) | 一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 | |
CN115068496B (zh) | Dna四面体框架核酸和香蒲新苷的复合物及其制备治疗急性肾损伤的药物的用途 | |
CN108178803A (zh) | 一种载药的肉桂醛-葡聚糖聚合物自组装纳米粒的制备及其抗肿瘤应用 | |
KR20150006743A (ko) | 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 | |
Dikmen et al. | Characterization of solid lipid nanoparticles containing caffeic acid and determination of its effects on MCF-7 cells | |
KR20150006742A (ko) | 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 | |
Yan et al. | Brucea javanica derived exosome-like nanovesicles deliver miRNAs for cancer therapy | |
Yang et al. | “Star” miR-34a and CXCR4 antagonist based nanoplex for binary cooperative migration treatment against metastatic breast cancer | |
CN106800650B (zh) | 功能靶向性载体材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-苯基葡萄糖苷及其制备方法与应用 | |
Li et al. | New advances in the research of clinical treatment and novel anticancer agents in tumor angiogenesis | |
Wang et al. | “Layer peeling” co-delivery system for enhanced RNA interference-based tumor associated macrophages-specific chemoimmunotherapy | |
KR101734018B1 (ko) | 비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료 | |
Yang et al. | Injectable selenium-containing polymeric hydrogel formulation for effective treatment of myocardial infarction | |
KR101809795B1 (ko) | 폴리올계 삼투압적 폴리디자일리톨 폴리머 유전자 전달체 및 이의 용도 | |
Shao et al. | Strategies of porous network quinolone polymers: A comprehensive evaluation of their biological activity | |
Hu et al. | Inhibition of human cervical cancer development through p53-dependent pathways induced by the specified triple helical β-glucan | |
Rahman et al. | Synthesis and characterization of magnesium gluconate contained poly (lactic-co-glycolic acid)/chitosan microspheres | |
KR20180039589A (ko) | 폴리펩티드를 함유한 생체 다중효과를 가진 약제학적 조성물 및 그 용도 | |
Zhang et al. | Poly-antioxidants for enhanced anti-miR-155 delivery and synergistic therapy of metastatic breast cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240619 Address after: Room 1-17, 15th Floor, Building 2, No. 89, North Section 4, Second Ring Road, Jinniu District, Chengdu City, Sichuan Province, 610000 Patentee after: Chengdu Yunhai Tetrahedral Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 610000 No. 24 south part of Wuhou District first ring road, Chengdu, Sichuan. Patentee before: SICHUAN University Country or region before: China |
|
TR01 | Transfer of patent right |