CN115038795A - 捕获磁珠介导的单颗粒中核酸靶标的分子条形码编码及用于其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方案提供了捕获磁珠介导对颗粒，例如细胞或细胞外囊泡的核酸靶标进行分子条形码编码的方法。所述方法包括以下方面：a)将包含颗粒的样品与包含用于颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到靶标结合区以产生捕获的核酸。还提供了组合物，例如捕获磁珠，包括带条形码的磁珠，以及用于实施本方法的实施方案的装置/***和试剂盒。

Description

捕获磁珠介导的单颗粒中核酸靶标的分子条形码编码及用于 其的组合物
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求于2019年12月4日提交的美国临时专利申请序列第62/943647号的申请日期的优先权。该申请的公开内容通过引用并入本文。
背景技术
检测和定量单个细胞中特异性核酸和蛋白质分子的能力对于理解细胞多样性在发育、健康和疾病中的作用至关重要。流式细胞仪已成为高通量检测单细胞蛋白标志物的标准技术，并已广泛应用于基础研究和临床诊断。相比之下，例如mRNA表达之类的核酸测量方法，通常在大量样品上进行，从而掩盖了单个细胞的贡献。
为了表征细胞***的复杂性，非常需要开发用于监测在成千上万个细胞中大量基因的表达的方法、装置和***。当前的技术允许以大规模并行方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达，通过将细胞特异性寡聚核苷酸条形码连接到来自单个细胞的多聚(A)mRNA分子上，其中每个单个细胞在分隔间与条形码试剂珠共定位。
除细胞外，人们对检测细胞外囊泡中的核酸，例如外泌体和微囊泡越来越感兴趣。细胞外囊泡，例如外泌体和微囊泡，几乎从所有细胞类型脱落，广泛分布于血液和其他体液中。多个研究报告已经证明，包埋在EV内的各种RNA类型(包括mRNA、miRNA和lncRNA)可以从供体细胞转移到受体细胞，并干扰后者的基因表达。Turchinovich等人，“Trascriptome ofExtracellular Vesicles:Sate-of-the-Art,”Front Immunol.(2019)10:202。因此，细胞外囊泡核酸的特征是令人感兴趣的。
发明内容
尽管当前技术允许以大规模并行方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达，但是发明人已经识别到迄今为止使用的方法的某些不足之处。例如，目前使用的平台可能很难划分具有低沉降率的小细胞和囊泡。此外，目前使用的平台可能对很多不感兴趣的细胞进行条形码编码和测序，导致资源使用效率低下。本发明的实施方案解决了这些和其他需求。
本发明的实施方案提供了捕获磁珠介导的对例如细胞或细胞外囊泡之类的颗粒的核酸靶标进行分子条形码编码的方法。所述方法包括以下方面：a)将包含颗粒的样品与包含用于颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到靶标结合区以产生捕获的核酸。还提供了组合物，例如，捕获磁珠，包含带条形码的磁珠，以及用于实施本方法的实施方案的装置/***和试剂盒。
本文提供了对颗粒的核酸进行条形码编码的方法。所述方法包括以下方面：a)将样品与包含用于样品颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案划分捕获样品的捕获颗粒以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸，例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到结合了条形码核酸的珠的靶标结合区以产生捕获的核酸。在一些情况下，珠结合的条形码核酸被拴系在捕获磁珠上，而在其他情况下，连接条形码核酸的珠被拴系在与捕获磁珠不同的带条形码的珠上。在一些情况下，划分的颗粒被划分到微孔中。在一些情况下，捕获部分包含特异性结合成员，例如抗体或其结合片段。在一些情况下，除了靶标结合区外，珠结合的条形码核酸还包含一个或多于一个细胞标记域、独特独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中结合条形码核酸的珠具有以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特独特分子索引域-靶标结合区-3’。方法可以用于对来自多种颗粒的核酸进行条形码编码，例如生物颗粒、例如，细胞以及亚细胞大小的颗粒，例如，胞外囊泡、血小板、囊泡，例如外泌体或微囊泡。在一些情况下，方法还包括例如，通过使用施加磁场将捕获的核酸与划分的捕获颗粒的其他成分分离。在一些情况下，方法还包含混合捕获的核酸。在一些情况下，方法还包含将捕获的核酸置于cDNA合成反应条件下，以产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域。在一些情况下，方法还包含从包含捕获的核酸的第一链cDNA域中产生扩增子组合物。在一些情况下，例如在其中扩增子组合物包含下一代测序(NGS)文库的实施方案中，使用一轮或多于一轮扩增从包含捕获的核酸的第一链cDNA域产生扩增子组合物。在一些情况下，扩增子组合物包含含有核酸的NGS衔接子。在一些情况下，该方法还包括对NGS文库进行测序。
在一些情况下，方法包括：a)将包含颗粒的样品与捕获磁珠组合，所述捕获磁珠包含：i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及ii)与颗粒特异性结合的捕获部分，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案将捕获样品的捕获颗粒划分至微孔中，以产生划分的捕获颗粒；裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到条形码核酸的靶标结合区以产生捕获的核酸；将捕获的核酸置于cDNA合成反应的条件下，以产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域；从包含捕获的核酸的第一链cDNA域构建NGS文库；以及对NGS文库进行测序，从而对靶标颗粒的核酸进行测序。
在一些情况下，该方法还包括使用寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂，例如，在其中需要检测例如定量分析一种或多于一种细胞组分，例如，表面蛋白的应用中。这种实施方案中使用的寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂包括与细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸偶联的细胞组分结合试剂，例如，抗体或其结合片段，所述细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的标识符序列，标识符序列与细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸相关。在这种情况下，捕获磁珠可以包括配置为捕获，例如，特异性结合细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸域。通过这种方式，可以结合基因表达分析蛋白表达，例如，在需要进行多组学分析时，例如转录组和蛋白质组的组合分析。
还提供了可用于该方法的实施方案的捕获磁珠。捕获磁珠的实施方案包括具有与磁珠稳定结合的条形码核酸的磁珠以及与颗粒特异性结合的捕获部分。在一些情况下，捕获部分包含抗体或其结合片段。在一些情况下，条形码核酸除了靶标结合区(例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域)外，还包括一个或多于一个细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中珠结合的条形码核酸具有以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
还提供了可用于该方法的实施方案的装置。该装置的实施方案包括：a)包含100个或多于100个微孔的基底，所述微孔包含捕获磁珠，所述捕获磁珠包含：i)包含靶标结合区的条形码核酸；ii)与珠特异性结合的捕获部分；以及b)与基底流体连通的流动池。在一些情况下，捕获部分包含抗体或其结合片段。在一些情况下，除了靶标结合区(例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域)外，条形码核酸还包括一个或多于一个细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中珠结合的条形码核酸具有以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
还提供了可用于该方法的实施方案的***。所述***的实施方案包括：a)包含100个或多于100个微孔的基底，所述微孔包含捕获磁珠，捕获磁珠包含：i)包含靶标结合区的条形码核酸；ii)与颗粒特异性结合的捕获部分；b)与基底流体连通的流动池；以及c)流量控制器，其中，所述流量控制器被配置为控制向流动池的流体输送；并且在一些情况下是磁场施加器，例如，如下详述。在一些情况下，捕获部分包含抗体或其结合片段。在一些情况下，除了靶标结合区(例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域)外，条形码核酸还包括一个或多于一个细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中珠结合的条形码核酸具有以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
还提供了可用于该方法的实施方案的试剂盒。试剂盒的实施方案包括：(a)捕获磁珠，其包含特异性结合靶标颗粒的捕获部分，以及条形码核酸。在一些情况下，捕获磁珠包含条形码核酸，而在其他情况下，条形码核酸被拴系在与捕获磁珠分离的带条形码的珠上。在一些情况下，捕获部分包含抗体或其结合片段。在一些情况下，除了靶标结合区(例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域)外，条形码核酸还包括一个或多于一个细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中珠结合的条形码核酸具有以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。在一些情况下，该试剂盒还包括装置，装置包含：(i)包含100个或多于100个微孔的基底；以及(ii)与基底流体连通的流动池。
附图的简要说明
在以下详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另有规定，相似的符号通常识别相似的组分。说明书、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着具有限制性。在不背离本文所述主题的精神或范围的情况下，可以使用其他实施方案，并且可以进行其他更改。很容易理解，如本文所述并在图中说明的本公开内容的各个方面，可以以多种不同的构造布置、置换、组合、分离和设计，所有这些都在此处明确地考虑并构成本公开内容的一部分。
图1A和图1B提供了根据本发明各种实施方案的捕获磁珠的代表。
图2提供了根据本发明实施方案的捕获样品制备的代表。
图3A和图3B提供了根据本发明实施方案的划分的捕获颗粒的代表。
图4A至图4C提供了根据本发明实施方案的划分的捕获颗粒的代表。
图5提供了使用根据本发明实施方案的***的工作流的代表。
图6提供了可以用于本发明实施方案的测序文库制备工作流的图示。
定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。参见，例如Singleton等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold SpringHarbor,NY 1989)。出于本公开内容的目的，以下术语的定义如下。
本文使用的术语“衔接子”可以指促进相关核酸的扩增或测序的序列。相关核酸可以包括靶标核酸。相关核酸可以包括一个或多于一个空间标记、靶标标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)。衔接子可以是直链的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一个或多于一个衔接子可以位于核酸的5’端或3’端。当在5’端和3’端的衔接子包含已知序列时，已知序列可以是相同的或不同的序列。位于多核苷酸5’端和/或3’端的衔接子能够与固定在表面上的一个或多于一个寡聚核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两个或多于两个核酸分子共有的核苷酸序列区。两个或多于两个核酸分子也可以具有序列不同的区。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用的核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用的序列。可以存在于多个核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单一通用引物复制或扩增多个不同的序列。类似地，可以存在于核酸分子集合的不同成员中的至少一个、两个(例如，一对)或多于两个通用序列可以允许使用至少一个、两个(例如，一对)或多于两个与通用序列互补的单一通用引物来复制或扩增多个不同的序列。因此，通用引物包括可以与这种通用序列杂交的序列。可以修饰携带靶标核酸序列的分子，以将通用衔接子(例如，非靶标核酸序列)连接到不同靶标核酸序列的一端或两端。与靶标核酸连接的一个或多于一个通用引物可以为通用引物杂交提供位点。与靶标核酸连接的一个或多于一个通用引物可以相同也可以彼此不同。
本文使用的抗体可以是全长的(例如，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白的分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。在一些实施方案中，抗体是功能性抗体片段。例如，抗体片段可以是抗体的一部分，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。抗体片段可以与被全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体可变区组成的分离片段，例如组成为轻链和重链可变区的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区是通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于，癌细胞的抗体、病毒的抗体、结合细胞表面受体(例如，CD8、CD34和CD45)的抗体、以及治疗性抗体。
本文使用的术语“相关”或“有关”可以表示被识别为在某个时间在处于同一位置的两个或多于两个种类。相关可以意味着两个或多于两个种类在或曾在相似的容器中。相关可以是信息学相关。例如，关于两个或多于两个种类的数字信息可以被存储，并可用于确定一个或多于一个种类在某个时间处于同一位置。相关也可以是物理相关。在一些实施方案中，两个或多于两个的相关种类被“栓系”、“附着”或“固定”到另一个或共同的固体或半固体表面上。相关可以指将标记附着到例如珠的固体或半固体支撑物上的共价或非共价方法。相关可以是靶标和标记之间的共价键。相关可以包括两个分子(例如靶标分子和标记)之间的杂交。
本文使用的术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸上给定位置的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸通过氢键连接，那么这两个核酸在该位置上彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，它可能是完全互补的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以说第一核苷酸序列与第二序列“互补”。如果第一核苷酸序列与第二序列相反(即核苷酸的顺序相反)的序列是互补的，那么可以说第一核苷酸序列与第二序列“反向互补”。本文使用的术语“互补的”、“互补”和“反向互补”可以互换使用。从公开内容中可以理解，如果分子可以与另一个分子杂交，那么它可以与正在杂交的分子互补。
本文使用的术语“数字计数”可以指在样品中估算靶标分子数量的方法。数字计数可以包括确定与样品中的靶标相关的独特标记的数量的步骤。这种研究方法，在本质上可以是随机的，它将分子计数问题从定位和识别相同分子的问题转变为关于检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。
本文使用的术语“标记”或“多个标记”可以指与样品内靶标相关的核酸代码。标记可以是，例如，核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是被识别为不同的天然核酸的一部分。标记可以是已知序列。标记可以包含核酸序列的连接物，例如天然序列和非天然序列的连接物。本文使用的术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传递信息。例如，在各种实施方案中，标记可以用于确定样品的特性、样品的来源、细胞的特性和/或靶标。
本文使用的术语“非消耗型储存池”可以指由许多不同标记组成的条形码池(例如，随机条形码)。非消耗型储存池可以包含大量不同的条形码，使得当非消耗型储存池与靶标池相关时，每个靶标都可能与独特的条形码相关。相对于标记的多样性，每个经标记的靶标分子的独特性可以通过随机选择的统计数据确定，并且取决于集合中相同靶标分子的拷贝数。所得的经标记的靶标分子的大小可以由条形码编码过程的随机性确定，然后通过分析检测到的条形码的数量，可以计算原始集合或样品中存在的靶标分子的数量。当存在的靶标分子的拷贝的数量与独特条形码数量之比较低时，经标记的靶标分子具有高度独特性(即多于一个靶标分子被给定标记标记的概率非常低)。
本文使用的术语“核酸”指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包含核苷酸。核酸对于细胞来说可以是外源的或内源的。核酸可以在无细胞环境中存在。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包含一个或多于一个类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉核酸、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮杂-GTP、荧光团(例如，与糖连接的罗丹明或荧光素)、包含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。“核酸”、“多核苷酸”、“靶标多核苷酸”和“靶标核酸”可以互换使用。
核酸可以包含一种或多于一种修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，以使核酸具有新的或增强的特征(例如提高稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖的组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。这类杂环碱基最常见的两类是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括磷酸基团共价连接到核苷的糖部分的核苷。对于那些包含戊呋喃基糖的核苷，磷酸基团可以连接到糖的2'羟基、3'羟基或5'羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以共价连接相邻的核苷，形成直链的聚合的化合物。反过来，该直链的聚合的化合物的各个末端还可以连接形成环状化合物；然而，通常直链的化合物是合适的。此外，直链的化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，因此可能以某种方式折叠以产生完全或部分双链的化合物。在核酸内，磷酸基团通常可以被称为形成核酸的核苷间骨架。连接键或骨架可以是3'至5'磷酸二酯键。
核酸可以包含经修饰的骨架和/或经修饰的核苷间的连接键。经修饰的骨架可以包括那些骨架中保留磷原子的骨架和那些骨架中没有磷原子的骨架。其中包含磷原子的合适的经修饰的核酸骨架可以包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、膦酸甲基酯和其他膦酸烷基酯，例如3'-膦酸亚烷基酯、5'-膦酸亚烷基酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代膦酸烷基酯、硫代磷酸烷基三酯、硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯，它们具有正常3'至5'键、2'至5'键的类似物，以及具有反转极性的那些，其中一个或多于一个的核苷酸间的连接键是3'至3'键、5'至5'键或2'至2'键。
核酸可以包含多核苷酸骨架，多核苷酸骨架由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多于一个短链杂原子的或杂环的核苷间键形成。这些可以包括具有吗啉核酸的连接键(部分由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲缩醛(formacetyl)和硫代甲缩醛骨架；亚甲基甲缩醛和硫代甲缩醛骨架；核糖乙酰骨架；包含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；和混合了N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。
核酸可以包括核酸类似物。术语“类似物”可旨在包括多核苷酸，其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间的键均被非呋喃糖基团置换，仅置换呋喃糖环的也可被称为糖替代类似物。杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分可以保持用于与合适的靶标核酸杂交。一个这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖-骨架可以被含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核苷酸可以被保留，并直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的骨架可以包含两个或多于两个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使PNA具有含酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包含吗啉核酸骨架结构。例如，核酸可以包含取代核糖环的6元吗啉代环。在一些实施方案中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷间键可以取代磷酸二酯键。
核酸可以包含连接的吗啉代单元(例如，吗啉核酸)，其具有与吗啉代环连接的杂环碱基。连接基团可以连接吗啉核酸中的吗啉代的单体单元。非离子的基于吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白的不良相互作用较少。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子类似物。吗啉核酸类中的多种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一类多核苷酸类似物可称为环己烯基核酸(CeNA)。通常存在于核酸分子中的呋喃糖环可以被环己烯基环取代。可以使用亚磷酰胺化学合成法制备CeNADMT保护的亚磷酰胺单体并将其用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡聚腺苷酸可与核酸互补物形成复合物，其稳定性与天然复合物相似。其他的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基与糖环的4'碳原子相连，从而形成2'-C-甲醛键、4'-C-甲醛键，从而形成双环糖部分。该键可以是亚甲基(-CH2)、桥接2'氧原子和4'碳原子的基团，其中n为1或2。LNA和LNA类似物可以与互补核酸表现出非常高的双链热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3'-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或置换。本文使用的“未修饰”或“天然”核碱基可包括嘌呤碱(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物以及其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和5-丙炔基(-C＝C-CH3)胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤和鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤和鸟嘌呤、8-巯基腺嘌呤和鸟嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤和鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤和鸟嘌呤和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，特别是5-溴尿嘧啶和胞嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶和胞嘧啶和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。经修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，例如，吩
Figure BDA0003777502980000091
嗪胞苷(1H-嘧啶基(5,4-b)(1,4)苯并
Figure BDA0003777502980000092
嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G形夹，例如将取代的吩
Figure BDA0003777502980000093
嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4))苯并
Figure BDA0003777502980000094
嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶基(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G形夹如经取代的吩
Figure BDA0003777502980000095
嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并
Figure BDA0003777502980000096
嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3',2':4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
本文使用的术语“样品”可以指包含靶标的组合物。通过所公开的方法、装置和***进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。
本文使用的术语“样品装置”或“装置”可以指可以获取样品的一部分和/或将该部分放置在基底上的装置。样品装置可以指，例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、叶栅和/或切片机。
本文使用的术语“固体支撑物”可以指离散固体或半固体表面，其上可以附着多个条形码(例如，随机条形码)。固体支撑物可能包含由塑料、陶瓷、金属或聚合物材料(例如，水凝胶)组成的可能其上(例如，共价或非共价)固定有核酸的任意类型的固体、多孔或中空球、球体、轴承、圆柱体或其他类似构造。固体支撑物可以包括离散颗粒，其可以是球形(例如，微球)或具有非球形或不规则形状，例如立方体、长方体、金字塔形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或盘形等。珠的形状可以是非球形。以阵列间隔开的多个固体支撑物可以不包含基底。固体支撑物可以与术语“珠”互换使用。
本文使用的术语“随机条形码”可以指包含本公开内容的标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是用于随机条形码编码的多核苷酸序列。随机条形码可以用来定量样品中的靶标。随机条形码可以用于控制标记与靶标相关后可能出现的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序误差。与靶标相关的随机条形码可称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
本文使用的术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性靶标结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码编码的多核苷酸序列。随机条形码可以用来定量样品中的靶标。随机条形码可以用于控制标记与靶标相关后可能出现的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序误差。与靶标相关的随机条形码可称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
本文使用的术语“随机条形码编码”可以指核酸的随机标记(例如，条形码编码)。随机条形码编码可以利用递归泊松策略来相关和定量与靶标相关的标记。本文使用的术语“随机条形码编码”可以与“随机标记”互换使用。
本文使用的术语“靶标”可以指与条形码(例如，随机条形码)相关的组合物。通过公开的方法、装置和***分析的示例性合适的靶标包括寡聚核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等。靶标可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶标可以是蛋白质、肽或多肽。在一些实施方案中，靶标是脂类。本文使用的“靶标”可以与“种类”互换使用。
本文使用的术语“逆转录酶”可以指一组具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的酶。一般而言，此类酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、反转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II类内含子衍生逆转录酶及其突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、反转录子逆转录酶和II类内含子逆转录酶。II类内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌LI.LtrB基因内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类型的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即反转录子、II类内含子和产生多样性的逆转录元件等)。
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换使用，指核苷酸序列，其可用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码。例如，通用衔接子序列可以是在本公开内容的方法中使用的所有条形码中通用的已知序列。例如，当使用本公开内容的方法标记多个靶标时，每个靶标特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，在本公开内容的方法中可以使用多于一个通用衔接子序列。例如，当使用本公开内容的方法标记多个靶标时，至少有两个靶标特异性序列与不同的通用衔接子序列连接。通用衔接子引物及其互补物可包含在两个寡聚核苷酸中，其中一个寡聚核苷酸包含靶标特异性序列，另一个寡聚核苷酸包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是包含靶标特异性序列的寡聚核苷酸的一部分，以产生与靶标核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡聚核苷酸可能与核苷酸序列杂交并产生靶标特异性条形码(例如，靶标特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物的序列不同于与本公开内容的方法中使用的通用PCR引物。
单细胞中核酸靶标的分子条形码编码概述
作为本公开内容的方法、装置和***的基础研究方法，利用沉积策略来实现对大量单个细胞的单细胞分子条形码编码测定。例如，通过用其上拴系有条形码核酸的单个带条形码的珠关联单个细胞，来自单个细胞的分子靶标可以与细胞标记(也称为细胞索引、条形码或标签)和分子标记(也称为分子索引、条形码或标签)随机标记，其中每个单个带条形码的珠包含多个附着的随机标记。附着在给定珠上的随机标记可用于随机标记来自相关细胞的蛋白质或核酸靶标。在一些实施方案中，单细胞随机分布到多个微孔中(例如，微孔阵列)。每个包含多个拴系的随机条形码核酸标记的带条形码的珠的组合文库也随机分布到多个微孔中，使得微孔的子集包含单细胞和单个珠。在一些实施方案中，带条形码的珠在细胞沉积之前沉积。在其他实施方案中，带条形码的珠在细胞沉积之后沉积。在实施方案中，例如，其中带条形码的珠包括用于靶标细胞的捕获部分(例如，下文将更详细地描述)，珠和细胞(或亚细胞颗粒，例如，囊泡)可以同时沉积，例如，作为珠和细胞的结合复合物。包含细胞的和分子条形码的随机标记还可以包含能够附着于分子靶标，例如，核酸分子，或与之杂交的靶标识别区。靶标分子可以例如通过裂解细胞从每个细胞中释放，然后附着于相应带条形码的珠上的随机标记或与之杂交。在某些实施方案中，靶标分子通过裂解例如酶裂解从细胞中释放。在一些实施方案中，例如，当靶标分子是mRNA分子时，将mRNA靶标分子与随机标记杂交后，从微孔中回收珠，并在进行逆转录、扩增和测序反应之前汇集。
在一些实施方案中，附着在给定珠上的多个随机标记包含细胞标记，该细胞标记对于附着在该珠上的所有随机标记都是相同的，而附着在不同珠上的多个随机标记的细胞标记是不同的。在一些实施方案中，附着在给定珠上的多个随机标记包含不同种类的分子标记，所述分子标记选自包含特定数量的独特分子标记序列组。在一些实施方案中，附着在给定珠上的多个随机标记可以包含相同的靶标识别区。在一些实施方案中，附着在给定珠上的多个随机标记可包含两个或多于两个不同的靶标识别区。
在一些实施方案中，珠文库的细胞标记多样性(即独特细胞标记序列的数量)比待标记的细胞数量至少高一个或两个数量级，使得每个细胞与独特细胞条形码配对的概率非常高。例如，每个细胞与独特细胞条形码配对的概率可以大于80％、大于90％、大于95％、大于99％、大于99.9％、大于99.99％或大于99.999％。
在一些实施方案中，与附着在珠上的多个随机标记的分子标记多样性(即独特分子标记序列的数量)比待标记的靶标分子种类的估计出现数量至少高一个或两个数量级，使得细胞内靶标分子(例如mRNA分子)的每次出现都被独特标记的概率也非常高。例如，每个出现的靶标分子与独特分子条形码配对的概率可以大于80％、大于90％、大于95％、大于99％、大于99.9％、大于99.99％或大于99.999％。在这些实施方案中，可以通过确定附着在靶标分子序列上的独特分子标记序列的数量来计数(或估计)每个细胞中出现的靶标分子种类的数量。在许多实施方案中，可以通过对经标记的靶标分子(或其互补序列)的扩增文库进行测序以执行确定步骤。
在一些实施方案中，与待标记的靶标分子种类的估计出现数量相比，附着在珠上的多个随机标记的分子标记多样性是相当的或低的，使得多次出现的给定类型的靶标分子被多于一个拷贝的给定分子标记标记的可能性很大。在这些实施方案中，每个细胞中靶标分子的数量可以使用泊松统计，根据附着在靶标分子序列上的独特分子标记序列的数量计算。
在某些实施方案中，感兴趣的靶标分子是在单个细胞中表达的mRNA分子。由于每个细胞中所有或部分多聚腺苷酸化mRNA分子的cDNA拷贝共价保存在相应珠的表面上，因此可以随后分析任意选择的基因转录物。当带条形码的转录物被测序并分配到原来的细胞(基于识别的细胞标记)和计数(基于识别的独特分子标记的数量)时，可以重建每个细胞的数字基因表达谱。该分析研究方法的示例性描述可见Fan,等人,"Combinatorial Labelingof Single Cells for Gene Expression Cytometry",Science 347(6222):628；和Science 347(6222):1258367。
现在更详细地综述上述概述的各种要素。
条形码和数字计数
定量少量的核酸，例如信使核糖核酸(mRNA)分子，对于确定例如细胞在不同发育阶段或不同环境条件下表达的基因具有重要的临床意义。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数量也可以非常具有挑战性，特别是当分子数量非常少的时候。一种确定样品中分子绝对数量的方法是数字聚合酶链反应(PCR)。理想情况下，PCR在每个循环中产生分子的相同拷贝。然而，PCR会有缺点，例如每个分子以随机的概率进行复制，而这个概率随PCR循环和基因序列的不同而不同，导致扩增偏倚和基因表达测量不准确。具有独特分子标记(也称为分子索引(MI))的随机条形码可以用于分子数量计数和纠正扩增偏倚。例如PreciseTM测定(Cellular Research,Inc.(Palo Alto,CA))之类的随机条形码编码可以通过在逆转录(RT)期间使用分子标记(ML)标记mRNA以纠正由PCR和文库制备步骤诱发的偏倚。
PreciseTM测定可以利用非消耗型随机条形码池，其包含大量例如6561至65536的多聚(T)寡聚核苷酸上的独特分子标记，以在RT步骤期间与样品中所有多聚(A)-mRNA杂交。随机条形码可以包含通用的PCR引物位点。在RT过程中，靶标基因分子与随机条形码随机反应。每个靶标分子可以与随机条形码杂交，从而产生带随机条形码的互补核糖核苷酸(cDNA)分子。标记后，来自微孔板的微孔、液滴或其他分区的微孔中带随机条形码的cDNA分子可以汇集到单个管中进行PCR扩增和测序，例如，通过下一代测序方案，例如，如下所述。可以通过对原始测序数据进行分析，以产生读取的数量、具有独特分子标记的随机条形码的数量以及mRNA分子的数量。
条形码编码，例如随机条形码编码，已经在，例如Fu等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.,2011May 31,108(22):9026-31；美国专利申请公开第US2011/0160078号；Fu等人，Science,2015February 6,347(6222):1258367；美国专利申请公开第US2015/0299784号；PCT申请公开第WO2015/031691号中进行了描述，其中这些中的每一个的内容，包括任意支持或补充信息或材料的全部内容均通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是用于随机标记(例如，条形码、标签)靶标的多核苷酸序列的随机条形码。如果随机条形码的不同条形码序列的数量与任意待标记靶标的出现数量之比可以是，或约是，1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或这些值中任意两个之间的值或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶标可以是mRNA种类，其包含具有相同或几乎相同序列的mRNA分子、抗体标识符序列等。如果随机条形码的不同条形码序列的数量与任意待标记靶标的出现数量之比至少或至多是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码中的条形码序列可称为分子标记。
条形码，例如随机条形码，可以包含一个或多于一个标记。示例性标记可包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或预空间标记。空间标记、维度标记和细胞标记可以是任意顺序的。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记的顺序是任意的。条形码可以包含靶标结合区。靶标结合区可以与样品中的靶标(例如，靶标核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶标结合区可以包含寡聚(dT)序列，该寡聚(dT)序列可以与mRNA的多聚(A)尾和/或结合细胞组分的试剂特异性寡聚核苷酸等相互作用。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以被1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或多于20个核苷酸分隔。
标记，例如细胞标记，可以包含确定长度的独特核酸子序列组，例如，每个核酸子序列有七个核苷酸(相当于一些汉明纠错码中使用的比特数)，其可以设计为提供纠错能力。可以设计包含七个核苷酸序列的纠错子序列组，使得该组序列中任意成对组合表示出确定的“遗传距离”(或错配碱基的数量)，例如，纠错子序列组可以设计为表示三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，检查经标记的靶标核酸分子序列数据组中的纠错序列(下文更全面地描述)可以允许检测或纠正扩增或测序错误。在一些实施方案中，用于产生纠错码的核酸子序列的长度可以是变化的，例如，长度可以是，或约是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个，或者是这些值中任意两个值之间的值或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可用于产生纠错码。
通用标记
条形码可以包含一个或多于一个通用标记。在一些实施方案中，对于附着到给定固体支撑物的条形码组中的所有条形码，一个或多于一个通用标记可以是相同的。在一些实施方案中，一个或多于一个通用标记对于附着在多个珠上的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含能够与测序引物杂交的核酸序列，因此可以称为通用引物结合域。测序引物可用于对包含通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)，可以包含与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包含能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包含能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序或PCR引物杂交的通用标记核酸序列可以指引物结合位点。通用标记可包含可用于启动条形码转录的序列。通用标记可包含可用于延伸条形码或条形码内的区的序列。通用标记的长度可以是，或约是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或这些值中任意两个之间的值或范围。例如，通用标记可以包含至少10个核苷酸。通用标记的长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解的接头或经修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支撑物上裂解下来。
维度标记
条形码可以包含一个或多于一个维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包含提供关于出现的标记(例如，随机标记)的维度信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供有关靶标被条形码编码的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码编码(例如，随机条形码编码)的时间相关。维度标记可以在标记时被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶标、靶标组和/或样品被条形码编码的顺序的信息。例如，可以在细胞周期的G0期对细胞群进行条形码编码。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)再次脉冲细胞。在S期，可以用条形码再次脉冲细胞，以此类推。每个脉冲(例如，细胞周期的每个阶段)的条形码可以包含不同的维度标记。通过这种方式，维度标记提供了关于在细胞周期的哪个阶段标记哪些靶标的信息。维度标记可以查询许多不同的生物时间。示例性生物时间包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一个实例中，可以在药物和/或治疗之前和/或之后标记样品(例如，细胞、细胞群)。不同靶标拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或治疗的反应。
维度标记可以是可激活的。可以在特定的时间点激活可激活的维度标记。例如，可激活标记可以被结构性激活(例如，不关闭)。例如，可激活维度标记可以是可逆激活的(例如，可激活维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以例如可逆激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或多于10次。维度标记可以可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或多于10次。在一些实施方案中，维度标记可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解、连接另一个分子、添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光笼)，以及引入非天然核苷酸激活。
在一些实施方案中，维度标记对于附着到给定固体支撑物(例如，珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支撑物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支撑物上至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支撑物上至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支撑物上至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。
在多个固体支撑物(例如，珠)中可以表现多达106种或多于106种的独特维度标记序列。维度标记的长度可以是，或约是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。维度标记的长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个核苷酸。维度标记的长度可以包含约20至约125个核苷酸。
空间标记
条形码可以包含一个或多于一个空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码相关的靶标分子空间方向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标相关。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以是参照基底固定的。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以是参照界标固定的。界标可以在空间中识别。界标可以是可成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非自然界标，例如具有可识别标识符的结构，例如颜色代码、条形码、磁性、荧光、放射性或独特的尺寸或形状。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)相关。在一些实施方案中，多个空间标记一起使用以编码空间中的一个或多于一个位置。
空间标记对于附着到给定固体支撑物(例如，珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支撑物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，包含相同空间标记的相同固体支撑物的条形码百分比可以是，或约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或这些值中的任意两个之间的值或范围。在一些实施方案中，包含相同空间标记的相同固体支撑物的条形码的百分比可以至少或至多为60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，相同固体支撑物上至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，相同固体支撑物上至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。
在多个固体支撑物(例如，珠)中可以表现多达106个或多于106个的独特空间标记序列。空间标记的长度可以是，或约是，1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。空间标记的长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个核苷酸。空间标记可以包含约20个至约125个核苷酸的长度。
细胞标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一个或多于一个细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含核酸序列，其提供用于确定哪个靶标核酸源自哪个细胞的信息，因此可以称为细胞标记域。在一些实施方案中，细胞标记对于附着到给定固体支撑物(例如，珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支撑物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，包含相同细胞标记的相同固体支撑物的条形码百分比可以是，或约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或这些值中任意两个之间的值或范围。在一些实施方案中，包含相同细胞标记的相同固体支撑物的条形码百分比可以是，或约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，同一固体支撑物上至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一个实例，同一固体支撑物上至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。
在多个固体支撑物(例如，珠)中可以表现多达106或多于106的独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是，或约是，1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。细胞标记的长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个核苷酸。作为另一个实例，细胞标记可以包含约10个至约150个核苷酸。作为另一个实例，细胞标记可以包含约20个至约125个核苷酸的长度。
条形码序列
条形码可以包含一个或多于一个条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含提供与条形码杂交的特定类型的靶标核酸种类识别信息的核酸序列。条形码序列可包含提供特定出现的与条形码(例如，靶标结合区)杂交的靶标核酸种类的计数(例如，提供粗略近似)的核酸序列。
在一些实施方案中，不同组的条形码序列附着在给定的固体支撑物(例如，珠)上。在一些实施方案中，可以有或月有102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个，或这些值中任意两个之间的值或范围的独特的分子标记序列。例如，多个条形码可以包含约6561个具有不同序列的条形码序列。作为另一个实例，多个条形码可以包含约65536个具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以有至少或至多102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个或109个独特条形码序列。独特分子标记序列可附着于给定的固体支撑物(例如，珠)上。
条形码的长度在不同的实施方案中可以不同。例如，条形码的长度可以是，或约是，1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。作为另一个实例，条形码的长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
分子标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一个或多于一个分子标记。分子标记可以包括条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含提供与条形码杂交的特定类型的靶标核酸种类的识别信息的核酸序列。分子标记可包含提供与条形码(例如，靶标结合区)杂交的特定出现的靶标核酸种类计数的核酸序列。
在一些实施方案中，不同组的分子标记附着在给定的固体支撑物(例如，珠)上。在一些实施方案中，可以有或约有102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个，或这些值中任意两个之间的值或范围的独特分子标记序列。例如，多个条形码可以包含约6561个具有不同序列的分子标记。作为另一个实例，多个条形码可以包含约65536个具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以有至少或至多102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个或109个独特分子标记序列。带有独特分子标记序列的条形码可附着于给定的固体支撑物(例如，珠)上。
对于使用多个随机条形码的随机条形码编码，不同分子标记序列的数量与任意靶标的出现数量之比可以是，或约是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或这些值中任意两个之间的值或范围。靶标可以是mRNA种类，其包含具有相同或几乎相同序列的mRNA分子。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数量与任意靶标的出现数量之比至少是或至多是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
分子标记的长度可以是，或约是，1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。分子标记的长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
靶标结合区
条形码可以包含一个或多于一个靶标结合区，如捕获探针(其也可称为捕获的核酸)。在一些实施方案中，靶标结合区可以与感兴趣的靶标杂交。在一些实施方案中，靶标结合区可以包含与靶标(例如，靶标核酸、靶标分子、待分析的细胞核酸)特异性杂交的核酸序列，例如与特异性基因序列杂交的核酸序列。在一些实施方案中，靶标结合区可以包含能够附着(例如，杂交)到特异性靶标核酸的特异性位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶标结合区可以包含能够与限制性内切酶位点单链突出端(例如，EcoRI黏性末端单链突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接到包含与限制性位点单链突出端互补的序列的任意核酸分子上。
在一些实施方案中，靶标结合区可以包含非特异性靶标核酸序列。非特异性靶标核酸序列可指可以结合多个靶标核酸、与靶标核酸的特异性序列无关的序列。例如，靶标结合区可包含随机多聚体序列、多聚(dA)序列、多聚(dT)序列、多聚(dG)序列、多聚(dC)序列或其组合。例如，靶标结合区可以是与mRNA分子上的多聚(A)尾杂交的寡聚(dT)序列(例如，寡聚dT域)。例如，可以使用逆转录酶逆转录mRNA分子，例如使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶，以产生具有多聚(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括有多聚(dG)尾的靶标结合区。当条形码的多聚(dG)尾和cDNA分子的多聚(dC)尾之间进行碱基配对时，逆转录酶会将模板链从细胞RNA分子切换到条形码，并继续复制到条形码的5'端。通过这样做，得到在cDNA分子的3'端包含条形码(例如分子标记)序列的cDNA分子。
随机多聚体序列可以是，例如，任意长度的随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或高于十聚体的多聚体序列(其中靶标结合区可以称为随机序列域)。
在一些实施方案中，对于附着在给定珠上的所有条形码，靶标结合区是相同的。在一些实施方案中，与给定珠连接的多个条形码的靶标结合区可以包含两个或多于两个不同的靶标结合序列。靶标结合区的长度可以是，或约是，1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。靶标结合区的长度可至多是约1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或多于50个核苷酸。
在一些实施方案中，靶标结合区可以包含寡聚(dT)(即，例如，寡聚dT域)，其可以与包含多聚腺苷酸末端的mRNA杂交。靶标结合区可以是基因特异性的。例如，靶标结合区可以被配置为与靶标的特异性区域杂交(例如，其中靶标结合区是基因特异性域)。
靶标结合区的长度可以是，或约是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。靶标结合区长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。靶标结合区的长度可以约为5个至30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶标结合区时，该条形码在此可称为基因特异性条形码。
靶标结合区可以与样品中的靶标相互作用。靶标可以是或包含核糖核苷酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自包含多聚(A)尾的RNA或其任意组合。在一些实施方案中，多个靶标可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施方案中，靶标结合区可以包含寡聚(dT)序列，该序列可以与mRNA的多聚(A)尾相互作用。条形码的一个或多于一个标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔基基与条形码的另一个或两个剩余标记分开。例如，间隔基可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个，或多于20个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记都没有被间隔基分开。
通用衔接子引物
条形码可以包含一个或多于一个通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码，例如基因特异性随机条形码，可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指在所有条形码中通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是，或约是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个，或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。通用衔接子引物长度可至少或至多是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物长度可达5个至30个核苷酸。
接头
当条形码包含多于一种类型的标记(例如，多于一种细胞标记或多于一种条形码序列，例如一种分子标记)时，这些标记可以穿插接头标记序列。接头标记序列的长度可以至少是5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或多于50个的核苷酸。接头标记序列的长度可至多是5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或多于50个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包含纠错(例如，汉明)码。
固体支撑物
在一些实施方案中，本文公开的条形码，例如随机条形码，可以与固体支撑物相关。固体支撑物可以是，例如，合成颗粒。在一些实施方案中，一些或所有的条形码序列，例如固体支撑物上具有多个条形码(例如，第一多个条形码)的随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记相差至少一个核苷酸。同一固体支撑物上的条形码的细胞标记可以相同。不同固体支撑物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，位于第一固体支撑物上具有第一多个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，位于第二固体支撑物上具有第二多个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支撑物上具有第一多个条形码的第一细胞标记与第二固体支撑物上具有第二多条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记的长度可以是，例如，约5个至20个核苷酸。条形码序列的长度可以是，例如，约5个至20个核苷酸。合成颗粒可以是例如珠。
珠可以是，例如硅胶珠、受控孔玻璃珠、磁性珠、Dynabead、葡聚糖凝胶/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠，或任其任意组合。珠还可以包含例如以下材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸类聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、或其任意组合。
在一些实施方案中，珠可以是聚合物珠，例如可变形珠或凝胶珠，用条形码或随机条形码进行功能化(例如来自10X Genomics(Pleasanton CA)的凝胶珠)。在一些实施方案中，凝胶珠可以包含基于聚合物的凝胶。例如，可以通过将一个或多于一个聚合物前体封装成液滴以产生凝胶珠。将聚合物前体暴露于加速剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))时，可以产生凝胶珠。
在一些实施方案中，颗粒可以是可降解的。例如，例如，在所需的条件下，聚合物珠可以溶解、熔化或降解。所需的条件可以包括环境条件。所需的条件可导致聚合物珠以受控的方式溶解、熔化或降解。凝胶珠可由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任意组合而溶解、熔化或降解。
分析物和/或试剂，例如寡聚核苷酸条形码，例如，可以偶联/固定到凝胶珠的内表面(例如，通过寡聚核苷酸条形码和/或用于产生寡聚核苷酸条形码的材料扩散可接近的内部)和/或凝胶珠或本文所述的任意其他微胶囊的外表面。可以通过任意形式的化学键(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)偶联/固定。在一些实施方案中，试剂与凝胶珠或本文所述的任意其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，例如，通过不稳定部分(例如通过化学交联剂，包括本文所述的化学交联剂)。当施加刺激时，不稳定部分可以被裂解，并且释放被固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定部分是二硫键。例如，在寡聚核苷酸条形码通过二硫键固定在凝胶珠上的情况下，将二硫键暴露于还原剂中可以裂解二硫键并从珠上释放寡聚核苷酸条形码。不稳定部分可以包括作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为连接试剂或分析物到凝胶珠或微胶囊的化学接头的一部分、和/或作为试剂或分析物的一部分。在一些实施方案中，多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上、部分固定在颗粒上、封闭在颗粒中、部分封闭在颗粒中，或其任意组合。
在一些实施方案中，凝胶珠可以包含多种不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感性聚合物、盐敏感性聚合物、化学敏感性聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白质和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PTHF)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)
大量的化学刺激可以用来触发珠的破碎、溶解或降解。这些化学变化的实例可以包括但不限于pH介导的珠壁变化，通过化学裂解交联键导致的珠壁崩解，触发的珠壁解聚，以及珠壁开关反应。大量的变化也可以用来触发珠的破碎。
通过各种刺激对微胶囊的体积或物理变化也为设计释放试剂的胶囊提供了很多优势。体积或物理变化存在在宏观尺度上，其中珠破裂是由刺激诱发的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力诱发的破裂、珠壁熔化或珠壁孔隙率的变化。
生物刺激也可以用来触发珠的破碎、溶解或降解。通常，生物触发器类似于化学触发器，但许多实例使用生物分子，或在生命***中常见的分子，如酶、多肽、糖类、脂肪酸、核酸等。例如，珠可以包含具有对特异性蛋白酶的裂解敏感的肽交联聚合物。更具体地，一个实例可以包括包含GFLGK肽交联的微胶囊。当加入例如蛋白酶组织蛋白酶B之类的生物触发物时，壳壁的肽交联被裂解，并且珠的内容物被释放在其他情况下，蛋白酶可以被热激活。在另一个实例中，珠包含含有纤维素的壳壁。添加水解酶壳聚糖作为生物触发器，以裂解纤维素键、解聚壳壁、释放其内容物。还可以在施加热刺激的情况下，诱发珠释放它们的内容物。温度的变化可以导致珠发生多种变化。热的变化可以导致珠熔化，从而使珠壁崩解。在其他情况下，热可以增加珠内部组分的内部压力，从而导致珠破裂或***。在其他情况下，热可以将珠转变为皱缩的脱水状态。热也可以作用于珠壁内的热敏聚合物，导致珠壁破碎。
将磁性纳米颗粒包含在微胶囊的珠壁上可以允许触发珠的破裂以及引导珠形成阵列。本公开内容的装置可以包含用于任一目的的磁珠。在一个实例中，在震荡磁场的刺激下，将Fe3O4纳米颗粒加入到包含聚电解质的珠中会触发破裂。
珠可以由于电刺激而破碎、溶解或降解。与上一节描述的磁性颗粒类似，电敏性珠既可以触发珠的破裂，也可以实现其他功能，例如在电场中的比对、电导率或氧化还原反应。在一个实例中，包含电敏材料的珠在电场中排列，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁内部诱发氧化还原反应，从而可以增加孔隙率。
光刺激也可以用来破碎珠。许多光触发是可能的并且可以包括使用各种分子的***，例如能够吸收特异性波长范围的光子的纳米颗粒和发色团。例如，金属氧化物涂层可用作胶囊触发器。紫外线照射涂有SiO2的聚电解质胶囊可以导致珠壁崩解。在另一个实例中，可以在珠壁中引用例如偶氮苯基团之类的光开关材料。在施加紫外线或可见光时，诸如此类的化学物质在吸收光子时经历了可逆的顺反异构化。在这方面，加入光子开关可以导致珠壁在光触发器的作用下崩解或变得更加多孔。
本文公开内容的条形码可以关联(例如，附着到)固体支撑物(例如，珠)。与固体支撑物相关的条形码可以各自包含条形码序列，条形码序列选自至少100个或1000个具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支撑物相关的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，一定百分比的与固体支撑物相关的条形码包含相同的细胞标记。例如，百分比可以是，或约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或这些值中任意两个之间的值或范围。作为另一个实例，百分比可以最少或至多是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支撑物相关的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支撑物相关的条形码可以具有不同的细胞标记，其选自包含具有独特序列的至少100个或1000个细胞标记。
本文公开的条形码可以关联(例如，附着到)固体支撑物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以用固体支撑物对样品中的多个靶标进行条形码编码，该固体支撑物包括与多个条形码相关的多个合成颗粒。在一些实施方案中，固体支撑物可以包括与多个条形码相关的多个合成颗粒。不同固体支撑物上的多个条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。例如，固体支撑物可以包括二维或三维的多个条形码。合成颗粒可以是珠。珠可以是，硅胶珠、受控孔玻璃珠、磁珠、Dynabeads、葡聚糖凝胶/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠，或任其任意组合。固体支撑物可以包括聚合物、基体、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任意组合。在一些实施方案中，固体支撑物可以是自由浮动的。在一些实施方案中，固体支撑物可以嵌入半固体或固体阵列中。条形码可能不与固体支撑物相关。条形码可以是单个核苷酸。条形码可以与基底相关。
本文使用的术语“拴系”、“附着”和“固定”可互换使用，并且可以指将条形码连接到固体支撑物的共价或非共价方式。任意多种不同的固体支撑物都可以用作附着预合成条形码或用于条形码原位固相合成的固体支撑物。
在一些实施方案中，固体支撑物是珠。珠可以包含一种或多于一种类型的固体、多孔或空心球、球状物、轴承、圆柱体或可以固定核酸(例如共价或非共价)的其他类似构造。例如，珠可以由塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任意组合组成。珠可以是，或包含离散颗粒，其是球形(例如，微球)或具有非球形或不规则形状，例如立方体、长方体、金字塔形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形。
珠可以包含多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁性材料(例如，铁、镍、钴、它们的一些合金和一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任意组合。
在一些实施方案中，珠(例如，附着标记的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包含水凝胶。
本文公开的一些实施方案包括一种或多于一种颗粒(例如，珠)。每种颗粒可以包含多个寡聚核苷酸(例如，条形码)。多个寡聚核苷酸中的每一个可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记、和靶标结合区(例如，寡聚(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体、或其组合)。多个寡聚核苷酸中的每一个的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡聚核苷酸的细胞标记序列可以不同，从而可以识别不同颗粒上的寡聚核苷酸。不同细胞标记序列的数量在不同的执行方案中可以不同。在一些实施方案中，细胞标记序列的数量可以是，或约是10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、109个、这些值中任意两个之间的值或范围，或多于109个。在一些实施方案中，细胞标记序列的数量可以至少或至多是10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、或109个。在一些实施方案中，不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或多于1000个的多个颗粒包括有相同细胞序列的寡聚核苷酸。在一些实施方案中，包括具有相同细胞序列的寡聚核苷酸的多个颗粒至多为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、或多于10％。在一些实施方案中，多个颗粒中没有相同的细胞标记序列。
每个颗粒上的多个寡聚核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数量可以是，或约是10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、109个，或这些值中任意两个之间的值或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数量可至少或至多是10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个或109个。例如，多个寡聚核苷酸中的至少100个包含不同的条形码序列。作为另一个实例，在单个颗粒中，至少100个、500个、1000个、5000个、10000个、15000个、20000个、50000个、这些值中任意两个之间的值或范围，或多于50000个的多个寡聚核苷酸包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多个包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶标的存在(或拷贝或数量)次数与不同条形码序列之比可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或小于1:90。在一些实施方案中，多个寡聚核苷酸中的每一个还包含样品标记、通用标记或两者都包含。例如，颗粒可以是纳米颗粒或微粒。
珠的大小可以是变化的。例如，珠的直径可以为0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是，或约是，0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米，或这些值中任意两个之间的值或范围。
珠的直径可以与基底孔的直径有关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径更长或更短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或这些值中任意两个之间的值或范围、或比孔的直径更长或更短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或这些值中任意两个之间的值或范围。珠的直径可以与细胞的直径有关(例如，包埋在基底孔中的单细胞)。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径更长或更短至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％、或比孔的直径更长或更短至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。珠的直径可以与细胞的直径有关(例如，包埋在基底孔中的单细胞)。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径更长或更短10％，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中任意两个之间的值或范围、或比细胞的直径更长或更短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中任意两个之间的值或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径更长或更短至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％，或比孔的直径更长或更短至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
珠可以附着到和/或嵌入基底中。珠可以附着到和/或嵌入凝胶、水凝胶、聚合物和/或基体中。珠在基底(例如凝胶、基体、支架或聚合物)中的空间位置可以使用存在于珠上的条形码上的空间标记来识别，该条形码可以用作位置地址。
珠的实例可以包括但不限于链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁珠、
Figure BDA0003777502980000271
微珠、
Figure BDA0003777502980000272
微珠、抗体缀合珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡聚(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMagTM羧基末端磁珠。
珠可以与量子点或荧光染料相关(例如，以之浸渍)，以使其在一个荧光光通道或多个光通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬相关，使其成为顺磁性或铁磁性的。珠可以是可识别的。例如，可以使用相机对珠进行成像。珠可以具有与珠相关的可检测代码。例如，珠可以包含条形码。例如，由于在有机或无机溶液中的溶胀，珠可以改变大小。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。
固体支撑物(例如，珠)可以是可视化的。固体支撑物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支撑物(例如，珠)可以用标识符刻蚀。标识符可以通过对珠成像以可视化。
详细描述
本发明的实施方案提供了捕获磁珠介导的对颗粒，例如细胞或细胞外囊泡的核酸靶标进行分子条形码编码的方法。此方法包括以下方面：a)将包含颗粒的样品与包含用于颗粒捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸、以及从中释放的任选的细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸结合到靶标结合区以产生捕获的核酸。还提供了组合物，例如捕获磁珠，包含带条形码的磁珠，以及用于实施本方法的实施方案的装置/***和试剂盒。
在更详细地描述本发明之前，需要理解的是，本发明不限于所描述的特别的实施方案，因此本方案当然可以是变化的。还应该理解的是，本文使用的术语仅用于描述特别的实施方案，不意在限制，因为本发明的范围将仅限于所附权利要求。
在提供数值范围的情况下，应该理解的是，除上下文另有明确规定外，该范围的上限和下限与该范围内的任意其他规定值或中间值之间的每一个介于下限单位的十分之一的值都包含在本发明范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本发明内，置于规定范围内任意特异性排除的限制下。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，不包括其中一种或两种的限制范围也包括在本发明中。
某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。本文使用的术语“约”为其前面的精确数字以及接近及近似于该术语前面的数字提供字面意义的支持。在确定一个数字是否接近或近似于特异性列举的数字时，接近的或近似的未列举的数字可以与在其出现的上下文中提供的特异性列举的数字基本上相等。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述方法和材料相似或相等的任意方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本文，如同每个单个出版物或专利被特异地和单个地指示通过引用并入，并且在此通过引用并入本文，以公开和描述与出版物相关的方法和/或材料。引用任意出版物都是为了其在申请日期之前的公开内容，不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于该出版物。此外，提供的出版日期可能与需要独立确认的实际出版日期不同。
需要注意的是，除非上下文另有要求，如本文和附加权利要求书使用的单数形式包括复数指称。还应注意的是，权利要求书的起草可能排除任意任选因素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求书要素或使用“否定”限制时使用“单独的”、“仅有的”等这种排他性术语的先行根据。
对于阅读本公开的本领域技术人员来说，显而易见的是，本文描述和说明的每个单个的实施方案具有离散的组分和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，这些实施方案可以容易地与其他几个实施方案中的任意特征分离或组合。任意列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任意其他逻辑上可能的顺序实施。
为了功能性解释的语法流畅性，需要明确理解的是，除非根据35U.S.C.§112明确表达，否则不应将权利要求书解释为在任意方面一定受到“装置”或“步骤”的限制，但应给予权利要求在相等的司法原则下所提供的定义的全部意义和相等的范围，在此情况下，根据35USC§112明确表达的权利要求将获得根据35USC§112规定的完全相等的法定效力。
在本发明各种方面的进一步描述中，首先更详细地回顾了本文的各种方案和试剂/***，之后，深入回顾本发明的各种方法，以及试剂盒实施方案的描述，以用于实践本方法的各种实施方案。
方法
如上所述，提供了磁珠介导的对来自颗粒，例如细胞或亚细胞组分分子，例如，囊泡，中的靶标核酸进行分子条形码编码的方法。此方法的方面包括将至少怀疑包括感兴趣颗粒的样品与一个或多于一个捕获磁珠(包括捕获磁珠文库)组合，其中捕获磁珠包括用于颗粒的捕获部分以产生捕获样品。与一种或多于一种捕获磁珠接触的样品可以是任意样品，例如，包括一种或多于一种细胞以及其他组分，例如细胞外组分，例如囊泡的样品。在一些实施方案中，样品可以是颗粒，例如单细胞或细胞外囊泡(例如，微囊泡、外泌体或凋亡小体)、多个颗粒，例如细胞和/或囊泡、组织样品、肿瘤样品、血液样品等。在一些实施方案中，样品可以包含细胞类型的混合物，例如正常细胞、肿瘤细胞、血细胞、B细胞、T细胞、母体细胞、胎儿细胞等，或来自不同实验对象的细胞的混合物，以及其亚细胞组分，例如囊泡。在一些情况下，样品是含水样品，其包括一种或多于一种类型的颗粒，例如细胞和/或囊泡，例如存在细胞和亚细胞大小的其他组分，例如存在囊泡。虽然在本发明的工作流实施方案中使用的给定含水样品中的颗粒数量可以是变化的，但在某些情况下，给定样品体积中的颗粒数量范围从0.0001个颗粒/毫升至100亿个颗粒/毫升。当靶标颗粒很少时，例如循环肿瘤细胞(CTC)、母体血液中的胎儿细胞、传染性细菌或真菌细胞，给定样品中的颗粒数量可以在范围内，例如0.0001个颗粒/毫升至100个颗粒/毫升，例如0.01个颗粒/毫升至10个颗粒/毫升。当靶标颗粒充足时，例如，EV、RBC，给定体积中的颗粒数量可以为1000万个颗粒/毫升至100亿个颗粒/毫升，例如1亿个颗粒/毫升至100亿个颗粒/毫升。取决于样品的稀释或浓缩，上述提供的浓度可以更低或更高。给定浓度代表样品中天然存在的浓度。
在一些实施方案中，这些方法包括对来自细胞的核酸进行条形码编码。在一些情况下，方法包括对来自亚细胞大小的颗粒，例如细胞外囊泡，的核酸进行条形码编码，其中这种亚细胞大小的颗粒可以具有1000nm或小于1000nm的直径。在一些实施方案中，方法包括对细胞外囊泡的核酸进行条形码编码，其中在一些情况下，细胞外囊泡的直径为5μm或小于5μm，例如1μm或小于1μm，其中在一些情况下，所述细胞外囊泡的直径为30nm至2500nm，例如30nm至1000nm。在一些情况下，颗粒是微囊泡(例如，直径为100至100nm)。在一些情况下，颗粒是外泌体(例如，直径为30nm至150nm)。
例如，如上所述，样品与一种或多于一种捕获磁珠接触，捕获磁珠包含用于颗粒的捕获部分，颗粒例如样品的细胞或亚细胞(例如囊泡)组分。捕获磁珠是指在空间中受施加磁场影响(即，移动)的珠。因此，它们可以在空间中移动，例如，通过向捕获磁珠的环境施加例如来自另一磁体的磁场以从一个位置移动到另一个位置。磁性捕获珠包含磁性固体支撑物，所述支撑物具有与其稳定相关的例如在其表面上的用于颗粒的捕获部分，所述颗粒为例如细胞或亚细胞样品组分，例如囊泡。珠可以包含一种或多于一种类型的固体、多孔或空心球、球状物、轴承、圆柱体或可以固定捕获部分(例如共价或非共价)的其他类似构造。例如，珠可以包含塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任意组合。珠可以是，或包含离散颗粒，其是球形(例如，微球)或具有非球形或不规则形状，例如立方体、长方体、金字塔形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形。由于珠具有磁性，它们可以包含多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴、它们的一些合金和一些稀土金属化合物)等。珠还可以包括许多添加材料，例如陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任意组合。
与捕获磁珠的固体支撑物稳定相关的是用于颗粒的捕获部分，例如细胞或囊泡。捕获部分是与颗粒的组分(即，决定簇)，例如，表面蛋白或其他结构结合的部分。最广义的结合可以是任意类型的结合，包括特异性或非特异性结合。在一些情况下，捕获部分特异性结合颗粒的决定簇，例如表面蛋白。在捕获部分与颗粒的决定簇特异性结合的情况下，捕获部分和决定簇彼此具有亲和力。一对特异性结合成员和其特异性结合的决定因素之间的亲和力可以变化的，在一些情况下，它们可以以结合复合物的形式彼此特异性结合，其可以用KD(解离常数)为10-5M或小于10-5M、10-6M或小于10-6M、10-7M或小于10-7M、10-8M或小于10-8M、10-9M或小于10-9M、10-10M或小于10-10M、10-11M或小于10-11M、10-12M或小于10-12M、10-13M或小于10-13M、10-14M或小于10-14M、或10-15M或小于10-15M表征(需要注意的是，在某些实施方案中，这些值可以应用于本描述中其他地方提到的其他特异性结合对的相互作用)。任意合适的决定簇结合试剂可以用于捕获部分，例如蛋白质结合试剂、抗体或其片段、适配体、小分子、配体、肽、寡聚核苷酸等，或其任意组合。例如，捕获部分可以包含抗体，例如，对靶标，例如细胞或囊泡上的特异性部分(例如，受体)具有特异性的抗体。抗体可以是全长的(即天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白的分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。抗体片段可以是抗体的一部分，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与被全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体可变区段组成的分离片段，例如由轻链可变区和重链可变区组成的“Fv”片段和重组单链多肽分子，其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接。示例性的抗体可以包括但不限于，抗癌细胞抗体、抗病毒抗体、结合细胞表面受体(CD8、CD34和CD45)的抗体以及治疗性抗体。
如上所述，捕获部分与捕获磁珠的固体支撑物表面稳定相关。稳定相关指捕获部分相对于其所附着的固体支撑物的表面位置是固定的。本文使用的术语“固定”、“拴系”和“附着”可互换使用，并且可以指将捕获部分连接到固体支撑物的共价或非共价方式。
图1A示出了包括捕获部分的磁性捕获实例。图1A示出了捕获磁珠100包括磁珠110(例如，如上所述)，其表面与捕获部分120稳定地结合。如上所述，捕获部分可以是变化的，其中捕获部分的实例包括但不包括限于：对靶标颗粒(例如，细胞或细胞外囊泡)特异性的抗体、生物素、抗生物素蛋白或另一种分子(例如，与抗体结合的缀合有抗生物素蛋白、生物素或与和珠稳定结合的捕获部分互补的其他分子)。
任选地，捕获磁珠还可以包括与之结合的条形码核酸，例如，如上所述。当存在时，条形码核酸包括靶标结合区。如上所述，靶标结合区可以包含与靶标(例如，靶标核酸、靶标分子、待分析的细胞核酸)特异性杂交的核酸序列，例如与特异性基因序列杂交的核酸序列。在一些实施方案中，靶标结合区可以包含可以附着(例如，杂交)到特异的靶标核酸的特异的位置的核酸序列。在其他情况下，靶标结合区可以是非特异性的，例如寡聚dT域。而在其他情况下，靶标结合区可以是随机的，例如随机六聚体，例如，其中靶标结合区是随机序列域。
图1B示出了包括条形码核酸的捕获磁珠的实例。如图1B所示，捕获磁珠150包括磁珠110(例如，如上所述)，其表面与捕获部分120稳定地结合，捕获部分120通过接头152拴系到结合的表面。磁珠110的表面也拴系有珠结合的条形码核酸160。结合条形码核酸的珠具有以下结构：珠(110)-5'-通用引物结合域(162)-细胞标记域(164)-独特分子索引域(166)-靶标结合区(168)-3'，其中这些域如上所述。
如上所述，样品与捕获磁珠接触，包括多个捕获磁珠，例如捕获磁珠文库，以产生捕获样品。在任意给定的方案中，与给定样品接触的不同珠的数量可以是变化的，其中在一些情况下，数量是1个或多于1个，例如10个或多于10个、50个或多于50个、100个或多于100个、1000个或多于1000个、5000个或多于5000个、10000个或多于10000个、包括20000个或多于20000个。与给定样品接触的磁珠可以是相同的，也可以是不同的，例如，就捕获部分或其他组分而言，例如条形码，使得与样品接触的捕获磁珠群例如文库，包括与其他珠在例如条形码、捕获部分等某些特征上不同的多个珠。
样品和珠在足以使珠的捕获部分与其颗粒结合的条件下相互接触，以产生捕获样品，该捕获样品包括与捕获磁珠结合的例如细胞、囊泡等颗粒的结合复合物。只要产生所需的结合复合物，条件可以有所变化。所得的捕获样品包括捕获的颗粒，该颗粒是由结合到捕获磁珠上的例如细胞、囊泡等颗粒组成的结合复合物。捕获样品的制备实例如图2所示。如图2所示，样品200与磁性捕获珠210组合以产生捕获样品220，其由结合到捕获磁珠上的例如细胞、囊泡等颗粒的结合复合物组成。在捕获样品的制备之后，可任选地将捕获颗粒从捕获样品的其他成分例如未结合颗粒、未结合珠等中分离。
在产生捕获样品之后，此方法包括以下方面，使用施加磁场介导的划分方案划分捕获样品的捕获颗粒以产生划分的捕获颗粒。划分是指将捕获颗粒放置在小的反应室中，该反应室可以是由固体材料定义的微孔等流体分离结构，被构造为容纳捕获颗粒。在已经公开的方法、装置和***的一些实施方案中，使用随机分布在基底上的多个微孔。在一些实施方案中，多个微孔以有序的模式例如有序阵列分布在基底上。在一些实施方案中，多个微孔以随机的模式例如随机阵列分布在基底上。微孔可以制作成多种形状和大小。合适的孔的几何形状包括但不限于圆柱形、椭圆形、立方体、圆锥形、半球形、矩形或多面体，例如包含几个平面的三维几何形状，例如长方体、六角柱、八角柱、倒三棱锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱锥或倒截棱锥。在一些实施方案中，非圆柱形微孔，例如具有椭圆形或方形覆盖的孔，可以在能够容纳更大的细胞方面提供优势。在一些实施方案中，孔壁的上边缘和/或下边缘可以是圆形的，以避免尖锐的拐角，从而减少由于静电场浓度而可能在尖锐边缘或点处出现的静电力。因此，使用圆拐角可以提高从微孔中回收珠的能力。可以用绝对尺寸表征微孔尺寸。在一些情况下，微孔的平均直径可以为约5μm至约100μm。在其他实施方案中，微孔直径的平均值是至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm或至少100μm。在其他实施方案中，微孔直径的平均值是至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多45μm、至多40μm、至多35μm、至多30μm、至多25μm、至多20μm、至多15μm、至多10μm或至多5μm。在本发明的方法中使用的微孔的体积可以是变化的，在一些情况下为约200μm3至约800000μm3。在一些实施方案中，微孔体积是至少200μm3、至少500μm3、至少1000μm3、至少10000μm3、至少25000μm3、至少50000μm3、至少100000μm3、至少200000μm3、至少300000μm3、至少400000μm3、至少500000μm3、至少600000μm3、至少700000μm3或至少800000μm3。在其他实施方案中，微孔体积是至多800000μm3、至多700000μm3、至多600000μm3、至多500000μm3、至多400000μm3、至多300000μm3、至多200000μm3、至多100000μm3、至多50000μm3、至多25000μm3、至多10000μm3、至多1000μm3、至多500μm3、或至多200μm3。本发明实施方案中使用的给定装置中的微孔的数量可以是变化的，其中在一些情况下，数量是100个或多于100个，例如250个或多于250个、例如，500个或多于500个、包括1000个或多于1000个、例如5000个或多于5000个、例如，10000个或多于10000个，其中在一些情况下，数量是15000个或小于15000个，例如12500个或小于12500个。合适的用于本发明实施方案的微孔在序号为PCT/US2016/014612，公开号为WO/2016/118915的PCT申请中进一步描述，其公开内容通过引用并入本文。
在对捕获样品进行划分时，可以使用任意方便的方案将捕获的颗粒定位在微孔中。本公开内容提供了用于使捕获样品与划分域接触以便对样品进行划分的方法。例如，可以将包含的捕获样品引入例如微孔的结构中，以划分样品。捕获的样品可以通过例如重力流接触，其中捕获颗粒可以沉降到划分结构中。在一些情况下，捕获样品例如通过使其流过微孔与微孔接触，使得捕获颗粒沉积到微孔中。捕获样品可以流过与微孔流体连通的流动池。在适合于本发明实施方案中使用的微孔中描述了用于将捕获颗粒划分至微孔中的合适的方案和***，其在序号为PCT/US2016/014612，公开号为WO/2016/118915的PCT申请中进行了进一步描述，其公开内容通过引用并入本文。
在对捕获样品进行划分时，使用施加磁场使捕获样品与微孔接触，例如，当对捕获样品施加磁场时，捕获样品流过微孔。施加的磁场是一种将捕获颗粒从捕获样品移向微孔的磁场，并且取决于它的定向和磁性捕获颗粒的性质，对磁性捕获颗粒以是吸引的或排斥的。例如，在微孔底部下方施加磁场的情况下，磁场可以吸引磁性捕获颗粒。或者，在微孔上方施加磁场的情况下，磁场可以排斥磁性捕获颗粒。可以使用任意方便的源以施加磁场，例如永磁体、电磁体等。虽然施加磁场的强度可以根据需要而变化，但在一些情况下，强度从10高斯至15000高斯，例如100高斯至1000高斯。在序号为PCT/US2016/014612，公开号为WO/2016/118915的PCT申请中描述了***和使用该***的方法，该***包括一个或多于一个磁体及其控制器，可使用于本发明的实施方案中，其公开内容通过引用并入本文。
图3A提供了由捕获磁珠制备的划分捕获颗粒的示意图代表，所述捕获磁珠包括珠结合的条形码核酸，例如，如图1B所示，在使用流动池的微孔中。如图3A所示，在施加电场(如磁体330所示)的影响下，与包括珠结合的条形码核酸的捕获磁珠结合的包括例如细胞或细胞外囊泡颗粒的捕获颗粒310流过微孔阵列320，这导致捕获颗粒被划分到孔中，如图3B所示。
图4提供了从捕获磁珠制备的捕获颗粒的划分示意图代表，该捕获磁珠不包括珠结合的条形码核酸，例如，如图1A所示，在使用流动池的微孔中进行划分。如图4A所示，在施加电场(如磁体430所示)的影响下，与不包括珠结合的条形码核酸的捕获磁珠结合的包括例如细胞或细胞外囊泡颗粒的捕获颗粒410流过微孔阵列420，这导致捕获的颗粒被划分到孔中，如图4B所示。接下来，包含条形码核酸的珠被划分到微孔中，如图4C所示。这样，某些孔既包括捕获颗粒，也包括带条形码的珠。
例如，如上所述的捕获样品的划分导致划分的捕获颗粒在空间上接近于包括靶标结合区的例如，如上所述珠结合的条形码核酸。在一些情况下，珠结合的条形码核酸与捕获磁珠稳定地结合。在这种情况下，划分，例如微孔可以仅包括捕获颗粒，因为捕获颗粒的珠组分包括条形码核酸。在其他情况下，珠结合的条形码核酸是与捕获磁珠不同的分离珠的部分，例如，如上所述的带条形码的珠。在这种情况下，划分，例如微孔可以包括捕获颗粒和包括条形码核酸的分离的带条形码的珠。当条形码靠近捕获颗粒的靶标时，靶标可以与条形码杂交。可以以非消耗性比率接触条形码，使每个不同的靶标可以与本公开内容的不同的条形码结合。为了确保靶标和条形码之间的有效结合，可以将靶标与条形码交联。
如上所述，在划分颗粒例如细胞和/或囊泡之后，可以裂解颗粒以释放靶标分子，从而释放的靶标分子例如核酸可以结合到条形码核酸的靶标结合区以产生捕获的核酸。颗粒裂解可以通过多种方式完成，例如，化学或生化方式、渗透压冲击、或通过热裂解方式、机械裂解方式或光学裂解方式。可以通过添加细胞裂解缓冲液裂解颗粒，缓冲液包括表面活性剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、吐温-20或NP-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)或消化酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任意组合。为了增加靶标和条形码的结合，可以通过例如降低温度和/或增加裂解液的黏度以改变靶标分子的扩散速率。
在一些实施方案中，可以使用滤纸裂解样品。可以在滤纸的顶部用裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸施加到具有压力的样品上，这可以促进样品的裂解和样品的靶标与基底的杂交。
在一些实施方案中，可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行裂解。化学裂解可以包括使用消化酶，例如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。可以通过向基底上添加裂解缓冲液来进行裂解。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以至少包含约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或大于1M的Tris HCl。裂解缓冲液可以至多包含约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M、或1M或大于1M的Tris HCL。裂解缓冲液可以包含约0.1M的Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以至少为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10。裂解缓冲液的pH可以至多约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH约为7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中盐的浓度可以至少约为0.1M、0.5M、或1M或大于1M。裂解缓冲液中盐的浓度可以至多约为0.1M、0.5M、或1M或大于1M。在一些实施方案中，裂解缓冲液中盐的浓度约为0.5M。裂解缓冲液可以包含表面活性剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、吐温、NP-40)。裂解缓冲液中表面活性剂的浓度可以至少约为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、或7％或大于7％。裂解缓冲液中表面活性剂的浓度可以至多约为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、或7％或大于7％。在一些实施方案中，裂解缓冲液中表面活性剂的浓度约为1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中的使用时间可以取决于表面活性剂的用量。在一些实施方案中，使用的表面活性剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以至少约为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、或30mM或大于30mM。裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以至多约为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、或30mM或大于30mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液中螯合剂的浓度约为10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。裂解缓冲液中还原剂的浓度可以至少约为1mM、5mM、10mM、15mM、或20mM或大于20mM。裂解缓冲液中还原剂的浓度可以至多约为1mM、5mM、10mM、15mM、或20mM或大于20mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液中还原剂的浓度约为5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl、约pH7.5、约0.5MLiCl、约1％的十二烷基硫酸锂、约10mMEDTA和约5mM DTT。
裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度下进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、或20分钟或大于20分钟。裂解的细胞可以包含至少约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个、或700000个或多于700000个靶标核酸分子。裂解的细胞可以包含至多约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个、或700000个或多于700000个靶标核酸分子。
在颗粒裂解并从其中释放核酸分子之后，核酸分子可以随机地与共定位固体支撑物的条形码结合。结合可以包括条形码的靶标识别域与靶标核酸分子的互补部分的杂交(例如，条形码的寡聚(dT)可以与靶标的多聚(A)尾相互作用)。可以选择杂交所用的分析条件(例如，缓冲液pH值、离子强度、温度等)，以促进特异的、稳定的杂交体的形成。在一些实施方案中，从裂解的细胞中释放的核酸分子可以与基底上的多个探针结合(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡聚(dT)时，mRNA分子可以与探针杂交并被逆转录。寡聚核苷酸的寡聚(dT)部分可以作为cDNA分子第一链合成的引物，例如，当置于DNA合成反应条件下时，产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域。
附着还可以包括条形码的靶标识别区和靶标核酸分子的部分的连接。例如，靶标结合区可以包含能够与限制性位点单链突出端(例如，EcoRI黏性末端单链突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性内切酶(例如，EcoRI)处理靶标核酸以产生限制性位点单链突出端。然后条形码可以连接到包含与限制性位点单链突出端互补的序列的任意核酸分子上。可以使用连接酶(如T4 DNA连接酶)将两个片段连接起来。
在一些情况下，方法还包括使用寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂，例如，需要定量分析一种或多于一种细胞组分，例如，表面蛋白时。所述实施方案中使用的寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂包括与细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸偶联的细胞组分结合试剂，例如，抗体或其结合片段，所述特异性寡聚核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的标识符序列，其与细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸结合。在这种情况下，捕获磁珠可以包括配置为捕获的核酸，例如，特异性结合细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸域。通过这种方式，可以结合基因表达分析蛋白表达，例如，在需要进行多组学分析时，例如转录组和蛋白质组的结合分析。在这种情况下，方法可以包括使用寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂制备捕获样品，然后提供从捕获的、划分的细胞中释放的细胞成分结合试剂特异性寡聚核苷酸的捕获。关于使用寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂的更多细节可以在美国公开专利申请第US20180267036号和第US20200248263号中找到；其公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，该方法还包含将捕获的核酸与划分的捕获颗粒的其他成分分离。通过使用磁珠和外部施加磁场，可以执行基于固体支撑物的附着靶标条形码分子集合的回收。
如果需要，给定的工作流可以包括汇集步骤，其中将例如由捕获的核酸、合成的第一链cDNA或合成的双链cDNA组成的产品组合物与从一个或多于一个附加样品例如，颗粒，例如细胞和/或囊泡获得的产品组合物结合或汇集。在一些情况下，汇集步骤在条形码核酸和靶标核酸之间杂交的步骤之后进行，例如，如上所述。由不同样品例如，细胞中产生的不同产物组合物的数量，在这些实施方案中被结合或汇集的数量可能有所不同，其中，在一些情况下，其数量范围为2个至1000000个，例如3个至200000个，包括4个至100000个，例如5个至50000个，其中在一些情况下，其数量范围为100个至10000个，例如如1000个至5000个。在混合之前或之后，可以通过聚合酶链反应(PCR)等方法扩增产品组合物，例如下文详细介绍。
靶标条形码分子汇集在一起后，所有其他的处理都可以在单个反应容器中进行。其他处理可以包括例如逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。其他的处理反应可以在微孔中进行，也就是说，不需要从多个细胞中首先混合标记的靶标核酸分子。
本公开内容提供了使用任意方便的方案产生靶标-条形码缀合物的方法，例如逆转录或核苷酸延伸(例如，样品索引寡聚核苷酸或细胞组分＝结合试剂特异性寡聚核苷酸)。靶标-条形码缀合物可以包含条形码和全部或部分靶标核酸的互补序列(即，条形码编码的cDNA分子，例如随机条形码编码的cDNA分子)。可以通过添加逆转录酶和逆转录引物以使存在相关RNA分子的逆转录。逆转录引物可以是寡聚(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶标特异性寡聚核苷酸引物。寡聚(dT)引物的长度可以是12个至18个核苷酸，或可以约是12个至18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA 3'末端的内源性多聚(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在多种互补位点与mRNA结合。靶标特异性寡聚核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，可以通过添加逆转录引物，存在通过mRNA分子逆转录产生标记的RNA分子。在一些实施方案中，逆转录引物是寡聚(dT)引物、随机六核苷酸引物、或靶标特异性寡聚核苷酸引物。通常，寡聚(dT)引物长度为12个至18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA 3'末端的内源性多聚(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在多种互补位点与mRNA结合。靶标特异性寡聚核苷酸引物通常选择性地准备感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，靶标是cDNA分子。例如，可以使用逆转录酶逆转录mRNA分子，例如使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶，以产生具有多聚(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括有多聚(dG)尾的靶标结合区。当条形码的多聚(dG)尾和cDNA分子的多聚(dC)尾之间进行碱基配对时，逆转录酶会将模板链从细胞RNA分子切换到条形码，并继续复制到条形码的5'端。通过这样做，得到在cDNA分子的3'端包含条形码(例如分子标记)序列的cDNA分子。
逆转录可以反复发生，以产生多个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包含至少进行约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。方法可以包含至少进行约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。
可以进行一种或多于一种核酸扩增反应以产生标记的靶标核酸分子的多个拷贝。扩增可以以多路复用的方式进行，其中多个靶标核酸序列同时扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。如果存在，扩增反应可以包括扩增样品标记的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶标核酸或其组合的至少一部分。扩增反应包含扩增0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％、或这些值中任意两个之间的值或范围的多个核酸。方法还可以包括进行一种或多于一种cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶标-条形码分子的一个或多于一个cDNA拷贝。
在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文所述，PCR可以指通过同时引物延伸互补的DNA链以体外扩增特定DNA序列的反应。如本文所述，PCR可以包含的反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和装配PCR。
标记核酸的扩增可以包含基于非PCR的方法。基于非PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增、或环到环扩增(circle to circle amplification)。其他基于非PCR的扩增方法包括多个循环的DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链反应(LCR)、以及Qβ复制酶(Qβ)法、使用回文探针、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡聚核苷酸驱动扩增将引物与核酸序列杂交，在延伸反应和扩增之前将产生的双链裂解的扩增方法、使用缺乏5'外切核酸酶活性的核酸聚合酶进行链置换扩增、滚环扩增、以及网状分枝扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环状转录物。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记核酸(例如，标记-RNA、标记-DNA、标记-cDNA)进行聚合酶链式反应以产生标记扩增子(例如，随机标记扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可以包括双链RNA分子、双链DNA分子、或与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可包括DNA、RNA或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。因此，方法可以包括从包含捕获的核酸的第一链cDNA域产生扩增子组合物。
扩增可以包括使用一种或多于一种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉核酸和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加到扩增反应的一个或多于一个循环中。添加非天然核苷酸可用于识别产物为扩增反应中的特定循环或时间点。
进行一种或多于一种扩增反应可以包括使用一种或多于一种引物。一种或多于一种引物可以包含，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、或15个或多于15个核苷酸。一种或多于一种引物可以包含至少1个、2个、3个、4个、5个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、或15个或多于15个核苷酸。一种或多于一种引物可以包含少于12个至15个核苷酸。一种或多于一种引物可以退火至多个已标记的靶标(例如，随机标记的靶标)的至少一部分。一种或多于一种引物可以退火至多个标记靶标的3'末端或5'末端。一种或多于一种引物可以退火至多个已标记的靶标的内部区域。内部区域可以距多个标记靶标的3’末端至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸的距离。一种或多于一种引物可以包括引物的固定组。一种或多于一种引物可以包括至少一种或多于一种定制引物。一种或多于一种引物可以包括至少一种或多于一种控制引物。一种或多于一种引物可以包括至少一种或多于一种基因特异性引物。
一种或多于一种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或多于一种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶标或其任意组合。一种或多于一种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计以扩增一个或多于一个靶标。靶标可以包含一个或多于一个样品中全部核酸的子集。靶标可以包含一个或多于一个样品中全部标记靶标的子集。一种或多于一种引物可包含至少96种或多于96种定制引物。一种或多于一种引物可包含至少960种或多于960种定制引物。一种或多于一种引物可包含至少9600种或多于9600种定制引物。一种或多于一种定制引物可以退火至两种或多于两种不同的标记核酸。两种或多于两种不同的标记核酸可以对应一种或多于一种基因。
本公开内容方法中可以使用任意扩增方案。例如，在一个方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增附着在珠上的分子。第二轮PCR可以使用巢式基因特异性引物扩增第一个PCR产物，该引物两侧分别***Illumina测序引物2序列，以及与通用Illumina测序引物1序列相对的引物。第三轮PCR添加了P5和P7以及样品索引，将PCR产物转化为Illumina测序文库。使用150bp x 2测序可以揭示读取1上的细胞标记和条形码序列(例如分子标记)、读取2上的基因以及索引1读取上的样品索引。
在一些实施方案中，可以使用化学裂解以从基底上移除核酸。例如，核酸中存在的化学基团或修饰的碱基可用于促进其从固体支撑物上的移除。例如，可以使用酶从基底上移除核酸。例如，可以通过限制性内切核酸酶消化，从基底上移除核酸。例如，可以使用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理包含dUTP或ddUTP的核酸，从基底上移除核酸。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶，例如碱基切除修复酶，例如脱嘌呤嘧啶核酸内切酶，从基底上移除核酸。在一些实施方案中，可以使用可光裂解和光从基底上移除核酸。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头从基底上移除核酸。例如，可裂解接头可以包含生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性亲和素、Ig-蛋白A、光不稳定接头、酸或碱不稳定接头基团或适配体中的至少一种。
当探针是基因特异性探针时，分子可以与探针杂交并被逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已被合成(例如，逆转录)后，它可以被扩增。扩增可以以多路复用的方式进行，其中多个靶标核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加到核酸中。
在一些实施方案中，扩增可以在基底上进行，例如，使用桥式扩增。可以对cDNA进行均聚物加尾，以便使用基底上的寡聚(dT)探针产生用于桥式扩增的相容末端。在桥式扩增中，与模板核酸的3'末端互补的引物可以是每对共价附着至固体颗粒的第一个引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单次热循环时，模板分子可以退火至第一引物，并且通过添加核苷酸将第一引物正向延伸，形成由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链组成的双链分子。在下一个循环的加热步骤中，双链分子可以变性，从颗粒中释放模板分子，并留下通过第一引物附着在颗粒上的互补DNA链。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，该第二引物与互补链在从第一引物移除的位置处的片段互补。这种杂交可以使互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，通过共价键与第一引物固定，并通过杂交与第二引物固定。在延伸阶段，第二引物可以通过在相同的反应混合物中添加核苷酸以反向延伸，从而将桥转换为双链桥。然后下一个循环开始，双链桥可以变性产生两个单链核酸分子，每个分子的一端分别通过第一和第二引物附着到颗粒表面，每个的另一端不附着到颗粒表面。在第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链都可以与同一颗粒上以前未使用的另一个互补引物杂交，以形成新的单链桥。两个以前未使用的引物经过杂交后拉长，将两个新桥转换为双链桥。
扩增反应可以包括扩增至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％的多个核酸。
标记核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或基于非PCR的方法。标记核酸的扩增可以包含标记核酸的指数扩增。标记核酸的扩增可以包含标记核酸的直链的扩增。可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。PCR可以指通过同时引物延伸互补的DNA链以体外扩增特定DNA序列的反应。PCR可以包含的反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR和装配PCR。
在一些实施方案中，标记核酸的扩增包括基于非PCR的方法。基于非PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增、或环到环扩增。其他基于非PCR的扩增方法包括多个循环的DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链反应(LCR)、以及Qβ复制酶(Qβ)法、使用回文探针、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡聚核苷酸驱动扩增、将引物与核酸序列杂交，在延伸反应和扩增之前将产生的双链裂解的扩增方法、使用缺乏5'外切核酸酶活性的核酸聚合酶进行链置换扩增、滚环扩增、以及网状分枝扩增(RAM)。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在扩增的扩增子(例如，靶标)上进行巢式聚合酶链反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可以包含双链RNA分子、双链DNA分子、或与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可包含样品标签或分子标识符标记。或者，扩增子可以是单链分子。单链分子可包含DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包含合成的或改变的核酸。
在一些实施方案中，该方法包含重复扩增标记的核酸以产生多个扩增子。本文公开的方法包括至少进行约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。或者，该方法包括至少进行约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。
扩增还可以包括将一种或多于一种控制核酸添加到包含多个核酸的一种或多于一种样品中。扩增还可以包括将一种或多于一种控制核酸添加到多个核酸中。控制核酸可以包含控制标记。
扩增可以包括使用一种或多于一种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包含光不稳定和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉核酸和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加到扩增反应的一个或多于一个循环中。添加非天然核苷酸可用于识别产物为扩增反应中的特定循环或时间点。
进行一种或多于一种扩增反应可以包括使用一种或多于一种引物。一种或多于一种引物可以包含至少一种或多于一种寡聚核苷酸。一种或多于一种寡聚核苷酸可以包含至少7个至9个核苷酸。一种或多于一种寡聚核苷酸可以包含少于12个至15个核苷酸。一种或多于一种引物可以退火至多个已标记的核苷酸的至少一部分。一种或多于一种引物可以退火至多个已标记核酸的3'末端或5'末端。一种或多于一种引物可以退火至多个已标记核酸的内部区域。内部区域可以距多个已标记核酸的3’末端至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸的距离。一种或多于一种引物可以包括引物的固定组。一种或多于一种引物可以包括至少一种或多于一种定制引物。一种或多于一种引物可以包括至少一种或多于一种控制引物。一种或多于一种引物可以包括至少一种或多于一种管家基因引物。一种或多于一种引物可以包含通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或多于一种定制引物可退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标签、核酸或其产物。一种或多于一种引物可以包含通用引物和定制引物。定制引物可以被设计以扩增一个或多于一个靶标核酸。靶标核酸可以包含一个或多于一个样品中全部核酸的子集。在一些实施方案中，引物是附着到本公开内容的阵列的探针。
在一些实施方案中，对样品中的多个靶标进行条形码编码(例如，随机条形码编码)还包括生成已进行条形码编码的靶标(例如，已进行随机条形码编码的靶标)或靶标的已进行条形码编码的片段的索引文库。不同条形码的条形码序列(例如，不同随机条形码的分子标记)可以彼此不同。生成已进行条形码编码的靶标的索引文库包括从样品中的多个靶标中生成多个索引多核苷酸。例如，对于包含第一索引靶标和第二索引靶标的条形码靶标的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区可以与第二索引多核苷酸的标记区相差，相差约，或相差至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、或这些值中任意两个之间的值或范围的核苷酸。在一些实施方案中，生成已进行条形码编码的靶标的索引文库包括使多个靶标，例如mRNA分子与多个寡聚核苷酸接触，所述寡聚核苷酸包括多聚(T)区和标记区；使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子，每个标记的cDNA分子包含cDNA区和标记区，其中多个靶标包括至少两个不同序列的mRNA分子并且多个寡聚核苷酸包括至少具有两种不同序列的寡聚核苷酸。生成条形码靶标的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子，对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，方法可以包括生成衔接子标记的扩增子。
条形码编码(例如，随机条形码编码)可以包括使用核酸条形码或标签标记单个核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，它涉及将DNA条形码或标签添加到cDNA分子，因为它们是由mRNA产生的。可以进行巢式PCR以减少PCR扩增偏倚。可以添加衔接子用于使用例如，下一代测序(NGS)进行测序。测序结果可用于确定一个或多于一个靶标拷贝的细胞标记、分子标记和核苷酸片段序列。
在一些实施方案中，所提供的方法还包括将制备的表达文库，例如，如上所述产生的扩增子组合物，置于NGS方案中。该方案可以在任意合适的NGS测序平台上实施。感兴趣的NGS测序平台包括但不限于
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提供的测序平台(例如，HiSeqTM、MiSeqTM和/或NextSeqTM测序***)；Ion TorrentTM(例如，Ion PGMTM和/或Ion ProtonTM测序***)；Pacific Biosciences(例如，PACBIO RS II Sequel测序***)；Life TechnologiesTM(例如，SOLiD测序***)；Oxford Nanopore(例如，Minion)；Roche(例如，454GS FLX+和/或GSJunior测序***)；或其他任意感兴趣的测序平台。NGS方案将根据所使用的别的NGS测序***而有所不同。用于测序的详细方案，例如还可以包括扩增(例如，固相扩增)、测序扩增子并且可从所使用的NGS测序***的制造商处获得分析测序数据。
装置和***
本文公开了可用于实践本发明实施方案的装置和***。在一些实施方案中，装置包括：a)基底，其包含：i)至少100个微孔，和ii)多个捕获颗粒和/或带条形码的珠，其中多个至少100个微孔各自包含任选地具有单个带条形码的珠(例如，当捕获磁珠不包括条形码核酸时)的单个捕获颗粒，和b)与基底流体连通的流动池。在一些实施方案中，还存在至少一个进口端口和至少一个出口端口，其中至少一个进口端口和至少一个出口端口通过流体通道与所述流动池流体连通，其中，至少一个进口端口和至少一个出口端口能够指导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。在一些实施方案中，装置还包含阀，该阀防止流体在装置内流动，除非移液管尖端***锥形特征的移液管尖端接口中。
本文还公开了***，其包含：a)装置，其包含：i)包含至少100个微孔的基底；ii)与基底流体连通的流动池；以及iii)至少一个进口端口和至少一个出口端口，其中至少一个进口端口和至少一个出口端口能够指导流体流通过流动池，从而使微孔与流体接触；和b)流量控制器；其中，所述流量控制器配置为控制流体的递送。
在一些实施方案中，***还包含流体，其中流体包含颗粒(例如，细胞和/或囊泡)样品、珠悬浮液、分析试剂或其任意组合。在一些实施方案中，该装置是***的可移除的、可消耗的组件。在一些实施方案中，细胞样品和珠悬浮液由用户直接分配或注射到装置中。在一些实施方案中，除了细胞样品之外的珠和分析试剂被事先安装在装置中。在一些实施方案中，流量控制器被配置成将流体注入与空气注入分散到流通池中。在一些实施方案中，***还包含用于增强细胞和珠在至少100个微孔中的均匀分布的分布机制，其中分布机制的进行选自摆动、摇动、漩涡、循环流、低频搅拌和高频搅拌或其任意组合。在一些实施方案中，***还包含细胞裂解机制，例如，使用高频压电换能器对细胞进行超声处理。在一些实施方案中，***还包含温度控制器，用于维持用户特异的温度，或用于在两个或多于两个特异的时间间隔内两个或多于两个特异的温度之间的升温。在一些实施方案中，该***还包含用于产生磁场梯度的用于从至少100个微孔中洗脱珠或用于运输珠通过装置磁场控制器。在一些实施方案中，所述***还包含成像***，其被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像，其中所述成像***还包含照明子***、成像子***和处理器。在一些实施方案中，成像***被配置为进行明场、暗场、荧光或定量相位成像。在一些实施方案中，成像***被配置为提供实时图像分析能力，并且其中所述实时图像分析用于控制分布机制，以增强细胞或珠在至少100个微孔中的均匀分布，从而实现预先确定的细胞或珠分布。在一些实施方案中，预先确定的细胞和珠的分布是指至少10％的微孔同时包含单细胞和单珠。在一些实施方案中，预先确定的细胞和珠的分布是指至少25％的微孔同时包含单细胞和单珠。在一些实施方案中，***还包含选择机制，其中从处理过的图像中获得的信息用于识别表示出一个或多于一个特异性特征的细胞子集，并且选择机制被配置为从后续数据分析中包括或排除该细胞子集。在一些实施方案中，选择机制包含从至少100个微孔中物理除去与所识别的细胞子集的细胞共定位的珠。在一些实施方案中，选择机制包含从至少100个微孔中物理包载与所识别的细胞子集的细胞共定位的珠。在一些实施方案中，选择机制包含使用双编码珠，其中每个单个的珠都由所附着的寡聚核苷酸细胞标记进行光学编码和编码，对附着在珠上的细胞标记进行测序，该珠与已识别的细胞子集的细胞共定位，产生包括或排除其他分析的序列数据列表。在一些实施方案中，流量控制器被配置为在第一时间将第一测试化合物递送至至少100个微孔中，并在第二时间将细胞裂解试剂递送至至少100个微孔中。在一些实施方案中，第一时间和第二时间是相同的。在一些实施方案中，一种或多于一种特异的特征选自细胞大小、细胞形状、活细胞、死细胞、特异范围的细胞内pH、特异范围的膜电位、特异的细胞内钙水平、一种或多于一种存在的特异性细胞表面标志物、以及一个或多于一个特异性遗传标记的表达。
还可以存在保存在计算机可读介质中的软件，该软件被编程以进行以下序列数据分析步骤中的一个或多于一个：a)样品条形码、细胞条形码、分子条形码和靶标序列数据的解码或分用；b)自动聚类细胞标记，以补偿扩增或测序错误，其中序列数据被收集为随机标记的靶标寡聚核苷酸分子文库；c)序列数据与已知参考序列的比对；d)确定每个细胞中每个基因的读取数量，以及每个细胞中每个基因的独特转录分子的数量；e)统计分析以预测置信区间，以确定每个细胞中每个基因的转录分子数量；和f)根据基因表达数据对细胞进行聚类或识别稀有细胞亚群的统计分析。
还可以存在保存在计算机可读介质中的软件，该软件被编程以进行下列图像处理和仪器控制步骤：a)在多个微孔的一个或多于一个图像中检测微孔；b)在多个微孔的一个或多于一个图像中检测包含单个细胞的微孔；c)在多个微孔的一个或多于一个图像中检测包含两个或多于两个细胞的微孔，并确定所检测的每个微孔中的细胞数量；d)在多个微孔的一个或多于一个图像中检测包含单珠的微孔；e)在多个微孔的一个或多于一个图像中检测包含两个或多于两个珠的微孔，并确定每个检测微孔中珠的数量；f)在进行步骤(b)后确定包含单细胞的微孔的数量；g)在进行步骤(d)后确定包含单个珠的微孔的数量；以及h)在进行步骤(b)和(d)后确定包含单细胞和单个珠的微孔的数量，其中在步骤(f)至(h)中确定的数量用于控制配置为通过多个微孔分布细胞和珠的装置。
还可以存在保存在计算机可读介质中的软件，该软件被编程以进行下列图像处理和仪器控制步骤：a)检测在多个微孔的一个或多于一个图像中表现出一种或多于一种特异性特征的细胞子集，其中一部分微孔包含细胞；b)确定包含细胞子集的微孔的位置；以及c)使用在步骤(b)中确定的位置控制选择装置，该选择装置被配置为将细胞子集从后续序列数据分析中排除。
在一些实施方案中，步骤c)的选择装置被配置为在随后的序列数据分析中仅包括细胞子集。在一些实施方案中，多个微孔的一个或多于一个图像选自明场图像、暗场图像、荧光图像、发光图像和磷光图像。在一些实施方案中，该软件还包含使用一种或多于一种算法，该算法选自Canny边缘检测方法、Canny-Deriche边缘检测方法、Sobel算子方法、一阶梯度检测方法、二阶微分边缘检测方法、相位相干边缘检测方法、强度阈值方法、强度聚类方法、基于强度直方图的方法、广义霍夫变换、圆形霍夫变换、傅里叶变换、快速傅里叶变换、小波分析和自相关分析。在一些实施方案中，所述一种或多于一种特异的特征选自细胞大小、细胞形状、活细胞、死细胞、特异范围的细胞内pH、特异范围的膜电位、特异的细胞内钙水平、一种或多于一种存在的特异性细胞表面标志物、以及一个或多于一个特异性遗传标记的表达。
序号为PCT/US2016/014612，公开号为WO/2016/118915的PCT申请中描述了可以在本发明的实施方案中使用的例如上述的***和使用该***的方法，其公开内容通过引用并入本文。
图5所示为根据本发明实施方案的工作流的实例，该工作流使用例如如上所述的***，该***可作为RhapsodyTM单细胞分析***(Becton,Dickinson and Company)是可商购获得的。如图5所示，捕获颗粒包含与捕获磁珠结合的细胞以及珠结合的条形码核酸，使用施加磁场将捕获颗粒划分到阵列的微孔中，例如，如图3A和图3B所示。划分的捕获颗粒的细胞随后被裂解，从而从细胞释放的mRNA与珠上的条形码捕获的核酸杂交。然后使用施加磁场从孔中回收珠，用于产生测序文库，如图6所示然后对其进行测序，例如，使用例如如上所述的下一代测序平台。
流式细胞仪
在一些实施方案中，方法包括分离、获得和/或富集感兴趣的细胞。已在美国专利申请第2016/0244828号中描述了分离、获得和/或富集感兴趣的细胞，其全部内容通过引用并入文本。例如，可以使用流式细胞仪进行包含分离、获得和/或富集感兴趣细胞的方法。在一些实施方案中，流式细胞仪利用荧光激活的细胞分选。
流式细胞仪是有价值的细胞分析和分离方法。因此，它具有广泛的诊断和治疗应用。流式细胞仪利用流体流直链的隔离细胞，这样他们可以通过单行通过检测设备。单个细胞可以根据其在流体流中的位置和存在的可检测的标志物或部分(例如细胞组分结合试剂结合寡聚核苷酸上的荧光团)而加以区分。细胞流过聚焦询问点，其中至少有一个激光器将激光指导至通道内的聚焦点。通过以非常高的体积速率在样品流周围流动鞘流，将包含细胞的样品流体流体动力学地聚焦到非常小的芯径上。小芯径可以小于10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、110微米、120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、170微米、180微米、190微米、200微米，或这些值中任意两个之间的值或范围。鞘流的体积速率至少为样品体积速率的10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、或1000倍，或这些值中任意两个之间的值或范围。这导致聚焦细胞的直链的速度非常快，约为米每秒。所以每个细胞在激发点的停留时间非常有限，例如少于1微秒、2微秒、3微秒、4微秒、5微秒、6微秒、7微秒、8微秒、9微秒、10微秒、20微秒、30微秒、40微秒、50微秒、60微秒、70微秒、80微秒、90微秒、100微秒，或这些值中任意两个之间的值或范围。细胞通过询问点后，细胞不能再次重定向到询问点，因为直链的流速不能被逆转。
流式细胞仪是可以根据例如光散射和荧光等光学参数对细胞进行表征的工具。在流式细胞仪中，流体悬浮液中的细胞通过检测区，在该检测区中细胞暴露于通常来自一个或多于一个激光器的激发光下，并测量细胞的光散射和荧光特性。细胞或其组分通常用荧光染料标记以促进检测。利用光谱上不同的荧光染料标记不同的细胞或组分，可以同时检测多种不同的细胞或组分。在一些执行方案中，分析器中包含多个光电探测器，每个待测量的散射参数对应一个，每个待检测的不同染料对应一个。获得的数据包括针对每个光散射参数和荧光发射测量的信号。
通过添加流式细胞仪的分选或收集能力实现生物细胞的分离。被检测到具有一种或多于一种所需特征的分离流中的细胞，通过机械或电气除去以从样品流中单个分离。这种流式分选方法已用于对不同类型的细胞进行分选、分离用于繁育带有X和Y染色体的***、对染色体进行分选以进行遗传分析、以及从复杂的生物群体中分离出特别的生物。
常见的流式分选技术利用液滴分选，其中包含线性分离细胞的流体流破裂成液滴，包含感兴趣细胞的液滴带电并通过电场偏转到收集管中。液滴分选***能够形成液滴的速率约为100滴/秒、500滴/秒、1000滴/秒、2000滴/秒、3000滴/秒、4000滴/秒、5000滴/秒、6000滴/秒、7500滴/秒、10000滴/秒、20000滴/秒、30000滴/秒、40000滴/秒、50000滴/秒、60000滴/秒、75000滴/秒、100000滴/秒、200000滴/秒、300000滴/秒、400000滴/秒、500000滴/秒、600000滴/秒、750000滴/秒、1000000滴/秒或这些值中任意两个之间的值或范围，流体流通过直径小于1000微米、750微米、600微米、500微米、400微米、300微米、200微米、100微米、75微米、60微米、50微米、40微米、30微米、20微米、10微米、5微米、2微米、1微米或这些值中任意两个之间的值或范围的喷嘴。液滴分选要求液滴在距喷嘴尖端固定距离处从流中破裂。该距离通常在距离喷嘴尖端几毫米的量级上，并且可以通过以预定义的频率振动喷嘴尖端以维持流体不受扰动的流动。
当它们通过位于喷嘴尖端下方的观察点时，可以表征流中的线性分离细胞。细胞被识别为满足约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约75个、约100个、约200个、约300个、约400个、约500个、约600个、约750个标准，或这些值中任意两个之间的值或范围，或大于1000个标准后，它到达落点的时间和落点从流中破裂的时间是可以预测的。可以在包含选定细胞的液滴从流中破裂之前对流体流施加短暂的电荷，然后在液滴破裂后立即接地。被分选的液滴在破裂出流体流时保持电荷，而其他所有的液滴均不带电荷。带电液滴在电场作用下偏离其他液滴的向下轨迹，并收集在样品管中。不带电的液滴直接落入排液装置。
流式细胞仪还可以包含记录测量数据和分析数据的装置。例如，可以使用连接到检测电子设备的计算机进行数据存储和分析。例如，数据可以以表格形式存储，其中每行对应一个细胞的数据，列对应每个测量参数。使用标准文件格式，例如“FCS”文件格式，存储来自流式细胞仪的数据，以促进使用单独的程序和/或机器分析数据。使用当前的分析方法，为了易于可视化，数据通常以二维(“2D”)图显示，但也可以使用其他方法可视化多维数据。
使用流式细胞仪测量的参数通常包括细胞沿主要向前方向散射的激发光，称为前向散射(“FSC”)，细胞沿主要侧向散射的激发光，称为侧向散射(“SSC”)，荧光分子在光谱的一个或多于一个通道(频率范围)发出的光，称为FL1、FL2等，或主要在该通道中被测量到的荧光染料。可以通过散射参数和用染料标记各种细胞蛋白质产生的荧光发射识别不同的细胞类型。
荧光激活细胞分选是特殊类型的流式细胞仪。它提供了基于每个细胞的特异性光散射和荧光特征将细胞的不均匀混合物分选到微量滴定板的两个或多于两个容器或孔中的方法，一次一个细胞。它记录来自单个细胞的荧光信号，并在物理上分离特别感兴趣的细胞。首字母缩略词FACS是商标，由Becton Dickinson所有。
细胞悬液放置在狭窄、快速流动的液体流的中心附近。流配制成使平均(泊松分布)细胞之间相对于它们的直径有较大的分离。振动机制导致细胞流破裂成单个液滴。对***进行调整，使得液滴中存在一个以上细胞的可能性很低。在流破裂成液滴之前，流通过一个或多于一个激光交叉处，在那里测量每个感兴趣细胞的荧光特征。如果要收集细胞，则在一段时间内对流动池施加电荷，在这段时间内形成一个或多于一个液滴并从流中破裂。然后，这些带电液滴根据液滴上的电荷，通过静电偏转***落到靶标容器中。
合适的细胞分选的分选装置的非限制性实例包括BD FACSJazzTM细胞分选仪、BDFACSseqTM细胞分选仪、或任意其他细胞分选仪，包括Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)S3eTM细胞分选仪、Sony Biotechnology Inc.(San Jose,CA)SH800细胞分选仪、Beckman Coulter Inc.(Brea,CA)MoFloTMXDP细胞分选仪。
在一些实施方案中，该方法利用细胞表面标志物的标签和染色进行细胞分选。在一些实施方案中，该方法利用细胞表面标志物的标签磁性消耗不感兴趣的细胞、干扰细胞、和碎片。在一些实施方案中，方法包括基于获得的序列信息确定患者的基因型中的一种或多于一种；根据获得的序列信息确定患者的表型；根据序列信息确定患者的一种或多于一种基因突变；预测患者对一种或多于一种疾病的易感性。一种或多于一种疾病中至少有一种是癌症或遗传性疾病。
FACS可以使用靶标至可检测细胞标志物的抗体，对细胞表面标志物进行标签和染色，从而对细胞进行分类。抗体包括与荧光团偶联的单克隆和多克隆抗体。可检测的细胞标志物包括感兴趣的细胞表面标志物。在一些实施方案中，磁性消耗可以基于用带有包括单克隆抗体和多克隆抗体的抗体的磁珠给细胞表面标志物带上标签，缀合到它们非感兴趣的靶标细胞表面上，干扰细胞和/或碎片。细胞表面标志物的非限制性实例包括CD表面标记、生长因子/细胞因子、趋化因子受体、核受体和其他受体。细胞表面标志物的实例包括但不限于ALCAM、CD166、ASGR1、BCAM、BSG、CD147、CD14、CD19、CD2、CD200、CD127 BV421、CD25BB515、CD161 PE、CD45RA PerCP-CyTM5.5、CD15S AF647、CD4 APC-H、CD4、CD25、CD127、CD45RA、CD15S、CD161、CD3、EpCAM、CD44、以及Her2/Neu。生长因子/细胞因子受体、趋化因子受体的实例包括ACVR 1B、ALK4、ACVR2A、ACVR2B、BMPR1A、BMPR2、CSF1R、MCSFR、CSF2RB、EGFR、EPHA2、EPHA4、EPHB2、EPHB4、和ERBB2。核受体的实例包括雄激素受体、CAR、ERα、ERβ、ESRRA、ESRRB、ESRRG、FXR、糖皮质激素受体、LXR-a、LXR-b、PPARA、PPARD、PPARG、PXR、SXR、***受体β、孕激素受体、RARA、RARB、RARG、RORA、RXRA、RXRB、THRA、THRB、以及维生素D3受体。其他受体的实例包括AGER、APP、CLEC12A、MICL、CTLA4、FOLR1、FZD1、FRIZZLED-1、KLRB1A、LRPAP1、NCR3、NKP30、OLR1、PROCR、PTPN1、SOX9、SCARB2、TACSTD2、TREM1、TREM2、TREML1以及VDR。
组合物和试剂盒
本发明的方面还包括可用于实践本发明各种方法的试剂盒和组合物。组合物包括例如，如上所述的捕获磁珠。在一些情况下，捕获磁珠可以包括例如，如上所述的条形码核酸。
本发明的试剂盒可以包括例如，如上所述的捕获磁珠。在捕获磁珠不包括条形码核酸的情况下，试剂盒还可以包括例如，如上所述的带条形码的珠。试剂盒还可以包括用于实践该方法实施方案的一种或多于一种添加组分。例如，试剂盒可以包括以下的一种或多于一种：引物、聚合酶(例如，具有热启动特性或类似特性的热稳定性聚合酶、逆转录酶等)、dsDNA酶、外切核酸酶、dNTP、金属辅因子、一种或多于一种核酸酶抑制剂(例如，RNA酶抑制剂和/或DNA酶抑制剂)、一种或多于一种分子拥挤试剂(例如，聚乙二醇等)，一种或多于一种酶稳定性组分(例如，DTT)、刺激响应型聚合物，或任意其他所需的试剂盒组分，例如装置，例如，如上所述，固体支撑物、容器、盒，如管、珠、板、微流控芯片等。试剂盒的组分可以出现在单独的容器中，或者多个组分可以放在一个容器中。
除上述组分外，主体试剂盒还可以包括(在某些实施方案中)用于实践主体方法的说明。这些说明可以以多种形式存在于主体试剂盒中，其中一种或多于一种可以存在于试剂盒中。这些说明可以存在的一种形式是将信息印刷在合适的媒介或基底上，例如，印有信息的一张或几张纸，在试剂盒的包装上，在包装插页上，诸如此类。这些说明的另一种形式是记录了信息的计算机可读介质，如软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些说明的另一种存在形式可以是网站地址，可以在远距离位点通过互联网访问信息。
尽管有附加的权利要求，本公开内容也由以下条款定义：
1.一种对颗粒的核酸进行条形码编码的方法，所述方法包括：
a)将样品与包含用于样品颗粒捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；
b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及
c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到珠结合的条形码核酸的靶标结合区以产生捕获的核酸。
2.根据条款1所述的方法，其中，珠结合的条形码核酸被拴系在捕获磁珠上。
3.根据条款1所述的方法，其中珠结合的条形码核酸被拴系在与捕获磁珠不同的带条形码的珠上。
4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中划分的颗粒被划分到微孔中。
5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中捕获部分包含特异性结合成员。
6.根据条款5所述方法，其中特异性结合成员包含抗体或其结合片段。
7.根据前述条款中任一项所述的方法，其中珠结合的条形码核酸还包含细胞标记域。
8.根据前述条款中任一项所述的方法，其中珠结合的条形码核酸还包含独特分子索引域。
9.根据前述条款中任一项所述的方法，其中珠结合的条形码核酸还包含通用引物结合域。
10.根据条款1至条款6中任一项所述的方法，其中珠结合的条形码核酸包含以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
11.根据前述条款中任一项所述的方法，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
12.根据前述条款中任一项所述的方法，其中颗粒包括亚细胞大小的颗粒。
13.根据条款12所述的方法，其中亚细胞大小的颗粒包括囊泡。
14.根据前述条款中任一项所述的方法，其中颗粒包括细胞。
15.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将捕获的核酸与划分的捕获颗粒的其他成分分离，例如将寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂与核酸分离。
16.根据条款15所述的方法，其中分离包括使用施加磁场。
17.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括汇集捕获的核酸。
18.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将捕获的核酸置于cDNA合成反应条件下，以产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域。
19.根据条款18所述的方法，其中所述方法还包括从包含捕获的核酸的第一链cDNA域中产生扩增子组合物。
20.根据条款19所述的方法，其中所述扩增子组合物是从包含捕获的核酸的第一链cDNA域使用一轮或多于一轮扩增产生的。
21.根据条款19或条款20所述的方法，其中所述扩增子组合物包含下一代测序(NGS)文库。
22.根据条款21所述的方法，其中所述扩增子组合物包括包含核酸的NGS衔接子。
23.根据条款21或条款22所述的方法，其中所述方法还包括下一代测序NGS文库。
24.一种对颗粒的核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)将包含颗粒的样品与捕获磁珠组合，所述捕获磁珠包含：
i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及
ii)与颗粒特异性结合的捕获部分；
以产生捕获样品；
b)使用施加磁场介导的划分方案将捕获样品的捕获颗粒划分至微孔中，以产生划分的捕获颗粒；
c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸与条形码核酸的目标结合域结合以产生捕获的核酸；
d)将捕获的核酸置于cDNA合成反应的条件下，以产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域；
e)从包含捕获的核酸的第一链cDNA域构建NGS文库；以及
f)对NGS文库进行测序，从而对靶标颗粒的核酸进行测序。
25.根据条款24所述的方法，其中颗粒包括亚细胞大小的颗粒。
26.根据条款25所述的方法，其中亚细胞大小的颗粒包括囊泡。
27.根据前述条款中任一项所述的方法，其中颗粒包括细胞。
28.根据条款24所述的方法，其中所述方法还包括将捕获的核酸与划分的捕获颗粒的其他成分分离。
29.根据条款28所述的方法，其中分离包括使用施加磁场。
30.根据条款24至条款29中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在将捕获的核酸置于cDNA合成反应的条件下之前混合捕获的核酸。
31.根据条款24至条款30中任一项所述的方法，其中所述NGS文库是从包含捕获的核酸的第一链cDNA域使用一轮或多于一轮扩增产生的。
32.根据条款31所述的方法，其中扩增子组合物包括包含核酸的NGS衔接子。
33.根据条款24至条款32所述的方法，其中捕获部分包含抗体或其结合片段。
34.根据条款24至条款33中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含细胞标记域。
35.根据条款24至条款34中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含独特分子索引域。
36.根据条款24至条款35中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含通用引物结合域。
37.根据条款24至条款33中任一项所述的方法，其中条形码核酸包含以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
38.根据条款24至条款37中任一项所述的方法，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
39.根据条款24至条款38中任一项所述的方法，其中划分包括使用流动池。
40.根据条款39所述的方法，其中流动池包含基底。
41.包含条形码核酸和与颗粒特异性结合的捕获部分的捕获磁珠。
42.根据至条款41所述的捕获磁珠，其中捕获部分包含抗体或其结合片段。
43.根据条款41至条款42中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含细胞标记域。
44.根据条款41至条款43中任一项所述的捕获磁珠，其中条形码核酸还包含独特分子索引域。
45.根据条款41至条款44中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含通用引物结合域。
46.根据条款41至条款42中任一项所述的捕获磁珠，其中条形码核酸包含以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
47.根据条款41至条款46中任一项所述的捕获磁珠，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
48.一种装置，其包含：
a)包含100个或多于100个微孔的基底，所述微孔包含捕获磁珠，捕获磁珠包含：
i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及
ii)与颗粒特异性结合的捕获部分；以及
b)与基底流体连通的流动池。
49.根据条款48所述的装置，其中捕获部分包含抗体或其结合片段。
50.根据条款48至条款49中任一项所述的装置，其中条形码核酸还包含细胞标记域。
51.根据条款48至条款50中任一项所述的装置，其中条形码核酸还包含独特分子索引域。
52.根据条款48至条款51中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含通用引物结合域。
53.根据条款48至条款49中任一项所述的装置，其中条形码核酸包含以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
54.根据条款48至条款53中任一项所述的装置，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
55.一个***，其包含：
a)包含100个或多于100个微孔的基底，所述微孔包含捕获磁珠，捕获磁珠包含：
i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及
ii)与颗粒特异性结合的捕获部分；
b)与基底流体连通的流动池；以及
c)流量控制器；其中，流量控制器被配置为控制向流动池输送流体。
56.根据条款55所述的***，其中捕获部分包含抗体或其结合片段。
57.根据条款55至条款56中任一项所述的***，其中条形码核酸还包含细胞标记域。
58.根据条款55至条款57中任一项所述的***，其中条形码核酸还包含独特分子索引域。
59.根据条款55至条款58中任一项所述的方法，其中条形码核酸还包含通用引物结合域。
60.根据条款55至条款56中任一项所述的***，其中条形码核酸包含以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
61.根据条款55至条款60中任一项所述的***，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
62.一种试剂盒，其包含
(a)捕获磁珠，其包含特异性结合靶标颗粒的捕获部分；以及
(b)条形码核酸。
63.根据条款62所述的试剂盒，其中捕获磁珠包含条形码核酸。
64.根据条款62所述的试剂盒，其中条形码核酸被拴系在与捕获磁珠分离的带条形码的珠上。
65.根据条款62至条款64中任一项所述的试剂盒，其中试剂盒还包含：
装置，所述装置包含：
(i)包含100个或多于100个微孔的基底；以及
(ii)与基底流体连通的流动池。
66.根据条款62至条款65所述的试剂盒，其中捕获部分包含抗体或其结合片段。
67.根据条款62至条款66中任一项所述的试剂盒，其中条形码核酸还包含细胞标记域。
68.根据条款62至条款67中任一项所述的试剂盒，其中条形码核酸还包含独特分子索引域。
69.根据条款62至条款68中任一项所述的试剂盒，其中条形码核酸还包含通用引物结合域。
70.根据条款62至条款63中任一项所述的试剂盒，其中条形码核酸包含以下结构：珠-5’-通用引物结合域-细胞标记域-独特分子索引域-靶标结合区-3’。
71.根据条款62至条款70中任一项所述的试剂盒，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
在至少一些先前描述的实施方案中，在一个实施方案中使用的一个或多于一个要素可以在另一个实施方案中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修饰。所有这样的修饰和改变旨在落入如所附权利要求所定义的主题的范围内。
关于本文中基本上任意复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，可以在本文中明确阐明各种单数/复数排列。需要注意的是，除非上下文另有明确规定，如本说明和附加权利要求中使用的单数形式包括复数指称。除非另有说明，否则本文对“或”的任意包含旨在涵盖“和/或”。
本领域内的技术人员将理解，通常而言，本文，尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”等)。本领域内的技术人员还将理解，如果旨在引入特定数量的权利要求，这种意图将在权利要求中明确陈述，并且没有这种陈述的情况下不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多于一个”来介绍权利要求陈述。然而，这种短语的使用不应被解释为暗示由“一个”引入的权利要求陈述限制了任意特别的权利要求，其限制为引入的权利要求陈述仅包含一个此类陈述的实施方案，即使同一权利要求包括介绍性短语“一个或多于一个”或“至少一个”(例如，要素前无数量词应解释为“至少一个”或“一个或多于一个”)。此外，即使明确地列举了所引入的权利要求陈述的具体数目，本领域技术人员将认识到，这种陈述应当被解释为至少表示所列举的数目(例如，“两个陈述”的单纯陈述，没有其他修饰语，意味着至少两个陈述，或两次或多于两个陈述)。此外，在使用那些类似于“A、B和C中的至少一个等”惯例的情况下，一般来说，这样的结构在某种意义上，是旨在被本领域技术人员理解的惯例(例如，“具有A、B和C中的至少一个的***”将包括但不限于以下***：单独A，单独B，单独C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A，B和C一起，等)。在使用那些类似于“A、B或C中的至少一个等”惯例的情况下，一般来说，这样的结构在某种意义上，是旨在被本领域技术人员理解的惯例(例如，“具有A、B或C中的至少一个的***”将包括但不限于以下***：单独A，单独B，单独C，A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A，B和C一起，等)。本领域技术人员还将理解，几乎任意表示两个或两个以上可选条款的分离词或短语，无论是在描述、权利要求书或附图中，都应该理解为考虑包括其中一项条款、其中一项条款或两项条款的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，根据马库什组描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开内容也因此根据马库什组的任意个体成员或子组成员进行了描述。
本领域技术人员将理解的是，无论如何，例如在提供书面描述方面，本协议所公开的所有范围还包括任意和所有可能的子范围及其子范围的组合。任意列出的范围都可以容易地被识别为足以描述并且能够将相同的范围破裂成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围都可以很容易地分解为低三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解的是，所有的语言，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所列举的数字，并指代可以随后分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1项至3项条款的组是指具有1项、2篇或3项条款的组。类似地，具有1项至5项条款的组是指具有1项、2项、3项、4项或5项条款的组，等等。
尽管本文已经公开了各种个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是明显的。本文所公开的各个方面和实施方案是出于说明的目的而不旨在限制，其真实范围和精神由所附权利要求指示。
因此，前述仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，尽管在此没有明确地描述或显示，但这些布置体现了本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文中列举的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人对促进本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于上述具体实例和条件。此外，本文中所有列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的陈述，旨在包含其结构和功能上的等效物。此外，这些等效物旨在包括当前已知的等效物和未来开发的等效物，即，开发的任意进行相同功能的元件，无论其结构如何。此外，本文所公开的任意内容均不旨在面向公众，无论权利要求中是否明确列举这些公开内容。
因此，本发明的范围不旨在限于本文所示和描述的实例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在权利要求中，第35U.S.C.§112(f)或第35U.S.C.§112(6)被明确定义为仅当在权利要求的时效开始处引用了确切的短语“方法为”或确切的短语“步骤为”时才在权利要求中被援引；如果在权利要求的限制条款中没有使用这样确切的短语，则不援引35USC§112(f)或35USC§112(6)。

Claims (15)

1.一种对颗粒的核酸进行条形码编码的方法，所述方法包括：
a)将样品与包含用于样品颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；
b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及
c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到珠结合的条形码核酸的靶标结合区以产生捕获的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中珠结合的条形码核酸被拴系在捕获磁珠上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中珠结合的条形码核酸被拴系在与捕获磁珠不同的带条形码的珠上。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中划分的捕获颗粒被划分到微孔中。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中捕获部分包含特异性结合成员。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中珠结合的条形码核酸还包含细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中颗粒包括亚细胞大小的颗粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中亚细胞大小的颗粒包括囊泡。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中方法还包括将捕获的核酸与划分的捕获颗粒的其他成分分离。
11.根据权利要求10所述的方法，其中分离包括使用施加磁场。
12.一种捕获磁珠，其包含条形码核酸和与颗粒特异性结合的捕获部分。
13.一种装置，其包含：
a)包含100个或多于100个微孔的基底，所述微孔包含捕获磁珠，捕获磁珠包含：
i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及
ii)与颗粒特异性结合的捕获部分；以及
b)与基底流体连通的流动池。
14.一种***，其包含：
a)包含100个或多于100个微孔的基底，所述微孔包含捕获磁珠，捕获磁珠包含：
i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及
ii)与颗粒特异性结合的捕获部分；
b)与基底流体连通的流动池；以及
c)流量控制器；其中，流量控制器被配置为控制向流动池输送流体。
15.一种试剂盒，其包含：
(a)捕获磁珠，其包含与靶标颗粒特异性结合的捕获部分；以及
(b)条形码核酸。
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